Procédures sévères

695 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures de niveau sévère. Elles reçoivent des injections, des électrocardiogrammes sous anesthésie, une stimulation électrique par sonde intracardiaque et, pour certaines, une chirurgie thoracique provoquant un infarctus, l'objectif étant de déclencher des arythmies ventriculaires pour en comprendre l'origine. Le porteur indique que la souris est très résistante aux arythmies et peu susceptible de mourir subitement, et que les animaux ne sont réveillés qu'après le retour à la normale du rythme cardiaque. Il affirme que la structure des fibres de Purkinje et la physiologie cardiaque ne sont pas reproductibles en culture, ce qui rend selon lui la souris transgénique "indispensable".

Objectifs

La mort subite cardiaque due à des arythmies ventriculaires représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de cardiomyopathies. Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cardiomyocytes spécialisés appelés fibres de Pukinje. Les fibres de Purkinje (PF) forment un réseau de cables qui transmettent une activité électrique responsable de la contraction coordonée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du coeur, plusieurs études suggèrent qu’elles jouent un role disproportionné dans les arythmies ventriculaires chez l’homme. L’objectif principal de ce projet est de comprendre l’effet d’un défaut des fibres de Purkinje dans la survenue d’arythmie ventriculaire. Notre hypothèse est que des perturbations de l'architecture du réseau ou de la fonction des fibres de Purkinje chez certaines formes de cardiomyopathies représentent un facteur de risque élevé d'arythmies ventriculaires et de mort subite. Pour cela nous allons étudier l’architecture du réseau de Purkinje et l’activité électrique cardiaque dans des modèles de cardiomyopathies ou d’ischémie cardiaque chez la souris. Nous allons comparer la fonction cardiaque par un suivi d’enregistrements d’électrocardiogramme et nous établirons leur degré de susceptibilité à développer une arythmie ventriculaire provoquée par pharmacologie, stimulation électrique ou par une approche de chemogénétique. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris mutantes pour les gènes Nkx2-5 et Tbx5, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent asociées à des arythmies. Nous avons aussi un modèle de souris dystrophique (mutation mdx) qui développe des troubles cardiaques avec l’âge sachant que les patients atteints de dystrophie musculaire développent inévitablement une atteinte cardiaque qui se manifeste par une insuffisance cardiaque, des arythmies et une mort subite. Nous étudierons aussi le role du remodelage du réseau des fibres de Purkinje dans un modèle d’infarctus du myocarde.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du myocarde et son identification chez l’homme n’est pas possible de manière non invasive. L’utilisation de souris transgéniques chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies dont la myopathie de Duchenne et dans un modèle d’infarctus du myocarde.

Procédures

Ce projet comprend plusieurs types d’intervention : - Injection en intrapéritonéale de molécules. Au maximum une souris pourra recevoir 4 injections au cours de sa vie et toujours à des moments différents. - Enregistrement d’un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse, cette procédure sera répétée jusqu’à quatre fois chez la même souris mais à un mois d’intervalle. Cette procédure dure moins de 10 minutes sauf pour certains enregistrements de 30 minutes. - Une stimulation électrique par l’introduction d’une sonde intracardiaque par la veine jugulaire sous anesthésie générale. - Chirurgie thoracique pour provoquer un infarctus du myocarde avec une opération sous hypothermie qui dure 15 minutes maximum.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet est de provoquer des arythmies ventriculaires chez des souris anesthésiées qui seront monitorées par électrocardiogramme. Ces événements seront induits sur une courte période (quelques minutes) qui devraient entrainer de arythmies sporadiques et de courte durée, les animaux ne seront réveillés qu’à la fin de ces épisodes quand la fréquence des battements cardiaques sera revenue à la normale, ensuite les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter le moindre changement comportemental. La souris est un modèle animal très résistant aux phénomènes d’aryhtmies et donc peu succeptible de générer une mort subite.

Devenir

Tous les animaux sont mis à morts et utilisés pour des analyses supplémentaires d'histologie ou de biologie moléculaire.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure du réseau de fibres de Purkinje et de la physiologie cardiaque qui ne sont pas reproductibles en culture ou par des organoïdes.

Réduction

Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Vu la variabilité des données physiologiques entre les souris, nous avons surestimé de 20% le nombre d’animaux par groupe pour inclure des tests préliminaires et pallier les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation.

