Procédures sévères

Après une chirurgie crânienne de quarante-cinq minutes, une partie des souris est hébergée seule, un isolement dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress chez une espèce grégaire. 2 294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 814 un niveau modéré. Toutes subissent un prélèvement de queue à sept jours, certaines une prise de sang à l'âge adulte, d'autres des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, seulement décrits comme allant "du moins au plus stressant". Une des lignées a une espérance de vie raccourcie et la mutation étudiée pourrait faire apparaître des tumeurs, atteintes que le porteur met en regard de la forte homologie du gène avec celui de l'humain et de traits autistiques déjà caractérisés chez la souris.

Objectifs

Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacent de façon coordonnée. Il a été démontré que les défauts de substance blanche du système nerveux central (substance riche en gaines de myéline) sont observés de façon systématique chez des patients atteint du spectre de l’autisme. Ces défauts pourraient être directement liés au défaut de myélinisation (processus de formation de gaine de myéline) engendré par la présence d’une mutation de la protéine kinase que nous appellerons ‘protéine A’ qui a été observée chez certains patients. L’objectif de ce projet est l’étude des effets d’une mutation de la protéine A retrouvée chez des patients atteints du spectre de l’autisme. En effet, une telle mutation rendrait son activité kinase constitutivement active. Une souris porteuse de cette mutation telle qu’elle est retrouvée chez les patients, et porteuse d’un marqueur fluorescent pour visualiser les cellules myélinisantes permettra l’étude (1) des défauts structurels de myélinisation, (2) des autres défauts du cerveau liés à cette mutation (études des neurones et de leur fonction), (3) de la présence ou non de traits autistiques chez la souris (étude du comportement moteur, social et cognitif). L’étude de ce modèle murin nous permettra donc de contribuer à la compréhension de la physiopathologie de l’autisme et de mettre en avant de potentielles futures voies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

A terme, l’étude approfondie de la souris porteuse d’une mutation de la protéine A, telle qu’elle est retrouvée chez les patients, permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension de comment le développement des gaines de myéline mène à un comportement autistique. Les résultats de ce projet permettront peut-être d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude auront un prélèvement unique à 7 jours post-natals afin d’identifier les animaux porteurs de la mutation génétique d’intérêt pour notre projet. Une fois adulte, à 60 jours, 20 de ces souris auront une prise de sang (prélèvement unique conforme aux recommandations, effectué sur animal vigile) afin d’analyser différents paramètres biochimiques d’intérêt chez les sujets autistes. Dans le but de caractériser ce modèle de souris et analyser si elle présente des caractères autistiques, un groupe de souris sera étudié dans des tests comportementaux non-invasifs, effectués du moins au plus stressant, et séparés à minima d’une semaine entre chaque. Les tests seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima une heure. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris). Enfin, afin d’analyser les effets de la mutation sur la fonctionnalité du cerveau des souris, une partie d’entre elles seront opérées sous anesthésie locale et générale, et analgésie avant et après l’opération (une seule chirurgie par animal, durée maximal 45 minutes). Les animaux seront observés quotidiennement en post-opératoire afin d’intervenir au plus vite s’ils présentent des signes de douleur. Les animaux devront être hébergés de façon isolée (si sevrées) après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours) et leur cage sera enrichie en maison en carton et en kraft afin de limiter le stress.

Impact sur les animaux

L’une des lignées murines présente une espérance de vie raccourcie ainsi qu’un développement accru du cerveau. De plus, la mutation que nous étudions pourrait induire le développement de tumeur au sein de l’organisme. Les prélèvements de sang et d’un fragment de queue pourraient générer un stress et une légère et brève douleur, mais aussi un risque de saignement. Des nuisances liées à l’acte chirurgical pourraient survenir : risques liés à l’anesthésie (hypothermie, risque cardio-respiratoire), saignements et infections, qui seront maitrisés par les bonnes pratiques. Un stress pourra être induit suite à la manipulation des animaux et aux tests comportementaux auxquels ils seront sujets. S’agissant d’animaux grégaires, l’hébergement individuel des animaux générera un stress.

Devenir

A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : - soit pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin de réaliser les analyses nécessaires pour répondre à notre question scientifique. - soit à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux - soit à la fin de la période de reproduction prévue.

