Procédures sévères
Etudes d’efficacité d’un médicament destiné aux chiens ou chevaux par administration de l’agent pathogène chez des espèces non-cibles ou production de l’agent pathogène
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Hamsters dorés : 425
Cochons : 50
825 animaux non-humains, souris, hamsters dorés et porcs, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils reçoivent des agents pathogènes, dont Bordetella, la leptospirose, la leishmaniose ou le tétanos, y compris des essais de dose létale 50 où la mort d'une partie des animaux est le critère mesuré. Le porteur décrit des tableaux cliniques incluant état moribond, perte de poids de plus de 20 %, respiration agonique et crampes généralisées, qui déclenchent la mise à mort. Il justifie ces épreuves par une exigence réglementaire et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable".
Objectifs
Pour démontrer l’efficacité d’un produit contre un agent pathogène, la mise au point d’un modèle d’épreuve est indispensable. L’épreuve correspond à l’administration de l’agent pathogène pour reproduire, de manière expérimentale, la pathologie le plus fidèlement possible à la réalité. Une étape intermédiaire dans les études d’efficacité est de développer des tests analytiques ainsi que de produire et caractériser l’agent pathogène. Pour certains pathogènes il est nécessaire d’utiliser un système in vivo. L’objectif final d’une étude est de déterminer le ou les effet(s) bénéfique(s) du produit lors de l’épreuve. Justification règlementaire : Les études d’efficacité par administration de l’agent pathogène sont des obligations règlementaires (Pharmacopée Européenne et autres règlementations applicables) pour déposer un dossier d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) d’un médicament. L’utilisation d’espèces alternatives est une demande exigée par la Directive Européenne 2010/63/UE, afin de choisir des méthodes susceptibles de produire les résultats les plus satisfaisants et de causer le moins de douleur, de souffrance ou d’angoisse. Cette justification est valable lors du développement et de la réalisation de tests analytiques utilisant des animaux, de la production de souche d’épreuve ou du produit, détermination de la dose létale 50. Justification scientifique : En fonction de l’évolution des connaissances, il n’existe pas de méthode alternative plus adaptée pour la production de souche, le développement de modèle d’épreuve et la réalisation des tests analytiques.
Bénéfices attendus
L’intérêt final des études (réalisées selon les procédures expérimentales décrites ci-après) est de permettre de développer ou de contrôler des produits efficaces contre des maladies infectieuses.
Procédures
L’administration de différents produits est réalisée, ce qui est un acte technique de courte durée dont la voie et les modalités dépendent du produit administré et de l’espèce (cf. procédure spécifique). Lors des procédures, des prélèvements peuvent aussi être réalisés (écouvillons nasaux, prise de sang, prélèvements organes post mortem…). La fréquence, le volume et le nombre de ces derniers dépendent également de l’espèce, de la pathologie étudiée et de l’objectif expérimentale. Chaque acte est justifié d’un point de vue scientifique et/ou règlementaire. Lorsque l’anesthésie n’est pas plus traumatisante que l'acte en lui-même pour l’animal, une sédation peut être réalisée pour les différents actes décrits ci-dessus. Le choix de la sédation sera dépendant de l’espèce et de la durée de la procédure à réaliser. Cette décision sera prise par des vétérinaires compétents, disposant des connaissances nécessaires pour réaliser le choix le plus approprié. Lors de l’administration de souche d’épreuve, le suivi réalisé engendre une contention (pesée, observation des signes cliniques) à une fréquence adaptée aux pathologies. Les durées approximatives des phases d’épreuve sont comprises entre 2 et 15 jours environ. Durant cette période, une surveillance accrue des animaux entraine une manipulation fréquente des animaux pour veiller à la détection des points limites. Les actes sont réalisés par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une contention adaptée pour que le geste sur l’animal soit le moins douloureux et le moins stressant pour ce dernier.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie chez l’animal peut donner lieu à des signes cliniques provoquant une contrainte ou une douleur à l’animal. L’administration de produits ainsi que les prélèvements peuvent aussi engendrer un stress. Pour limiter la douleur potentielle ou le stress induit par ces actes, les procédures sont réalisées par des opérateurs hautement qualifiés qui assurent une approche et une contention adaptées à chaque animal. Une tranquillisation\anesthésie\analgésie de l’animal peut être réalisée si nécessaire. Des signes cliniques, liés au développement des pathologies peuvent également apparaitre. Un suivi clinique adapté (fréquence augmentée dès l’apparition de signes cliniques) est réalisé de manière à détecter des signes comportementaux anormaux (spontanés ou provoqués) et/ou des anomalies physiques et assurer une prise en charge rapide des animaux. Des points limites spécifiques sont définis en fonction des pathologies étudiées (comme visible dans le tableau ci-dessous – liste non exhaustive) entrainant une euthanasie de l’animal par un opérateur qualifié. Procédure étudiée Etat Moribond (animal prostré, dos voussé, reins creusés, pas de réponses aux stimulis) Gain ou perte de poids anormal Dégradation importante de l’état général (animal isolé, sale, apathie, immobile) Difficultés motrices, paralysies, (corps cambrés, pattes écartées) Autres Epreuve Bb chez le porc x (perte de poids >20% ; anorexie > 3 jours) x (absence de réponse aux stimuli) Respiration agonique ; comportement anormal (automutilation, décubitus permanent, stéréotypie…) Epreuve Leptospirose chez le hamster X Epreuve Leishmania chez le hamster X x L’état clinique est frustre mais en cas de détection de signe → Pesée Epreuve Rhinopneumonie équine chez le hamster X x Epreuve Bb chez la souris X x x Déshydratation DL 50 Bb chez la souris X x x Déshydratation Titrage Ac anti-tétanique sur la souris X x x Crampes généralisées De manière générale, tout tableau clinique évocateur d’une souffrance de l’animal entraine, en fonction de l’anomalie, l’euthanasie, l’exclusion de l’étude et/ou un traitement. Les critères sont en constante évolution pour les améliorer afin qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires (bibliographie et pratiques en vigueur).
Devenir
Les animaux atteignants des points limites après administration d’un agent pathogène sont euthanasiés pour raison éthique. De même, des animaux pour lesquels des prélèvements terminaux sont requis sont euthanasiés. Et lors de l’administration d’agents pathogènes nécessitant des zones de confinement spécifiques, les animaux entrés dans ces zones ne peuvent pas ressortir par mesure de sécurité pour l’environnement et les différents opérateurs. Ainsi, toutes les procédures de ce projet amènent à une euthanasie à la fin des procédures pour 100% des animaux.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le recours à l’espèce animale est, à l’heure actuelle, une exigence règlementaire. Ce recours est indispensable pour observer le plus fidèlement possible les effets sur les espèces cibles qui pourront bénéficier de ces traitements.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives. De plus, dans certaines études d’efficacité, plusieurs produits sont testés en parallèle de manière à mutualiser le groupe témoin ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des points limites spécifiques à chaque pathologie ont été définis afin de limiter le plus précocement possible la douleur des animaux. Ces critères sont en constante évolution de manière à ce qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie et une analgésie peuvent être réalisées lors de certains actes si nécessaire. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et stabiliser leur état physiologique. La durée optimale est de 7 jours (au minimum 4 jours pour les porcs et 2 pour les rongeurs). Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux. La mise en place des revues rétrospectives est un outil permettant la remontée d’informations (positives comme négatives) menant à l’amélioration continue du bien-être animal et des techniques utilisées à ces fins.
Choix des espèces
L’utilisation d’espèces alternatives s’inscrit dans l’exigence de la Directive Européenne à utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, souffrance, de l’angoisse et de subir des dommages durables tout en ayant une extrapolation optimale des résultats sur l’espèce ciblée. Dans le cas du porc, Bordetella bronchiseptica est un pathogène naturellement présent chez cette espèce et la symptomatologie est comparable à celle du chien. Par ailleurs, de la bibliographie est disponible sur ce modèle expérimental, ce qui est en faveur de sa robustesse. Pour les rongeurs, les souris et hamsters sont des modèles sensibles aux agents virulents administrés, qui sont démontrés par la bibliographie. Les animaux sont inclus dans une procédure à la fin de leur sevrage : - 4 semaines au minimum pour les porcs - 21 jours au minimum pour les rongeurs (souris et hamsters) Pour les procédures utilisant des rongeurs, le sevrage est effectué à 21 jours. Le modèle est bien décrit chez les animaux de cet âge et qu’il s’agit d’un standard reconnu (bibliographie, avis d’expert…).
Étude des fonctions génétiques et des caractéristiques épigénomiques des noyaux musculaires à la jonction neuromusculaire et à la jonction myotendineuse à l’aide d’AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des virus injectés dans le muscle ou l'abdomen réduisent chez ces souris l'expression de gènes propres aux jonctions entre muscle et nerf ou entre muscle et tendon, et le porteur prévoit, si ces gènes comptent, des "symptômes liés à une déficience" de ces jonctions. 2 832 souris vont être utilisées, 2 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 272 à un niveau léger, avec pour une partie des tests de force de préhension (String, Grip, Hanging) chaque semaine pendant sept semaines, et un entraînement sur Rotarod ou tapis roulant pour certaines. Le porteur décrit ces tests comme des procédures "durant lesquelles les souris ne souffrent pas" et affirme que les injections et tests "ne causeront pas d'effets indésirables", tout en prévoyant une surveillance de la paralysie des membres postérieurs et de la nourriture en gel pour les souris qui peinent à manger. Toutes sont tuées pour des biopsies musculaires, certaines sous l'anesthésie d'une mesure de force contractile dont elles ne se réveillent pas.