Raffinement

Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), et la douleur des animaux. Lors d’interventions chirurgicales les souris sont anesthésiées par isoflurane. Une injection d’analgésique est effectuée en pré-opératoire lors de chirurgie thoracique, et répétée au besoin en post-opératoire. Pendant la chirurgie et la phase de réveil, le maintien de la température corporelle des animaux est assuré par l’utilisation de tapis chauffants. Le personnel animalier et les opérateurs augmentent la fréquence des visites après chirurgie pour s’assurer d’une bonne récupération des animaux. Si des signes évidents de souffrance sont détectés malgré l’usage d’antalgiques, les animaux sont euthanasiés.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est pertinente car l’architecture du réseau de Purkinje est très similaire à celui observé chez l’homme et que nous possédons des modèles de souris transgéniques uniques qui nous permettent de les cibler. Ces cellules sont très peu représentées et non identifiables sans la présence d’une protéine fluorescente comme la GFP, RFP ou cherry. Nous avons développé une nouvelle méthode pour les stimuler de manière non-invasive par chemogénétique. Nos modèles nous permettront de générer des modèles de cardiomyopathies par mutation conditionnelle ou constitutive de gènes spécifiques. Toutes ces mutations ne perturbent pas leur viabilité ou fertilité et les animaux se comportent normalement. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. Nous utiliserons des souris nouveaux-nées car c'est à la naissance que l'on peut cibler un maximum le réseau de Purkinje et que c'est à ce stade que le coeur est capable de régénérer dans le cas d'un infarctus du myocarde. Les électrocardiogrammes seront réalisés sur des souris à partir de 21 jours quand la fonction cardiaque se stabilise et jusqu'6 mois quand elle diminue.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 450 dans des procédures de niveau sévère. Selon les groupes, elles subissent une chirurgie du cerveau ou un gavage trois fois par semaine pendant deux mois, puis une batterie de tests comportementaux, dont le rotarod, la reconnaissance d'objets, le test de la nage forcée et le test splash, avant d'être tuées pour l'analyse du cerveau. Ces tests servent à mesurer les troubles moteurs, cognitifs, anxieux et dépressifs d'un modèle de maladie de Huntington. Le porteur affirme que les études in vitro et sur invertébrés ne permettent pas d'étudier ces comportements et que ce modèle est "nécessaire" à une visée thérapeutique.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique, neurodégénérative qui est la plus fréquente des maladies à expansion de polyglutamine maladie de Huntington (MH. Les principales manifestations cliniques de cette maladie génétique sont les mouvements choréiques, un déficit cognitif et des troubles psychiatriques. La transmission est autosomique dominante avec une pénétrance complète. La neuropathologie de la MH affecte préférentiellement le striatum au stade précoce de la maladie mais peut s’étendre progressivement à d’autres structures cérébrales. Il n’existe aucun traitement curatif de la MH si bien que la maladie progresse inexorablement vers la mort. Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués à la fois dans les symptomes moteurs et psychiatriques afin de proposer des cibles thérapeutiques testées chez la souris. Nous avons plusieurs cibles thérapeutiques que nous voulons étudier pour ce projet. L'objectif du projet est de préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neuroprotection induite par une protéine dégradant le cholestérol CYP46A1 dans la MH et de proposer et tester des petites molécules ayant des effets mimétiques de CYP46A1 comme nouvelles stratégies thérapeutiques dans deux modèles murins de la MH. Le phénotype des souris sera étudié par des approches méthodologiques très complémentaires les unes par rapport aux autres.

Bénéfices attendus

Les résultats prometteurs générés par cette étude permettront de mieux comprendre les effets bénéfiques de la protéine dégradant le cholestérol (CYP46A1) dans la Maladie de Huntington (MH) et d'évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles cibles cellulaires. La stratégie de thérapie génique adoptée au cours du projet est un point de départ important dans l’optique d’une thérapie efficace et durable chez les patients atteints de la MH. De plus, l'analyse comportementales de petites molécules mimant les effets de CYP46A1 sur le phénotype des souris modèles de la MH peut être d'un intérêt majeur pour un développement clinique thérapeutique.

