Procédures sévères

Pêchés, anesthésiés, sortis de l'eau pour qu'on leur frotte la peau et qu'on leur arrache quatre à cinq écailles, 840 bars européens juvéniles sont ensuite plongés dix-huit heures dans un bain contaminé par une bactérie. 750 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, avec lésions de la bouche, des branchies et de la peau, nage anormale et perte d'équilibre jusqu'à vingt et un jours après l'infection. L'étude pilote cherche la concentration bactérienne qui fait atteindre le point limite à la moitié des poissons, afin de caler un protocole servant ensuite à tester des aliments d'élevage enrichis en plancton. Les survivants sont tous tués, le porteur indiquant que des raisons sanitaires interdisent de les réutiliser ou de les déplacer.

Objectifs

Cette demande d’autorisation de projet est une étude pilote qui permettra d’établir le protocole de challenge bactérien par balnéation avec une bactérie (souche et concentration bactérienne) sur le bar européen – protocole nécessaire à la réalisation d’un des axes d’un projet (évaluation des capacités de défense de bars européen à des agents infectieux) visant à améliorer la qualité nutritionnelle des aliments utilisés en aquaculture. Ce projet a pour objectif d’évaluer les effets d’une supplémentation alimentaire avec différentes fractions d’organismes marins issus du plancton sur 1) le développement / la croissance et 2) les capacités de défense à des agents infectieux.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront d’établir le protocole de challenge bactérien par balnéation avec une bactérie (souche et concentration bactérienne) sur le bar européen. Ce protocole pourra être utilisé dans le cadre de projets visant à tester la robustesse et la résistance aux maladies des animaux (contexte formulations alimentaires, impact changement global, utilisation de probiotiques en aquaculture).

Procédures

Les poissons subiront une pêche, une anesthésie et une émersion pour frotter la peau, enlever du mucus et 4 à 5 écailles pour créer une porte d’entrée à l’infection (

Impact sur les animaux

Un stress léger d’une durée de 30 sec pourra intervenir lors du frottement de la peau du poisson et du prélèvement de 4 à 5 écailles sous anesthésie. Le transfert de ce même poisson est un stress léger qui dure 5 min. Les épreuves infectieuses bactériennes constituent des nuisances sévères puisqu’elles induisent l’apparition de signes cliniques (lésions buccales, branchiales et/ou cutanées, nage anormale, déséquilibre, …) chez les poissons dans les 24 heures et jusqu’à 21 jours post-infection.

Devenir

A l'issue des challenges aux pathogènes, tous les poissons survivants seront mis à mort car d’un point de vue sanitaire ils ne pourront, ni être réutilisés pour une autre expérience, ni être re/déplacés.

Remplacement

Cette étude vise à définir la « combinaison bactérienne » (souche et concentration) adaptée permettant d’atteindre la DL 50 (concentration en pathogène qui va induire des signes de souffrance importants (atteinte du point limite, score total=ou>4) chez 50% des poisons) chez le bar européen. La caractérisation de ces effets se fait à l'échelle de l'organisme car plusieurs fonctions physiologiques interagissent dans la réponse de l'organisme. La capacité de résistance à un pathogène dépend de différentes composantes du système immunitaire dans divers organes mais également du statut énergétique du poisson (lui permettant de répondre à l’infection) ou encore de son microbiote. Pour ces raisons, le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle cellulaire.

Réduction

Le bar européen juvénile est un animal grégaire et le nombre d'animaux par bac répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de 30 poissons correspond à la densité minimale d’animaux requise pour cette espèce et la variabilité inter-bacs souvent observée. Il permet d’éviter des comportements d’agressivité et de compétition et il permettra aussi aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles, et donc de répondre à leur bien-être. Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation des challenges aux pathogènes a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

En début de procédure, les poissons seront transférés des bassins d’élevage vers la salle d’expérimentation dédiée à la contamination bactérienne. Trajet à pied dans des seaux opaques (15L) avec couvercle 5 poissons par seau. Afin de limiter les manipulations, nous profiterons de ce transfert pour anesthésier les poissons et créer une porte d’entrée au pathogène en “éliminant” un peu de mucus avec une spatule désinfectée et en enlevant 4 à 5 écailles à l’aide d’une pince désinfectée. L’allumage et l’extinction de l’éclairage se font très progressivement pour simuler un lever et coucher de soleil afin d’éviter tout stress pendant ces phases. L’intensité lumineuse sera également faible afin de limiter le stress. Les animaux seront suivis selon des critères spécifiques du projet. L'état de santé général des poissons sera évalué 4 fois/jour à partir de la contamination en utilisant une grille de scoring adaptée intégrant des points limites stricts et spécifiques du projet (nage, comportement, état physique). En fonction des scores obtenus avec cette grille, des actions pourront être mises en place comme des mesures de surveillance accrues et/ou une mise à mort.