Objectifs
Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées. Les noyaux situés dans la partie centrale des cellules musculaires sont en contact avec les motoneurones. Cette région est appelée la jonction neuromusculaire (JNM). La contraction de nos muscles commence au niveau de la JNM lorsque les motoneurones stimulent les cellules musculaires. Une JNM défectueuse est observée dans diverses maladies musculaires et peut entraîner de nombreux symptômes dévastateurs. Les noyaux situés aux extrémités des cellules musculaires sont en contact avec les tendons. Cette région est appelée jonction myotendineuse (JMT). Elle est responsable de l'amortissement de la force contractile du muscle. La JMT est la partie la plus touchée par les blessures lorsque nous faisons de l'exercice et revêt donc une grande importance pour la régénération et la réadaptation musculaires. Ces régions sont toutes les deux essentielles au bon fonctionnement du muscle squelettique, et il est nécessaire de mieux comprendre leur fonctionnement. Récemment, mon équipe a identifié de nombreux gènes qui ne sont exprimés que dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Cette découverte nous offre une nouvelle opportunité d'étudier la biologie de ces deux jonctions. Sur la base de ce contexte, nous avons deux objectifs dans ce projet. 1) Nous allons étudier les fonctions des gènes spécifiques de la JNM ou de la JMT que nous avons découverts. Nous injecterons dans le muscle des virus porteurs de petites séquences d’ARN ciblant les gènes d’intérêts qui réduiront leur expression lorsqu'ils sont présents dans une cellule. Si ces gènes jouent un rôle important dans la fonction de la JNM ou de la JMT, la perte de son expression entraînera des symptômes liés à une déficience de l’une ou l’autre de ces jonctions. 2) Nous isolerons des noyaux au niveau de la JNM ou de la JMT pour étudier plus en détail l'organisation des structures dans ces noyaux. Cela nous permettra de comprendre comment ils se spécialisent alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la même cellule. Pour ce faire, nous injecterons des virus exprimant des protéines fluorescentes uniquement dans les noyaux de l’une ou de l’autre de ces jonctions. La fluorescence nous permettra d'isoler ces noyaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra d'identifier de nouveaux gènes qui sont essentiels à la fonction de la JNM ou de la JMT et fournira également des informations sur la façon dont ces domaines musculaires sont formés. Cela présente de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice et des maladies qui provoquent des défaillances d’une de ces deux jonctions. La conception de notre projet a également pour avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés. À terme, l'analyse complète de la fonction d'un gène nécessite la génération de lignées de souris génétiquement modifiées. Cependant, la modification génétique des souris est très longue et coûteuse, et il est donc difficile d'étudier tous les gènes par cette méthode. Dans notre étude, nous utilisons des virus pour réduire l'expression des gènes recherchés. Cela nous permet de tester rapidement la fonction d'un grand nombre de gènes candidats et d'identifier les gènes à privilégier pour une étude plus approfondie à l'avenir. Par conséquent, notre conception a l'avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux par rapport à l'étude de chaque gène individuel par modification génétique.
Procédures
1. Injection intramusculaire ou intrapéritonéale : Il s'agit d'interventions très rapides dont seule l’introduction de l’aiguille provoque une douleur. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, les elles retourneront dans leur cage d'origine. 2. Mesure de la force de préhension (String, Grip et Hanging) et entraînement à l'exercice (Rotarod et Treadmill) : Il s'agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris feront les 3 mesures de la force de préhension (lot 1 et 2 de la procédure 3) et un des 2 entrainement à l’exercice (uniquement lot 2 de la procédure 3) 3 fois par jours, 1 fois par semaine chacun des tests sur une période de 7 semaines après l’injection d’AAV. Elles retourneront ensuite dans leur cage d'origine. 3. Mesure de la force contractile in situ : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les procédures d'injection ou les tests de phénotypage musculaire eux-mêmes ne causeront pas d'effets indésirables. Cependant, comme la délivrance systémique de virus adéno-associés peut également diminuer l'expression des gènes candidats dans d'autres tissus que les muscles ciblés, des effets indésirables inattendus, en raison de leur faible musculature, pourraient être observés. La mesure de la force contractile in situ est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant la fin des effets de l’anesthésie afin d’éviter toute douleur ou effet indésirable.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires après manipulation des gènes cibles. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Notre travail se concentre en particulier sur les sous-types nucléaires spécifiques à l'intérieur des cellules musculaires qui sont formés par l'interaction entre les cellules musculaires et d'autres types de cellules au niveau des JNM et des JMT. De plus il est impossible de mesurer les effets de la réduction de l’expression des gènes cibles sur la force musculaire avec une études réalisée sur des cellules. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro car elles impliquent différents types de cellules et de structures complexes.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : Avant d'injecter les virus capables de réduire l’expression des gènes d’intérêts chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Mesure 2 : La conception de notre projet présente l'avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés pour les expériences. En effet, le nombre de nouveaux gènes candidats dont nous avons découvert l'expression dans les noyaux de la JNM ou de la JMT rend difficile l'étude de tous les gènes en générant des lignées mutantes. Par conséquent, le criblage des gènes candidats prometteurs par une étude utilisant des virus a pour avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés à l'avenir. Mesure 3 : Pour un des objectifs, le prélèvement de l'échantillon de contrôle et de l'échantillon expérimental sera réalisé sur le même animal (par ex : muscle tibial antérieur gauche = contrôle et muscle tibial antérieur droit = expérimental) ce qui permettra de réduire de moitié le nombre total d'animaux utilisés. Mesure 4 : Pour les tests fonctionnels, de multiples expériences seront réalisées chez la même souris. Mesure 5 : Nous déterminerons la meilleure construction permettant de marquer les noyaux de la JNM ou de la JMT. Pour l'isolement de ces noyaux, nous injecterons les deux muscles afin de maximiser le nombre de noyaux extraits d'une souris. Mesure 6 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter. Les souris seront placées sur une plaque chauffante à 37°C pour éviter l'hypothermie et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques par injection de virus adéno-associés sont mieux établies dans ce modèle. Ces facteurs nous permettent d'obtenir un maximum de résultats par animal et de minimiser le nombre total d'animaux utilisés. En outre, le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir des gènes exprimés dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet.
Etude de l’efficacité d’organoides hépatiques humains dans des modèles précliniques d’insuffisance hépatique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1184 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 96 d’entre elles et sévère pour 1088. Une insuffisance du foie leur est provoquée par une surdose de paracétamol ou par l’ablation chirurgicale d’une grande partie du foie, puis des organoïdes issus de cellules humaines leur sont implantés, avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de chercher une alternative à la greffe de foie. Le porteur affirme que l’atteinte du foie par le paracétamol n’est pas douloureuse et encadre l’ablation par un antalgique. Il affirme qu’aucune méthode ne remplace l’animal pour un processus de régénération aussi intégré.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir aux patients atteints d'insufisance hépatique grave (intoxication au paracétamol (doliprane), ablation d'une portion importante du foie du fait d'une tumeur), une alternative à la transplantation du foie, grâce à l'implantation de groupes de cellules hépatiques appelés organoïdes. Notre projet vise à à démontrer leur efficacité chez des souris présentant une insuffisance hépatique aigüe. Dans ce projet les cellules utilisées pour former ces "organoïdes" sont des cellules souches dérivées de cellules humaines et seront implantées chez la souris malade. C’est pourquoi le recours à une souche d’animaux immunodéficients (incapables de rejeter les cellules humaines) pour permettre la greffe de l’implant est nécessaire. L’accueil de ces souris se fera dans une animalerie compétente. Nous analyserons l'évolution des souris en recherchant une améioration de la maladie du foie grâce à l'implantation des organoïdes. Les données obtenues grâce à ce projet pourraient permettre de mieux prendre en chargel es malades atteints d'insuffisance hépatique aiguë.
Bénéfices attendus
Les situations cliniques d'insuffisance hépatique aiguë restent très difficiles à traiter, la seule solution efficace demeurant la transplantation hépatique. Cependant la pénurie de greffons hépatiques justifie de rechercher des solutions thérapeutiques alternatives. Ce projet est une étude chez la souris visant à évaluer le bénéfice d'une greffe d'organoides hépatiques en situation d'insuffisance hépatique aiguë. Si l'implantation d'organoides hépatiques humains chez la souris malade permet une suppléance du foie et une amélioration des souris, alors des études supplémentaires pourront être dans l'avenir envisagées pour appliquer ce traitement chez l'homme.