Procédures

Les animaux sont soumis soit à 1 procédure chirurgicale (stéréotaxie) d'une durée de 40 minutes ou bien à des administrations par gavage de petites molécules d'une durée de quelques minutes : trois fois par semaine pendant 2 mois. Toute procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie. Aucun prélèvement n’est effectué sur les animaux vigiles. Les tests comportementaux permettant d'évaluer le phénotype moteur et cognitif seront réaliés en utilisant : le Rotarod (durée du test : 3 heures) , l'actimétrie (durée du test 1 heure), le cyclotron (durée du test 2 heures) , ces 3 tests seront réalisés une fois par mois chez les souris zq175 à l'âge de 7 mois jusqu'à 12 mois d'âge. Le test de reconnaissance d'objets (durée du test 15minutes, , 2 fois par jour pendant 4 jours), ce test est réalisé une fois chezles souris zq175 à l'âge de 8 mois. Pour évaluer le phénotype relié à l'anxiété et la dépression, les tests réalisés sont : O-maze (durée du test 12 minutes), clair&obscur (durée du test : 5 minutes), le test splash (durée du test 5 minutes) et la nage forcée (durée du test 6 minutes) qui seront réalisés une seule fois pour les souris zq175 entre 5,5 et 6 mois d'âge et une seule fois pour les souris R6/2 entre 8 semaines et 10 semaines d'âge . L'euthanasie est réalisée à la fin des tests de comportement dans le but d'effecteur les prélèvements de tissus.

Impact sur les animaux

Les procédures sont classées modérées et sévères. Les molécules injectées sont à valence protectrices et donc non nuisibles pour les animaux. Les nuisances ou effets indésirables possibles sont ceux liés aux actes chirurgicaux et au gavage des souris ainsi qu'à certains tests comportements associés à l'état dépressif et anxieux des souris. Un stress et une perte de poids peuvent éventuellement se manifester. Le comportement des souris dans leur cage est donc très minutieusement regardé durant et après les procédures. La règlementation est strictement appliquée et respectée.

Devenir

L'euthanasie des animaux se réalisée dans le but d'effectuer des études sur le cerveau des animaux afin de caractériser les effets neuroprotecteurs des cibles thérapeutiques choisies.

Remplacement

Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l'étude des comportements moteurs et reliés à la dépression et à l'anxiété. La neuropathologie des maladies neurodégénératives comme la MH est complexe , évolutive et multicellulaires ; l’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études ni de développer des stratégies à visées thérapeutiques pour obtenir des preuves de concepts pour une application translationnelle. Cependant, avant chaque procédure décrite dans ce projet, des résultats obtenus sur des cultures de cellules ont permis l'obtention de résultats solides afin de limiter les études in vivo chez la souris. En particulier, le choix d'agir sur les cibles provient de résultats obtenus sur des cultures cellulaires.

Réduction

Les résultats publiés et reliés à ce projet nous ont permis de définir le nombre minimal d'animaux permettant de générer des données statistiquement solides. C'est pourquoi, les analyses comportementales, biochimiques, neuropathologiques et moléculaires sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Les groupes d’animaux sont créés au fur et à mesure, avec les contrôles adaptés pour chaque procédure. Le nombre total d'animaux est de 900.

Raffinement

Les souris sont hébergés à l'animalerie avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Les chirurgies stéréotaxiques sont effectuées sous anesthésie (isofluorane au masque) et analgésique. Les souris sont regroupés après chirurgie pour limiter la période d’isolement et un enrichissement adapté pour les souris avec le nid végétal qui est placé dans la cage. Les souris font l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Ces contrôles, enregistrés et validés par la Structure chargée du Bien Etre des Animaux locale, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une surdose d’euthanasiant. (ces injections sont réalisées après une brève anesthésie ; induction à l’isoflurane).Les formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation sont suivies et permettent d’introduire des améliorations pour le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre Structure chargée du Bien Etre des Animaux et en interagissant avec le vétérinaire référant.