Choix des espèces

Le bar commun, espèce marine carnivore d'intérêt aquacole, a été choisie car il s'agit de l'espèce ciblée par le développement des formulations alimentaires supplémentées en protistes. Les poissons utilisés seront des juvéniles (non matures sexuellement). Agés de moins de 2 ans, ils pèseront moins de 100g au début de l’expérimentation.

Les souris utilisées sont humanisées et porteuses de tumeurs humaines, greffées par injection ou par chirurgie. 1 880 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent des injections trois fois par semaine pendant deux à quatre semaines, des scanners après injection d'un traceur, et pour certaines des prises de sang quatre fois dans la même journée. Le porteur classe tous ces modèles comme sévères et place les points limites à l'altération de la respiration pour le cancer du poumon et à la taille de la tumeur, l'abdomen tendu du carcinome du foie étant décrit comme un simple inconfort de mobilité.

Objectifs

Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d’une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d’auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Dans le cas du cancer, les molécules ciblant des points de blocage à la surface des cellules immunitaires ont eu de très bons résultats en essais cliniques. Ces essais ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques chez la souris. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Ce projet s’inscrit ainsi afin d’étudier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules de type protéique dans des modèles de cancer. Nous aimerions donc tester différents traitements de l’immunité capables d’activer un ou plusieurs types cellulaires et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer humain.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection (5min), ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (10-15min). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections (1min) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection d'une molécule "traceur" de la tumeur lors du suivi de la croissance tumorale par "scanner" (1 à 2 fois par semaine). Les animaux pourront être soumis à des injections (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines) uniquement dans le cas de cancer pulmonaire (5min). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang des animaux pourra être effectué sous anesthésie (intervention sans réveil). Certains animaux seront prélevés en sang en vigile (4 fois par jour le premier jour, puis une fois par jour la première semaine puis une fois par semaine, 5min).

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles comme le cancer du poumon, une altération de la respiration peut être observée (point limite). En outre, le carcinome hépatocellulaire entraîne un inconfort dans la mobilité dû à l’abdomen tendu. Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanés) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée, et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules humaines en culture ont permis d’identifier une activité biologique de ces nouveaux traitements, et donc, ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude de la molécule chez l'animal.

Réduction

L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces se verront évalués lors des étapes suivantes limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en mettant à mort les animaux selon un score clinique vétérinaire ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements supplémentaires du fait de son isolement (frisottis et dôme/tunnel). L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance, l’animal se verra administrer une injection d'analgésique deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie un analgésique local. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones féminines peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.

3 228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq injections de chimiothérapie en cinq jours. Une irradiation du corps entier précède l'injection de cellules leucémiques dans la veine de la queue, et une partie des souris subit un prélèvement de moelle osseuse dans l'os de la patte sous anesthésie. Le porteur reconnaît que la rate grossit et qu'on peut penser que cela cause des douleurs, tout en notant que les signes visibles restent rares. Faute de données préliminaires, l'effectif ne repose sur aucun calcul de taille d'échantillon, alors que les retombées annoncées pour les patients, nouvelles cibles et traitements personnalisés, restent au conditionnel.