Procédures
Les souris seront mises en insuffisance hépatique par deux méthodes, l'une médicamenteuse (injection d'un médicament) et l'autre chirurgicale (ablation d'une large portion du foie). Ces 2 méthodes correspondent aux situations les plus fréquentes d'insuffsance hépatique chez l'homme. Une fois la maladie du foie induite, nous chercherons à l'améliorer par l'implantation de cellules hépatiques dérivées de cellules humaines, formant des "organoïdes". Les prélèvements sanguins et tissulaires sont réalisés lors de la mise à mort des animaux. Durée des interventions: pour l'administration du médicament, une seule injection puis mise à mort des animaux à différents temps (H6, H24, H48, J7); pour l'ablation d'une partie du foie, intervention durant 15 minutes, puis mise à mort à différents temps (H6, H24, H48, J7).
Impact sur les animaux
Les souris traitées avec une surdose de paracétamol développent des dommages hépatiques aiguës entraînant une insuffisance hépatique. Ces ldommages ne sont pas associées à la douleur chez l'homme, et les souris soumises à ce modèle ne présentent aucun signe de douleur. Cependant, les animaux présentent des signes de fatigue et se déplacent plus lentement dans les 12 heures suivant l'injection. Après ablation d'une partie du foie, les souris ont également une phase de fatigue de 48 heures pendant lesquelles un antalgique leur est administré dans leur nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Dans ce projet, le recours au sacrifice à la fin de chaque procédure est indispensable dans le but d’étudier les cellules et tissus impliqués dans la maladie que nous cherchons à traiter, au premier rang desquels le foie et les cellules (organoïdes) implantées.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet d'étude préclinique, il n’existe pas de méthode alternative pour remplacer l'expérimentation animale. La régénération du foie repose sur de très nombreux échanges entre différentes cellules et différents organes du corps : un tel processus intégré est actuellement impossibe à recréer en dehors d'un organisme vivant. Ainsi pour évaluer les possibilités de développer un foie transplantable cliniquement, le recours à l’expérimentation animale reste nécessaire. Dans ce cadre, pour améliorer la compréhension de ces multiples processus et pouvoir développer de nouvelles thérapies, le recours au sacrifice à la fin de la procédure est indispensable dans le but d’étudier les cellules et tissus impliqués, au premier rang desquels le foie et les cellules (organoïdes) implantées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ce nombre a été évalué à 12 à 16 souris par groupe en fonction des expériences. Dans une première procédure (tests pour l'implantation des cellules (organoïdes)) : 48 souris (4 groupes de 12). Dans une 2ème procédure (implantation des celllules chez les souris malades après injection d'un médicament) : 288 souris. Dans une 3ème procédure (ablation chirurgicale d'une partie du foie) : 256 souris. Pour obtenir des résultats scientifiquement solides, nous sommes tenus de répéter les procédures dans une 2ème série, donc il faudra doubler ces nombres de souris. En tout pour les procédures 1, 2 et 3, cela fera 592 X 2 = 1184 souris.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés pour chaque procédure. La maladie du foie induite par l'injection d'un médicament chez la souris n'est pas douloureuse. L'ablation chirurgicale d'une partie du foie est encadrée par un traitement antalgique administré avant et après l'opération pour éviter toute souffrance. L’environnement sera enrichi, la nourriture et l’eau seront disponibles à volonté. Les souris immunodéficientes seront accueillies dans une animalerie strictement réservée à ces souris, hébergées en isolateurs et prises en charge par du personnel qualifié. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal. Si l’animal atteint un score de 3, il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les animaux seront examinés quotidiennement par du personnel qualifié. L’observation quotidienne des animaux se fera d’abord lointaine (les animaux ayant tendance à cacher leur douleur) puis proche. Toutes les personnes impliquées dans la réalisation et le suivi des expériences sont formées.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour le type de projet que nous réalisons. La souris a une anatomie et une physiologie assez proches de celles de l'homme, ce qui permet un premier stade de mise au point de traitements destinés à être plus tard testés chez l'homme. En particulier pour étudier la régénération du foie, la souris est l'animal le plus utilisé. Entre 12 et 16 semaines, sa taille est optimale pour le type d'interventions programmées. De nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées existent, de sorte que la recherche peut en être facilitée. Ainsi nous utiliserons des souris immunodéprimées de façon à ce qu'elles ne puissent pas rejeter les cellules humaines que nous implanterons.
Etude de l’impact de la L-Dopa sur les comportements sociaux d’un modèle murin de troubles du spectre autistique (TSA)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1358 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 878 d’entre elles et sévère pour 480. Des femelles gestantes reçoivent une injection d’acide valproïque qui provoque une surmortalité de leur descendance avant le sevrage, les jeunes survivants subissant ensuite des injections de dopamine, l’implantation d’une puce, une chirurgie sans réveil et des tests comportementaux non détaillés, pour évaluer un traitement des troubles du spectre autistique. Le porteur qualifie ces gestes d’inconfort léger malgré une gravité déclarée jusqu’à sévère. Il affirme que ces symptômes de nature comportementale ne peuvent être reproduits en culture cellulaire et présente le recours au modèle animal comme "essentiel".
Objectifs
Les études épidémiologiques ont apporté des preuves tangibles qu’une exposition prénatale à l’acide valproïque (VPA), un anti-épileptique, est associée à un risque accru de développer des troubles psychiatriques et neurologiques tel que les Troubles du Spectre Autistique (TSA). Les TSA sont des troubles du développement qui sont associés à des perturbations dans la communication, les interactions sociales, la conscience et les émotions. Les TSA sont également caractérisés par des comportements répétitifs et restreints. Un nombre croissant de preuves associe les TSA aussi à des troubles complexes du mouvement, dont l’absence de coordination des mouvements. Ces troubles moteurs sont une indication d’une altération du système dopaminergique pouvant concerner les mêmes centres nerveux que ceux affectés dans la maladie de Parkinson. L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact d’un traitement à la Dopamine sur les comportements sociaux et moteurs dans le modèle murin des TSA. Ce projet ouvre la voie vers un traitement des TSA avec une molécule éprouvée, la Dopamine, car déjà utilisée depuis plus de 40 ans dans le traitement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Les données de la littérature montrent des déficits sociaux dans ce modèle animal de TSA avec une diminution significative du niveau cérébral de Dopamine indiquant une possible implication des systèmes dopaminergiques dans les troubles sociaux. Le traitement des animaux présentant un TSA avec la Dopamine pourrait induire une restauration ou une amélioration des capacités sociales avec une compensation des déficits dans les taux de dopamine. Si le traitement à la Dopamine se montre capable de corriger ou améliorer les déficits sociaux et/ou moteurs dans ce modèle, cela pourrait constituer une voie d’approche pour le traitement de ces troubles dans les TSA.
Procédures
1) Traitement par la Dopamine : 1 injection, moins de 2 minutes par animal, 2) Exposition à l’acide Valproïque : une injection, moins de 2 minutes par animal en cours de gestation 3) Chirurgies sous anesthésie avec antalgique : 1 chirurgie de 10 minutes maximum sur la descendance pour implantation d’une puce qui permettra le suivi des animaux, 1 seule fois et 1 chirurgie sans réveil de l’animal, 5 minutes maximum. 4) 2 Tests comportementaux : 15minutes et 6h cumulées, 1 seule fois 5) Prélèvement sanguin sous anesthésie générale et antalgie : 1 seule fois, 5 minutes maximum.
Impact sur les animaux
1/ Léger inconfort lié à l’injection de Dopamine pouvant engendrer des comportements stéréotypiques 2/ Léger inconfort lié à l’injection de l’acide valproïque engendrant une surmortalité chez la descendance avant le sevrage et des symptômes sociaux et moteurs chez la descendance qui atteint le sevrage 3/ Léger inconfort lié au réveil après anesthésie et à l’implantation de la puce de traçage 4/ Léger stress lié aux tests comportementaux 5/ Léger inconfort lié à l’injection de l’antalgique pour le prélèvement sanguin
Devenir
Les lots de souris consacrés à l’étude pilote permettant de déterminer les doses de traitement à la dopamine sont mis à mort à la fin de dette étude. Ces animaux ayant reçus une dose de Dopamine ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet. Pour l’étude de l’effet de la Dopamine sur les comportements sociaux et moteurs dans le modèle des TSA, tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude pour la collecte des tissus et l’analyse en aval.
Remplacement
Nous étudions les bases cellulaires et moléculaires de pathologies psychiatriques dont les TSA pour ce projet. Les symptômes cliniques de cette pathologie sont de nature comportementale (cognitive et motrice) qu’il est impossible de reproduire en culture cellulaire ou en modèle informatique dans l’état des connaissances actuelles. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparaît essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Afin de déterminer la taille de l’échantillon nécessaire pour cette étude, nous avons effectué une analyse de puissance : le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet est de 1358 souris. Nous avons aussi pris en compte le pourcentage de succès de la reproduction pour la souche murine utilisée ainsi que le taux de survie de la descendance des mères en présence de VPA ou non. Dans ce projet, nous utiliserons également une approche séquentielle permettant de limiter le nombre d’animaux au maximum pour déterminer la dose efficace de L-Dopa pour le traitement des animaux.
