Procédures sévères
Réponse de l’épithélium broncho-alvéolaire lors d’une irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques chez la souris : focus sur les cellules club
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures de gravité sévère et 576 de gravité modérée. Elles reçoivent une irradiation pulmonaire de 80 Gy sous anesthésie et des injections de naphtalène destinées à détruire un type de cellules pulmonaires, pour mesurer leur rôle dans la fibrose radique. Le porteur indique n'avoir aucun recul au-delà d'un mois sur cette association et que les lésions pourraient provoquer des difficultés respiratoires, les prélèvements étant réalisés post-mortem à un et six mois. Il reconnaît que des organoïdes pulmonaires pourraient remplacer en partie les animaux mais que le laboratoire n'est "pas armé" pour les mettre en place.
Objectifs
La qualité de la prise en charge thérapeutique du cancer inclut la qualité du contrôle tumoral et la qualité de vie des patients, avec une espérance de vie de plus en plus longue c. La radiothérapie est très efficace mais génère des séquelles pouvant compromettre sévèrement la qualité de vie. Nous étudions les effets des rayonnements ionisants sur les poumons qui sont des organes à risque pour le traitement des tumeurs thoraciques (e.g. poumon, sein). La réponse pulmonaire aux rayonnements ionisants fait l’objet de nombreuses publications, mettant en avant le rôle de plusieurs types cellulaires dans le développement des dommages radio-induits, dont les pneumocytes de type I et II et les cellules endothéliales de la microvascularisation pulmonaire. Nous avons pu identifier un type cellulaire, les cellules club, comme candidat intéressant dans la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire. Ce sont des cellules situées sur l’épithélium bronchiolique et qui sont impliquées dans la protection de l’épithélium bronchiolique et dans la détoxification pulmonaire. Ce sont également des cellules souches potentielles, capables de se diviser et se différencier pour reconstruire l’épithélium endommagé. La protection épithéliale passe entre autres par la synthèse et la sécrétion d’une protéine (dont la diminution a été associée au développement de certaines pathologies comme la broncho-pneumopathie obstructive chronique). Dans nos travaux sur l’effet de la dose, du volume et du protocole de fractionnement sur les lésions pulmonaires, nous avons remarqué que les conditions d’irradiation aboutissant à de la fibrose pulmonaire étaient systématiquement associées à une diminution sévère du nombre de cellules club dans les bronchioles. Dans les schémas ne générant pas de fibrose, les cellules club n’étaient pas déplétées. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de déplétion transitoire des cellules club afin de déterminer l’impact de ce type cellulaire sur le développement des lésions radiques pulmonaires. La déplétion des cellules club est induite par injection unique de naphtalène par voie intra-péritonéale. La déplétion par le naphtalène est transitoire. Ce modèle est très utilisé dans la bibliographie et ne provoque pas de conséquence clinique notable chez les animaux.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle des cellules club dans la réponse aux rayonnements ionisants, et globalement de la réponse de l’épithélium bronchiolique, peut permettre d’améliorer l’index thérapeutique de la radiothérapie thoracique, en offrant des perspectives préventives ou thérapeutiques sur les lésions radiques pulmonaires.
Procédures
Tous les animaux : Irradiation 80 Gy, sous anesthésie (durée max 40 min) Selon les procédures et lots : - Injection intra-péritonéale sur animal vigile (unique ou répétée, jusqu’à une injection par semaine pendant 24 semaines) - Instillation nasale sous anesthésie (1 fois par semaine pendant 3 semaines) - Scanner sous anesthésie (4 minutes, max 4 fois)
Impact sur les animaux
D’après le recul acquis au laboratoire, l’irradiation focale pulmonaire à une dose de 80 Gy ne génère pas de conséquences cliniques notables jusqu’à 6 mois post-irradiation. L’absence de cellules club au moment de l’irradiation pourrait aggraver la sévérité des lésions. Sur l’association naphtalène/80 Gy nous avons un recul d’un mois, sans effet clinique notable. Aucune donnée n’est disponible pour le point 6 mois. Si les lésions sont fortement aggravées, les animaux pourraient développer des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les prélèvements aux points d’étude 1 et 6 mois seront faits post-mortem. Les prélèvements concernent tous les animaux du projet.
Remplacement
La réponse globale du tissu pulmonaire aux rayonnements ionisants ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un système biologique intégré. Il existe des modèles in vitro pouvant remplacer en partie l’utilisation d’animaux, à savoir les organoïdes pulmonaires. Ces modèles sont complexes à mettre en place et le laboratoire n’est pas armé à ce jour pour construire de tels modèles.
Réduction
Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer les tests statistiques requis, il est donc nécessaire d’avoir un minimum de 8 animaux pour chaque groupe irradié pour obtenir des résultats exploitables en fonction des analyses effectuées. Pour les groupes contrôles, 6 animaux sont suffisants. Pour les analyses en single cell RNA seq, le nombre d’animaux sera réduit à 3 à 4 par groupe, nombre suffisant pour obtenir des résultats robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (mise en place de grilles de score, suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est également l’espèce de référence utilisée au sein de notre laboratoire. Les précédents projets d’irradiation pulmonaire du laboratoire ont été menés sur souris. Les animaux seront utilisés entre 8 et 34 semaines, correspondant au stade adulte. Le stade adulte est choisi car la thématique de recherche concerne les séquelles des radiothérapies chez les adultes, les effets secondaires des tumeurs pédiatriques étant un domaine de recherche particulier.
Preuve de concept d’un modèle de glioblastome chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome humain leur sont implantées dans le cerveau selon trois techniques comparées, avec des chirurgies sous anesthésie, deux scanners et la pose d'électrodes intracrâniennes lors de la dernière intervention. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer une atteinte des fonctions cérébrales et, rarement, une paralysie d'une patte, les animaux étant tués en fin de protocole pour prélever les tissus. Il qualifie l'usage d'animaux d'"indispensable" et présente ce modèle comme un futur outil pour la recherche translationnelle et la formation des neurochirurgiens.
Objectifs
Les glioblastomes constituent des tumeurs cancéreuses cérébrales ayant un potentiel d’infiltration agressif, qui sont à l’origine d’une véritable problématique en thérapeutique humaine. Ces tumeurs sont difficiles à extraire totalement en chirurgie, ce qui entraîne généralement une survie limitée. Le projet consiste en la création d’un modèle de glioblastome chez le lapin, à partir de cultures primaires de cellules issues de tumeurs fraiches humaines de glioblastome. Afin de déterminer la meilleure méthode d’implantation, 3 techniques seront évaluées dans ce protocole. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle sur le gros animal de tumeur gliale avec les caractéristiques du glioblastome, la possibilité d’utiliser un tel modèle pourrait permettre à l’avenir d’améliorer les méthodes diagnostiques (imagerie, électrophysiologie), afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’améliorer les existantes.
