Procédures sévères

Opérées sous anesthésie pour un rétrécissement de l'aorte, les souris subissent ensuite trois prélèvements sanguins espacés de quinze jours, une IRM, trois à quatre échocardiographies et un test d'effort sur tapis de course. 240 souris femelles sont ainsi utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique qu'un œdème pulmonaire peut apparaître chez 10 à 20 % d'entre elles juste après l'opération, puis chez 20 à 30 % huit à douze semaines plus tard, à mesure que l'insuffisance cardiaque s'installe. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, alors que les retombées annoncées, de nouvelles cibles pour prévenir l'insuffisance cardiaque, restent formulées au conditionnel.

Objectifs

Nous allons nous appuyer sur un modèle chirurgical de sténose aortique présentant une réponse morphophénotypique dépendante de la souche de souris. En effet, la souris C57BL6J femelle développe une cardiomyopathie hypertrophique concentrique tandis que la souris BALB/c développe une cardiomyopathie excentrique dilatée. En caractérisant la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques dans ce modèle, nous souhaitons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de limiter l’inflammation et la dysfonction cardiaques. Ce modèle va permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Ce modèle permet d’étudier deux cardiomyopathies d’origine non-ischémique induits par surcharge de pression : l'hypertrophie cardiaque et la cardiomyopathie dilaté. Nos travaux de recherche nous permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler l’inflammation, l’œdème et la fibrose afin de restaurer/préserver la fonction cardiaque. A terme, nous espérons pouvoir proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le développement d’une insuffisance cardiaque.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie et couverture analgésique, une procédure chirurgicale (duré de 10-20 minutes) en début d'étude, suivi des prélèvements sanguins (3 fois, espacé de 2 semaines minimum). Ils seront également soumis à des analyses non invasifs (IRM 1 fois, échocardiographie 3-4 fois, un test à l’effort par tapis de course 1 fois) pendant l'étude.

Impact sur les animaux

Ce modèle peut induire, chez 10-20% des individus, un œdème pulmonaire transitoire (maladie), liée à la surcharge de pression rapide induit par le rétrécissement aortique. Ceci pourrait influencer la respiration des souris (rythme de respiration accéléré, peu d’activité de locomotion). Généralement, sous 24h après l'opération, 80-90% des animaux récupérer. D’autre part, pendant les premiers jours après la chirurgie, les animaux pourront avoir des douleurs liées à la mini-thoracotomie. Un autre point de souffrance pendant l’étude pourrait être une infection sur les points de sutures (maladie). Finalement, vers 8-12 semaines post-opératoires un œdème pulmonaire peut apparaitre chez 20-30% des individus (maladie), qui pourrait altérer la respiration. Ceci est liée au développement de l’insuffisance cardiaque, la pathologie que nous étudions avec ce modèle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas, à ce jour de modèles de cardiomyopathies in vitro

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM, tolerance d'effort) puis des mesures invasives (hémodynamique).

Raffinement

Pour raffiner, les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle.

Un rein retiré et le pédicule vasculaire de l'autre serré par un clamp, ou les deux pédicules bloqués pendant vingt-cinq minutes : 590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent une perfusion intraveineuse de cinq heures sous anesthésie pour une partie des animaux, des prélèvements d'urine répétés par massage abdominal et une mesure de filtration rénale demandant deux anesthésies séparées de deux heures. L'insuffisance rénale ainsi provoquée entraîne douleur, perte de poids et déshydratation, atteintes que le porteur décrit comme impossibles à éviter complètement puisque l'induction de la maladie est "absolument indispensable" au projet. Sur le remplacement, il indique que les organoïdes de rein existants n'ont pas de vascularisation et ne permettent donc pas de mesurer une fonction rénale.

