Procédures sévères

La veille de l'opération, chaque souris subit un prélèvement de sang et une épilation de la zone à ouvrir. Le lendemain, sous anesthésie gazeuse, les expérimentateurs exposent l'artère en sortie du cœur et la rétrécissent, puis recousent l'animal au bout d'une demi-heure. Suivent vingt-huit jours de défaillance cardiaque installée, avec une échographie hebdomadaire sous anesthésie dans un second laboratoire, une mortalité attendue de 20 % à l'opération puis de 5 % pendant la procédure. Les 252 souris de ce second volet, comme celles du premier, sont tuées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, pour que leur cœur et leur sang soient analysés.

Objectifs

Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude d'une protéine vasculaire qui est impliquée dans le changement de morphologie d'autres organes mais dont le rôle dans l'insuffisance cardiaque n'a pas été exploré. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons ce modèle à des souris qui produisent, et à d'autres qui ne produisent pas (souris modifiées génétiquement) notre protéine d'intérêt, afin de les comparer. L'objectif de ce projet est ainsi de déterminer si celle-ci joue ou non un rôle dans l'évolution de l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si notre protéine d'intérêt s'avère être une cible potentielle, nous envisagerons de tester à la suite de ce projet des outils dont nous disposons au laboratoire et qui sont capables de la bloquer. Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie de rétrecissement du diamètre de l'aorte, estimée de l'ordre de 20%, ainsi qu'au cours des 28 jours de la procédure (environ 5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire pendant les 24h suivant la chirurgie, une perte de poids post-opératoire, stress possible lié aux échographies répétées.

Devenir

Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.

Remplacement

La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas notre molécule d'intérêt, ce qui permet d'étudier son rôle, comparativement aux souris qui la produisent normalement.

Une souris sur cinq environ ne survit pas à l'opération, le porteur chiffrant à 20 % la mortalité attendue lors du rétrécissement chirurgical de l'aorte et à 5 % les morts survenant pendant les vingt-huit jours suivants. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cœur et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La chirurgie dure une trentaine de minutes, elle expose l'artère à la sortie du cœur et la resserre, et l'évolution de la défaillance cardiaque est ensuite suivie chaque semaine par échographie. Le projet cherche à savoir si une protéine vasculaire joue un rôle dans l'insuffisance cardiaque, faute de traitement curatif existant, et le porteur écrit que ses résultats "pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine".

Objectifs

Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude d'une protéine vasculaire qui est impliquée dans le changement de morphologie d'autres organes mais dont le rôle dans l'insuffisance cardiaque n'a pas été exploré. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons ce modèle à des souris qui produisent, et à d'autres qui ne produisent pas (souris modifiées génétiquement) notre protéine d'intérêt, afin de les comparer. L'objectif de ce projet est ainsi de déterminer si celle-ci joue ou non un rôle dans l'évolution de l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si notre protéine d'intérêt s'avère être une cible potentielle, nous envisagerons de tester à la suite de ce projet des outils dont nous disposons au laboratoire et qui sont capables de la bloquer. Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie de rétrecissement du diamètre de l'aorte, estimée de l'ordre de 20%, ainsi qu'au cours des 28 jours de la procédure (environ 5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire pendant les 24h suivant la chirurgie, une perte de poids post-opératoire, stress possible lié aux échographies répétées.

Devenir

Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.

Remplacement

La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas notre molécule d'intérêt, ce qui permet d'étudier son rôle, comparativement aux souris qui la produisent normalement.

D'abord une échographie cardiaque de vingt minutes sous anesthésie, puis une opération de cent dix minutes pour provoquer un infarctus, puis des échographies à deux jours et à deux, quatre, huit, douze et seize semaines. Selon le groupe, chaque souris reçoit aussi jusqu'à vingt-six injections sous-cutanées. 1 504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, le porteur indiquant que l'insuffisance cardiaque installée provoque une baisse d'énergie, une perte de poids et un essoufflement modérés sur le long terme. Le bénéfice annoncé, un meilleur pronostic pour les patients ischémiques, reste au conditionnel, quand les seize semaines de défaillance cardiaque, elles, sont programmées.