Objectifs

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) représentent un groupe parmi les cancers du sang caractérisés par une prolifération incontrôlée de certaines cellules dans la moelle osseuse et dans le sang, entraînant un défaut de production des cellules normales du sang et des dysfonctionnements de nombreux organes. Le traitement standard des patients atteints de LAM repose sur l’administration d’une combinaison de 2 drogues. Cette approche permet d’induire une guérison de la maladie chez deux tiers des patients, mais malheureusement les rechutes sont fréquentes et moins d’un quart des patients survivent à long terme. En effet, depuis 40 ans, les mécanismes expliquant comment la chimiothérapie élimine les cellules leucémiques ne sont pas connus avec précision. Or, comprendre ces mécanismes nous permettraient d’identifier les vulnérabilités des cellules leucémiques afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques actuelles ou d’en proposer de nouvelles. Ainsi, une étude préliminaire chez des patients atteints de LAM et traités par chimiothérapie intensive semble indiquer que 2 gènes pourraient jouer un rôle crucial dans la réponse thérapeutique. Ces 2 gènes sont impliqués dans des mécanismes cellulaires importants tels que le contrôle de la mort des cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’étudier in vivo le rôle de ces 2 gènes dans la réponse des cellules cancéreuses de LAM (cancer du sang) à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices pourraient découler de ce projet. Si les gènes étudiés sont des acteurs majeurs dans la réponse à la chimiothérapie, cela pourrait ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cancer du sang et potentiellement dans d’autres cancers. Les médicaments spécifiques ciblant ces gènes pourraient être développés pour améliorer l'efficacité des traitements. Ceci pourrait également permettre une approche plus personnalisée du traitement des patients ; les traitements pourront être adaptés en fonction du profil individuel du patient. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de la chimiothérapie pourrait par ailleurs permettre de réduire les effets secondaires indésirables associés à ces traitements. En minimisant les dommages aux cellules normales et en ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, on pourrait améliorer la qualité de vie des patients pendant et après le traitement. Ce projet pourrait également contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine du bon ou du mauvais fonctionnement de nos cellules. Ces connaissances pourraient avoir des implications bien au-delà du domaine du cancer du sang, bénéficiant ainsi à d'autres domaines de la recherche en oncologie et en biologie cellulaire.

Procédures

Les souris seront soumises à différents types d’interventions selon les procédures : - 1 seule injection d’une molécule sur un nombre restreint de souris dans la veine de la queue. Ce geste, très bref (moins d’une minute, sur souris éveillée), permet d’éliminer un type de cellules dans la moelle osseuse des souris traitées. - 1 irradiation non létale sur corps entier (durée: 5 minutes) et sur un nombre restreint de souris suivie de l'injection de cellules leucémiques dans la veine de la queue. Ce geste, très bref (moins d’une minute sur souris éveillée), permet de déclencher le développement de la leucémie (cancer du sang) chez l’animal. – 1 prélèvement de moelle osseuse sur certaines souris seulement sous anesthésie générale. L'ensemble de la procédure, de l’endormissement au réveil complet, dure environ 10 minutes. Ces prélèvements permettront, après analyse, d’évaluer le niveau d’envahissement leucémique, afin de déclencher le traitement au moment approprié. - Administration de chimiothérapie (2 traitements testés avec 3 doses différentes) : les médicaments seront administrés quotidiennement par injection, soit dans la cavité abdominale de 1 administration à 5 administrations sur 5 jours, soit par la veine de la queue, selon les protocoles définis (de 1 administration à 3 administrations sur 3 jours). Ces gestes, réalisés sans anesthésie, durent chacun moins de 3 minutes et visent à traiter la leucémie induite.

Impact sur les animaux

Les procédures telles que l’injection de cellules leucémiques et l’administration de médicaments de chimiothérapie sont potentiellement stressantes et sont susceptibles de provoquer un certain niveau d’inconfort chez la souris (anémie, fatigue, réduction de l’appétit, perte de poids, infections). Quand la leucémie se développe, la rate des souris grossit (splénomégalie). On peut penser que cela cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée. Quand les souris sont traitées avec la chimiothérapie pendant 5 jours, elles peuvent perdre du poids à partir du troisième jour du traitement. Cet effet est observable sur une journée de 2 à 3 jours. Quand les souris sont prélevés au niveau de l'os long de la patte, un inconfort peut être visualisé les premières minutes post-réveil avec une rétraction de la patte ponctionnée qui n’empêche pas le déplacement de la souris et qui disparait assez vite.

Devenir

A la fin du développement de la leucémie (cancer du sang) et du traitement, les souris seront euthanasiées, aucune souris ne sera gardée en vie. Ceci nous permettra de prélever la rate et la moelle osseuse des os. Ces tissus sont d’une importance capitale dans l’analyse des cellules sanguines cancéreuses.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences préliminaires sur des cellules leucémiques in vitro (hors de l’organisme) qui ont révélé des différences notables des réponses avec les cellules leucémiques in vivo (à l’intérieur de l’organisme). En effet, dans les leucémies, le comportement des cellules dans la circulation sanguine, leur interaction avec la moelle osseuse et d'autres organes, et probablement leur réponse à la chimiothérapie, sont intrinsèquement liés à l'environnement complexe de l'organisme. Il est donc essentiel, pour la pertinence et l'application clinique de nos résultats, d'utiliser un modèle animal qui peut mimer le contexte humain de la leucémie aussi fidèlement que possible.