Objectifs

L'insuffisance rénale aiguë correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant chez 10% des patients hospitalisés et 50% des patients en réanimation. Un épisode d'insuffisance rénale aiguë est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique, qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Il n’existe actuellement aucun traitement de l'insuffisance rénale aiguë. La production d'énergie par les cellules rénales est fortement perturbée pendant une insuffisance rénale aiguë. Des études ont notamment décrit un blocage de la synthèse de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l'alimentation. La supplémentation en vitamine B3 permet de restaurer la production de NAD et de limiter les conséquences d'une insuffisance rénale aiguë. Ces résultats sont très prometteurs mais, avant une application en clinique, il reste beaucoup de questions, qui constituent nos objectifs : - existe-t-il une corrélation entre la sévérité de l'insuffisance rénale aiguë et l'atteinte de la synthèse de NAD ?. - quelle est l'évolution de la synthèse de NAD après insuffisance rénale aiguë ? Les résultats publiés ne portent que sur la phase aiguë, précoce. Il faut maintenant compléter ces études en caractérisant l'évolution de cette synthèse la phase de récupération et la phase de transition vers la maladie rénale chronique. - la vitamine B3 est-elle bénéfique lorsqu'elle est administrée après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë ? Les études publiées ont uniquement rapporté le bénéfice d'une administration commencée avant l'insuffisance rénale aiguë . Il faut maintenant déterminer si la vitamine B3 est efficace après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë. Au cours de ce projet, nous caractériserons également l'évolution du rapport de deux molécules impliquées dans la synthèse de NAD, à savoir le rapport quinolinate/tryptophane. Ce rapport varie très tôt pendant l'insuffisance rénale aiguë, beaucoup plus tôt que les tests utilisés actuellement pour diagnostiquer une insuffisance rénale aiguë. La caractérisation de son évolution pendant les différentes étapes menant de l'insuffisance rénale aiguë à la maladie rénale chronique nous permettra de déterminer si ce rapport peut avoir un intérêt diagnostique et pronostique.

Bénéfices attendus

Il n'existe actuellement aucun traitement spécifique de l'insuffisance rénale aigue. L'administration de vitamine B3 est particulièrement prometteuse. Le projet décrit ici doit nous permettre de définir quand doit être administré ce traitement dans le contexte de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique. Le deuxième objectif du travail est la caractérisation d'un outil (le rapport quinolinate/tryptophane) diagnostique et/ou pronostique précoce de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique, qui manque aujourd'hui. Cet outil pourrait également permettre de déterminer le moment et le temps pendant lequel il faut administrer la vitamine B3. Ensemble, ces deux aspects du projet permettront de limiter l'administration de vitamine B3 à la période strictement nécessaire, réduisant ainsi non seulement le risque d'effets secondaires connus, comme la toxicité vis-à-vis du foie, mais également les effets nocifs potentiels sur le rein d'une activation à long terme de la production de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) dans la phase de réparation après insuffisance rénale aigue ou lors de la transition vers la maladie rénale chronique.

Procédures

(1) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à exciser le rein droit et à poser un clamp autour du pédicule vasculaire rénal gauche Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à clamper les deux pédicules vasculaires rénaux pendant 25 minutes. Ce protocole dure 45 minutes (exposition puis pose des clamps sur les pédicules, ischémie et sutures). (3) Une partie des animaux sera soumise à la mesure du débit de filtration glomérulaire qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. (4) Tous les animaux recevront au moins une injection intrapéritonéale. Cette procédure, effectuée sur animal vigile, dure moins d'une minute. (5) Une partie des animaux sera soumise à une perfusion intra-veineuse pendant 5h sous anesthésie gazeuse. (6) Des prélèvements de 50 microlitres d'urine seront effectués avant la chirurgie et à plusieurs temps après la chirurgie (miction spontanée ou léger massage abdominal). La durée de cette procédure, effectuée sur animal vigile, est de 1-2 minutes. Tous les animaux y seront soumis. (7) Tous les animaux seront soumis prélèvement sanguin effectué sous anesthésie suivi de l’euthanasie des animaux par une méthode réglementaire. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie. Un traitement analgésique sera également appliqué toutes les 6-8h après chirurgie pendant 48 heures.