Bénéfices attendus
Fournir un modèle de glioblastome issu de culture primaire de cellules extraites de tumeur fraiche humaine avec une voie d'implantation validée permettant : • De servir de modèle pour les projets de recherche translationnelle sur les glioblastomes • De valider de nouvelles approches thérapeutiques, notamment la chimiothérapie intra-artérielle (seule ou en association à la chirurgie) • D’évaluer de nouvelles techniques diagnostiques • D’enseigner la chirurgie d’exérèse aux neurochirurgiens en formation Dans un même temps, ce projet permettra pour la première fois sur un modèle animal d’identifier certains marqueurs de l'invasion cérébrale par la tumeur.
Procédures
La première session chaque animal aura la procédure chirurgicale adaptée à son groupe de voie d’implantation sous anesthésie générale (60 à 120 minutes environ). Une deuxième anesthésie générale sera effectuée au jour 10pour le contrôle scanner (30 min environ). Le dernier contrôle au jour 30 demandera également une anesthésie générale pour le contrôle scanner, et une chirurgie pour l’implantation d’électrodes sEEG et la pose de grille mini-ECoG permettant les mesures électrophysiologiques, pour laquelle l’animal ne sera pas réveillé à son terme (1 h environ).
Impact sur les animaux
L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Après mise en place des abords vasculaires des douleurs peuvent survenir suite à l’intervention. Il existe également une possibilité, très rare, de paralysie de la patte arrière du lapin en cas de lésion du nerf fémoral. L’étude portant sur des tumeurs cérébrales, une possible atteinte fonctionnelle du cerveau pourrait survenir en cas de croissance rapide.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques à des fins d’analyse en histologie.
Remplacement
Ce projet vise à concevoir un modèle de glioblastome chez le gros animal permettant la recherche pré clinique (diagnostique, thérapeutique). L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.
Réduction
Un contrôle intermédiaire effectué par scanner à 10 jours après l’implantation tumorale permettra de confirmer la croissance tumorale sans sacrifice. Pour chaque voie d’implantation étudiée, il a été décidé de n’utiliser que deux lapins par culture cellulaire pour diminuer le nombre d’animaux utilisés dans cette étude pilote.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Le comportement des lapins sera particulièrement suivi pour mettre en évidence une éventuelle atteinte des fonctions cérébrales, qui traduiraient une croissance rapide de la tumeur. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Si une infection survient, un traitement antibiotique adapté au lapin pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort. Par ailleurs, la décision a été prise d’effectuer un premier test d’implantation sur un nombre réduit d’animaux avec une lignée cellulaire connue moins agressive afin d’obtenir des informations sur le processus et d’améliorer la prise en charge.
Choix des espèces
Les modèles petits animaux (souris, rats) ne permettent pas d’utiliser les outils d'imagerie cliniquement disponibles en raison de leur petite taille et ne permettent pas le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques telles que le traitement par voie endovasculaire (chimiothérapie intra-artérielle) en raison de la limitation de la navigation distale des cathéters dans le réseau vasculaire. Le lapin possède une anatomie vasculaire intra crânienne se rapprochant de celle de l’Homme avec un polygone vasculaire à la différence du porc. Enfin, la taille des vaisseaux du lapin permet une navigation endovasculaire avec les micro-cathéters utilisés en neuroradiologie interventionnelle chez l’humain. Le poids des lapins New-Zealand adulte est supérieur à 3.5kg, soit autant qu'un nouveau-né, ce qui permet d'utiliser les appareils d'imagerie disponibles en clinique et d’évaluer des stratégies chirurgicales ou endovasculaires. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3kg500 pour la taille des artères.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue pour induire un cancer du foie, certaines recevant des drogues anticancéreuses, avec un suivi par imagerie jusqu'à un volume tumoral de 1 500 mm³. Le porteur qualifie la nuisance de l'injection de "temporaire" et inférieure à trente minutes, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut faire souffrir les souris. Il affirme que la validation in vivo est "indispensable" après les tests sur cultures cellulaires et organoïdes.
Objectifs
La grande complexité du carcinome hépatocellulaire (CHC) est liée à plusieurs caractéristiques influençant leur évolution et leur résistance au traitement, notamment son hétérogénéité moléculaire intra- et inter-tumorale. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin génétiquement modifié qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de coopérants pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en utilisant la technique d'injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris (IH) qui permet de transfecter des plasmides dans une certaine proportion d'hépatocytes (0.1% - 1% d'hépatocytes).
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue. La durée est très courte (inférieure à 5 secondes). Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue, par voie orale (per os), intrapéritonéale ou intraveineuse (veine de la queue). Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance, induite par l'injection IH, n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Pendant cette période, les souris seront suivies constamment par les expérimentateurs. Au delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial de la tumorigenèse, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux. Cependant, la formation des tumeurs pourra induire chez certaines souris des souffrances que nous évaluerons et que nous essaierons de minimiser grâce à des stratégies d’optimisation de bien être animal couramment utilisées dans l'ensemble de nos projets de recherche (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d'hébergement). A la fin de l'expérience (entre 2-5 mois et/ou lorsque les tumeurs atteignent au volume total maximal de 1500 mm3), les souris seront euthanasiées. Le volume des tumeurs étant évalué par imagerie non invasive.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, ce qui est le cas lors d’expériences réalisées avec les animaux. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères: poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation).
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Réponse moléculaire de l’endothélium vasculaire à l’irradiation chez la souris : intérêt pour la prédiction du risque de toxicité pulmonaire après une irradiation localisée du thorax à forte dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Uniquement des mâles, elles reçoivent une irradiation localisée du thorax de 17 à 20 grays sous anesthésie, avec un risque de détresse respiratoire voire de mort aux doses les plus fortes, avant d'être tuées pour prélever les poumons. Le porteur étudie la réponse des cellules des vaisseaux à l'irradiation pour améliorer un modèle de prédiction de la toxicité pulmonaire de la radiothérapie. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe, tout en présentant ce projet comme une étape vers un modèle in vitro censé, à terme, "remplacer l'expérimentation animale".