Raffinement
Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes en minimisant le "mal être" animal. Les animaux auront une période d’habituation à l’animalerie de 14 jours avant toute intervention. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance quotidienne des animaux, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu. De plus toutes les chirurgies se font sous anesthésie générale en présence d’antalgique additionnée à une anesthésie locale et sur tapis chauffant. Les animaux sont pesés deux fois par semaine jusqu’au sacrifice et pour les mères durant la gestation. Les descendants ne sont pas manipulés de leur naissance au sevrage, mais seulement observés. Nous réaliserons une étude pilote afin de déterminer la dose optimale de Dopamine à utiliser pour éviter les effets néfastes d’un excès de Dopamine (hyperactivité / stéréotypies). Les femelles, même lorsqu’elles sont gestantes, sont hébergées par 2 dans une cage ventilée avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et ont à leur disposition un tunnel et du matériel de nidification afin de faire leur nid en vue de la mise-bas. Les femelles gestantes seront séparées au moment de l’injection de VPA ou de solution saline à la moitié de la gestation (12.5jour) afin de limiter les manipulations et le stress de la séparation sur la mise bas et s’assurer de bien pouvoir identifier de quelle mère est issu chacun des petits pour les analyses épigénétiques. Les pères ainsi que la descendance sevrée, sont hébergés à 4/cage. Les animaux de l’étude pilote sont hébergés à 3/cage. L’injection des puces de tracage est une chirurgie légère sous cutanée (10min) s’effectuant sous anesthésie générale et locale. Après cette chirurgie les animaux sont hébergés en groupe de quatre de manière randomisée avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et à un enrichissement (papier de nidification) leur permettant de se cacher. Les expérimentateurs sont expérimentés et compétents.
Choix des espèces
La souris, et plus spécifiquement la souche C57BL/6Jrj, est l’espèce la plus pertinente pour les études menées sur les TSA car elle ouvre la porte à l'utilisation de souris transgéniques portant des mutations spécifiques en phase avec notre projet de recherche. Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles de petite taille ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris (Mus musculus) ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux reproducteurs auront entre 12 et 25 semaines pour les reproductions. La descendance sera étudiée dès le sevrage (J28, implantation de la puce de tracage) et entre J35 et J84 pour les analyses comportementales.
Formation et maintien des compétences concernant les gestes techniques chirurgicaux sur les rongeurs (2022-B-017)
- Formation professionnelle
Rats : 860
Cochons d'Inde : 160
Hamsters dorés : 160
1880 rongeurs, souris, rats, cobayes et hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du sans réveil au sévère, 475 d’entre eux en gravité sévère. Chaque animal peut subir deux interventions parmi la pose de cathéter, la craniotomie, l’induction d’une pathologie, l’ablation d’un organe ou la greffe de peau, non pour produire des connaissances mais pour former le personnel d’un prestataire de services à la chirurgie. Le porteur indique que ces gestes sont déclenchés par la demande d’un client et présente le cobaye et le hamster comme des espèces ajoutées pour rester réactif à cette demande. Il affirme que les mannequins ne suffisent pas et que l’apprentissage des gestes rend l’utilisation d’animaux vivants nécessaire.
Objectifs
Tous les personnels impliqués dans des études menées sur des animaux ont pour obligation d'acquérir et de maintenir leurs compétences tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de former et d'actualiser les compétences du personnel sur différents actes techniques impliquant de la chirurgie dans le but de développer et de réaliser des études précliniques pour le compte de clients. Les actes chirurgicaux nécessitant une expertise élevée, l'acquisition de ces compétences est requise afin que ceux-ci soient réalisés de façon maîtrisée et reproductible. Certaines espèces et techniques de ce projet seront utilisées à la marge mais peuvent tout de même être demandée par un client. Afin d'être suffisament réactif par rapport à notre activité de prestatire de services, notre personnel se doit de pouvoir être formé pour ces espèces et ces techniques. Ainsi l'acquisition de nouvelles compétences sera toujours initiée par une demande Client.
Bénéfices attendus
L'acquisition et le maintien de compétences de gestes techniques en chirurgie permet d’acquérir et de maintenir la dextérité et la technicité permettant de limiter les dommages infligés à l’animal et les niveaux de douleurs non conformes au type de chirurgie réalisée. La maitrise des techniques chirurgicales obtenues par le maintien des compétences contribue par la suite à une réduction du nombre d’animaux dans les procédures. D’où l’importance de ce projet, quant à l'acquisition et au maintien des compétences du personnel intervenant sur les animaux. De par notre activité de prestataire de services nous nous devons d'avoir l'ensemble de notre personnel opérationnel sur l'ensemble des techniques utilisées au sein de notre société. Ainsi nous devons envisager tous les cas de figure c'est pour cette raison que notre projet comporte plusieurs procédures sur de nombreuses espèces de rongeurs. Néanmoins, le nombre d'animaux calculé reste un maximum et sera sans aucun doute inférieur.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans deux procédures maximum de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelque soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure chirurgicale sont les suivants : - Procédure 1 (Implantation de cathéter) : moins d’une heure - Procédure 2 (Injection nécessitant une chirurgie) : moins de 20 min - Procédure 3 (Craniotomie) :moins d’une heure - Procédure 4 (Induction d'une pathologie avec réveil) : environ 2h00 - Procédure 5 (Induction d'une pathologie sans réveil) : jusqu’au retrait des clamps temps estimé à 1h30 - Procédure 6 (Exérèse d'organe) : moins de 30 minutes - Procédure 7 (Implantation de dispositifs médicaux) : environ 30 minutes - Procédure 8 (Greffe cutanée) : moins d’une heure.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Pour chaque procédure, la possibilité d’administrer une dose supplémentaire d’analgésique durant la période post-opératoire en cas de signe visible de douleur est prévue. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 48h suivant les interventions, ces paramètres font l’objet d’un suivi durant la période de rétablissement des animaux. Dans le cadre des procédures d’induction d’une pathologie, les signes cliniques de la pathologie (ex : insuffisance rénale ou hépatique) sont attendus et font l’objet d’un suivi spécifique.
Devenir
Les procédures terminant par une exsanguination impliquent forcément une mise à mort de l’animal. Dans un but de réduction du nombre d'animaux utilisés, les animaux impliqués dans un procédure (excepté P4, P5, P6 ) pourront être réutilisés dans une autre procédure de ce projet. Au terme, des deux procédures maximum subies par l'animal, il n’est pas envisagé de les replacer, ces animaux seront alors mis à mort au terme de la période post-opératoire déterminée pour chaque procédure. La mise à mort des animaux pourra également avoir lieu dans le cas de prélèvements d’organes / tissus en vue d’une analyse histologique ou biochimique visant à valider le geste technique de la personne formée.
Remplacement
Des modèles animaux artificiels (exemple : rats ou souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, l’apprentissage des bons gestes en chirurgie ainsi que de la surveillance de la profondeur d’anesthésie/analgésie et du suivi post-opératoire ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Néanmoins, certains gestes de base (exemples : sutures, incision, etc...) inclus dans les différentes procédures décrites dans ce projet pourront être réalisés sur ce type de support dans un but de remplacer l'utilisation de l'animal.
Réduction
Une meilleure maîtrise des gestes techniques permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. De plus, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, naïfs de toute expérimentation (après avis favorable de la SBEA et du vétérinaire référent) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux impliqués dans cette demande pourra également être revu à la baisse dans les cas suivants : - lorsque les gestes techniques auront été pratiqués par un collaborateur lors d'une étude - lorsqu'un collaborateur maitrise le geste technique qu'il aurait pratiqué dans une autre société /laboratoire de recherche - lorsque la personne maitrise le geste technique sur un des 4 types de rongeurs cités dans cette demande. Les animaux utilisés dans ce projet pourront être utilisés dans plusieurs procédures. Par exemple, un animal ayant subi une craniotomie (P3) pourra être réutilisés dans une procédure sans réveil (P5), au terme de sa période de récupération, dans le but de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Pour finir, les modules d'acquisition des compétences ne seront initiés sans qu'ils ne soient motivés par la demande d'un client. L'ensemble de ces conditions s'inscrivent dans le cadre de la réduction du nombre d'animaux.
Raffinement
Le tuteur sera vigilant sur l’exécution des manipulations/gestes réalisés sur l’animal tout au long de la formation/maintien des compétences. Le tuteur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou une douleur chez l’animal. Préalablement à toute formation, des points limites seront définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. Ces points limites permettront un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des gestes techniques mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une intervention précoce et adaptée si cela est nécessaire. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée après 48h, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du tuteur de la formation et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie (type, dose, fréquence) ainsi que l’analgésie (type, dose, fréquence) nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire référent. Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex : lampe chauffante, enceinte thermostatée etc…). Les animaux seront hébergés individuellement après chaque chirurgie jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 21 jours). Afin de limiter le stress dû à l’isolement et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisé (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…).