Impact sur les animaux

La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique); (3) altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont en effet nécessaires post-mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Le rein est un organe complexe, composé de plusieurs types de cellules chargés chacun d'une mission spécifique, qu'il est actuellement difficile de reconstituer en dehors d'un organisme vivant. Si des équipes ont décrit la génération d'organoïdes ("organes dans une boîte") rénaux, elles n'ont pour l'instant pas réussi à mettre en place un système de vascularisation, indispensable pour reproduire fidèlement la situation de l'organisme. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique de la vitamine B3 est l'amélioration de la fonction rénale, qui ne peut pas être mesurée sur un organe sans circulation sanguine. Enfin, le foie joue un rôle crucial dans la synthèse et le métabolisme du NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide), une des sources d'énergie que nous étudions. Il est donc essentiel pour notre étude que l'interaction entre le foie et le rein soit présente.

Réduction

Le nombre total d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est 590. Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité qui existe entre individu dans les deux modèles d'insuffisance rénale aigue que nous utilisons. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Des points limites ont été définis. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière pendant toute la durée du protocole.

Choix des espèces

L'étude d'un modèle expérimental de mammifère est indispensable puisque le but de notre travail est de pouvoir transposer un jour le résultat de nos études à la clinique humaine. Nous avons choisi la souris car nous maîtrisons parfaitement les protocoles expérimentaux dans cette espèce. Les procédures seront menées chez des souris mâles et femelles de 9-10 semaines, c'est-à-dire des animaux adultes. L'insuffisance rénale aigue touche en effet majoritairement des adultes.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent sous anesthésie une injection rétro-orbitaire de staphylocoque doré multirésistant, puis jusqu'à six injections intrapéritonéales d'antibiotiques par jour sur animal vigile, pendant deux à cinq semaines. L'infection du sang et des articulations ainsi provoquée entraîne douleur et troubles du déplacement, et les prélèvements réalisés après la mise à mort servent à compter les bactéries restantes. Sur le remplacement, le porteur écrit que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier l'élimination des bactéries dans une infection générale et que le "modèle animal est indispensable" au projet.

Objectifs

Le staphylocoque doré est une bactérie responsable d'infections graves. Certaines bactéries sont dites multi-résistantes car résistantes à plusieurs familles d'antibiotiques et posent de nombreux problèmes thérapeutiques. Nous proposons une approche innovante avec l'association de deux antibiotiques qui leur permet un meilleur accès au site infecté pour traiter les infections graves à staphylocoque doré multi-résistant. Il a été identifié plusieurs combinaisons antibiotiques dont l'action est efficace en laboratoire. Ce projet vise à tester ces combinaisons d'antibiotiques dans des modèles souris d'infections sévères du sang et des articulations.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier de meilleures stratégies thérapeutiques contre les infections sévères à staphylocoque. Le projet déterminera l’efficacité de nouvelles combinaisons d'antibiotiques administrées de manière à mieux accéder directement au site de l'infection.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une anesthésie d'une durée de 5 à 15 minutes. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse rétro-orbitaire d'une durée de 5 secondes réalisée sous anesthésie. Les animaux recevront des injections sous-cutanées d'analgésiques tous les 3 jours, soit un total de 5 à 12 injections selon les études menées (2 à 5 semaines). Les injections sous-cutanées d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales quotidiennes d'antibiotiques au nombre de 2 ou de 6 selon l’étude menée. Les injections intrapéritonéales d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation. L'infection est susceptible de générer douleur et problèmes de déplacement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des deux procédures. Des prélèvements post-mortem seront effectués pour quantifier le nombre de bactéries et évaluer l'efficacité des différents traitement antibiotiques.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la clairance bactérienne et de l’efficacité des traitements antibiotiques dans des modèles d’infection systémique. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet et permettra également de mesurer l’impact des différentes molécules à court terme sur le microbiote intestinal. Les combinaisons d’antibiotiques qui seront testées ont démontré leur efficacité dans des modèles simples de culture.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe et même âge obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec nourriture et eau ad libiditum, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement, jours fériés et week-end inclus, par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l'infection du sang et des articulations. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 7 semaines car elles disposent d'un système immunitaire mature.