Choix des espèces

En application de l’article R. 214-106 du Code rural et la pêche maritime, l’expérimentation animale sera faite sur 2 lignées, modèles de rongeurs mus musculus génétiquement modifiés afin de satisfaire l’exigence d’utilisation d’animaux d’espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Deux lignées de souris sont utilisées car ce sont des modèles de mammifères qui reproduisent un certain nombre de symptomes moteurs, cognitifs, anxieux et depressifs qui sont caractéristiques des symptomes chez l'homme dans la maladie de Huntington. Une lignée présente des symtomes très précoces dans leur développement (5 semaines) qui correspond au cas juvénile de la maladie humaine. La deuxième lignée présente des symptômes plus tardifs à l'âge adulte, vers 5 mois. Pour la réalisation des tests comportementaux, les souris seront testées à 4 semaines pour une lignée tandis que les souris de la deuxième lignée seront utilisées à 4 mois. Dans la mesure où les souris de la première lignée présentent un phénotype comportemental très rapidement (entre 5 et 12 semaines), il est important de commencer l’étude phénotypique dès 4 semaines d’âge. En revanche, les souris de la deuxième lignée présentant un phénotype comportemental plus tardif (à partir de 5 mois) seront utilisées à partir de 4 mois d’âge. L’objectif du projet étant de valider des cibles thérapeutiques mises en évidence in vitro, un nombre minimum d’une quinzaine de souris par groupe sera nécessaire pour l'étude comportementale.

77 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 66 dans des procédures de niveau sévère. Ils reçoivent un cathéter veineux par chirurgie, sont immunodéprimés, puis infectés par voie intra-trachéale avec la bactérie Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes, pour tester la rifampicine seule ou associée au méropénème. Le porteur indique que l'infection entraîne chez les témoins une atteinte sévère pouvant provoquer une détresse respiratoire et la mort, des points limites devant en principe déclencher la mise à mort avant. Il affirme que reproduire la complexité d'une infection pulmonaire n'est aujourd'hui possible qu'à travers des modèles in vivo, et que le recours à l'animal est une étape "obligatoire et règlementaire".

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer l’efficacité de la rifampicine dans un modèle d’infection pulmonaire à CRAb (Acinetobacter baumannii résistants au carbapénèmes) chez le lapin immunodéprimé. En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine chez le modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe chez la souris où la rifampicine a entrainé une forte réduction bactérienne pulmonaire après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. La combinaison de la rifampicine avec un carbapénème (le méropénème) pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de pose de cathéter veineux. Certain subiront également une immunodépression via ce cathéter. Des traitements (rifampicine et méropénème) et des prélèvements sanguins (de 5 sur 5 jours pour le suivi de l’immunodépression à 12 sur 8h répétés 2 fois pour l’étude pharmacocinétique du méropénème) seront aussi réalisés par le cathéter.

Impact sur les animaux

1) Pose de cathéter : les animaux de ce projet devront subir un acte chirurgical pour la pose d’un cathéter veineux central. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale et accompagnée d’une analgésie adaptée, reste un acte invasif susceptible d’entrainer une gêne ou une douleur chez l’animal. La pose de cathéter permettra de limiter l’impact (stress et douleur) des prélèvements et des traitements répétés. 2) Immunodépression : Une trop forte dose d’endoxan (immunosuppresseur) peut entrainer des effets secondaires. Dans notre recherche de la dose idéale résultant en une immunodépression sans effet néfaste pour l’animal, un suivi rapproché sera mis en place pour anticiper l’atteinte des point limite. 3) Infection : réalisée elle aussi sous anesthésie générale, l’infection par voie intra-trachéale entrainera chez les animaux témoins, une infection sévère impliquant parfois une détresse respiratoire pouvant aboutir à la mort. → Des points limites spécifiques à ces nuisances ont été mis en place afin de limiter au maximum la souffrance des animaux

Devenir

Procédure 1 : Les animaux seront cathétérisés et immunodéprimés, ils ne pourront pas être réutilisés ou placés (risque d’infection élevé). Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Procédure 2 : Les animaux seront cathétérisés et subiront jusqu’à 2 procédures de traitement antibiotique, ils ne pourront pas être réutilisés ou placés. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Procédure 3 : Les poumons et la rate des animaux de cette procédure seront collectés pour réaliser des analyses microbiologiques. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.

Remplacement

Des analyses in vitro ont déjà été réalisées sur l’efficacité de la rifampicine sur certaines souches d’Acinetobacter baumannii. Toutefois réussir à retranscrire la complexité d’une infection bactérienne pulmonaire ainsi que sa diffusion tissulaire et systémique n’est aujourd’hui possible qu’à travers les modèles in vivo.