Objectifs
L’irradiation localisée à forte dose engendre des lésions tissulaires d’origine plurifactorielle et liées à l’altération de nombreux types cellulaires. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de développer des moyens de limiter ces toxicités tout en conservant/augmentant le contrôle tumoral. Avec les nouvelles pratiques avec des débits de doses plus importants et des faisceaux de particules de plus grandes énergies, il est essentiel de comprendre les mécanismes conduisant aux lésions tissulaires, limiter les toxicités et développer des moyens de prédire la toxicité tissulaire. Un des programmes a pour objectif de concevoir des outils de prédiction des risques de complications liés aux nouvelles pratiques de radiothérapies, en se basant sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro. Nous nous appuyerons sur les mesures de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales in vitro : expression de gènes, sénescence ou cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. Jusqu’à présent, la difficulté d’isoler les cellules endothéliales à partir d’organes rendait difficile l’étude de leur réponse moléculaire. Depuis quelques années, les études sur cellules uniques sont devenues réalisables. Il est possible de mesurer l’expression de milliers de gènes dans des cellules uniques par des approches de séquençage de l’ARN à haut débit et de cytométrie en flux pour évaluer simultanément l’expression des protéines sur des cellules uniques. La phase 1 a été réalisée dans un projet précédent et a permis de choisir le poumon. Dans la phase 2 du projet, présentée ici, il s’agit d’irradier le poumon à différentes énergies et différents débits de doses afin d’étudier la réponse des cellules endothéliales et immunitaires. Ces expériences nous permettront de comprendre comment les cellules endothéliales répondent à l’irradiation in vivo au niveau moléculaire et comment elles interagissent avec les cellules immunitaires, de corréler les niveaux d’expression de gènes et de protéines des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in situ à ceux des cellules endothéliales cultivées in vitro, et d’étudier la toxicité de ces modalités d’irradiation chez la souris.
Bénéfices attendus
L’objectif global de ce projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues des poumons irradiés in vivo chez la souris afin d’améliorer notre modèle de prédiction du risque de séquelles tardives radio-induites dues à la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est d’une part une meilleure compréhension de la réponse des cellules endothéliales in vivo, et d’autre part un renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles sur des cellules en culture en comparant les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle aura pour but d’évaluer les risques in vitro sans recourir à l’expérimentation animale. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : (i) par une meilleure compréhension de la réponse à l’irradiation et à différentes modalités d’irradiation des cellules endothéliales in vivo, nous pourrons mieux comprendre comment les séquelles radio-induites sont initiées et comment elles se développent ; (ii) par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous souhaitons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie volatile (isoflurane) (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément par anesthésie par volatile (isoflurane) afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Certains animaux seront imagés au micro-CT sous anesthésie volatile (isoflurane) juste avant l’euthanasie (durée max de 10 minutes). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation du thorax à 17 Gy est assez bien caractérisé dans notre laboratoire. Cependant, les configurations d’irradiation sont différentes de celles utilisées dans les études précédentes (énergies des faisceaux, débit de dose, champ d’irradiation) ce qui nécessite des tests préliminaires à différentes doses (17, 18, 19 et 20 Gy). Les doses les plus fortes pourraient occasionner des douleurs et l’euthanasie ou la mort prématurée d’une partie des animaux, c’est pourquoi la première étape du projet s’attachera à définir la dose d’irradiation suffisante pour induire une fibrose pulmonaire à long terme sans entrainer la mort des animaux. Aux plus fortes doses, les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder, c’est pourquoi nous avons prévu une première étape qui permettra de déterminer la dose qui permet de générer des lésions tardives pulmonaires de type fibrose sans engendrer de la mortalité. Les animaux devront être euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, des groupes de 10 à 12 animaux sont nécessaires. Pour les analyses moléculaires, des groupes de 4 à 6 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). Nous utiliserons des souris mâles afin d’avoir des animaux de poids suffisamment important (animaux de 20-25 gr à 10-12 semaines). Nous avons fait le choix scientifique de ne travailler que sur des mâles dans un premier temps, car nous avons au laboratoire un recul conséquent de ce modèle sur des souris de sexe mâle. Nous envisageons un futur projet sur des femelles pour étudier les conséquences de la dose d’irradiation choisie à une modalité d’irradiation. La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour ce modèle.
Développement d’un modèle murin sur rat Fischer de lambeau libre perforant ostéo-cutané par ingénierie tissulaire pour la reconstruction des pertes de substances osseuses interruptrices de mandibule
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une opération de deux heures, puis jusqu'à huit semaines de suivi : des rats Fischer mâles reçoivent dans un défaut de taille critique de la mandibule une construction osseuse vascularisée, implantée huit semaines plus tôt autour d'un pédicule vasculaire. 60 rats vont être utilisés, dont six pour un prélèvement de moelle osseuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil, léger et sévère, et tous sont tués à l'issue pour analyser les implants. Le projet doit mettre au point un lambeau associant os imprimé en 3D et peau, pour reconstruire la mâchoire après un cancer ou un traumatisme sans prélever d'os ailleurs sur le patient, et le porteur le présente comme une étape avant des expériences sur "de plus gros animaux". Il ne décrit pourtant qu'une douleur faible, aucune limitation de mobilité et une possible gêne à s'alimenter, sans dire quelle procédure justifie le classement d'une partie des rats en souffrance sévère.
Objectifs
Les pertes de substances pluritissulaires ostéo-cutanées ou ostéo-muqueuses suite à un traumatisme, une chirurgie cancérologique ou une infection représente un défi pour la chirurgie reconstructrice du fait des différents types de tissus à reconstruire et régénérer. Ces pertes de substance peuvent être accompagnées de séquelles fonctionnelles, sensorielles, sensitives, ou esthétiques non négligeables avec des conséquences multiples pour la victime (intégrité physique et morale affectée). Ceci étant d’autant plus vrai pour les pathologies maxillo-faciales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau chez le rat, ce lambeau se voudra bi tissulaire (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes de la mandibule en s’affranchissant de prélèvements séquellaires. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéocutanés tels que une fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelle sur la zone donneuse.
Procédures
Expérimentation animale préliminaire (14 rats, deux semaines) Expérimentation animale avec réalisation d’une construction osseuse vascularisée avec implants mis en place 8 semaines (4 groupes de 8 rats et 6 rats permettant le prélèvement de moelle). Le geste de mise en place d’un implant ayant pour durée 20 minutes. Pour la preuve de concept de réparation de substance ostéo-cutanée mandibulaire, une construction osseuse vascularisée pendant 8 semaines, puis transférée dans un défaut mandibulaire de taille critique lors d’une intervention chirurgicale de 2 heures. La consolidation de la réparation sera évaluée à une durée allant jusqu'à 8 semaines post transfert.
Impact sur les animaux
Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la première expérimentation (dissection du lambeau perforant) et deuxième (mise en place de l’implant autour du pédicule in situ) - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier - Les éventuels effets dureront 2 semaines lors de la première procédure, 8 semaines pour la moitié de chaque groupe dans la deuxième procédure et deux semaines supplémentaires pour l’autre moitié de chaque groupe. Concernant la chirurgie maxillo-faciale, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée.