Réduction

L'absence de données préliminaires concernant la variabilité de l'effet de la chimiothérapie sur l'expression des deux gènes que nous étudions dans les cellules murines rend difficile l'application des formules permettant de déterminer la taille de l’échantillon. Notre stratégie d'expérimentation s'appuiera donc sur les expériences murines précédemment menées au sein de notre équipe. En effet, nous initierons le projet par une phase pilote qui servira à valider notre approche méthodologique. Pendant cette phase nous réaliserons différents tests sur nos modèles de souris pour trouver le traitement adéquat (choix du bon cocktail de molécules et du bon dosage). Les données recueillies de ces expériences initiales qui porteront sur des groupes de souris pourront alors nous permettre d'estimer la variance des effets de manière plus précise. Pour chaque animal, plusieurs paramètres et variables seront étudiés simultanément, permettant ainsi d'obtenir le maximum d'informations, évitant de recourir à des souris supplémentaires pour des études ultérieures.

Raffinement

- Un suivi quotidien de l'apparence générale sera effectué pour détecter rapidement tout signe de malaise, de stress ou de douleur. L’expérience de notre équipe sur ces modèles animaux nous permet une bonne connaissance du développement de la maladie. Nous pouvons ainsi prévenir l’inconfort et la douleur pouvant y être associés Une grille de score clinique basée sur des paramètres tels que la perte de poids, la fréquence respiratoire, l’état du pelage, l’alimentation, l’hydratation, la taille de la rate (splénomégalie) et le comportement permettra de mettre en place des actions précises (renforcement de la surveillance des signes clinique et accès facilité à la nourriture et à la boisson, voire euthanasie). - En planifiant soigneusement les expériences, nous nous efforcerons de limiter le nombre de manipulations subies par chaque animal, réduisant ainsi les perturbations et le stress.

Choix des espèces

- Le génome des souris présente de grandes similitudes avec celui des humains, ce qui rend leurs réponses physiologiques et génétiques proches de celles des êtres humains. - D’un point de vue historique, les modèles souris ont été utilisés depuis des décennies dans les études biomédicales, offrant une riche littérature et des protocoles plus ou moins standardisés pour comparer et interpréter nos résultats. - Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur la souris. - Le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. - La plupart des technologies de manipulation génétique permettant des études ciblées sur des gènes ou des voies spécifiques sont bien établies chez la souris. La composition de la moelle osseuse et des cellules sanguines varie en fonction du stade de développement. Pour ce projet, nous envisageons l’utilisation de souris jeunes adultes âgés de 6 à 10 semaines. A ce stade, les souris sont matures et ont une physiologie stable. De plus, nos études précédentes ainsi que celles publiées par d’autres auteurs sur ces modèles de cancer du sang ont été réalisées à ce stade de développement.

1 792 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dont 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modifiées génétiquement pour développer une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent l'usage des pattes arrière puis des pattes avant et peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure puis des sessions d'enregistrement en isolement pouvant durer sept jours d'affilée, cinq à huit fois, avec des injections quotidiennes pendant trente jours, l'autre partie passant des tests de motricité et d'interactions sociales. Le porteur teste des somnifères déjà utilisés chez l'humain et affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal doté d'une structure hypothalamique bien caractérisée.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie grave qui touche les nerfs contrôlant les muscles. Elle provoque une paralysie progressive et entraîne le décès en quelques années. Les traitements actuels ne permettent que de ralentir légèrement son évolution. Des travaux récents ont montré que, bien avant les premiers signes de paralysie, les personnes atteintes peuvent présenter d’autres symptômes : perte de poids, modification du métabolisme et troubles du sommeil. Ces problèmes apparaissent parfois plusieurs années avant les difficultés motrices. Notre groupe de recherche a observé, chez des patients et chez des souris modèles de la maladie, que ces signes précoces sont liés à des anomalies dans une zone du cerveau qui régule l’appétit, l’énergie du corps et l’alternance veille-sommeil. Dans ce projet, nous cherchons à mieux comprendre comment ces circuits du cerveau sont perturbés au début de la maladie. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées reproduisant certains aspects de la sclérose latérale amyotrophique. L’objectif est d’identifier des cibles thérapeutiques très précoces pour tenter de ralentir l’évolution de la maladie avant l’apparition des symptômes moteurs. Nous testerons notamment l’effet de traitements déjà utilisés chez l’humain pour améliorer le sommeil, afin de voir s’ils peuvent aussi agir sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique. Mieux comprendre et traiter ces signes précoces pourrait, à terme, contribuer à améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans la voie de signalisation de l’orexine dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique. Elles pourraient conduire à l’identification de nouvelles voies ou cibles thérapeutiques potentielles, tout en apportant un éclairage sur les effets bénéfiques que pourrait avoir la modulation de cette voie chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique. Le sommeil, dont les altérations précèdent les symptômes moteurs, constitue un déficit prodromal de la maladie en partie dépendant de la signalisation à l’orexine. Agir sur cette voie pourrait ainsi contribuer à ralentir la progression de la sclérose latérale amyotrophique.