Remplacement

Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes mis en culture (donc hors de l’animal). il est essentiel ensuite dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal de la mutation afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l'activité électrique des neurones, (2) d'étudier l'impact de la mutation sur le comportement de la souris.

Réduction

Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (2294) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d'évaluer la présence éventuelle d'un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire

Raffinement

L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et neslet, papier craft), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les animaux seront suivis régulièrement par notre équipe (deux fois par semaines) et quotidiennement par la zootechnie. Un vétérinaire est présent sur place afin de conseiller les expérimentateurs sur les soins appropriés à mettre en place, si besoin. Ils seront hébergés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie maintenus dans les références recommandées. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe de cinq souris maximum, avec du coton pour se former un nid et un bâtonnet à ronger). Afin d’évaluer les impacts des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux. Ainsi, les animaux génétiquement modifiés seront observés tous les deux à trois jours (deux fois par semaine) à l’aide d’une grille d’évaluation qui permet de suivre de près toute modification du comportement physique ou alimentaire présupposant une détresse de l’animal. Si une telle détresse est observée, l’avis du vétérinaire sera automatiquement demandé et les soins appropriés seront donnés à l’animal. Toute mise en place de traitement nécessitera l’isolement de l’animal. Ainsi tout animal isolé sera dans une cage enrichie avec du kraft, des bâtonnets de bois et une maison en carton. Si le vétérinaire le conseille, l’animal en détresse pourra être euthanasié afin de réduire ses souffrances.

Choix des espèces

La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. De plus, de nombreux traits autistiques ont été bien caractérisés chez la souris, avec les tests comportementaux adaptés pour les étudier. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris à différents âges post-nataux correspondant à la maturation de la myéline dans les zones testées. Ainsi par exemple, le comportement social sera évalué à un stade où la myélinisation des cortex gérant les interactions sociales est fortement active.

L'artère coronaire gauche est ligaturée pour provoquer un infarctus, après la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, sur des rats ensuite perfusés une à six heures. 447 rats mâles vont être utilisés, dont 432 dans des procédures classées sévères, tous tués à l'issue. Le porteur indique que cette chirurgie entraîne une mortalité d'environ 20 % même avec une maîtrise du geste, mortalité qu'il intègre au calcul de ses effectifs, tout en affirmant que les conditions de soins seront "les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur". Les cœurs sont prélevés après un cathétérisme intracardiaque mené sous anesthésie sans réveil, pour mesurer l'effet d'une perfusion de lactate de sodium sur l'inflammation.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle animal en vue de l'évaluation de l'impact métabolique d’une perfusion de lactate de sodium sur la fonction cardio-vasculaire, l’inflammation au cours de l’IR myocardique. L’Infarctus du myocarde représente un enjeu thérapeutique majeur puisqu’il touche environ 80 000 personnes et est responsable de 12 000 décès en France chaque année. Des travaux précédents ont montré qu’en situation de stress les corps cétoniques et le lactate constituent les principaux métabolites du myocarde. Ainsi, il a été montré chez des patients en insuffisance cardiaque qu’une perfusion d’hydroxybutyrate (corps cétonique) améliorait l’hémodynamique ; de plus, des travaux de notre laboratoire sur un modèle de sepsis ont mis en évidence les effets bénéfiques d’une perfusion de lactate de sodium sur la fonction cardiovasculaire, l’inflammation et la production de corps cétoniques. L’objectif de ce projet est donc d’effectuer une étude sur l’impact d’une perfusion curative de lactate de sodium sur un modèle d’ischémie-reperfusion par des approches in vivo et ex vivo.

Bénéfices attendus

Le traitement de l’infarctus du myocarde représente un enjeu thérapeutique majeur puisqu’il touche plus de 80 000 personnes et serait responsable de 12 000 décès en France chaque année, constituant la première cause de décès par cause cardiovasculaire. Ce projet permettra de fournir des résultats préliminaires pour une meilleure prise en charge thérapeutique des patients atteint d’un infarctus du myocarde grâce à la meilleure compréhension des mécanismes pathologiques afin de réduire l'incidence de l’insuffisance cardiaque chez des patients ayant fait un infarctus du myocarde.