Objectifs

L’infarctus cardiaque est caractérisé par une quantité de sang insuffisante transportée jusqu’au muscle cardiaque ce qui entraîne une réduction d’apport en oxygène aux cellules du cœur. Il est une cause importante du développement vers l'insuffisance cardiaque. Malgré des progrès significatifs dans la prise en charge des patients, l'insuffisance cardiaque continue d'avoir des taux de mortalité élevés. Avec une disponibilité limitée d'options de traitement, un pronostic précis reste un objectif thérapeutique important, en particulier dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le remodelage cardiaque, qui devrait avoir un effet protecteur contre le développement progressif vers l’insuffisance cardiaque. L'infarctus induit des modifications de la taille, de forme et de fonction du cœur qui sont considérées comme des indices précurseurs dans le développement de l’insuffisance cardiaque. Par conséquent, il est primordial de clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de comprendre le développement de l'insuffisance cardiaque et d'améliorer le pronostic des patients atteints d’un infarctus du myocarde. Dans ces conditions, notre projet vise dans un premier temps à corréler la dysfonction du coeur, aux différentes atteintes tissulaires et cellulaires après un infarctus. Dans un deuxième temps, différentes stratégies seront testées pour proposer de nouveaux traitements pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de notre projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre aux besoins des cliniciens et des chercheurs sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l’insuffisance cardiaque après un infarctus. 2) Élaborer la preuve de concept de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’en expliquer les mécanismes. À terme, la compréhension de la pathologie de l’insuffisance cardiaque grâce à notre approche qui combine plusieurs niveaux d’analyses (fonctionnelle et structurelle), devrait aider à concevoir des stratégies thérapeutiques pertinentes pour traiter précocement les patients ischémiques et éviter d’évoluer vers une insuffisance cardiaque sévère invalidante.

Procédures

Les animaux insuffisants cardiaques seront suivis jusqu’à 16 semaines. Chaque animal sera soumis sous anesthésie profonde à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 2 jours, 2-4-8-12-16 semaines postopératoire (20 min). Selon le groupe d’étude, les animaux recevront à la reperfusion : 1) une injection intracardiaque et intraveineuse de chlorure de sodium (1 minute, 2 injections totales) 2) une injection intracardiaque et intraveineuse de vecteurs viraux (1 minute, 2 injections totales) 3) une injection intracardiaque et intraveineuse d’un peptide (1 minute, 2 injections totales) 4) une injection sous cutanée du traitement classique contre l’insuffisance cardiaque (

Impact sur les animaux

La contention de l’animal induit un stress léger de courte durée. Les piqures de l’aiguille pour les traitements entrainent une douleur légère de courte durée. L’incision de la peau entraine une douleur légère de courte durée. L’incision musculaire entraine une douleur légère, de courte durée. Les piqures des sutures entrainent une douleur légère, de courte durée. Le réveil de l’animal après chirurgie entraine un stress léger, de courte durée. Le développement de l’insuffisance cardiaque entraîne une baisse d’énergie, une perte de poids et une dyspnée modérées à long terme.

Devenir

A l’issu des procédures 1 et 2 du projet, tous les animaux seront mis à mort par un personnel compétent pour effectuer les prélèvements et les analyses prévus dans le protocole.

Remplacement

L‘étude d’un modèle de souris d’insuffisance cardiaque mimant la pathologie clinique est cruciale pour comprendre la pathologie et mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans le processus de développement de la maladie. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux. Par ailleurs, l’isolement de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique. Le nombre d’animaux du projet de recherche tient compte également de la perte d’animaux liée au stress ischémique. Par conséquent, au maximum 1504 animaux seront utilisés dans ce projet pour caractériser finement le développement de l’infarctus vers l’insuffisance cardiaque et proposer de potentielles thérapeutiques. Une première cohorte aura pour but de tester le pouvoir thérapeutique des traitements testés sur la fonction cardiaque de l’animal. Le nombre d’animaux a été évalué à 32 animaux par groupe, soit pour 9 groupes (dont 1 groupe sham opéré), un total de 288 souris. En cas de réussite du traitement testé, une seconde cohorte sera envisagée pour déterminer les mécanismes moléculaires impliquées. Le nombre d’animaux a été évalué à 16 animaux par groupe (sauf les basales n=12) pour chacune des deux cohortes, soit pour 8 groupes, un total de 1216 souris au maximum. Les prélèvements prévus pour le dernier temps du protocole (16 semaines) seront issus des animaux en fin de protocole de la première cohorte, optimisant de ce fait les animaux étudiés. Pour chaque expérience des groupes homogènes d’animaux seront constitués pour permettre une évaluation statistique plus pertinente. Dans la mesure du possible, le groupe d'animaux utilisé pour l'étude de la fonction cardiaque va également contribuer à l'étude des aspects moléculaires.