Les porcs qui présentent des convulsions au réveil sont tués, comme ceux dont la circulation sanguine n'a pas repris après trente minutes de réanimation. 27 porcs juvéniles de 30 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués vingt-quatre heures après l'arrêt cardiaque pour examiner leurs lésions cérébrales. Un arrêt cardio-respiratoire leur est provoqué sous chirurgie, puis un massage cardiaque leur est appliqué avec compression des membres et ventilation par un mélange gazeux contenant de l'argon, les survivants étant réveillés et suivis une journée. Le bénéfice annoncé, une réduction des séquelles neurologiques chez les patients réanimés après un arrêt cardiaque, reste au conditionnel, tandis que le raffinement décrit se limite à des copeaux de bois, des jouets en plastique et des antalgiques.

Objectifs

Les états de chocs cardiovasculaires sont fréquents chez les patients réanimés après un arrêt cardiaque extrahospitalier. Le faible débit sanguin durant la réanimation cardiopulmonaire (RCP) aggrave les lésions neurologiques. Le cerveau peut aussi être lésé par la modification des échanges gazeux en oxygène et dioxyde de carbone pendant la réanimation. Dans ce contexte, nous proposons d'évaluer les effets bénéfiques potentiels d'un traitement combinant la compression des membres antérieurs et postérieurs, pour améliorer le flux sanguin dans les organes vitaux, et d’une ventilation avec un mélange gazeux protecteur contenant de l’argon (gaz neuroprotecteur), et des teneurs contrôlées en oxygène et en dioxyde de carbone. Ce mélange gazeux limiterait les conséquences potentielles d’une mauvaise ventilation. La prévention des troubles liées à une oxygénation excessive du sang ou à une trop forte diminution du dioxyde de carbone devrait accroitre l’effet bénéfique de la redistribution sanguine permise par la compression des membres. L'objectif de la présente étude est de renforcer les résultats antérieurs observés avec ce traitement qui a démontré des bénéfices sur la perfusion sanguine cérébrale notamment. Ainsi, nous évaluerons dans un modèle porcin d'arrêt cardiaque l'effet de ce traitement sur les séquelles neurologiques après un arrêt cardiaque par rapport à une réanimation cardiopulmonaire standard (oxygène pur au cours de la RCP puis mélange air/oxygène après la réanimation) et sans compression des membres.

Bénéfices attendus

Dans des travaux antérieurs, l’occlusion des membres antérieurs et postérieurs pendant le massage cardiaque a démontré une amélioration du flux sanguin cérébral et cardiaque pendant la réanimation cardio-pulmonaire. Le bénéfice attendu est donc une réduction des séquelles neurologiques par l’augmentation de la perfusion de ces organes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale et à un arrêt cardio-respiratoire. Des prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés tout le long de la procédure. Les animaux seront mis à mort au terme des 24 heures de suivi après l’arrêt cardiaque.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les échecs de réanimation sont possibles chez les animaux, puisqu’ils sont soumis à un arrêt cardiaque. En cas d’absence de reprise de la circulation sanguine spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue. Dans le cas où la réanimation cardiopulmonaire a abouti à un succès (reprise de circulation sanguine), les animaux seront réveillés et suivi pendant 24 heures après l’arrêt cardiaque. Un traitement analgésique puissant sera mis en place. Lors du réveil, si un animal présente des signes aiguës d’encéphalopathie anoxique avec des convulsions, ils seront euthanasiés (point limite). Tous les animaux ayant survécu seront euthanasiés après 24 heures suivant l’arrêt cardiaque.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole après 24heures de suivi afin d’évaluer les lésions cérébrales.

Remplacement

L’arrêt cardiaque induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Cette affection impactant différents organes simultanément ne permet donc pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Nous envisageons d’inclure un total de 27 animaux. Ce calcul permet à partir de calculs statistiques d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux recevront des administrations d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques systémiques et cérébraux. Porcs juvéniles de 30 kg car ce poids facilite la manutention de l’animal pour les expérimentations du projet.