Procédures

Les animaux des deux procédures subiront une procédure chirurgicale visant à un poser un cathéter jugulaire droit et à l’induction d’une ischémie reperfusion myocardique induite par ligature coronaire. Les animaux seront perfusés pendant 1 à 6h avec les différentes solutions d’intérêt. Les protocoles invasifs (cathétérisme intracardiaque, les prélèvements d’organes) seront réalisés sur des animaux anesthésiés et seront sans réveil.

Impact sur les animaux

Les deux procédures sont classées sévères. La chirurgie visant à induire une ischémie par ligature coronaire puis une reperfusion entraine un taux de mortalité d’environ 20%. Tous les animaux subiront deux anesthésie (gazeuse puis intrapéritonéale). Comme décrit dans la littérature la ligature coronaire est une chirurgie qui entraine un taux de mortalité important même avec une maitrise du geste.

Devenir

Pour les deux procédures les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations, du fait des prélèvements d'organes et notamment du coeur.

Remplacement

Ce projet a pour but de caractériser un modèle d’ischémie reperfusion myocardique pour évaluer l’impact métabolique du lactate de sodium. Le modèle expérimental consiste en la ligature de l’artère coronaire gauche proximale chez des rats, dans des conditions de physiologie et de physiopathologie intégrées. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous avons constitué des procédures permettant autant que possible la réalisation séquentielle de mesures. En effet, les animaux subiront une échocardiographie, puis une de la courbe pression-volume du ventricule gauche et enfin un prélèvement du cœur à visée histologique. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaires afin de détecter une différence de 10 %. Les groupes de N=8 sont nécessaires pour atteindre la significativité statistique au vu du taux de mortalité attendu lié à la procédure chirurgicale. Les groupes de N=5 pour la série 4 seront nécessaires car un taux de mortalité proche de 0 est attendu. De plus les données obtenues chez les animaux de cette série (Sham) seront réutilisés comme témoins dans la seconde procédure afin de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé plusieurs fois par jour durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Les rats perdant plus de 15% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirurgie, nous injectons une solution saline en sous- cutanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. Un traitement analgésique en préopératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 12h pendant toute la durée du protocole. Nous allons dans ce projet utiliser des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.

Choix des espèces

Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro à cause de la complexité de la pathogenèse des processus conduisant à l’ischémie-reperfusion, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles Wistar adultes (environ 400g) d’environ 10 semaines seront utilisés pour induire une ischémie myocardique par ligature de l’artère coronaire gauche proximale. Ce poids et cet âge sont justifiés par l’abondance de la littérature sur ce modèle.