Raffinement

Pour pallier toute perte de poids durant la première semaine d’hébergement après chirurgie, de la nourriture hydratée sera mise à disposition. La chirurgie utilisera une voie d’abord par une ouverture du muscle du thorax limitant la douleur et l’inflammation dues à la chirurgie. Le réveil de l’animal sera fait en couveuse, pour permettre une meilleure récupération après la chirurgie. L’utilisation de fils résorbable permettra une meilleure acquisition et quantification de la fonction cardiaque par échographie réduisant de ce fait la variabilité et le nombre d’animaux nécessaire pour montrer des différences statistiques. Les souris en expérimentation seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L'état général de la souris fera l'objet d'une observation minutieuse : aspect des yeux, apparence physique, modification du comportement et respiration. Tous ces signes, une fois combinés et pondérés par la grille de score, nous renseigneront sur le niveau de souffrance de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, dont la planification de protocole pour éviter le stress et la mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure utilisée. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection, l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.

Choix des espèces

La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Par ailleurs, pour la problématique de ce projet, tous les modèles ont déjà fait leurs preuves pour l’insuffisance cardiaque. Au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, la souris est largement utilisée pour étudier les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 10 à 16 semaines au moment de la chirurgie. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.

Deux gavages par jour, cinq jours par semaine, pendant quatre semaines, soit jusqu'à quarante administrations forcées par animal, après une infection par Toxoplasma gondii. 931 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélever le cerveau. En phase aiguë, le porteur indique que les souris peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, l'objet du projet étant de tester des molécules censées rendre les neurones infectés à nouveau détectables par le système immunitaire. Aucun analgésique ni anti-inflammatoire n'est prévu, y compris la buprénorphine, au motif que ces molécules modifieraient les résultats.

Objectifs

Toxoplasma gondii (T. gondii) est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des êtres humains on été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles sont incapables d’éliminer le parasite qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux. Plusieurs études suggèrent que des mécanismes d’échappement sont mis en place pour limiter la détection des neurones infectés par les lymphocytes T CD8+, ce qui favorise la persistence à long-terme du parasite dans le cerveau. L’infection chronique par T. gondii est problématique pour la santé car en cas d’immunosuppression, le parasite peut se réactiver et provoquer une encéphalite. De plus, un faisceau d’évidences récentes suggère que cette infection du cerveau, et la neuroinflammation chronique qui l’accompagne, perturbe les fonctions cognitives et accélère le déclin cognitif au cours de la maladie d’Alzheimer. Les traitements disponibles contre T. gondii sont efficaces contre la forme réplicative responsable de la dissémination au cours de l’infection aigue. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun traitement capable d’éliminer les formes enkystées, responsables de la chronicité de l’infection. Ainsi, ce projet vise à : (i) mieux comprendre les mécanismes moléculaires permettant à T. gondii d’échapper à la détection par les lymphocytes T CD8+ ; (ii) tester des molécules thérapeutiques pour lever les mécanismes d’échappement afin d’accentuer la détectabilité des neurones infectés par T. gondii vis-à-vis des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau et d’aboutir à une élimination (clairance) du parasite.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre (i) comment les formes persistantes de T. gondii dans les neurones interfèrent avec les neurones infectés pour limiter leur reconnaissance par les lymphocytes T CD8+, et (ii) à tester de nouvelles pistes thérapeutiques pour inverser les effets modulateurs du parasite dans le cerveau. Une meilleure compréhension des réservoirs parasitaires qui persistent en phase chronique de la toxoplasmose est essentiel car il n’existe actuellement aucun traitement contre les kystes. Cette forme latente du parasite peut se réactiver et causer une encéphalite potentiellement mortelle. De plus, l’infection latente chez l’immunocompétent est associée à des troubles neuropsychiatriques (e.g. schizophrénie), diverses altérations cognitives et une accélération du déclin cognitif. A terme, nos résultats pourraient identifier une nouvelle voie thérapeutique conduisant à l’élimination du parasite (clairance) en s’appuyant sur l’immunité naturelle des individus infectés et en rendant plus efficace l’action des lymphocytes T CD8+ dans le cerveau. Ce projet pourrait avoir des retombées majeures et bénéfiques sur la prise en charge des personnes à risque de développer une encéphalite (e.g. porteuses du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) ainsi que des individus touchés par des démences de type Alzheimer.