Procédures

Toutes les souris subiront un prélèvement tissulaire sur animal vigile, d’une durée inférieure à une minute, pour leur identification génétique. Un premier lot sera soumis à une intervention chirurgicale unique sous anesthésie générale, d’une durée d’environ une heure. Après récupération, ces animaux seront temporairement isolés à plusieurs reprises pour réaliser des mesures physiologiques, comprenant des enregistrements cérébraux (EEG) et métaboliques. Chaque session pourra durer jusqu’à sept jours, avec un total de cinq à huit sessions, espacées de dix jours à un mois selon le groupe. Une partie de ces animaux recevra un traitement comprenant une injection quotidienne pendant trente jours, tandis que l’autre partie recevra deux injections espacées d’un jour. La manipulation, incluant la contention, ne dépassera pas quinze secondes par injection. Un second lot ne subira pas de chirurgie mais sera suivi du point de vue comportemental. Ce suivi comprendra des évaluations courtes, d’environ trois minutes chacune, permettant d’apprécier la capacité motrice, la motricité fine et les interactions sociales. Ces évaluations seront réalisées à intervalles réguliers, tous les quinze à vingt jours ou selon la nature du test. Ces animaux recevront également, selon le groupe, soit un traitement quotidien de trente jours, soit deux injections espacées d’un jour, avec une durée totale de manipulation inférieure à quinze secondes. En résumé, les interventions prévues incluent : un prélèvement bref sur animal vigile pour tous les individus ; une chirurgie unique suivie de sessions de mesures physiologiques pour un premier lot ; des évaluations comportementales pour un second lot ; et, pour l’ensemble des animaux traités, des injections ponctuelles ou répétées de très courte durée.

Impact sur les animaux

Chez les souris SOD1 G86R, des altérations motrices progressives des pattes arrière peuvent apparaître à partir de 90 jours, évoluant ensuite vers les pattes avant, accompagnées d’une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Ces signes seront suivis de près à l’aide de points limites prédéfinis pour anticiper toute souffrance et décider d’une euthanasie si nécessaire. Les animaux subiront également un stress lié à la contention et à l’isolement temporaire, notamment lors des mesures physiologiques (EEG et calorimétrie). Bien que les animaux soient progressivement habitués à la manipulation, un stress de courte durée est inévitable mais maîtrisé grâce à l’enregistrement en temps réel de paramètres physiologiques permettant de détecter toute détresse. La chirurgie d’implantation peut induire une inflammation locale et une douleur post-opératoire. Ces effets sont limités par la formation expérimentale, la prise en charge adaptée et l’utilisation systématique d’analgésiques et d’antalgique conformément aux protocoles en vigueur. D’autres nuisances possibles incluent une altération temporaire du comportement liée à la manipulation, à l’isolement et aux interventions expérimentales. Ces effets sont surveillés quotidiennement et des mesures correctives seront appliquées si nécessaire, afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux ainsi que leurs tissus.