Tuées en fin de procédure pour collecter leurs tissus, 72 souris mâles porteuses d'une mutation qui reproduit le syndrome de Barth vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles naissent avec un faible poids et des atteintes cardiaques, puis sont gavées une fois par jour pendant cinq mois au maximum, gavages dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent provoquer des irritations à force de répétition. Le test d'endurance les fait courir jusqu'à quinze minutes sur un tapis incliné, avec jusqu'à trois chocs électriques de faible intensité par séance. Le porteur conclut que le recours à un modèle animal est "une nécessité" pour compléter ses résultats en culture cellulaire, et prévoit la mise à mort de toute souris perdant 20 % de son poids.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une grave maladie génétique liée au chromosome X qui touche essentiellement les garçons, elle est principalement caractérisée par des retards de croissance, un déficit musculaire et de graves problèmes au cœur. A ce jour malgré des progrès importants dans la compréhension de la physiopathologie des maladies, le développement de nouvelles approches pharmacologiques thérapeutiques est indispensable. Plusieurs molécules ont pu être identifiées comme cible potentielle pour améliorer cette maladie, certaines ont été ensuite testées sur des cellules prélevées de patients. Notre étude a pour but de tester l'efficacité d'un médicament dans un modèle murin de syndrome de Barth. Nous allons évaluer son efficacité au niveau musculaire et cardiaque.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de l'efficacité d'un médicament pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel aucun traitement n'existe à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur des animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 5 mois maximum ; quelques secondes pour chaque geste) et un prélèvement de sang (5 minutes maximum sous anesthésie). Les souris subiront un test d'endurance sur tapis roulant qui consiste à faire courir l'animal en une vitesse de course de 10 m/min, sur une pente de 5% et pendant 15 minutes maximum. La semaine d'après, la fonction électrique et contractile du cœur sera évaluée, ces deux tests durent maximum 20 minutes par souris et ont pour but d’étudier la fonction cardiaque des souris.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés auront un phénotype dommageable (faible poids, problèmes cardiaques). Ils subiront des gavages pouvant provoquer des irritations du fait de la répétition. Ils devront courir sur un tapis de course et potentiellement subir des chocs électriques de faible intensité (3 maximum par session). Les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour passer des échographies cardiaques ou le prélèvement sanguin.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l'étude de phénomènes physiologiques et aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth. Les modèles cellulaires ne tiennent pas en compte de l'ensemble des interactions existantes au sein d'un organisme tout entier. L’utilisation d'un modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in-vitro, mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'Homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Cette variabilité induite dans le travail sur un modèle in vivo impose de travailler avec des effectifs minimums de 12 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux mutants et contrôles seront dans des cages séparées. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd davantage de 10% par rapport à son poids le plus haut, du gel alimentaire sera ajouté. En cas de perte de 20 %, l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement ou de locomotion de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajouté dans la cage. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Pendant l'échographie, une anesthésie gazeuse sera utilisée. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), le réflexe oculaire et l’hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Le gavage sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Nous avons une bonne expérience de gavage des animaux à long terme, cela n’ a pas entraîné de problèmes jusqu’à présent.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à être pris en contention - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines, il est idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours) et nous disposons du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très bien maîtrisé en termes de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie. Les animaux mâles seront utilisés dès le sevrage. Jusqu’à l'âge de 3, 4 ou 5 mois en fonction de l'efficacité du médicament. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéressant de pouvoir commencer le gavage du médicament au plus tôt.

Le crâne ouvert pour poser une plaque de fixation puis percé lors d'une craniotomie, 340 souris sont maintenues tête fixée pendant des séances d'enregistrement cérébral d'une à deux heures. Cinquante autres subissent en plus une destruction de l'oreille interne, par chirurgie pour trente-cinq d'entre elles et par administration d'un produit toxique pour les quinze restantes, dans des procédures classées sévères. Le porteur reconnaît des dommages osseux et tissulaires, une douleur possible, une perte de poids, une immobilité et des comportements anormaux, tout en fixant à un jour la durée typique de récupération après une opération. Les 390 souris finissent tuées par perfusion à travers le cœur, pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre l’intégration multisensorielle, dans les structures du cerveau qui sont impliqués dans l'orientation. Une meilleure compréhension des fonctions cognitives comme l'orientation dans l'espace et dans le temps est un défi majeur en neuroscience. Le cerveau joue un rôle important dans l’orientation spatiale et la mémoire. Les régions qui sont importantes pour l'orientation et la mémoire sont particulièrement affectée dans la maladie d’Alzheimer, et de l’épilepsie. La myéline est la substance blanche qui est déficiente dans le cas de la sclérose en plaque. Notre recherche vise à élucider la connectivité fonctionnelle entre les différentes régions du cerveau, et à révéler la coordination temporelle des signaux électriques dans le cerveau. Nous souhaitons mieux comprendre comment les informations vestibulaires et visuelles sont intégrées pour préserver l'orientation spatiale de l'individu. Nous examinerons la flexibilité du réseau pour la mise à jour du signal de l'orientation. Et nous allons apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la substance blanche pour la communication entre les différents régions du cerveau.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l’environnement. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’intégrer les informations sensorielles venant de plusieurs modalités sensorielles, et comment s’effectue la mise à jour de ces informations du monde externe, par rapport à une représentation interne. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures du circuit de l’orientation spatiale est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements cognitifs et à des déficits d'orientation. Une partie du projet vise à déterminer l'impact de la substance blanche, pour mieux comprendre son rôle pour l'intégration multisensorielle. De plus, chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, des troubles cognitifs sont associés à des lésions de régions cérébrales impliquées dans l'intégration multisensorielle. Nos travaux pourront apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes pathologiques des déficits dans la sclérose en plaques.