Choix des espèces
D'un point de vue scientifique, nous disposons d'un grand nombre d'articles et de données validées sur le rat et la souris. De plus, les espèces les plus demandées par nos clients sont le rat et la souris. C'est pour cette raison que nous souhaitons accentuer nos efforts d'acquisition de compétences sur ces deux espèces principalement. Néanmoins, notre activité de prestataire de services peut nous amener à développer des modèles de pathologie sur d'autres espèces telles que le hamster et/ou le cobaye, à la demande d'un client. Dans le cadre de notre activité, nous devons être réactifs face à toute demande client ainsi nous avons ajouté comme espèce le hamster et le cobaye à notre projet. Ces derniers ne seront utilisés dans le cadre d'une acquisition de compétence qu'en cas de demande spécifique d'un client, d'où le faible nombre d'hamsters et cobayes impliqués dans ce projet. Seuls des animaux adultes seront utilisés dans les procédures faisant l’objet de ce projet, les protocoles d’anesthésie et de chirurgie décrits ayant été mis au point sur des animaux à ce stade.
Comparaison de l’efficacité de la radiothérapie par photons versus la protonthérapie sur du tissu tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 800 d'entre elles et sévère pour 160. Une tumeur cérébrale leur est greffée puis irradiée par rayons X ou par protons, avec un suivi de la croissance tumorale pendant un à deux mois, pour comparer les deux irradiations sur le tissu sain et le tissu tumoral. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité et l'équilibre et que l'irradiation peut provoquer une perte de poids ou une atteinte de la peau. Il rattache le projet à la limitation des troubles neurocognitifs après radiothérapie de l'enfant, une retombée formulée au conditionnel.
Objectifs
• Contexte scientifique Le développement de troubles neurocognitifs complique fréquemment les radiothérapies (RT) cérébrales, notamment chez l’enfant. La protonthérapie (PRT) permet de minimiser l’irradiation des tissus sains entourant les tumeurs et représente ainsi une avancée majeure pour le traitement des tumeurs pédiatriques. Elle n’en reste pas moins responsable d’effets secondaires comme par exemple des défauts neurocognitifs. Si l’épargne cérébrale liée à la distribution de dose en profondeur des protons en comparaison des photons (rayons X) est évidente, la comparaison des toxicités cérébrales pour une même dose reçue reste à analyser. Notre projet a pour objet l’étude de l’efficacité de la protonthérapie par rapport à une irradiation conventionnelle sur 2 modèles de tumeurs cérébrales. • Objectifs du projet Nous comparerons les effets induits par l’exposition du cerveau dans son ensemble à une dose de rayons X et de protons afin de modéliser l’irradiation de patients atteint de tumeurs cérébrales chez des souris Les résultats seront mis en parallèle d’une précédente étude afin d'établir les bénéfices sur le tissu sain et l'efficacité sur le tissu tumoral de ces deux types d'irradiation • Résultats attendus En analysant l’efficacité de la protonthérapie et ses avantages par rapport à l’irradiation X, notre projet devrait permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques limitant les atteintes neurocognitives et ayant une efficacité identique sur le tissu tumoral permettant ainsi d’augmenter l’index thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le développement de troubles neurocognitifs complique fréquemment les radiothérapies cérébrales, notamment chez l’enfant. La protonthérapie permet de minimiser l’irradiation des tissus sains entourant les tumeurs et représente ainsi une avancée significative pour le traitement des tumeurs pédiatriques. Elle n’en reste pas moins responsable d’effets neurocognitifs (défaut de concentration, d’attention, mémorisation à l’origine de difficultés scolaires et d’insertion). Au final, si l’épargne cérébrale liée à la distribution de dose en profondeur des protons est évidente, la comparaison des toxicités cérébrales pour une même dose reçue (en radiothérapie conventionnelle versus protonthérapie) reste à analyser. En contribuant à mieux connaître l’efficacité de la protonthérapie et ses avantages par rapport à la radiothérapie conventionnelle sur la progression tumorale, notre projet devrait permettre le développement de nouvelles stratégies préventives et/ou thérapeutiques limitant les atteintes neurocognitives.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées/greffées sur des animaux anesthésiés (durée anesthésie < 15 minutes). Les animaux ayant développé des tumeurs seront anesthésiés pour être traités par radiothérapies selon différentes modalités (durée < 5 minutes) et la croissance tumorale sera suivie soit par mesure au pied à coulisse (animaux vigiles) soit par imagerie sous anesthésie (durée < 15 minutes) en fonction du site d’injection. Pour assurer une bonne qualité des tissus prélevés pour effectuer l’analyse histologique, une partie des animaux seront perfusés corps entier avant le prélèvement de l’organe d’intérêt (anesthésie profonde sans réveil)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que nous attendons suite à nos expériences sur les animaux sont ceux liés aux actes chirurgicaux (douleurs, perte d’équilibre, perte de poids) estimées à 1 journée post-greffe, à l’apparition de tumeurs suite à l’implantation de cellules tumorales (réduction de la mobilité, perte d’équilibre, croissance/taille du volume tumorale) estimée à 1 à 2 mois en fonction du modèle, à la perte de poids ou dermite cutanée qui pourront être observées suite aux irradiations. Ces effets seront suivis tout au long de l’expérimentation soit environ 1 mois ou 2 mois au maximum.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem de la zone portant la tumeur
Remplacement
Le but de cette étude est de caractériser l’efficacité de la protonthérapie comparée à une irradiation conventionnelle sur la progression tumorale. Il est donc nécessaire de travailler avec un modèle vivant intégré et autonome.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, un outil statistique a été utilisé. Le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum. Quand cela est possible, nous utiliserons un système non-invasif pour le suivi du développement tumoral dans le cervelet au cours du temps (imagerie). Ce système nous permet également de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés pour tous les gestes techniques invasifs ou nécessitant une immobilité des animaux. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou/et généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance. Dès l’irradiation, l’alimentation usuelle des animaux sera complétée par des aliments gélifiés disposés directement dans le fond de leur cage. L’accès à la nourriture sera ainsi plus aisé. Une surveillance accrue des animaux sera mise en place le lendemain de la chirurgie intracrâniale et également un suivi le lendemain de l’irradiation pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis quotidiennement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en cancérologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les souris seront greffées à l’âge adulte, ce modèle de génération de tumeur est communément utilisé et bien maîtrisé (reproductible). La bonne connaissance de nos modèles sur les souris adultes nous ont conduit à réaliser ces expériences sur adultes pour garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.
Effet de l’euthasol sur l’activité cérebrale et cardiaque chez la souris
- Formation professionnelle
10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le crâne, puis une sédation et une injection d'euthasol dont l'effet est enregistré à la fois sur le cœur et le cerveau, l'objet de l'étude étant de dater la mort cérébrale par rapport à l'arrêt cardiaque pendant la mise à mort. Le porteur situe la retombée du côté du choix des techniques de perfusion et de la formation des expérimentateurs de l'établissement. Il affirme que le suivi de ces constantes lors de l'euthanasie ne peut se faire sans animaux.
Objectifs
Le principe de la perfusion intracardiaque est d'utiliser le système vasculaire pour délivrer des fixateurs ou solutions physiologiques à débit régulier au sein des tissus d'intérêt. Une fixation suite à l’euthanasie de l’animal est nécessaire pour préserver l'ultrastructure et la morphologie des tissus en vue de leur examen par microscopie classique ou microscopique. En électrophysiologie, le maintien des propriétés de viabilité du tissu chez l’animal adulte est indispensable, il est donc essentiel de stopper rapidement la dégradation de l’ARN et des protéines. Suite à une sédation par xylazine et une injection d’euthasol, une étude antérieure nous a permis de déterminer que l’arrêt cardio respiratoire est visible à l’œil nu après deux minutes. Par ElectroCardioGramme (ECG), nous observons une perte des fonctions cardiaques associés à une interruption de l’activité électrique normale du cœur dans les 2 à 3 minutes après l’injection d’euthasol. Pour compléter ces données nous souhaitons déterminer à quel moment à lieu la mort cérébrale par ElectroEncephaloGramme (EEG) vis-à-vis de l’arrêt de l’activité cardiaque normale dans notre protocole par l’étude simulatanée EEG-ECG lors de l’euthanasie. L’ensemble du projet est mis en œuvre dans l’application des 3 Rs. Le nombre d'animaux sera le plus faible possible tout en permettant de réaliser une analyse statistique des résultats.
Bénéfices attendus
Ce projet sera l’aboutissement d’une initiative collective d’expérimentateurs et de la structure chargée du bien-être animal de l’établissement afin de répondre à des problématiques opérationnelles dans le cadre d’étude post mortem de tissus murins. L’ensemble des conclusions des projets permettra d’apporter des arguments pour guider les expérimentateurs vers des techniques de perfusions adaptées aux traitements de l’échantillon postérieur. Les bénéfices seront : - Des arguments scientifiques appuyés de protocole - Une meilleure formation des expérimentateurs - Un partage des meilleures méthodes à la communauté scientifique
Procédures
L'isolement de l'animal est une nuisances prévus qui sera de courte durée et sera palier par l'implémentation d'enrichissement. Aucune intervention regulière n'est prevu. Les douleurs postopératoires seront paliées au maximum par l'injection d'analgésique.(buprénorphine 0.1mg/kg). Le déroulé expérimentale est : - une chirurgie implatatoire(1heure) - 6x injection SC d'analgésie post chir (moins d'une minute- buprénorphine 0.1mg/kg) -1x injection IP xylazine(moins d'une minute- 15mg/kg) -enregistreement EEG -1x injection IP Euthasol (moins d'une minute- 140mg/Kg)
Impact sur les animaux
Les nuisances sont: l'isolement de l'animal, risque infectieux/problème de cicatrisation,baisse de la qualité du signal enregistré.