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire afin d’analyser les implants mis en place autour du pédicule vasculaire du lambeau.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux avant d’envisager des expériences sur de plus gros animaux et l’ultime but : l’utilisation chez l’homme. Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux n’est possible; les systèmes de bioréacteurs in vitro n'étant pas assez avancés pour réaliser le projet. Seul un modèle animal vivant permet de nos jours la génération d'une construction osteo-cutanée transplantable selon les principes du bioréacteur in vivo.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’utilisation de rat Fischer mâles permet un prélèvement de moelle osseuse plus important sans devoir prélever sur tous les rats. Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente (P = 95%, alpha 1%), le nombre d’animaux pour les procédures 1 et 2 a été évalué à à 14 et 8 par groupe (4 groupes soit 32 rats). Un animal supplémentaire par groupe est requis afin de pallier les possibles complications expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit un cycle jour/nuit saisonnier (e.g., 12h/12h/ été, 8h/14h hivers) avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 2 pour limiter le stress de la surpopulation ou de l’isolement. Des tunnels pour les rats seront placées dans la cage pour permettre aux animaux de s’enfouir et se cacher. Chaque protocole a été choisi pour répondre à une question précise, par sa reproductibilité afin de réduire la variabilité expérimentale et par conséquent le nombre d’animaux utilisés par expérience. Le protocole sera interrompu le plus tôt possible en accord avec des points limites définis et réalisés sur le plus petit nombre d’animaux possible suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative. La fréquence des inspections sera faite tous les jours pour ce protocole. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des animaux. La prise en charge de la douleur des animaux sera réalisée par injection en sous cutanée de lidocaïne et de buprénorphine dès l’anesthésie et ceci avant le geste opératoire (injection répétée toutes les huit heures pour la buprénorphine pendant deux jours si besoin). Des AINS seront administrés de manière systématique pendant au moins deux jours.
Choix des espèces
Le rat permet une première approche in vivo avant de tester les hypothèses confirmées avec ce modèle sur des animaux plus similaires à l’Homme, puis chez l’Homme. C’est un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des rats adultes, c'est-à-dire, âgés de 10 semaines (300g), ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années dans notre laboratoire et dans la littérature.
MISE AU POINT D’UN MODELE MURIN DE CANCER DU PANCREAS
- Recherche appliquée
- Cancers
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour développer spontanément un cancer du pancréas, elles subissent des échographies hebdomadaires, des jeûnes de 16 à 20 heures, jusqu'à six prélèvements sanguins et l'administration de produits sur huit semaines, avec métastases, perte de poids et ascite attendues. Le porteur veut caractériser ce modèle KPC et constituer une banque de tumeurs pour tester des candidats médicaments. Il affirme qu'il est "impossible de reconstituer in vitro" la complexité d'une tumeur et son microenvironnement, rendant selon lui les études in vivo "indispensables".
Objectifs
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) représente 90-95% des cancers du pancréas et est un cancer très agressif (survie
Bénéfices attendus
Actuellement, les études pharmacologiques pré-cliniques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de greffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut représenter une barrière physique à la diffusion des traitements anti-cancéreux. La souris KPC développe spontanément un cancer du pancréas qui présente de nombreuses similarités avec le cancer du pancréas humain (microenvironnement tumoral, morphologie des cellules tumorales, effets secondaires…). Elle représente de ce fait un modèle d’intérêt dans la recherche de nouveaux candidats médicaments pour le traitement du cancer du pancréas. Comme le microenvironnement tumoral spécifique à ce cancer peut représenter une barrière à la diffusion des molécules anti-tumorales, ce modèle pourrait être plus prédictif de l’efficacité des candidats médicaments chez le patient souffrant de cancer du pancréas. De plus la greffe de fragments tumoraux KPC pourrait permettre d’obtenir un modèle d’ACP avec une récapitulation des principales caractéristiques de la pathologie humaine tout en évitant les signes cliniques attendus et associés au développement spontané de l’ACP chez la souris KPC. Ce modèle permettrait notamment de suivre plus facilement la croissance tumorale à l’aide d’un pied à coulisse. Il pourrait ainsi devenir un modèle d’ACP facile pour mieux sélectionner les candidats médicaments. Finalement, ces 2 modèles pourraient représenter des modèles précliniques plus pertinents et prédictifs de l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Enfin, la réalisation d’une banque de tissus de tumeur pancréatique représente un intérêt fort pour les projets de recherche sur le cancer du pancréas puisque les futures cibles thérapeutiques pourraient être validées dans ces tissus conservés.
Procédures
- Puçage : réalisé une seule fois quelques jours avant l’étude. Ce puçage dure moins de 1 minute. - Mesure du volume tumoral par échographie. Réalisé à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. - Prélèvement de sang : peut être réalisé de façon répétée (jusqu’à 6 fois chez le même souris) ou de façon unique. La durée d’un prélèvement de sang est de moins de 1 minute. - Administration de produits. Ces administrations peuvent être réalisées de façon quotidienne, biquotidienne ou à raison de 1 à 2 fois par semaine sur une période de 8 semaines maximum. Les administrations durent de quelques secondes à 1 min selon la voie d’administration. - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif : le prélèvement est réalisé une seule fois et dure environ 1 min.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, nous serons vigilants sur les effets indésirables suivants qui peuvent survenir chez la souris KPC: • Tumeur du pancréas spontanée et apparition de métastases dans les tissus adjacents au pancréas. • Perte de poids pouvant être associée au développement du cancer du pancréas. • Signes cliniques rares : abdomen gonflé dû au développement d’une ascite ou d’une jaunisse. • Inconfort lié à l’induction de la pathologie. • Possibilité d’avoir recours à une mise à jeun de 16 à 20 heures préalable à chaque échographie.
Devenir
Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, recherche ou confirmation de cibles, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) préparation de fragments pour greffe d’études d’efficacité.
Remplacement
L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de sélectionner les molécules les plus efficaces. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. Les souris KPC représentent un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement du cancer du pancréas puisque ce modèle récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre la tumeur et son micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a donc pas de méthodes substitutives.
Réduction
• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la croissance de la tumeur dans la souris KPC. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études d'efficacité de traitement. • En fin d’étude, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gènes d’intérêt…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons.
Raffinement
• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique quotidienne pouvant être biquotidienne dès observation d’un signe clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. Une grille de scoring individuel (avec suivi de : poids, gonflement de l’abdomen, couleur oreille/ patte) sera mise en place en concertation avec la SBEA afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. • Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Les tumeurs sont mesurées 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et anticiper l’application des points limites le plus précocement possible. • Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen caractéristique de l’apparition d’ascite. • Pour des prélèvements de sang d’un volume faible, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal afin d’éviter des biais interindividuels.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, le modèle préclinique de cancer spontané du pancréas associé à des mutations de gènes spécifiquement associés au cancer du pancréas est uniquement décrit chez la souris. La souris est donc l’espèce de choix. Les souris KPC seront utilisées de 4 à 24 semaines afin de pouvoir observer toutes les étapes du cancer du pancréas.