Procédures

Un lot d'animaux (340 animaux) subira deux chirurgies. La première chirurgie (installation de la plaque de fixation et injections) dure environ 1h. Le lendemain, et pendant 2 jours, une habituation à la fixation de la tête (15 minutes) est effectuée. Une craniotomie est réalisée le jour suivant (durée: 30 minutes). Les enregistrements de l'activité du cerveau commencent le lendemain, et durent 1-2 heures par séance (total: 1 - 3 séances, à un rythme de 1 séance par jour). Finalement, suite à la dernière séance, une perfusion par le coeur est effectuée. Un lot d’animaux (50 animaux) subira en plus une lésion de l'oreille interne. De ces 50 animaux, 15 animaux subissent une lesion pharmacologique. Une substance qui est toxique pour l'oreille interne est administré. Les autres 35 animaux subissent une chirurgie. Cette intervention dure 30 minutes. Après 2 jours de récupération, on perce le crâne, pour poser une sonde d'enregistrement électrique. Finalement les animaux subissent une chirurgie terminale sous anesthésie pour le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les injections dans le cerveau prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments contre la douleur et l'inflammation. La durée typique de récupération après une opération est de 1 jour, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. Des chirurgies potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées pour induire un déficit de l'oreille interne; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements pour supprimer ou atténuer la douleur sont mis en place. Les souris peuvent présenter des déficits de l'audition. Le protocole des stimulations sensorielles nécessite que les souris soient maintenues tête fixe. La fixation de la tête va initialement induire un stress chez l'animal et réduire sa mobilité. Afin qu'il s'habitue au dispositif, plusieurs séances d'entrainement d'une durée de 15 min seront réalisées pendant les 2 jours précédant la première séance d’enregistrement. Le temps expérimental n’excède pas 120 min.

Devenir

Tous les 390 animaux sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques.

Remplacement

L’intégration des signaux visio-spatiale implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, et l’effet de la myélinisation sur la maturation et la coordination entre les aires du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude prévoit d’enregistrer un grand nombre de neurones depuis un seul animal, grâce à des sondes de haute densité. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour 2 ou 3 sessions d'enregistrement quand c’est possible. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Les animaux de la procedure 1 servent comme temoin pour les animaux de la procedure 2. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est contrôlé avant et après une chirurgie, et régulièrement pendant les phases de tests. Notre équipe a une grande expérience dans les lésions vestibulaires. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. Les souris transgéniques avec des déficits de la myélinisation sont disponibles, pour clarifier le rôle de la myélinisation pour la maturation des neurones et des circuits. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Pour les études sur les souris pendant la myelinisation, nous allons cibler différentes âges, depuis la période critique jusqu’à la maturité du système.

276 souris vont être utilisées, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : chaque nouveau-né, âgé de trois à six jours, subit une chirurgie du cerveau de trente minutes pour la pose d'électrodes et d'une barre de tête, puis deux heures d'enregistrement pendant son sommeil. En amont, les mères gestantes sont opérées de l'abdomen pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne. Le porteur range parmi les effets indésirables la douleur, le stress et la faim des nouveau-nés, et le stress ou la douleur des femelles. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour localiser les électrodes, l'apport annoncé étant de servir de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.

Objectifs

Après la mise en place des neurones de l'embryon, le cerveau subit un processus de maturation spécifique impliquant des activités spontanées,ne dépendant pas de stimuli externes à l’individu. Chez l’homme ce processus de maturation se met en place lors du 3e trimestre de grossesse, chez le rongeur, lors des deux premières semaines Post-Natales (PN). Ces activités néonatales (ANs), orchestrées par une catégorie spécifique de neurones, jouent un rôle important dans la mise en place des circuits du cérébraux et leurs fonctions ultérieures. Cependant les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sont sujets à controverse. Cette question est d’autant plus importante qu’il existe des pathologies neurologiques graves avec retard mental et épilepsies affectant les enfants dès la naissance. Or, une majorité de ces pathologies affectent de façon directe ou indirecte la classe de neurones qui orchestrent ces ANs. Notre but est donc de comprendre, pendant la première semaine de vie comment s'organise l'activité de ces neurones chez la souris en développement et de comprendre quelle est leur influence sur la mise en place des circuits. Pour ce faire, nous utilisons une technique de biologie moléculaire qui nous permet d'activer ces neurones à la demande par la lumière lors des enregistrements de l'activité cérébrale de la souris nouveau-née en sommeil.