Devenir
Il s’agit d’un projet pour mieux appréhender les divers phases de l’euthanasie il n’est pas possible de se passer de l’euthanasie des animaux dans ce contexte.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que de nombreuses procédures alternatives existent, il n’est pas possible dans notre contexte d’utiliser autres choses que ces animaux étant donné l’interêt porté sur le monitoring des constantes physiologique EEG et ECG lors de l’euthanasie.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude afin d’établir les paramètres idéaux pour de meilleurs échantillions. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. 10 souris seront utilisés
Raffinement
Une période d’acclimatation, d’une semaine minimum, à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus le plus longtemps possible. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace (tableau 1.1, directive européenne 2010/63/UE) ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, l’alimentation et soins si nécessaires, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Les animaux bénéficieront de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de maisons et neslet. Une période d’acclimatations à la zone d’hébergement d’une semaine minimum est respectée. Chaque procédure aura lieu après une acclimatation de 30 minutes et un examen clinique. La douleur est prise en charge par une analgésie maintenu 48h à minima après chirurgie. Pendant les anesthésies, la profondeur de narcose sera contrôlée par : 1) l’observation du rythme cardio-respiratoire 2) pincements de la patte arrière et études des réflexes de flexion 3) relaxations des sphincters anaux et vésicaux 4) la température.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’identifier les différentes phases aboutissant à la mort de l’animal lors d’une euthanasie de manière à garantir l’absence de douleur et le prélèvement de tissu de qualité lors de la perfusion intracardiaque. Nous souhaitons valider la procédure de perfusion intracardiaque optimale en fonction contexte d’exploration ex vivo afin de coller au plus près aux contextes expérimentaux rencontrés quotidiennement en recherche en neurosciences i.e chez un groupe de souris adultes à hétérogénéité sexuée.
Evaluation de l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’infection par le virus Nipah, par une approche vaccinale prophylactique, chez le singe vervet
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
12 singes vervets juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une quinzaine d'anesthésies et des prélèvements répétés puis une infection par le virus Nipah, dont la létalité annoncée atteint 75 %, pour évaluer un candidat vaccin. Le porteur indique que les animaux témoins doivent développer les signes de la maladie, dérégulation de la température, perte de tonus, troubles respiratoires et neurologiques. Il affirme que les méthodes in vitro ne permettent pas de reproduire une maladie dans un "organisme entier".
Objectifs
Le virus Nipah (NiV) est un virus qui a émergé courant des années 90 en Asie du Sud-Est. Ce virus est responsable d’encéphalite sévère et de syndrome respiratoire chez l’humain. L’observation de transmission interhumaine par les voies respiratoires et la découverte de virus proches chez des chauves-souris en Afrique occidentale, objectivent la menace que ces virus constituent pour la santé humaine. Du fait de sa dangerosité, d’une létalité importante (75% pour la souche Bangladesh concernée dans ce projet) et de l’absence de traitements et vaccins, NiV fait partie de la liste des maladies prioritaires de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). La prévention et/ou le contrôle d'épidémies dépendra de la capacité à concevoir des stratégies efficaces pour combattre ces virus. Ce projet de recherche se focalise sur une approche vaccinale avant exposition au virus NiV. L’objectif du projet est de tester l’efficacité d’un vaccin, sur le modèle primate non-humain (PNH) Vervet tout en comparant les données obtenues à celles d’anciens projets. Le candidat vaccin proposé se base sur un ciblage des cellules et d’anticorps étant associés aux antigènes présents dans le vaccin. Il a été démontré en modèles animaux (souris humanisées, PNH) que cette approche permet d’induire une réponse immunitaire forte et protectrice contre différentes maladies infectieuses. Des études précédentes n’ont montré aucun effet indésirable, hormis des réactions locales mineures. Ce vaccin a été testé chez le rongeur ; les résultats montrent une importante réponse immunitaire. Ces résultats préliminaires chez la souris sont donc encourageants pour continuer ces essais chez le vervet et espérer une protection contre l’infection.
Bénéfices attendus
Bien que les flambées épidémiques liées au virus Nipah soient un problème de santé publique en Asie du Sud-Est et inquiètent l’OMS, il n’existe à ce jour aucun traitement ni aucune prophylaxie permettant de lutter contre une infection par ce virus. La démonstration de l’efficacité d’un candidat vaccin chez les primates non humains pourrait mettre sur la voie d’un moyen de prophylaxie permettant de protéger les populations à risque et ainsi limiter les flambées épidémiques. A long terme, le vaccin étudié dans ce projet pourrait entrer en phase d’essai clinique chez l’humain pour à plus long terme être utilisé chez les populations à risque si l’évaluation en modèle vervet donne des résultats favorables.
Procédures
La procédure expérimentale soumettra les animaux, de la réception jusqu’ à la fin du protocole, à des anesthésies (au nombre de 13 prévues dans la procédure expérimentale et d'une durée de 1h à 2h selon les individus) et à des prélèvements pharyngés, nasaux et sanguins sur animaux anesthésiés (12 sessions de prélèvements sanguins et 7 sessions pour le nasal et pharyngé, prévues dans cette procédure expérimentale). Une table de scoring et une liste de points limites sont établis à partir de la littérature et d’études précédentes, afin d’avoir des critères d’observations reflétant l’état des animaux et le développement de la maladie. Lors de l'atteinte d’un point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis les prélèvements de sang et moelle osseuse, ainsi que le lavage broncho-alvéolaire seront réalisés avant de procéder à la mise à mort puis au prélèvement de liquide céphalo-rachidien et des organes d’intérêt. Pour les animaux ne présentant ni point limite ni score limite, la procédure s’achèvera alors à J28 au maximum. La mise à mort des survivants sera donc réalisée à J27 et J28 selon le nombre d’animaux concernés, par programmation de 4 animaux maximum par jour. La procédure aura donc une durée totale de 14 jours d’acclimation puis 28 jours de protocole au maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus Nipah, en particulier souche Bangladesh, tels qu’une dérégulation de la température corporelle, une perte de tonus ainsi que des troubles respiratoires et de potentiels signes neurologiques. Les animaux vaccinés devraient présenter moins ou pas de signes contrairement aux contrôles, puis devraient présenter un état de santé normal dans les deux semaines suivant l’infection.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés (n=12) et vaccinés (n=9). Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données virologiques et immunologiques statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire classiquement utilisée depuis des décennies. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans l'organisme. Citons par exemple le développement de la culture cellulaire en trois dimensions, ou encore la culture d'organoïdes, sphéroïdes ou d'organes sur puce. Dans tous les cas, il s'agit de reconstituer la structure organisationnelle de systèmes cellulaires complexes ex vivo, afin de mimer les conditions observées in vivo. Ces avancées récentes ont déjà permis d'étudier des questions complexes et multidimensionnelles telles que l'apparition de la maladie, la régénération tissulaire ou bien les interactions entre organes. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées, tout en étant multi factorielles. Dans le cadre de notre étude, elles ne permettent pas, pour l'instant, de répondre à des questions globales telles que l'apparition d'une maladie dans un système vivant "entier", le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires dans leur ensemble suite à une réponse vaccinale suivie d’une épreuve virale. Afin de répondre à nos questions et pour toutes les raisons citées précédemment, il est impossible de remplacer l'utilisation d'un organisme vivant complexe.
Réduction
Le projet est basé sur l’utilisation de 12 PNH répartis en 4 groupes de 3 animaux (en accord avec les capacités d’hébergement et la réglementation). Il s’agit du nombre minimal pour observer des différences statistiquement significatives entre chaque groupe et pour s’assurer d’une reproductibilité. Plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même animal au cours de l’expérimentation et un nombre maximal d’échantillons de fluides et tissus sera prélevé à l’autopsie, afin de procéder à des analyses ultérieures. Cette procédure inclut l'utilisation d'un groupe contrôle non vacciné de 3 animaux (infectés par la même dose que les animaux vaccinés) dont les données seront par la suite également analysées en comparaison aux deux groupes contrôles historiques. De plus, seulement un groupe (3 animaux) sera le contrôle afin de tester les effets de l’adjuvant du vaccin et de façon simultanée à l’observation des groupes vaccinés. Ces individus contrôles seront observés en comparaison avec les animaux étant vaccinés, pour lesquels la cinétique d'apparition (ou non) de signes cliniques n'est pas encore connue et doit être observée dans les mêmes conditions (même dose d’épreuve virale et mêmes jours de prélèvements). S’agissant d’une étude pilote, un plus grand nombre d’animaux vaccinés que de contrôles est inclus dans l’étude, tout en ayant accès aux analyses des contrôles d'études précédentes, afin d’atteindre une meilleure puissance des tests statistiques.