Procédures

Selon les procédures, les animaux seront infectés par : (i) injection intra-péritonéale, une fois ou (ii) gavage per os en 1 fois, qui est le mode naturel d’infection avec T. gondii. Ensuite, en phase chronique de l'infection, les animaux seront seront soumis à soit (i) des injections per os 2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine pendant 4 semaines, soit (ii) des injections intra-péritonéales à raison de 2 fois par semaine, pendant 4 semaines. A l'issue de ces procédures, les animaux seront éventuellement soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil, pour prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

La phase aigue de l'infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 pi (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Après récupération suit la phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents, ataxie) ne sont observés que dans les conditions ‘encéphalite’, rarement en condition latence. Dans les différentes conditions expérimentales que nous projetons de tester, nous nous attendons à observer un meilleur controle, voire une élimination, du parasite lors de la phase chronique, donc nous nous attendons à une moindre nuisance par rapport à l'infection controle. Enfin, les souris subiront des injections intrapéritonéales (i.p.) et des gavages (per os). Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes).

Devenir

Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo ou in vitro.

Remplacement

Notre projet se focalise sur les interactions entre le parasite Toxoplasma gondii et des cellules du système nerveux (neurones) et immunitaire (lymphocytes T CD8+), qui assurent la surveillance du parasite dans le cerveau. Au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas auparavant, nous cultivons maintenant les tachyzoïtes sur des fibroblastes humains, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En outre, nous avons dédié une partie du projet (cf procédure 1 sans réveil) à l’étude de ces phénomènes in vitro grâce à des cultures de neurones primaires, ce qui limite le nombre d’animaux infectés passant en procédure sévère. Ces expériences in vitro permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l'échappement immunitaire par les neurones infectés mais elles ne suffisent pas pour appréhender les conséquences réelles sur la physiopathologie de la toxoplasmose, ni la pertinence des traitements envisagés. Des infections expérimentales in vivo sont indispensables pour compléter ce projet car la complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il n’est actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (cf détails ci-dessous). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). Lors des phases plus sévères (phase aigue de l’infection), l'expérimentateur vérifiera le poids et apportera une aide à l’alimentation quotidiennement (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée (gel-diet et water-gel)). Il/elle évaluera aussi l'état de santé globale des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation de la santé d’un animal atteignant les points limites d’arrêt de la procédure définis plus haut. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ces molécules sont connues pour interférer avec les processus inflammatoires et pourraient donc modifier les résultats de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique (buprénorphine) ont des propriétés immunomodulatrices.

Choix des espèces

T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte tenu des nombreux outils qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’hôte et Toxoplasma gondii. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’être humain : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales.

1 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune portant une greffe de cancer du sein humain pendant treize semaines, avec seize séances d'imagerie sous anesthésie et treize prises de sang à la joue sur animal éveillé. La tumeur est mesurée deux fois par semaine, les traitements sont injectés dans la veine de la queue ou directement dans la tumeur sans anesthésie, et le porteur attend douleurs, difficultés à se déplacer, lésions aux points d'injection et métastases pouvant provoquer gêne respiratoire et atteinte du foie. Toutes sont tuées à treize semaines, ou plus tôt si un point limite terminal est atteint, pour prélever la tumeur et les organes. Le bénéfice annoncé, un transfert vers la clinique "dans un futur proche" pour des cancers du sein métastatiques sans solution, reste au conditionnel, quand l'atteinte est immédiate et déclarée sévère pour les 1 880 animaux.