Remplacement

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative complexe qui touche divers types de neurones le long de l’axe moteur et implique l’interaction de plusieurs types cellulaires, neuronaux et non neuronaux, comme les cellules gliales et les muscles striés. Notre projet vise à étudier les mécanismes neuronaux du sommeil dans les modèles expérimentaux de sclérose latérale amyotrophique, ainsi que les effets d'un traitement chronique par un somnifère. Cette approche ne peut être menée qu’in vivo, sur l’organisme entier.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux, les animaux de comparaison issus des mêmes portées seront utilisés. Le nombre de souris a été calculé à partir de données préliminaires pour garantir que les résultats soient fiables, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées par une personne déjà formée, donc aucun animal supplémentaire ne sera utilisé pour l’apprentissage. Les opérations se feront progressivement, par petits groupes, ce qui permet d’ajuster le protocole selon les premiers résultats. Si aucun effet n’est observé, le nombre d’animaux pourra être réduit, voire l’expérimentation arrêtée. Les mêmes animaux serviront à plusieurs mesures, comme l’étude du sommeil et des paramètres métaboliques, ce qui limite encore le nombre total d’animaux utilisés. Ainsi, chaque étape a été pensée pour obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera assuré par un environnement enrichi répondant à leurs besoins naturels. Les enrichissements fournis incluront des bâtonnets à ronger pour satisfaire leur comportement naturel de mastication, du coton compressé et des frisures de papier pour la construction de nids, favorisant le confort thermique et réduisant le stress, ainsi qu’un tunnel de transfert pour faciliter une manipulation douce. Les animaux seront hébergés en groupes compatibles, sauf contraintes expérimentales, et feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter tout signe de souffrance ou de changement comportemental. La nourriture pourra être placée au sol si nécessaire. Avant les injections répétées et certains tests comportementaux, les animaux seront progressivement habitués à la manipulation et à une contention douce pour réduire le stress. Une période d’habituation est également prévue avant les mesures physiologiques. Les animaux subissant une chirurgie recevront une thermorégulation appropriée et des analgésiques avant, pendant et après l’intervention. Des points-limites préalablement définis permettront d’arrêter toute manipulation ou procédure si un animal montre des signes de souffrance, garantissant ainsi que leur confort et leur sécurité soient prioritaires tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Dans toutes les procédures expérimentales, un de nos modèles sera utilisées à un âge compris entre 50 et environ 120 jours et l’autre entre 3 mois et 10 mois. Pour chaque modèle, cette période correspond à la fenêtre temporelle durant laquelle les troubles caractéristiques de la maladie se manifestent. Elle permet ainsi d’évaluer les effets du traitement à la fois en phase présymptomatique, en débutant l’intervention à 60 jours ou 3 mois, et en phase post-symptomatique, avec un traitement initié à 75 jours ou 7 mois. Cette approche garantit une analyse complète de la progression pathologique.

Jusqu'à six injections pour déclencher une épilepsie, une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements dix heures par jour pendant vingt et un jours et jusqu'à quarante-deux injections: 846 souris vont être utilisées, dont 621 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la chirurgie, elles sont hébergées seules jusqu'à sept semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress pour une espèce vivant normalement en groupe. Le projet vise à identifier les cellules cérébrales actives pendant les crises pour les cibler ensuite par optogénétique ou chémogénétique. Le bien-être des animaux non-humains est présenté comme la "priorité" de l'équipe, laquelle indique aussi qu'il arrive que des crises très sévères leur soient fatales.

Objectifs

L'épilepsie est une maladie neurologique courante qui touche près de 1 pourcent de la population mondiale. L'une de ses formes les plus fréquentes chez l'adulte est l'épilepsie du lobe temporal mésial, souvent causée par la sclérose hippocampique, une cicatrice dans une partie du cerveau appelée hippocampe. Pour environ 30 pourcents de ces patients, les médicaments actuels ne parviennent pas à contrôler les crises. On parle alors d'épilepsie pharmacorésistante. Dans ces cas, une chirurgie pour enlever la zone cérébrale responsable des crises est souvent la seule solution. Notre objectif est d'améliorer la compréhension de cette forme d'épilepsie afin de trouver de nouveaux traitements. Pour cela, nous utilisons un modèle expérimental de l'épilepsie chez la souris, qui reproduit les caractéristiques de la maladie humaine. Notre recherche se déroule en plusieurs étapes. Nous allons tout d'abord essayer d’identifier les types de cellules cérébrales qui sont actives pendant les crises d'épilepsie. Puis nous les étudierons ensuite pour comprendre leurs caractéristiques (leur forme, leur activité et les gènes qu'elles expriment). Une fois ces cellules bien identifiées, nous pourrons essayer de moduler spécifiquement leur activité pour voir si cela permet de réduire la fréquence des crises. De plus, en nous basant sur les mécanismes que nous aurons identifiés, nous allons rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques et tester l'efficacité de molécules agissant sur ces mécanismes. Notre but est de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient aider les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les traitements actuels. Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de l'épilepsie du lobe temporal pour développer de nouvelles thérapies. Notre travail, effectué sur un modèle de souris, vise à identifier les cellules à l'origine des crises pour pouvoir les cibler de manière plus précise et ainsi offrir de nouvelles options aux patients dont les crises ne peuvent pas être contrôlées par les médicaments.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à combler un manque de connaissances important : la compréhension précise des réseaux de neurones responsables du déclenchement et de l'évolution des crises d'épilepsie. Les informations que nous allons récolter pourraient aider à identifier avec plus de précision les cellules spécifiques impliquées dans l'activité épileptique. Ce projet pourrait permettre de découvrir de nouvelles pistes pour développer des médicaments plus efficaces, en ciblant directement les mécanismes responsables des crises. Par ailleurs il permettra également d'évaluer des techniques de pointe, comme l'optogénétique et la chémogénétique. Ces méthodes utilisent la lumière ou des molécules pour contrôler l'activité de cellules spécifiques. Elles pourraient, à terme, ouvrir la voie à des thérapies totalement nouvelles pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. En résumé, ce projet a pour objectif d'améliorer de manière significative notre compréhension de l'épilepsie, avec l'espoir de développer à plus long terme de nouvelles options de traitement pour les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les médicaments.