Raffinement
Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3, dans un environnement enrichi avec des dispositifs favorisant l’adoption d’un comportement naturel (perchoir, hamac, jeu, diversification alimentaire…). Les animaux seront implantés par télémétrie, nous permettant de surveiller et d’enregistrer en temps réel, l’activité et la température corporelle des animaux. Un système de vidéosurveillance permettra également de visualiser le comportement des animaux pendant les périodes où ils ne seront pas stimulés par la présence des techniciens. La surveillance via ce système est réalisée quotidiennement en fin de journée, et plus régulièrement pendant la période critique. L'accès aux enregistrements est également possible. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision. La majorité des procédures réalisées au cours de ce protocole ont un impact mineur sur le bien-être des animaux. Ces procédures comprennent notamment des injections musculaires et sous-cutanées, des écouvillonnages nasopharyngés et des prises de sang, réalisés sur des animaux anesthésiés.
Choix des espèces
Le modèle PNH étant proche de l'Homme, il est un modèle sensible à l'infection par NiV. Comme le révèlent les observations de terrain ainsi que les travaux précédents menés en laboratoire sur le modèle Vervet, les PNH développent des symptômes comparables à ceux décrits chez l'Homme (particulièrement des signes respiratoires induits par la souche Bangladesh), ce qui en fait un modèle de choix pour l'évaluation de stratégies dont vaccinales. Les animaux utilisés seront des animaux juvéniles (de plus de 2 ans et moins de 3 ans). En effet, l'hébergement permet l’accueil de PNH de moins de 3 ans uniquement, par groupes de 3 animaux par volière. Cependant, les animaux auront plus de deux ans afin d’avoir un système immunitaire le plus mature possible. L’âge des animaux est donc contraint par les capacités d’accueil. La moyenne des poids lors des dernières pesées (début juin 2022) était de 3 kg.
Etude du rôle de la cytokine IL-34 dans un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de la sclérose en plaques, leur est induite, provoquant une paralysie ascendante suivie sur une échelle clinique, pour évaluer le rôle d'une cytokine et son effet thérapeutique possible. Le porteur mentionne une perte de poids, une mobilité réduite et un stress liés à la maladie, et prévoit l'euthanasie des animaux les plus atteints. Il affirme qu'aucune expérience in vitro ne rend compte d'une maladie auto-immune dans son ensemble.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie invalidante touchant le système nerveux central, caractérisée par une démyélinisation (altération de la gaine de myéline entourant les fibres nerveuses), une inflammation et une dérégulation du sytème immunitaire. Cette pathologie est médiée à la fois par des lymphocytes T qui présentent une auto réactivité contre les protéines de la myéline et donc la dégradent, et par l’activation de lymphocytes B qui produisent des anticorps autoréactifs (réactifs contre des protéines du soi). Ce dysfonctionnement du sytème immunitaire est responsable de la pathogénèse de cette maladie autoimmune qu'est la sclérose en plaques. Des études menées par notre équipe ont mis en évidence que l'Interleukine (IL)-34 est une cytokine exprimée par des sous populations de lymphocytes T, et qui permet d'induire une tolérance dans un modèle d'allogreffe cardiaque chez le rat. Cette cytokine régulatrice est aussi nécessaire au recrutement et au développement de la microglie, macrophages résidents du système nerveux central dont le nombre augmente lors d’épisodes neuro-inflammatoires et neuro-dégénératifs, observés notamment dans le modèle murin préclinique de sclérose en plaques (EAE, encéphalomyélite immune expérimentale induite par la glycoprotéine MOG ). Les objectifs de ce projet sont à la fois de déterminer la contribution exacte de la cytokine IL34 dans cette maladie autoimmune, et son effet thérapeutique potentiel dans cette maladie du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Par l'administration de la cytokine IL34 à des animaux atteints de sclérose en plaque, nous espérons réduire le dysfonctionnement du sytème immunitaire, réduire l'inflammation et donc réduire les lésions au niveau de la gaine de myéline. L'effet potentiel thérapeutique de cette cytokine dans cette pathologie pourrait par la suite s'étendre à d'autres pathologies du système nerveux central.
Procédures
Trois injections le 1er jour du protocole sur animaux anesthésiés. Une injection quotidienne sur animaux vigiles entre le 1er et le 15eme jour du protocole. Suvi clinique quotidien: observation du comportement général, pesée, évaluation du score clinique locomoteur selon l'échelle standard de paralysie ascendante. Des prélevements sanguins et de tissus (moelle epinière, cerveau, rate) seront effectués lors de l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Perte de poids, mobilité réduite et stress associés à la pathologie.
Devenir
Euthanasie des animaux à la fin de l'expérimentation ou en cas d'atteinte de points limites, pour effectuer des prélevements de tissus post-mortem.
Remplacement
A ce jour, aucune expérience in vitro ou modélisation informatique ne permet de rendre compte d'une maladie auto-immune telle que la sclérose en plaques. De plus, les analyses in vitro ne rendent pas compte de la complexité du système immunitaire dans son ensemble, d'autant plus que l'IL-34 est une cytokine exprimée par différents types cellulaires dont la fonction n'est pas encore entièrement connue dans tous les tissus. Les modèles in vivo permettent donc de prendre en compte ces différents aspects.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Durant le protocole, les animaux seront suivis quotidiennemeny pour leurs poids et le développement de la maladie. Les animaux montrant une souffrance importante, selon une grille se score établie, seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle d’encéphalomyélite immune expérimentale (EAE) induite par la glycoprotéine MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) chez la souris C57Bl/6 est proche de la forme progressive de sclérose en plaques observée chez l’homme, et est le modèle préclinique le mieux caractérisé. Les souris utilisées auront 6-8 semaines, âges auxquels les protocoles d'EAE sont classiquement réalisés.
Rôle des macrophages périvasculaires dans la physiopathologie des transformations hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou de collagénase dans le cerveau, après une injection intracérébrale de liposomes, pour étudier le rôle de certains macrophages dans les hémorragies cérébrales. Le porteur décrit des signes de douleur dans les premières heures et un affaiblissement de la patte avant gauche qui peut disparaître en une semaine. Il affirme que les techniques de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information que la souris.
Objectifs
Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Les HT aggravent l'issue de l'AVC et augmente la mortalité. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié. Ce projet vise donc à caractériser le role des PVM dans la physiopathologie des HT. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs roles.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prise en charge des patient victimes d'un AVC.
Procédures
Phase 1 : Etude de l'impact de la déplétion des PVM "per se" sur les transformations hémorragiques - (J-5) : Déplétion des PVM par injection intracérébroventriculaire de liposomes contenant du clodronate (30min). - (J0) : Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (40min). - (J1) : Evaluation des transformations hémorragiques à 24h post AVC par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15min). - (J+5) : Evaluation des transformations hémorragiques à 5 jours post AVC par Imagerie par Résonance Magnétique (15min). Phase 2 : Etude de l’impact de la déplétion des PVM et de la thrombolyse tardive (rtPA) sur les transformations hémorragiques : - (J-5) : Déplétion des PVM par injection intracérébroventriculaire de liposomes contenant du clodronate (30min). - (J0) : Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (40min). Pose d’un cathéter intraveineux et injection intraveineuse de rtPA à 4h30 post occlusion (20min). - (J1) : Evaluation des transformations hémorragiques à 24h post AVC par Imagerie par Résonance Magnétique (15min). - (J+5) : Evaluation des transformations hémorragiques à 5 jours post AVC par Imagerie par Résonance Magnétique (15min). Phase 3 : Etude de l’impact de la déplétion des PVM sur un modèle d'AVC hémorragique : -(J-5) : Déplétion des PVM par injection intracérébroventriculaire de liposomes contenant du clodronate (30min). - (J0) : Modèle d'AVC hémmorragique par injection intrastriatale de collagènase VII (30min). -(J1) : Evaluation des transformation hémorragiques à 24h post AVC par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) séquence T2 anatomique, T2* pour visualiser les HT (15min).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la pâte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de douleur sont le suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le « grimace scale », une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un carré de coton (Nestlets), dôme en carton, paillettes). Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude du transcriptome rythmique de tumeurs pancréatiques de stade avancé
- Recherche fondamentale
- Oncologie
567 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 513 d'entre elles et sévère pour 54. Les souriceaux subissent l'amputation d'une phalange sur chaque patte, sur animal vigile, pour le génotypage, et les souris porteuses d'un cancer du pancréas sont laissées jusqu'à un stade avancé. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ni dérivé morphinique ne peut être administré pour limiter leur souffrance, cela modifiant le métabolisme de la tumeur. Il revendique le recours aux souris comme "absolument indispensable" pour étudier le rythme jour-nuit des tumeurs.