Une ligature du nerf sciatique sous anesthésie ou des injections répétées d'anticancéreux installent une neuropathie douloureuse chronique chez 648 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sept fois par animal, un filament est appliqué sur la patte ou la patte est plongée dans un bain à 10 °C, pour mesurer la douleur avant et après l'application d'une crème antalgique. Le porteur décrit ces tests comme entraînant "une douleur de quelques secondes" et précise que l'animal reste libre de retirer sa patte, après avoir écrit que l'induction de la neuropathie constitue une "nuisance à part entière" mais "indispensable" à la conduite de l'étude. Toutes les souris sont tuées, le porteur indiquant que leur souffrance est irréversible.

Objectifs

Nous souhaitons réaliser, chez l’animal, une étude qui permettra de mettre en avant une action additive, potentiellement synergique (c’est-à-dire obtenir un effet supérieur à une simple addition), de deux principes actifs après une application locale sous forme de crème dans des douleurs neuropathiques périphériques. Des données de biologie moléculaire sont également nécessaires afin de localiser l’expression des protéines cibles dans le tissu périphérique.

Bénéfices attendus

Le produit attendu est un nouvel antalgique pour lutter contre les symptômes neuropathiques tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein, des cancers colorectaux de stade III (avancé) et IV (métastatique) mais pourrait être ouvert à ceux des cancers ovariens et du tête-cou pour lesquels les mêmes protocoles chimiothérapiques sont prescrits. La forme crème (action topique) permettra de limiter les effets indésirables de ces deux molécules prises par voie orale.

Procédures

Les souris pourront subir, en fonction des procédures, les interventions suivantes : - Induction des modèles de neuropathies chimio-induite : Il s’agit ici d’injection en intrapéritonéal sur animal vigil (durée par animal : 3 secondes) réalisées 2 ou 3 fois par semaines pendant 1 ou 4 semaines, en fonction de l’anticancéreux. - Induction du modèle de neuropathie par ligature du nerf sciatique (modèle SNI ou Spared Nerve Ligation) : une chirurgie sera réalisée chez la souris anesthésiée (durée par animal : 15 min). - Tests comportementaux : ils consistent, soit à appliquer des filaments sur la patte, soit à immerger la patte dans l’eau froide à 10°C. Durée par animal : 5 à 30 secondes). Fréquence : 7 fois par animal : une fois avant l’induction du modèle, puis au jour 7 ou 14 après l’induction du modèle (en fonction du modèle), et enfin 20, 40, 60, 90 et 120 minutes après l’application de la crème. - Application de la crème : elle sera réalisée pendant 5 minutes (fréquence : une fois) sur la patte de l’animal anesthésié sous isoflurane 2,5%.

Impact sur les animaux

L’induction de neuropathie chronique périphérique chez la souris sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera associée à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Des tests comportementaux pour évaluer la douleur seront réalisés sur souris vigiles. Il s’agira du test du von Frey ou du test d’immersion de la patte. Le test du von Frey consiste à appliquer un filament au niveau de la patte de l’animal et le test d’immersion à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Cela va donc entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.

Remplacement

S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques périphériques n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Il n’y a pas actuellement de système in silico disponible pour l’étude de la douleur qui est un modèle intégré. Ce type d'étude sur modèle animal de douleurs neuropathiques chimio induites est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expériences. Enfin, si les résultats de chaque procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.

Raffinement

Des méthodes de raffinement sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Afin de limiter la souffrance liée au tatouage des animaux, ils sont identifiés par un marquage sur la queue réalisé une fois par semaine. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.

Choix des espèces

La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les douleurs neuropathiques périphériques. D’autres travaux antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontané tout à fait adapté à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. Il s'agit du stage "adulte" de la souris pour mimer au mieux une douleur neuropathique aussi au stade adulte chez l'homme et pour éviter tout phénomène biologique aux âges extrêmes de l'animal.