Procédures

Une partie des animaux recevra des injections de molécules pour induire la pathologie (vigile, 6 injections maximum, quelques secondes par injection). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Pour une partie de ces animaux leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur 1 journée pendant 10h environ et ils recevront une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, 1 fois, quelques secondes pour l’injection). Pour les autres l’enregistrement sera réalisé en continu pendant 21 jours et ils recevront 1 à 2 injections de composés chaque jour pour évaluer leur effet thérapeutique (vigile, quelques secondes par injection, 42 injections maximum). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour injecter une molécule au niveau du cerveau afin d’induire la pathologie (1 fois, 1h maximum). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer et stimuler l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur une journée pendant 10h environ au cours de laquelle ils reçoivent une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, durée quelques secondes). 1 semaine après, les enregistrements (vigile) sont réitérés 10h par jour pendant 21 jours consécutifs. Au cours de ces enregistrements certains recevront une stimulation cérébrale (vigile, durée quelques secondes), les autres recevront une molécule modulant l’activité cérébrale dans leur eau de boisson (20 jours). A partir de la chirurgie d’implantation du dispositif tous les animaux seront hébergés seuls jusqu’à la fin de l’étude (7 semaines maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sans réveil, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée inférieure à 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’induction du modèle d'épilepsie pourra entraîner des effets secondaires comme une perte de poids et une réduction de la mobilité. La survenue des crises engendre un stress et une fatigue significatifs pour l’animal. L’injection des molécules pour mettre en place le modèle peut induire des effets périphériques (accélération du pouls, sudation, saignements). Il arrive que des crises très sévères soient fatales pour les animaux. Les chirurgies seront associées à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours, de plus il existe un risque de légère perte de poids, rapidement réversible. Le dispositif d’enregistrement implanté pourra générer un inconfort pour l’animal. Les souris implantées avec ce dispositif seront hébergées seules jusqu’à la fin de la procédure, s’agissant d’animaux vivant normalement en groupe cela génèrera un stress. L’anesthésie générale pour les chirurgies sera associée à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de difficultés cardiorespiratoires. Les différentes injections pourront induire une légère et brève douleur au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Pour comprendre l'épilepsie et trouver de nouveaux traitements, la recherche sur des modèles vivants est essentielle. Les mécanismes complexes d'une crise d'épilepsie ne peuvent pas être reproduits fidèlement en laboratoire sur des cellules isolées ou à l'aide de simulations informatiques. Nous utilisons déjà des modèles plus simples, comme des cultures de cellules ou des tissus humains obtenus après une chirurgie. Ces méthodes sont utiles pour tester des molécules, mais elles ne permettent pas d'étudier l'impact direct d'un traitement sur l'ensemble du cerveau et sur la survenue d'une crise. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire. Il est le seul à pouvoir nous donner des informations sur la manière dont les crises se déclenchent et se propagent dans un cerveau vivant. Cela nous permet de tester l'efficacité de nouvelles thérapies de manière réaliste et de progresser vers des traitements pour les patients.