Réduction

Un protocole progressif sera utilisé pour la mise au point de l’immunodépression et permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Grace à la réutilisation des animaux, seulement 3 lapins seront nécessaires pour l’étude pharmacologique du méropénème. Pour réaliser une analyse statistique fiable, 6 animaux par groupe seront nécessaire à l’évaluation de l’efficacité de la rifampicine (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons et la rate par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté, enrichi et seront surveillés quotidiennement après la chirurgie puis au moins 2 fois par jour après l’immunodépression. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie avec une analgésie. L’infection sera également réalisée sous anesthésie générale. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La rifampicine est un antibiotique antibactérien de la famille des rifamycines, antituberculeux, antilépreux, dont le mode d'action est la formation d'un complexe stable avec la RNA polymérase des bactéries. Utilisé en clinique, son spectre antibactérien est large et comprend les staphylocoques, les streptocoques et les bactéries à croissance intracellulaire telles que les mycobactéries. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). La mesure de l’efficacité de la rifampicine ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal, ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. Les lapins représentent classiquement un des modèles de choix pour la réalisation d’infections bactériennes pulmonaires. Il est également particulièrement approprié à l’humanisation de la pharmacocinétique de traitement antibiotique. L’étude débutera lorsque les lapins auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

Une souris qui perd plus de 20 % de son poids en une semaine est mise à mort. 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 20 à un niveau sévère. Toutes reçoivent cinq jours d'injections intrapéritonéales de tamoxifène, puis, selon leur groupe, une injection de dexaméthasone ou de placebo, un mois de gavage quotidien à la prednisone ou au placebo, 24 à 48 heures de jeûne, ou trois heures de tests de tolérance au glucose et à l'insuline par prises de sang à la queue, pour étudier le rôle du gène Lsd1 dans la fonte musculaire, qui peut atteindre 20 % du muscle sous glucocorticoïdes et 30 % sous jeûne. Le porteur écrit que ce jeûne "pourra fortement affaiblir les animaux", précise n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, et annonce un bénéfice au conditionnel : contrôler cette voie "ouvrirait de nouvelles perspectives" contre les effets indésirables des glucocorticoïdes.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.

Bénéfices attendus

Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.

Procédures

L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h.

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur animal vigile car l'anesthésie serait plus "traumatisante" que les injections sur animaux non anesthésiés. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Souriceaux d'un modèle de la maladie de Menkès, elles subissent une biopsie de la queue sans anesthésie à sept jours, des injections sous-cutanées cinq jours par semaine, puis une imagerie TEP avec traceur radioactif, pour vérifier le passage d'un transporteur de cuivre vers le cerveau. Le porteur indique que les animaux malades non traités meurent entre trois et cinq semaines et que les injections répétées peuvent provoquer des lésions cutanées. Il affirme que ce modèle murin est le seul adapté et qu'aucune étude in vitro ne reproduit le passage du cuivre à travers la barrière sang-cerveau.

Objectifs

La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre au niveau des barrières intestinales, placentaires et sang-cerveau. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multisystémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et sang-cerveau est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion cellulaire augmentée grâce à leur faible taille donc pourraient traverser la barrière sang-cerveau. Dans ce cas, l’utilisation d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) serait une solution thérapeutique. Dans un projet précédent, nous avons démontré la tolérance du TSC, déterminé une dose de TSC et un rythme d’administration optimaux, et démontré l’amélioration des signes cliniques chez les animaux malades traités par TSC. Le but de ce nouveau protocole est de démontrer que le TSC est capable de franchir la Barrière sang-cerveau tandis que l’histidine-cuivre, traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes, ne le serait pas. Pour cela l’utilisation d’un radiotraceur tel le 64-Cu dans des techniques de tomographie à émission de positons permettra de répondre à cette question scientifique. L’objet de cet avenant porte sur l’allongement de la durée de la DAP expirant le 22/07/2022 et qui s’explique par plusieurs points. 1/ les 2 établissements dépendent de 2 CE différents, ce qui a créé un décalage de plusieurs mois entre les 2 autorisations. 2/ Une dérive génétique nous a contraint à une procédure de revitalisation qui a très largement retardé le projet (plus de 6 mois) alors que la saisine était déjà autorisée. 3/ Le taux de natalité des animaux mutants de ce nouveau lot est plus faible qu’habituellement, ce qui augmente le temps de production permettant d’obtenir le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.

Bénéfices attendus

Vérification de la biodistribution du médicament candidat et compréhension des mécanismes de clairance, recherche des effets toxiques potentiels et des zones d’accumulation du principe actif ou du cuivre résiduel. Nous observerons en parallèle l’amélioration de la motricité des animaux et restauration des fonctions altérées par la maladie.