Objectifs

Il n’existe aucun traitement efficace pour traiter les patients atteints de cancer du sein avec métastases. Les objectifs du projet sont donc de développer de nouveaux médicaments capables de cibler la tumeur primaire ainsi que les métastases dans les cancers du sein. En particulier les objectifs de ce projet sont de proposer de nouvelles thérapies innovantes seules ou en combinaison avec des drogues de chimiothérapie pour proposer un traitement efficace de ces cancers du sein pour lesquels il y a un réel manque de solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le nombre de nouveaux cas devrait augmenter au cours des prochaines décennies. C’est ainsi que l’apparition de métastases dans les cancers du sein très aggressifs est la principale cause de décès et ces cancers très agressifs sont ceux qui bénéficient le moins des thérapies ciblées. Malgré le développement de nouvelles stratégies, des traitements efficaces sont encore en devenir pour les cancers dits métastatiques. Des approches thérapeutiques innovantes, guidées par des découvertes fondamentales, sont nécessaires d'urgence pour répondre à cette problématique. Notre projet permettra de tester et valider de nouveaux médicaments efficaces contre le cancer du sein métastatique pour permettre dans un futur proche un transfert vers la pratique médicale en clinique aux bénéfices des patients atteints de cancer du sein métastatique en réel manque de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les souris, sous anesthésie, recevront une injection unique sous la peau au niveau de la glande mammaires des cellules de cancer du sein humain (durée 30s). Un suivi de la taille de la tumeur sera réalisé 2fois par semaine (2 minutes). Cinq semaines après l’injection des cellules tumorales, les souris seront analysées en imagerie après une injection d’un produit de contraste au niveau de l’abdomen (sous anesthésie, durée 10 min) 2 fois par semaine pendant 8 semaines. En fonction des groupes d’animaux, deux traitements seront administrés avec des dosages, modes d’administration (dans la veine de la queue, sans anesthésie; durée 30 secondes ou au niveau de la tumeur, sans anesthésie; durée 30 secondes) et durées différents. Une prise de sang au niveau de la joue sur animal éveillé sera réalisée 1 fois par semaine pendant 13 semaines (durée 30s, sans anesthésie).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules tumorales peut entrainer une douleur de courte durée au site d'injection. Lors du développement d’une tumeur au niveau de la glande mammaire, il peut en découler une douleur et lorsque la tumeur grossira une éventuelle difficulté de locomotion. Les souris peuvent aussi présenter du stress lié à la mesure répétée de la taille de la tumeur (2 fois par semaine), l'injection répétée des traitements et les anesthésies répétées pour les séances d'imagerie. Les injections répétées des traitements peuvent également générer une douleur et des lésions au niveau du site d'injection. L’apparition de métastases pourrait engendrer de la douleur, une difficulté respiratoire, éventuellement une atteinte hépatique. Le prélèvement sanguin peut être source de stress et pourrait entrainer une hémorragie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit à la fin de la procédure (13 semaines après le début) soit de manière anticipée si atteinte d’un point limite terminal. Post-mortem, des prélèvements de la tumeur primaire et des différents organes des souris seront effectués pour analyser la présence et contenu des cellules tumorales.

Remplacement

Le modèle murin de cancer du sein que nous utiliserons reproduit la physiopathologie de la progression du cancer du sein que l’on retrouve chez la femme avec tout d’abord une croissance de la tumeur, puis l’apparition de métastases. Ce modèle animal entier vivant permet aussi de reproduire la biodistribution des traitements que l'on retrouve dans le corps humain. Les interactions des cellules cancéreuses avec l’hôte (ici la souris) ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire. Nous avons réalisé au préalable le maximum d’expériences in vitro avec des cellules humaines dans des tubes à essai. Néanmoins, l’utilisation d’animaux est indispensable car malheureusement la capacité de former des métastases ne peut pas être évaluée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum après estimation des effectifs basée sur les données antérieures du laboratoire et une simulation statistique afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables.