Bénéfices attendus

Pour mieux comprendre comment, dans la période qui entoure la naissance, le cerveau se prépare aux premières expériences sensorielles, il est important de déterminer le rôle respectif des grandes classes de neurones dans la maturation du cerveau et de ses circuits. La théorie en vigueur sur l'action d'une certaine classe neurones (neurones inhibiteurs) à ces âges précoces est de plus en plus remise en cause, ce qui nous interroge sur les mécanismes fondamentaux du développement du cerveau. Or, des dysfonctionnements de cette même classe de neurones sont impliqués dans un tres grand nombre de troubles neurologiques infantiles (troubles du spectre autistique, épilepsies, retard mental). En déterminant la fonction de cette classe de neurones lors du développement du cerveau sain, cette étude servira donc de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.

Procédures

Un groupe de souris gestantes, porteuses des embryons à traiter, subira une chirurgie abdominale sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Leurs embryons, sous l'influence de ces traitements, subiront une injection intracrânienne. Après la naissance ces animaux subiront une chirurgie du cerveau (30 minutes) afin de préparer le placement d'électrodes et d'une barre de tête. Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Une demi-heure plus tard, toujours sous analgésie, l'activité cérébrale sera enregistrée pour un maximum de 2h alors que la souris nouveau-née dort.

Impact sur les animaux

La chirurgie des nouveau-nés peut avoir des effets indésirables, tels qu'une douleur, un stress ou la faim. La chirurgie des souris gestantes peut induire du stress ou de la de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem pour prendre des images des structures cérébrales et reveler la localisation des electrodes.

Remplacement

L'étude des activités neuronales dans la periode de la naissance nécessite l'observation de systèmes neuronaux intacts, en phase de sommeil lent et d'être correlés aux activités motrices de l'individu (contractions spontanées ou sursauts physiologiques du nourisson). Il est donc impossible de la réaliser sur un modèle informatique ou les modèles récents d'alternative à l'experimentation animale (s cellules souches). La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles). A ce jour, aucune étude n'a été faite pour enregistrer et manipuler par électrophysiologie et optogénétique l’activité cérébrale des souris nouveau-nées. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles transgéniques qui nous intéressent ne sont disponibles que chez la souris. La souris présente aussi davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale et la facilité d'élevage.

Réduction

Les chirurgies sont réalisées sous anesthesie gaseuse, locale et sous analgésie pour réduire au minimum la souffrance potentielle causée par ces procédures. Les enregistrements des nouveaux-nés sont ausi faits sous analgésie. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet d’enregistrer un grand nombre de neurones, sur de multiples sites simultanément. Ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont preparés par petites series de 4 ou 5 (une portée à la fois) et les resultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procedure s'arretant des que le nombre d'animaux requis est atteint. Nous utilisons à la fois des males et des femelles. Le nombre d'animaux à utiliser a été déterminé par calculs statistiques (calculs de puissance) établis sur la base de données publiées par notre groupe et d'autres laboratoires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle (température, luminosité, cycle jour-nuit et hygrométrie contrôlée) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’hébergement respecte les groupes sociaux. Les animaux font l'objet d'un suivi quotidien par les expérimentateurs et les zootechniciens, et leurs conditions d'hébergement sont enrichies (matériaux pour nidification, tunnels, dômes). Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué réguliérement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Nous procédons à un suivi post-opératoire lors duquel le bien être des animaux est évalué et traité (anesthésie et analgésie appropriée). Les nouveau-nés, sont maintenus en condition proche de celles de la portée, (maintien de la température corporelle, contension légère avec du cotton , nourrissage de lait maternisé).

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser les pathologies neurologiques du développement, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilite d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liée aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). Ceci nous permet d'apporter des connaissances complémentaires à la communauté scientifique et permet une reproduction idéale des résultats. Enfin, les patrons électrophysiologiques des souris nouveau-nées sont fortement similaires à ceux observés chez l'enfant prématuré et le nourrisson. Les souris sont étudiées entre 3 et 6 jours post-nataux, inclus.