Objectifs
Le but de ce projet est d'identifier des cibles métaboliques présentant des profils d’activation différents dans la tumeur pancréatique (ADKP) versus les organes sains au cours de la journée (i.e. jour et nuit). Ceci afin de définir à quel moment de la journée, les traitements, dirigés contre ces cibles, engendreront une régression maximale de la masse tumorale et des effets secondaires restreints. Pour atteindre cet objectif, un prélèvement toutes les 4h sur 24h des organes d’intérêts et du sang sera réalisé chez des souris développant des ADKPs et chez des souris saines. Le développement de ces ADKPs est induit par les mutations les plus fréquemment retrouvées chez les patients et les ADKPs ainsi formés récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet émergent et innovant générera des résultats robustes, inexistants en raison des contraintes méthodologiques, avec un fort potentiel clinique, puisqu'il vise à élaborer de nouvelles modalités d’administration d’inhibiteurs métaboliques déjà existants ou en développement afin d’apporter un réel bénéfice thérapeutique pour les patients atteints d’ADKP. Il permettra également le développement de collaborations interdisciplinaires entre biologistes et mathématiciens/modélisateurs, et cliniciens, indispensable pour mener à bien ce projet.
Procédures
Chaque souriceau généré par les couples de souris fondatrices seront, à l’âge de 7 à 10 jours, identifiés par ablation de la phalange la plus distale, et d’une seule phalange par patte, excepté le pouce, et en privilégiant les pattes postérieures. Cette unique intervention, réalisée sur animaux vigiles, permettra de définir précocement leur génotype, de limiter leur manipulation et de ne garder que les souriceaux avec les génotypes d’intérêts.
Impact sur les animaux
Les souris atteintes d’un cancer du pancréas se caractérisent par une stabilisation de leur poids corporel puis par des apparences et/ou comportements anormaux, qui signent la présence d’une tumeur pancréatique de stade avancé. Notre expertise nous permet de détecter quotidiennement tout signe de douleur, d’angoisse et de souffrance de l’animal, et de procéder à l’euthanasie de celui-ci dès lors que le score du point limite est atteint. Il est à noter qu’à ce-jour, aucun marqueur de dépistage précoce de la maladie et technique d’imagerie fiable ne sont utilisables en préclinique et clinique pour la détection et/ou le suivi de la progression de la maladie.
Devenir
Chaque souris porteuse d’une tumeur pancréatique sera euthanasiée dès lors que le point limite est atteint, ainsi que sa congénère de phénotype non-dommageable de même. Nous procèderons au prélèvement des organes d’intérêt et du sang, qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet, qui vise à caractériser le profil d’activation rythmique de cibles thérapeutiques métaboliques dans la tumeur pancréatique vs les organes sains au cours d’une journée de 24h. Celui-ci doit être réalisé sur des animaux vigiles, qui possèdent une horloge interne fonctionnelle, capables de percevoir les variations du cycle lumière/obscurité environnemental. L’utilisation d’alternatives expérimentales ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux sera envisagée chaque fois que c’est possible (ex : conditions de culture permettant de mesurer l’activité métabolique rythmique des cellules tumorales pancréatiques et de définir l’efficacité de drogues métaboliques).
Réduction
Nous avons défini : - un intervalle d'échantillonnage minimun, toutes les 4h sur 24h, qui nous permettre selon les recommandations bibliographiques de discriminer les rythmes métaboliques avec une périodicité de 24h de ceux avec une périodicité moindre ; - un nombre calculé de réplicats biologiques (n=6/groupe/temps) nécessaire à l’obtention de la puissance statistique souhaitée (=0,8), défini grâce à l’application RnaSeqSampleSize. Toutefois, de par notre expérience, le nombre de souris contrôle a été volontairement porté à n=9/temps, afin d’obtenir un nombre suffisant d’échantillons d’excellente qualité pour notre analyse (n=6/temps). De même, pour réduire l’hétérogénéité tumorale entre animaux porteurs de cancer pancréatique, nous avons délibérément augmenté le nombre d’individus de cette cohorte à n=9/temps pour avoir au final 6 tumeurs pancréatiques de grades similaires pour l’analyse RNASeq. Les résultats de cette étude seront analysés par nos collaborateurs experts en bioinformatique à l’aide d’outils spécifiques qu’ils ont développé ou qui sont utilisables gratuitement en ligne.
Raffinement
Des personnes compétentes en expérimentation animale seront en charge de la surveillance et de la manipulation quotidienne des souris avec un phénotype dommageable. Quotidiennement, des critères objectifs seront quantifiés et un score cumulé sera établi (e.g. Score cumulé 10 apparences et/ou comportements anormaux). Lorsque ce score cumulé est > à 10 pour une souris avec un phénotype dommageable, celle-ci sera rapidement euthanasié ainsi que son congénère de portée de même âge ayant un phénotype non-dommageable. Afin de minimiser l’hétérogénéité tumorale et obtenir des résultats robustes et significatifs, les souris ne peuvent être euthanasiées à des stades moins avancés et aucun anti-inflammatoire non stéroïdien ou dérivé morphinique ne peut être prescrit pour limiter les souffrances de l’animal avec un phénotype dommageable. En effet, les données bibliographiques montrent que leur administration altère le métabolisme tumoral, limite la croissance tumorale et/ou potentialise l’action de la chimiothérapie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine des rythmes biologiques de périodicité proche de 24h et très similaire à l'homme sur le plan génétique. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Les souris développant des tumeurs pancréatiques seront euthanasiées au stade de jeune adulte (environ 8,5 semaines après la naissance), stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont relativement homogènes et dites de haut grades, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à terme à améliorer l’efficacité des traitements anti-métaboliques chez ce groupe de patients en particulier.
Différences moléculaires de l’effet des antidépresseurs à action lente versus rapide dans différents modèles murins de dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 140 d'entre elles et sévère pour 280. Une partie subit une chirurgie de la patte induisant une douleur neuropathique pendant neuf semaines, une autre un stress répété une heure par jour pendant trois semaines, avant des tests d'anxiété et de dépression et une injection de kétamine. Le porteur indique que la douleur et les symptômes dépressifs ne peuvent être soulagés car ils sont l'objet de l'étude. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale chez l'animal vivant.
Objectifs
La dépression affecte approximativement entre 8% et 20% de la population. Les traitements pharmacologiques disponibles actuellement sont très insuffisants puisque moins d’un tiers des patients recevant une thérapie pharmacologique parviennent à la rémission après 14 semaines de traitement. En outre, les patients rétablis à la suite d’un premier épisode dépressif présentent un risque de récidive dans les 6 mois évalué à 50% en cas d’arrêt du traitement et il a été montré qu’en l’absence de traitement 15% des patients succombent à la suite d’un suicide et qu’entre 60% et 80% des suicides (entre 10000 et 15000 par an en France) sont le fait d’individus fortement dépressifs. Ainsi, la dépression est un problème majeur de santé publique, nécessitant de mieux comprendre ses origines biologiques afin de développer nouveaux traitements. Le stress chronique mais également la douleur chronique sont deux facteurs déterminant dans l’apparition de la dépression. En effet, environ 50% des patients souffrant de douleur ou de stress chronique vont développer une dépression. Actuellement il existe deux types de traitements utilisés pour soigner la dépression : les antidépresseurs à action lente (qui vont mettre plusieurs semaines avant d’agir) et les antidépresseurs à action rapide (qui vont agir dans les heures qui suivent). Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents au développement de symptômes dépressifs dans les cas de stress ou de douleurs chroniques et le fonctionnement de ces 2 types d’antidépresseurs restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Le but de ce projet est de caractériser et de comparer les changements biologiques dans des structures cérébrales clés connues pour être impliquée dans la dépression chez le mâle et la femelle traités par ces 2 types antidépresseurs.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les changements moléculaires dans 4 structures cérébrales d’intérêt induits par deux familles de traitements antidépresseurs : les antidépresseurs à action lente versus les antidépresseurs à action rapide (kétamine), dans deux modèles murins où la dépression est induite par des évènements différents. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de décrire les adaptations moléculaires liées aux différents traitements antidépresseurs dans deux modèles de dépression différents et ce chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 9 semaines ou un stress chronique pendant 3 semaines avec dans les deux cas développement de troubles anxio-dépressifs. Un premier lot d’animaux subira donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ. Ces animaux subiront plusieurs fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis une fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental. Ils subiront également 3 tests anxio-dépressifs d’une durée comprise entre 5 et 6 min selon les tests (avec 48h minium entre chaque test).Un second lot d’animaux subira un évènement stressant pendant 1 heure chaque jour pendant 21 jours. A la fin de ces 21 jours, ils subiront également 3 tests anxio-dépressifs d’une durée comprise entre 5 et 6 min selon les tests (avec 48h minium entre chaque test). Un lot d’animaux subira également une unique injection de kétamine d’une durée de 45 secondes environ.
Impact sur les animaux
Il y a présence de symptômes anxio-dépressifs et de douleur qui ne peuvent être soulagés car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux seront traités avec des antidépresseurs qui vont réduire leurs symptômes anxio-dépressifs.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements pour analyses de biologie moléculaires.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur et de sa composante émotionnelle et affective nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux explorant les comportements de type anxio-dépressif liés à la douleur chronique ou au stress imprédictible variable seront constitués de 20 souris car seulement 60 à 75 % des animaux développent un phénotype anxio-dépressif. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les 2 procédures expérimentales détaillées ci-après feront partie d’un enchainement et utiliseront les mêmes animaux, ce qui en réduira grandement l’effectif. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations moléculaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, nous metterons en place ces approches moins stressantes.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).