Chirurgies d’implantation de dispositifs permettant la diffusion de substances ou le suivi de paramètres biologiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 2500
5 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation, sous la peau ou dans l'abdomen, d'un dispositif diffusant des substances ou mesurant des paramètres biologiques, avec jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, puis sont expédiés vivants aux chercheurs ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Le porteur produit ces modèles implantés pour la communauté scientifique et revendique qu'ils réduisent le stress lié aux manipulations répétées. Il prévoit des animaux surnuméraires liés au taux d'échec des chirurgies et admet un "phénotype dommageable" possible selon les besoins du projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique des modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) d’implants sous la peau ou dans l’abdomen permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit la mesure de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension).
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles implantés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension) chez l’animal sans la moindre manipulation de la part du chercheur et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des manipulations répétées. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, …) tout en réduisant les nuisances posssibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel implanté. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place de l’implant suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel implanté. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles implantés a pour objectif de mettre à disposition des modèles rongeurs implantés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou du comportement des individus face à une substance ou un stimulus. Cela entraîne de nombreux mécanismes différents et implique de nombreux organes. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les implantations permettent le suivi de paramètres biologiques ou l’administration de substances en continu sans intervention humaine ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des manipulations répétées. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration appropriée d’analgésique et/ou d’anesthésie locale, sous le contrôle d’un vétérinaire. Une réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation positive des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel implanté, selon les recommandations éthiques en vigueur et les recommandations du fournisseur.
Implication d’un canal potassique dans la sensibilité douloureuse inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine, elles reçoivent dans une patte une injection d'agent inflammatoire, formaline, carraghénane ou adjuvant complet de Freund, puis subissent des tests de sensibilité douloureuse thermique et mécanique avec possibilité d'échappement, avant d'être tuées pour prélever cerveau, ganglions et poumons. Le porteur étudie le rôle de cette protéine dans la douleur, avec l'espoir de nouveaux antidouleurs pour l'humain. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" à l'expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse.
Objectifs
Les protéines que nous étudions sont connus pour leur implication dans la régulation des messages nerveux, notamment des neurones. Nos recherches nous mènent à penser que la protéine que nous étudions est impliquée dans la transmission de messages douloureux. Elle pourrait donc représenter une cible pharmacologique importante pour l'Homme dans le domaine de la douleur. Disposant déja d'une lignée de souris transgénique n'exprimant pas cette protéine, nous étudierons les effets de de l'absence de cette protéine sur la sensibilité de ces souris. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les cerveaux/ganglions/poumons dans le but de réaliser des analyses de ces organes.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait mettre en évidence le rôle de cette protéine dans la régulation de la douleur. Ainsi, ce projet pourra apporter des informations nouvelles sur le fonctionnement de la douleur et ouvrirait la voie à la recherche de nouveaux anti-douleurs chez l'Homme.
Procédures
Les seules interventions que subiront les animaux sont des injections d'agents inflammatoires. Il y aura 4 procédures. Dans une procédure, un total de 96 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection intra-plantaire unique d'un agent inflammatoire appelé formaline dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Dans deux autres procédure, un total de 192 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection unique d'un agent inflammatoire appelé carraghénane dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Dans une dernière procédure, un total de 48 animaux mâles et femelles seront soumis à l'injection unique d'un agent inflammatoire appelé adjuvant complet freudien dans une patte, cette injection sera réalisée en quelques secondes. Les animaux seront âgées de 7 à 8 semaines dans le but d'éviter les variations de perception douloureuse dues à l'âge. Ces tests seront réalisés sur animaux mâles et femelles dans le but de déterminer s'il existe une différence lié au sexe.
Impact sur les animaux
Après injection d'un agent inflammatoire, les animaux sont susceptibles de présenter différents troubles comme une altération de la locomotion, une absence de toilettage ou encore du stress, c’est pour cela qu’une attention particulière sera accordée à chacun de ces animaux tout au long de la période de test inflammatoire. Des tests de sensibilité douloureuse thermique et mécanique avec possibilité d'échappement seront réalisés sur les animaux, les nuisances sont donc limitées par la possibilité d'échappement du test par l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever leurs cerveux, ganglions de la racine dorsale et poumons. Ceci nous permettra de pouvoir analyser ces organes, c'est la seule façon de pouvoir obtenir des informations essentielles pour l'étude de notre protéine dans les voies de la sensibilité et de la douleur.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer le fonctionnement d'une protéine dans les voies de la douleur. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour observer la sensibilité douloureuse, il nous est donc impossible de remplacer les animaux pour étudier les voies de la douleur.
Réduction
Nous avons pris des mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d'abord, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les cerveaux/ganglions/poumons dans le but de réaliser des analyses de ces organes. Nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière a utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour les 2 tests de sensibilité inflammatoires chroniques, divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux pour cette procédure.
Raffinement
Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et aux bien-être des animaux tout au long de leur vie. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les facteurs pouvant influencer la sensibilité. Nous avons concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire, allant de 45min à 3h dans le but de diminuer au maximum l'inconfort et la souffrance potentielle des animaux.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude, nous n'auront donc pas besoin de générer de nouveaux modèles. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.
Caractérisation phénotypique de modèles murins du syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de quatre mutations du gène MECP2 modélisant le syndrome de Rett, elles enchaînent des tests comportementaux nommés dans le résumé, dont le rotarod, la barre crantée, l'enfouissement de billes, la reconnaissance d'objet, un test de sensibilité sur plaque à 52 °C et un test de crises épileptiques déclenchées par injection d'un agent convulsivant. Le porteur indique que ces mutations entraînent une mortalité précoce et n'utilise que des mâles alors qu'il rappelle que le syndrome touche les filles. Il décrit cette caractérisation comme une étape "indispensable" avant d'envisager une thérapie génique, objet d'une demande séparée.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Seules les filles sont atteintes de cette pathologie, les garçons étant très rares et mourant d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi qu'une sensibilité accrue aux crises épileptiques, des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse visant à corriger le gène muté MECP2. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous allons caractériser quatre modèles de souris portant des mutations dans le gène MECP2 représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous permettra de sélection le ou les modèles les plus pertinents pour évaluer une approche de thérapie génique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).
Bénéfices attendus
La caractérisation des modèles de souris du syndrome de Rett, notamment une caractérisation des symptomes observés chez la souris dans nos conditions en comparaison à la clinique humaine, nous permettra d’avoir une meilleure compréhension du déroulement de la pathologie et des méchanismes impliqués dans la maladie. Cette caractérisation nous permettra d'évaluer dans un deuxième temps une approche de traitement par thérapie génique et la correction du phénotype, en suivant le même protocole.
Procédures
Nous allons réalisé les tests d'exploration fonctionnelle suivants à 7-12 semaines d'age, chacun des tests étant réalisé une seule fois: activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); labyrinthe en croix surélevé pour évaluer l'anxiété (5 minutes); observations cliniques (15 minutes); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test d'enfouissement de billes pour évaluer l'anxiété et/ou des troubles compulsifs (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); étude de la sensibilité thermique ( 30 secondes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection de PentyleneTetraZole (agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes); le suivi du poids des animaux (1X/semaine). Maintien d'une lignée à phénotype sévère.