Raffinement

Nous serons attentifs au bien-être des animaux en veillant à ce que les animaux soient maintenus autant que possible en groupe dans un environnement agréable et stimulant grâce à leur mise disposition des carrés de coton et des tunnels en carton. Tout au long du déroulement de l’expérience, une surveillance quotidienne (visuelle) sera effectué ainsi qu’une observation systématique de l’état clinique (3 fois par semaine) des souris utilisées sera assurée. L’état des animaux sera scrupuleusement évalué grâce à une grille de critères d’observation prédéfinis qui dirigerons la mise en place d’actions spécifiques en cas de souffrance. L’injection de cellules tumorale sera fera sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques. L’imagerie de l’apparition des métastases sera faite sous anesthésie gazeuse. En cas de signes d'affaiblissement de la souris, nous ajouterons de la nourriture humidifiée dans la cage. Si la tumeur présente une zone de nécrose, un traitement local avec un anti-douleur sera mis en place juste avant l'injection des traitements anti-cancéreux. En cas de lésions liées aux injections répétées, la zone sera désinfectée et la cicatrisation surveillée. Si l'état de la souris ne s'améliore pas en 24h, l'euthanasie sera réalisée.

Choix des espèces

Nous utilions dans ce projet des souris, car le modèle de cancer du sein est bien décrit dans la littérature scientifique et les nouvelles thérapies peuvent y être testés avec la possibilité d'utiliser des voies d'administration similaire à celles réalisées chez les patientes. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 8 semaines, âge à partir duquel les souris sont sexuellement matures et considérées comme jeunes adultes. Cela correspond à la période au stade de développement chez la femme de ce type de cancer.

Pour vérifier si le microbiote intestinal de souris âgées transmet une sensibilité accrue aux infections respiratoires, 1 653 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Trois semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, un gavage de matières fécales sur animal éveillé, puis une infection par le pneumocoque ou le virus grippal déposée dans le nez sous anesthésie générale. Le porteur prévoit la mise à mort vingt-quatre heures après le pneumocoque et quatre jours après la grippe, en indiquant que ce calendrier précède l'apparition des signes cliniques, tout en décrivant une perte de poids qui commence dès le deuxième ou le troisième jour. Au-delà de ces délais peuvent survenir prostration, tremblements, respiration laborieuse et hypothermie, et une perte de poids de 20 % déclenche la mise à mort.

Objectifs

Les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Des travaux récents montrent que le microbiote intestinal intervient dans les mécanismes de défense contre les infections, dont les infections respiratoires. Le microbiote intestinal produit de nombreux métabolites qui diffusent dans le sang et activent le système immunitaire dans les poumons. La fonction du microbiote intestinal (dysbiose) chute avec l’âge. Nous proposons que la dysbiose liée à l’âge participe à la susceptibilité des personnes âgées aux infections respiratoires virales et bactériennes. A notre connaissance, cette hypothèse de travail n’a pas encore été étudiée. Afin de valider cette hypothèse, notre premier objectif sera de démontrer que le microbiote intestinal isolé de souris âgées transmet une susceptibilité accrue à l’infection chez des souris receveuses jeunes. Pour cela, des expériences de transfert de flore fécale seront réalisées. Brièvement, des souris dépourvues en flore intestinale ou préalablement traitées avec une large gamme d’antibiotiques (afin d’éliminer le microbiote résiduel) recevront du microbiote (fèces) de souris âgées ou de souris jeunes. Les souris colonisées seront ensuite infectées avec le pneumocoque (première cause de pneumonie bactérienne chez l’homme) ou le viral grippal. Nous déterminerons la charge bactérienne et virale dans les poumons. Nous nous attendons à ce que les souris ayant reçu le microbiote de souris âgées soient plus sensibles à l’infection par rapport aux souris ayant reçu le microbiote de souris jeunes. Nous déterminerons la composition du microbiote et quantifierons les métabolites microbiens (fèces et sang) des souris colonisées. Nous corrélerons ces données avec les paramètres infectieux. Cela nous permettra d’identifier des candidats potentiellement impliqués dans la défense contre l’infection. Les candidats identifiés seront ensuite testés dans nos modèles d’infection. La demande concerne la procédure de colonisation des souris, le suivi des souris colonisées, l’infection des souris avec le pneumocoque ou le virus grippal, la quantification de la charge infectieuse et l’analyse des mécanismes immunologiques sous-tendant la susceptibilité à l’infection. La demande concerne également des procédures expérimentales visant à valider les candidats à potentiel thérapeutique issus de nos recherches. Il pourra s'agir de métabolites dont la production chute massivement chez la souris/individu âgé(e).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre pourquoi les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Ce projet pourrait permettre d’identifier des métabolites microbiens (dérivés du microbiote intestinal) capables, à distance, d’activer certaines cellules du système immunitaire et de favoriser la défense contre les infections respiratoires. Outre l’intérêt fondamental, des retombées thérapeutiques sont attendues de ce projet.