Réduction

Le nombre d'animaux que nous utilisons dans notre projet a été défini avec soin pour être le plus juste possible, en se basant sur nos expériences passées et les données de la littérature scientifique. Nous avons travaillé à améliorer notre modèle expérimental. Par exemple, nous avons réduit les doses des substances utilisées pour déclencher les crises, ce qui a permis de diminuer la mortalité et le nombre d'échecs. Cela nous permet d'obtenir les informations nécessaires avec moins d'animaux. Le chiffre total de 846 animaux a été calculé en tenant compte de plusieurs facteurs clés : Nombre de groupes : Chaque expérience nécessite des groupes d'animaux suffisants (entre 5 et 10 animaux par groupe) pour garantir la fiabilité des résultats. Nous avons des groupes de contrôle et des groupes qui reçoivent différents traitements ou sont soumis à des conditions variées (épilepsie vs. non épileptiques, différents médicaments, etc.). Taux d'échec et de perte : Nous devons prévoir les animaux qui ne développeront pas l'épilepsie, ceux qui ne survivront pas au déclenchement des crises, et ceux pour lesquels les données collectées seront inexploitables. Ces taux sont essentiels à prendre en compte pour s'assurer que nous aurons au final un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement valables. Pour valider nos résultats, nous utiliserons des tests statistiques reconnus afin de nous assurer que nos conclusions sont solides et ne sont pas dues au hasard.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité. Nous nous engageons à respecter des règles très strictes pour garantir qu'ils soient dans les meilleures conditions possibles tout au long de notre étude. Les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation. Elles ont de l'eau et de la nourriture à volonté et bénéficient d’un enrichissement dans leur cage (carré de coton pour faire un nid, bâton de bois à ronger). Pour celles qui auront un dispositif implanté, un hébergement individuel est nécessaire pour éviter toute blessure, dans ce cas une maisonnette sera ajoutée dans leur cage et nous vérifierons que ces animaux ne présentent pas de signes de stress lié à cet hébergement. Les animaux seront observés quotidiennement. Ils sont pesés régulièrement et leur état général est contrôlé. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. Nous avons perfectionné notre méthode pour déclencher l'épilepsie, nous permettant d’améliorer la récupération et la survie des animaux. Les opérations chirurgies se déroulent sous anesthésie générale et locale, avec des antidouleurs. Nous surveillons la température des animaux et protégeons leurs yeux. Après l'opération, ils sont placés dans une zone de réveil chauffée jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis. Pendant leur récupération, nous les surveillons de près, en vérifiant leur poids et leur comportement. Nous leur donnons une nourriture liquide spéciale et veillons à ce qu'ils soient bien hydratés, surtout après le déclenchement des crises. Les animaux sont habitués progressivement à l’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors de ces enregistrements nous les surveillons à distance, limitant ainsi les interventions humaines directes. Lors de l’administration de composés nous alternons les zones d'injection pour éviter les risques d’irritation locale. Des critères d'arrêt clairs et éthiques ont été établis pour garantir qu'aucune souffrance inutile ne soit infligée aux animaux. Ces mesures strictes témoignent de notre engagement à mener cette recherche de manière responsable, tout en cherchant à faire progresser la connaissance pour le bien des patients humains.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour notre recherche est le résultat d'une démarche scientifique rigoureuse. C'est un modèle animal standard pour l'étude de l'épilepsie, pour plusieurs raisons clés. Procédures standardisées : Les méthodes d'anesthésie et d'analgésie (gestion de la douleur) chez la souris sont très bien établies et maîtrisées. Cela nous permet de garantir le bien-être des animaux tout au long des expériences. Modèles d'épilepsie bien connus : Les techniques pour déclencher des crises d'épilepsie chez la souris ont été largement étudiées et validées par la communauté scientifique. Cela assure la fiabilité de notre modèle. Outils génétiques uniques : Certaines de nos expériences les plus avancées nécessitent l'utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris sont conçues pour permettre de marquer ou de contrôler l'activité de cellules spécifiques du cerveau, une méthode impossible à réaliser chez d'autres espèces. Stade de développement pertinent : Nous utiliserons des souris de 8 semaines, un stade de développement qui correspond à l'âge adulte. Cela est important car la forme d'épilepsie que nous étudions est la plus courante chez l'adulte humain. En résumé, la souris est le meilleur modèle pour cette étude car elle nous offre les outils nécessaires pour répondre à nos questions de recherche de manière précise, fiable et en minimisant les procédures invasives.