Impact sur les animaux
Les mutations dans le gène MECP2 induisent une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 10 à 30 semaines selon la mutation. Durant le test de sensibilité à la douleur thermique, les souris sont exposées à une température de 52°C sur une plaque chauffante. Au premier signe pouvant indiquer une souffrance (retrait de la patte, cri...), le test est arrêté et la durée est enregistrée. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés), et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire et raideur) surviennent; la durée et la latence sont enregistrées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences par inhalation croissante de CO2, notamment après le dernier test qui peut potentiellement induire des crises épileptiques.
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de souris portant des mutations dans le gène MECP2 représentatives de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptomes de la maladie de Rett, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 15 males mutants et 15 males controles pour évaluer le phénotype des animaux, pour chacune des 4 mutations MECP2. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à ces mutations, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Lors du test de sensibilité thermique, l’animal est retiré du test dès la première réaction de douleur observée au niveau des pattes arrière. Si aucune réaction n’est observée, le test s’arrête au bout de 30 sec. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal.
Choix des espèces
Le modèle souris portant des mutations dans le gène MECP2 permet de reproduire les symptomes du syndrome de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi dans un deuxième temps d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Nous utiliserons des animaux "adolescents" / adultes jeunes (7-12 semaines d'age pour réaliser l'ensemble de la procédure), age où s'installent les phénotypes (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptomes du syndrome de Rett).
Caractérisation d’un modèle de rat pour la Dystrophie Musculaire de Becker.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Génétiquement modifiés pour développer une dystrophie musculaire de Becker, ils passent des examens présentés comme non invasifs (électrocardiogramme, échocardiographie, pléthysmographie, test de préhension, tapis roulant) puis sont tués à des âges échelonnés jusqu'à trente-deux mois. Le porteur précise qu'une partie des animaux est laissée jusqu'à la mort naturelle pour établir une courbe de survie. Il espère que ce rat deviendra le "modèle animal de référence" de la maladie, aucun modèle n'existant à ce jour, et renvoie les bénéfices thérapeutiques au moyen terme.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Becker est une pathologie affectant les muscles cardiaque et squelettiques, liée à des mutations dans un gène situé sur le chromosome X. Ces mutations entrainent des anomalies de l'expression d'une protéine appelée, la dystrophine, qui a pour rôle de protéger la membrane de la cellule musculaire lors de la contraction. Cette pathologie est liée au même gène que celui de la dystrophie musculaire de Duchenne mais la symptomatologie en est globalement moins sévère car la protéine n'est pas complètement absente dans ce cas-là mais anormalement courte. La dystrophine anormale fragilise les cellules musculaires qui sont de fait plus sensibles aux contraintes mécaniques. La maladie débute pendant l'enfance, souvent après l'âge de 7 ans, mais parfois plus tardivement. Les symptômes caractéristiques chez les enfants sont la marche sur la pointe des pieds ou des crampes pendant l'exercice, accompagnées ou non d'un signe de la dégénérescence des fibres musculaires détectable par la présence de myoglobine dans les urines. Au fur et à mesure que la pathologie évolue, la faiblesse musculaire peut entraîner des difficultés fonctionnelles : difficulté à monter les escaliers ou à se lever d'une chaise. La maladie progresse lentement et environ 40 % des patients affectés finiront par devenir dépendants du fauteuil roulant. Chez les patients en fauteuil roulant, la faiblesse des muscles intercostaux et du diaphragme engendre une insuffisance respiratoire. Les anomalies cardiaques sont rarement observées au début de la pathologie mais lorsqu'elles surviennent, l'atteinte cardiaque est alors caractérisée par une augmentation de la cavité cardiaque et est disproportionnée par rapport à l'atteinte des muscles squelettiques. À ce jour, il n'existe pas de modèle animal pour la dystrophie musculaire de Becker, ni aucun remède, mais de nouveaux traitements sont en cours d’élaboration. L’objectif de ce projet est de caractériser le phénotype d'un modèle animal unique pour cette maladie que nous venons de créer en espérant qu'il mime parfaitement la pathologie humaine et ceci afin de l'utiliser par la suite pour le développement de traitements efficaces.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à caractériser un modèle unique de dystrophie musculaire de Becker qui pourrait être utilisé pour mieux étudier cette maladie. A moyen terme nous espérons que ce modèle sera utile à la communauté scientifique pour développer et tester de nouvelles thérapies comme c'est le cas avec notre modèle de rats de la dystrophie musculaire de Duchenne.
Procédures
Les prélèvements ne seront réalisés qu'après la mise à mort dans la procédure de caractérisation du phénotype dystrophique du modèle BMB. Il n'y a pas de procédure chirurgicale prévue dans la présente saisine. Les tests fonctionnels auxquels sont soumis les animaux pour la caractérisation du phénotype sont non invasifs, ne seront pas faits les mêmes jours et s'ils doivent être combinés ils le seront par deux: un test passif (ECG par holter - 12h, echocardiographie - 20min, plethysmographie - 15 min) et un test actif (grip test -10min, tapis roulant - jusqu'à arrêt spontanné de l'animal ou analyse de la démarche - 15min).
Impact sur les animaux
La procédure d'elevage n'engendre aucune nuisance. En procédure de survie, il n'y a pas de manipulation sur les animaux pouvant générer stress ou douleur, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur sinon que les rats BMD développement spontanément d'une dystrophie musculaire faible à modérée. Dans la procédure de caractérisation du phénotype, les animaux pourraient être stréssés par les manipulations et la contention liée aux examens comme le grip test, la plethysmographie et l'echocardiographie.
Devenir
En dehors de la procédure pour établir la courbe de suivie où nous devons aller jusqu'au décès naturel des animaux BMD, dans les procédures d'élevage et de caractérisation du phénotype du modèle BMB, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale d'une dose létale de pentobarbital sodique après l'induction d'une anesthésie 20 à 30 minutes avant, soit lors du remplacement des couples reproducteurs dans la procédure d'élevage soit à chaque point d'observation défini dans la procédure de caractérisation du modèle (6, 9, 12, 18, 24, 28 et 32 mois).
Remplacement
Nous souhaitons avec ce projet répondre à des questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante les uns avec les autres ce à quoi l'utilisation des cultures cellulaires ne peut pas répondre intégralement.