Procédures

Le traitement aux antibiotiques (ajoutés dans l’eau de boisson) durera trois semaines. La colonisation des souris sera réalisée par gavage sur animaux vigiles. Les souris seront infectées deux à trois semaines après colonisation. L’infection sera réalisée par voie intra-nasale sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant l’apparition des signes cliniques liés à l’infection (24 heures près l’infection par le pneumocoque et 4 jours après infection par le virus grippal). Ce choix maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour le traitement, en fonction de la nature du ou des métabolites, ces derniers seront administrés par gavage ou dans l’eau de boisson. Les doses correspondront à des doses physiologiques. Outre les paramètres cliniques, des études de pharmacocinétique et de biodistribution seront menées par prélèvements de sang et dans différents organes.

Impact sur les animaux

Un stress momentané est possible suite à la colonisation (gavage sur animaux vigiles). Dans nos conditions expérimentales, les animaux infectés par le virus grippal commencent à perdre du poids à partir du 3ème jour. Le sacrifice a lieu 4 jours après l’infection, avant l’apparition des signes cliniques. Lors de l’infection par le pneumocoque, les animaux commencent à perdre du poids au 2ème jour. La mise à mort des animaux a lieu 1 jour après l’infection. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Des signes sévères de mal-être post-infection peuvent aussi survenir au-delà de 5 jours (virus grippal) et de 2 jours (pneumocoque) tels que la prostration, tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie, et perte de poids.

Devenir

Les animaux sont euthanisés selon la procédure en vigueur à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les expériences ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par le pneumocoque ou le virus grippal et de l’efficacité des transferts de flore nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. Suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets des transferts de flore fécale ne peuvent être évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.

Réduction

Il n’existe pas de méthode de substitution pour étudier les effets physiopathologiques de l’infection par le virus grippal ou le pneumocoque et pour évaluer l’efficacité de médicaments lors de l’infection. Il en est de même pour l’étude du microbiote intestinal et de ces interactions avec les cellules immunitaires du poumon. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’informations. Le modèle souris est particulièrement pertinent pour ce type d’étude.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par (i) la mise au point de procédures rigoureuses, (ii) la formation du personnel, (iii) un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (iv) le recours à des procédures non invasives et non douloureuses. Pour les procédures induisant une douleur, les animaux seront anesthésiés. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant la durée de l’étude. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Tout signe éventuel de détresse (signes sévères) incluant prostration, changement du comportement de l’animal (diminution des soins, animal prostré), tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie fera l’objet d’une attention particulière. Si une perte de poids supérieure à 20% survenait, ou un signe évident de souffrance, les animaux concernés seront euthanasiés selon la procédure en vigueur. Les points limites sont définis selon les directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, hypothermie, problèmes ambulatoires, accès à la nourriture et à l’eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie etc. Afin de réduire le stress, le milieu sera enrichi avec du matériel de nidification. Les procédures sont réalisées dans une zone calme différente de la pièce d’hébergement. Les animaux seront manipulés avec délicatesse (de préférence par le même expérimentateur). Outre le respect de la règle des R, ces précautions sont importantes pour éviter tout biais sur les résultats expérimentaux.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour modéliser les infections respiratoires. Par ailleurs, même si la composition du microbiote varie entre une souris et un humain, il y a de nombreux points communs sur leur activité métabolique, notamment les produits issus de la fermentation. De nombreux métabolites communs sont retrouvés chez la souris et l’homme.