Procédures

- Biopsie de queue réalisée chez la souris âgée de 7 jours. Le prélèvement est réalisé délicatement à l’extrémité de la queue, mesure moins de 1 mm sans toucher à la partie ossifiée. Par ailleurs, à ce stade de croissance il n'y a pas de poils et il suffit de peu de tissu pour réaliser un génotypage de qualité. Il n'y a pas d'anesthésie car cela induit un stress supplémentaire et inutile chez l’animal, le temps d'induction de l'anesthésie est au moins d'une minute tandis qu’une biopsie réalisée rapidement est peu douloureuse et sans aucun saignement, avec une cicatrisation très rapide de la zone lésée. Les injections sous-cutanées des traitements au niveau de la nuque seront réalisées 5 fois par semaine en prenant soin d'alterner les zones de piqure, chez les souris âgées de 5 jours et jusqu'au terme du protocole fixé à J35. A l’âge de 25 jours, transfert dans un nouvel EU (à moins de 2h de route) afin de procéder à la dernière étape du protocole qui est une imagerie médicale (TEP) nécessitant l'injection d'un traceur radioactif (animal anesthésié) quelques heures avant de réaliser le test (animal anesthésié). Au terme du protocole les animaux seront mis à mort afin de procéder aux dissections qui permettront une analyse biochimique et anatomopathologique complète.

Impact sur les animaux

Risque de mort prématurée des animaux malades non traités avec le TSC (espérance de vie estimée entre 21 et 35 jours). Injections sous cutanées répétées de médicament ou placebo 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J35, pouvant induire des lésions cutanées. Chez les animaux malades traités avec le TSC ou l’histidine cuivre, aucune toxicité liée au produit n'a encore jamais été observée. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires sont en cours. Injection de cuivre radioactif pour l’imagerie médicale réalisée sous anesthésie. Le radiotraceur sera présent durant 24h dans l’organisme avant la mise à mort de l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux du protocole (36 animaux) seront mis à mort à l’issue de la dernière imagerie TEP afin de prélever les organes d’intérêt et procéder à des analyses physiques (mesure de la radioactivité ex vivo), biochimiques et histopathologiques.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative pour étudier l’effet de la mutation du gène ATP7A sur le fonctionnement du cerveau car : 1 - Les défauts de transport du cuivre à travers la Barrière Sang-cerveau, et la biodistribution du cuivre à travers le cerveau ne peuvent pas être transposés dans un modèle d’étude in vitro 2 - Le modèle murin MoBlo est le plus proche de la maladie de Menkès chez l’homme et le mieux adapté pour évaluer le passage du produit radioactif à travers la barrière sang-cerveau et la restauration des paramètres physiologiques grâce au traitement avec le TSC administré par voie sous-cutanée.

Réduction

L’étude portera sur 36 souris mâles de laboratoire, réparties en 6 groupes de 6 mâles dont 3 groupes de 6 souris saines (sauvages) et 3 groupes de 6 souris mutantes (hémizygotes). Cette cohorte de 36 souris mâles sera étudiée et mise à mort une fois les analyses terminées afin de disséquer et analyser tous les organes d’intérêt. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux ne seront jamais maintenus seuls en cage, ils sont hébergés dans des cages autonomes avec filtrage de l'air entrant, et ces cages sont enrichies avec un tunnel et un carré de coton déchiquetable. Les souriceaux seront en contact permanent avec leur mère à laquelle nous donnerons les éléments nécessaires pour préparer un nid. La surveillance des animaux sera assurée quotidiennement par des personnels techniques qualifiés. Les animaux malades sont surveillés avec plus d’attention, et une procédure d’estimation et suppression de la douleur est en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). La gestion de la lignée mutante, qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en piqure sous-cutanée répétée 5 fois par semaine, l’imagerie médicale in vivo sous anesthésie et la mise à mort auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris se justifie par l’existence d’animaux porteurs de la mutation du gène ATP7A conduisant à une carence systémique en cuivre, proche de la maladie de Menkès observée chez l’homme. La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J35, correspondant à la fin de l’imagerie médicale en TEP. En effet, durant cette dernière étape, nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur la biodistribution du cuivre sur une période de 24h.