Réduction
Chez l’homme la variabilité entre patients atteints d’une dystrophie musculaire de Becker est plus importante que chez les patients atteints d’une dystrophie musculaire de Duchenne, c'est pourquoi dans cette étude de caractérisation nous souhaitons utiliser des groupes de 10 rats BMD et 5 rats sauvages pour nos analyses afin d'être en mesure d'avoir des résultats significatifs. En fonction des statistiques obtenues, si cela est possible nous affinerons à la baisse ce nombre pour les saisines expérimentales ultérieures tout comme nous l’avons fait pour le modèle de rats DMD pour lequel il nous faut maintenant entre 6 et 8 rats DMD pour obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour étudier l'évolution de la maladie et l'effet des traitements que nous testons.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en portoirs dans de grandes cages ventilées et éclairées 12h par jour, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, le nombre d'individus par cage étant fonction de l'âge et du poids des animaux. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Pour ce qui est de la gestion d'une douleur potentielle liée au développement de la maladie, nous utiliserons des points limites adaptés au développement de la maladie avec un suivi de l'état général des animaux et si nécessaire une injection d'un antalgique sera réalisée pour prévenir la douleur et en dernier lieu la mise à mort compassionelle si l'animal ne peut être soulagé.
Choix des espèces
Le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle rat a les atouts des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants. Nous espérons que notre modèle rat de la dystrophie musculaire de Becker reproduira fidèlement la symptomatologie observée chez les patients et qu'il deviendra le modèle animal de référence en la matière dans la communauté scientifique puisqu'il n'existe à ce jour aucun animal modèle pour ce type de dystrophie. Pour l'élevage, nous utiliserons des femelles porteuses de la mutation et des males sauvages de l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) jusqu'à l'âge de 8 mois (les femelles auront fait 4 à 6 portées). Pour établir la courbe de survie, nous utliserons des animaux de l'âge de 6 mois (début potentiel des premiers symptômes de la maladie) jusqu'à leur décès donc potentiellement 32 mois (durée de vie d'un rat sauvage étant de plus ou moins 36 mois, nous estimons que les rats BMD devraient décéder un peu plus tôt). Pour la caractérisation du phénotype du modèle, nous utliserons des animaux de l'âge de 6 mois jusqu'à 32 mois, ainsi nous pourrons suivre la progression du dévéloppement de la maladie à différénts âges ce qui nous permettra d'établir s'il existe une bonne corrélation avec la pathologie humaine et de valider notre rat BMD comme modèle pré-clinique pour le développement de thérapies.
Etude pilote d’injection de virus adéno-associé par différentes voies intraveineuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Des femelles gestantes reçoivent une injection de virus dans la veine de la queue, et quatre d'entre elles subissent une laparotomie pour injecter directement leurs fœtus, l'objet étant de vérifier si le virus franchit le placenta. Le porteur reconnaît que la laparotomie peut être douloureuse et présenter un risque d'infection, et prévoit de tuer les petits à trois ou huit semaines après observation sous lampe UV. Il présente l'étude comme un test de faisabilité sans approche statistique, dont dépend l'application future à des souris modèles de myopathies.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote permettant d'évaluer la capacité de certains virus à traverser la barrière placentaire. Pour étudier ce passage, des souris gestantes seront injectées en intraveineux avec des virus porteurs d'un composé vert fluorescent. Le passage placentaire sera évalué en étudiant la fluorescence des petits. Si les virus ne passent pas la barrière placentaire, les foetus seront injectés directement via leur veine vitelline au cours de la gestation. Si les virus sont capables de passer dans le système sanguin des embryons de souris, ceci permettrait à l'avenir de traiter de la même façon des souris malades avant la naissance, notamment des souris atteintes de maladies musculaires sur lesquelles nous travaillons au sein de l'équipe. Les virus pourraient alors être utilisés comme vecteurs pour délivrer des molécules thérapeutiques durant la gestation. Ce traitement in utero permettrait d'éviter ou d'atténuer notablement les phénotypes musculaires sévères dès la naissance.
Bénéfices attendus
Chez l'Homme, le diagnostic prénatal des maladies génétiques offre de plus en plus de possibilités d'envisager une thérapie génique in utero. Ces techniques d'injection prénatale représenteraient une solution de traitement pour certaines maladies musculaires et présenteraient de nombreux avantages. Tout d'abord, chez l'Homme, les traitements postnataux sont coûteux et durent souvent toute la vie. De plus, traiter la maladie avant la naissance serait très probablement davantage efficace de par la petite taille du foetus, la possibilité de transduire des cellules souches (cellules mères à partir desquelles les autres se développent) et l'absence de défense anti-virale. Si cette étude pilote s'avère positive, c'est-à-dire que la transduction foetale est efficace, nous pourrons envisager d'administrer (par l'une ou l'autre des 2 voies d'injection) un traitement à différents modèles de souris myopathes que nous possédons déjà au laboratoire. Ceci nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies musculaires.
Procédures
24 femelles gestantes seront soumises à une injection intraveineuse unique dans la veine de la queue (compter 3 minutes pour la réalisation du geste). A la naissance, les petits seront séparés de leur mère 5 minutes le temps d'être observés sous lampe UV. 4 femelles seront anesthésiées et une laparotomie sera effectuée. Les embryons de ces femelles seront injectés au jour embryonnaire 15.5 avec le virus en intraveineux. Cette procédure dure une trentaine de minutes au total de l'anesthésie de la femelle à son réveil. Les femelles seront soumises à une seule laparotomie et les petits à une unique injection au stade foetal. A la naissance, les petits seront séparés de leur mère 5 minutes le temps d'être observés sous lampe UV.
Impact sur les animaux
Les souris gestantes qui seront injectées dans la veine de la queue seront immobilisées dans une chambre de contention le temps de l'injection intraveineuse, il y a à ce moment un risque d'anxiété/stress. Suite à l'injection, les souris peuvent présenter un problème d'hémorragie, d'inflammation ou d'infection au site d'injection ou s'automutiler. Les petits des femelles injectées seront manipulés à la naissance le temps de l'observation sous lampe UV, ils seront séparés de la mère un court instant ce qui peut la perturber. En ce qui concerne les femelles qui seront anesthésiées afin d'exposer les foetus, l'opération de laparotomie peut s'avérer douloureuse et il y a un risque de mauvaise cicatrisation, d'inflammation ou d'infection.
Devenir
Une fois le sevrage des souriceaux effectué, les femelles seront euthanasiées et les petits seront observés à la naissance sous lampe UV puis euthanasiés à 3 ou 8 semaines pour prélever 4 organes différents ce qui nous permettra d'évaluer l'expression de fluorescence.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées in vitro car nous ne pourrons pas observer le passage ou non de la barrière placentaire sur des cellules ni le passage dans le système sanguin des embryons. De plus, si cette étude pilote s'avère concluante, nous pourrons appliquer ce protocole à des modèles animaux qui mimiquent bien les myopathies. Ceci nous permettra donc de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies musculaires.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, d'autant plus qu'il s'agit ici d'une étude pilote dépourvue d'approche statistique. Il s'agit d'évaluer la faisabilité d'un protocole. Au total pour les deux procédures, 28 femelles gestantes sont nécessaires ainsi que leurs petits (168). Pour la première partie du projet, il s'agit d'évaluer la capacité des virus à traverser le placenta. Pour cela, différentes conditions seront testées. 5 virus différents seront injectés (ayant des affinités pour des tissus différents) en duplicat, c'est-à-dire 2 femelles par injection (cela permet d'écarter la possibilité de différences inter-individus). De plus 2 femelles seront injectées avec le virus supplémenté d'une hormone permettant d'augmenter la perméabilité vasculaire afin d'optimiser le passage des composés. Ces injections (12) seront menées sur deux fonds génétiques différents car les souris peuvent présenter des différences génétiques qui peuvent être à l'origine de différences placentaires. Cette première partie du projet concerne l'injection de 24 souris et l'observation de leurs petits (144). En cas de résultat négatif, les foetus seront injectés directement. Pour cela, 4 femelles seront nécessaires (2 par fond génétique). Les femelles donnent en moyenne 6 embryons par portée, ce qui représente 24 embryons. 28 animaux seront donc utilisés au total lors de cette deuxième partie de projet.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Les souris seront hébergées par groupe de 2 par cage afin d'être sociabilisées et non isolées et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (soit un analgésique sera administré, soit les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire). Durant les expériences, les souris seront anesthésiées sous isoflurane et analgésiées par métacam (pendant et après la procédure). Pour l'injection IV des femelles, celles-ci seront placées dans la chambre de contention pendant quelques minutes durant les deux jours précédents l'injection, ce qui permettra à la souris de s'habituer à cette chambre et ainsi réduire son niveau de stress. Toutes les précautions adéquates seront prises pour assurer le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales (plaque chauffante jusqu'au réveil, gel ophtalmique pendant l'anesthésie pour éviter le dessèchement de la cornée, surveillance des points limites).
Choix des espèces
La souris est très utile en recherche car l'expression de ses gènes est très similaire à celle de l'humain. Des modifications génétiques faites chez la souris ont permis d'obtenir des modèles de maladies musculaires affectant l'humain et ainsi d'étudier la pathologie et tester des pistes thérapeutiques. D'autre part, les souris présentent plusieurs avantages comme celui d'avoir un cycle de développement court, un élevage facile à bas coût, elles se reproduisent rapidement et donnent plusieurs petits par portée. Enfin, les études antérieures sur ces maladies musculaires ayant été conduites sur le modèle murin, l'utiliser à nouveau nous permettra de compléter nos résultats et de mieux comprendre la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être faites sur cellules car il s'agit d'étudier le transport sanguin d'un composé et le passage à travers le placenta. Pour la première partie du projet les femelles seront injectées dès le premier jour de gestation afin d'assurer une diffusion optimale du composé dès la formation de l'embryon. L'injection des foetus sera quant à elle menée 15.5 jours après le début de gestation car la veine doit être suffisamment visible et accessible pour une injection précise. De plus, les embryons seront déjà bien développés ce qui réduit le risque de les endommager. Les petits seront observés dès la naissance pour voir si la transduction a eu lieu avec une lampe UV puis euthanasiés à 3 ou 8 semaines afin d'observer l'expression de fluorescence dans des organes spécifiques en fonction du temps. A 3 semaines les organes sont développés et faciles à identifier/isoler. L'observation à 8 semaines permettra de voir si l'expression de fluorescence persiste ou non.
Evaluation de différents candidats médicaments sur la mémoire traumatique dans un modèle de conditionnement aversif chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
930 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 180 réutilisés ensuite et les autres tués. Ils reçoivent des chocs électriques d'intensité modérée pour induire une mémoire traumatique, puis passent des tests comportementaux (interaction sociale, labyrinthe en croix surélevé, open field) et reçoivent des candidats médicaments. Le porteur reconnaît que les effets indésirables des produits testés ne sont pas prévisibles et que certains animaux seront tués à la suite de ces effets. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'évaluation d'une molécule sur le conditionnement à la peur et que l'animal reste un "passage obligatoire" avant l'homme.
Objectifs
Chez l'Homme, l'exposition à un stress intense et traumatique peut induire un syndrome de stress post-traumatique chez certains individus. Ce trouble neuropsychiatrique est caractérisé par plusieurs symptômes : une agitation, de l'anxiété, des souvenirs et pensées traumatiques envahissant(e)s, des troubles du sommeil... etc. D'un point de vue neurobiologique, le syndrome de stress post traumatique semble venir d'un disfonctionnement du mécanisme appelé "conditionnement à la peur" permettant dans des conditions normales d'éviter des situations dangereuses et/ou traumatisantes. Le traumatisme associé à une situation particulière (l’environnement) entraine une réponse conditionnée de peur (tremblement, évitement) lorsque le sujet est de nouveau exposé à l’environnement sans la présence du traumatisme. Après plusieurs expositions à l’environnement sans le traumatisme, la réponse de peur diminue et disparait (phase d’extinction). Chez les patients atteint de cette maladie, ce phénomène d’extinction de la peur devient anormalement long. Un mécanisme de sensibilisation à la peur, où l'anxiété du patient face à des situations peu stressantes normalement devient alors exacerbée et durable après le traumatisme, se rencontre également chez certains patients. Chez l'animal, ce type de mémoire traumatique et l'anxiété associée due à la sensibilisation à la peur peuvent être étudiés en utilisant le test de conditionnement à la peur et différents protocoles comportementaux (comme test de l’anxiété et de l’interaction sociale) suivant une exposition à un stress modéré. Le but de ce projet est de démontrer la capacité de différents candidats médicaments à atténuer efficacement, à bloquer cette mémoire traumatique, faciliter l'extinction de la peur et réduire l'anxiété associée chez le rat en vue de faciliter l'extinction des souvenirs traumatiques et de l'anxiété chez le patient.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'anxiété liée au syndrome de stress post traumatique, une pathologie humaine touchant 5 à 12% de la population générale (données de l'Inserm https://www.inserm.fr/dossier/troubles-stress-post-traumatique/). A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chocs électriques d'intensité modérée, puis remis dans le même environnement pour évaluer leur comportement (immobilité); ensuite au test d'interaction sociale et/ou test du labyrinthe en croix surélevé et/ou au test de l'open filed, à des prélèvements sur animal vigile et/ou anesthésiés. Les animaux seront aussi adminsitrés avec les candidats médicaments.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des chocs électriques d'intensité modérée afin d'induire chez l'animal une mémoire traumatique. Plusieurs test comportementaux seront réalisés afin d'évaluer l'anxiété: remise dans l'environnement stressant, test des interactions sociales, test du labyrinthe en croix surélevé et test de l'open field. De plus ils seront administrés avec les candidats médicaments. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou Sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le conditionnement à la peur). Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques: en général 10 animaux / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur ce type de mémoire émotionnelle car il présente une réponse d'immobilité robuste et reproductible. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.