Procédures sévères

Injectées la veille, anesthésiées profondément le lendemain, puis maintenues sous anesthésie quatre à sept heures pendant que leurs vaisseaux sanguins sont observés, une partie des 178 souris de ce projet porte une forme inactivée d'une protéine de la coagulation. D'autres subissent la ligature d'un vaisseau sanguin abdominal au cours d'une chirurgie de quarante minutes, d'autres encore une injection déclenchant une inflammation généralisée. 54 relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 124 d'un niveau modéré, le porteur signalant des risques de saignement important, de réveil difficile et de paralysie transitoire des pattes arrière. Toutes sont tuées, par excès d'anesthésique ou dans les quarante-huit heures suivant la chirurgie, le porteur indiquant qu'elles ne pourraient pas survivre à ces interventions.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt sur les propriétés antithrombotique (inhibant la formation de caillot ou amas plaquettaires) et anti-inflammatoire des vaisseaux sanguins autres que ceux du cerveau. L’inhibition d’une protéine d'intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité des vaisseaux dans le contexte de l'accident vasculaire cérébral. L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme agissant sur la conservation d’un état protecteur des vaisseaux sanguins. En effet au niveau cérébral le sang contenu dans les vaisseaux n’est pas capable de s’en échapper et les amas de plaquettes sont plus petit chez ses animaux. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire des vaisseaux et sur les amas de plaquettes en temps reel. L’impact de cette molécule d’intérêt sera évalué grâce à des souris génétiquement modifiées et en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons ainsi savoir si la protéine ciblée peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans un contexte thrombotique ou inflammatoire autre que les accidents cardiovasculaires cérébraux. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également le développement et la solidité du thrombus (amas plaquettaire) ainsi que sa capacité à emboliser (à se détacher du vaisseau). Ces amas plaquettaires circulants sont critiques car ils sont à l’origine des obturations des vaisseaux cérébraux ou pulmonaire.Mieux comprendre l’impact de cette molécule est indispensable pour clarifier les mécanismes impliqués dans la thrombose et pour évaluer son potentiel en tant que cible thérapeutique. Cette étape est également cruciale pour envisager, à terme, le développement de molécules inhibitrices spécifiques.

Procédures

Trois types d’interventions sont réalisées sur des lots différents d’animaux : 1-Une injection intraveineuse la veille de l'expérimentation sera réalisée sur certains lots. L’intervention dure moins de 5 minutes dans EU1. Dans EU 2 Le lendemain Les animaux sont, sous anesthésie profonde, préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins, afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. 2- Dans EU2 Des lots différents sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés. 3- DAns EU2 Les derniers lots d'animaux sont soumis à une inflammation généralisée par une injection intrapéritonéale. 24h après cette induction les animaux sont anesthésiés et préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins et la réponse inflammatoire grâce à la mobilité des globules blancs. Ces animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et euthanasié après une heure d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intérêt sont viables et ne présentent aucun défaut morphologique apparent ni de reproduction. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum7 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique. Concernant les procédures sévères : Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. L’induction du sepsis va entrainer une inflammation généralisée chez les souris. L’inflammation sera étudiée à 24h post induction puis les souris seront euthanasiées par excès d’anesthésique.

Devenir

Les procédures utilisées étant invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures car ils ne pourraient pas survivre aux interventions.

Remplacement

Le recours à l’espèce souris est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes et la nature des différentes cellules misent en jeu ne sont pas modélisables par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas le lot en entier. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. De plus, si aucune différence n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, nous ne réaliserons pas les expériences avec les molécules inhibitrices.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture à volonté. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçus par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant si un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié. Pour les procédures necessitant un suivi: les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus (amas plaquettaire) et le développement d'une inflammation dans les souris est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nos collaborateurs ont établi une lignée de souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt qui nous permet d’étudier spécifiquement son impact sur la thrombose et l’inflammation. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures

2 650 rats et souris vont être utilisés, dont 2 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour examen des organes. Une chirurgie de trente minutes leur pose un cathéter dans l'espace qui entoure la moelle épinière, puis les composés y sont injectés jusqu'à trois fois par semaine pendant deux semaines, avec jusqu'à neuf prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et un jeûne de seize heures avant la mise à mort chez le rat. Le porteur estime qu'un quart des animaux, ceux qui reçoivent la dose forte, présenteront des signes modérés et exceptionnellement sévères, parmi lesquels stéréotypies, agressivité, tremblements et perte de plus de 20 % du poids. L'objet du projet est d'écarter tôt les molécules toxiques pour éviter des études réglementaires qu'il décrit comme coûteuses "d'un point de vue éthique, en animaux, et économique".

Objectifs

Le projet a pour objectif : • d’étudier les effets liés à l’administration par voie intrathécale d ‘une molécule d’intérêt. L'injection intrathécale est une injection dans l'espace sous-arachnoïdien. L'espace sous-arachnoïdien constitue le canal rachidien et contient le liquide cérébrospinal (LCS). Cela permet d'administrer le médicament dans le LCS. L'administration peut se faire à l'aide d'une aiguille à ponction lombaire ou avec un catheter implanté au cours d'une intervention chirurgicale Ces effets pourront être reliés à la concentration du candidat médicament administré grâce à des données d’exposition générées • de déterminer, dans le cas de toxicité, des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en analysant les échantillons biologiques obtenus dans le Projet, à l'aide de méthodes d’analyses ex vivo de biologie moléculaire, génomique, protéomique ou métabolomique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à détecter très tôt dans le développement d’un candidat-médicament les effets de toxicité du composé- test afin d’arrêter son développement avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour dans le domaine du système nerveux. Pour cibler une indication du système nerveux central, certaines molécules ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique lorsqu’elles sont administrées par voie systémique dû, entre autres, à leur taille moléculaire et leur charge ionique négative. Elles doivent alors être administrées localement par voie intrathécale dans le liquide cérébrospinal. Cette voie d’administration est aussi celle utilisées chez l’homme et permet une distribution ciblée de la molécule dans le système nerveux central, ce qui est crucial pour traiter des maladies neurologiques.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Pose d’un cathéter intrathécal par chirurgie : durée 30 minutes. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : durée quelque secondes sur animaux anesthésiés si administration transcutanée et sur animaux vigiles si animaux porteurs d’un cathéter. Unique ou répétée max 4 fois à un intervalle d’une semaine si administration transcutanée ou 3 fois maximum par semaine pendant 2 semaines avec cathéter. • Anesthésie et analgésie pour des administrations intrathécale : durée de 5 minutes, maximum 4 fois à un intervalle d’une semaine. • Prélèvements de sang : o en microsampling : Durée 60 secondes sur animal vigile. Maximum 9 fois sur 24h. oprélèvement terminal en fin d'étude sous aneesthésie profonde : Durée 1 minute sous anesthésie générale. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, matériel de nidification et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Durée de l’hébergement individuel maximal de 24h. • Préhension douce lors des observations générales et neurologiques : durée 1 minute sur animal vigile, 6 fois maximum par jour. • Test de coordination motrice : 6 sessions d’une durée de 5 minute maximum sur animal vigile, avec une récupération de 15 minutes entre chaque session. •Mise à jeun d‘une durée maximale de 16h chez le rat préalablement à la procédure terminale de l’étude en vu des prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

L'exposition des animaux à des possibles doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effets indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes cliniques légers à modérés généralement et exceptionnellement sévères si la produit s’avère toxique :changements de comportements comme l’apparition de stéréotypie et/ou d’agressivité, barbering, hypomotilité, négligence du toilettage, posture analgésique, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général comme l’apparition d’une prostration, modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des contractions, selles diarrhéiques ou perte majeure du poids corporel (

Devenir

Pour l’ensemble des 3 procédure décrites ci-dessus, les animaux sont tous mis à mort en fin de procédure. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.

Remplacement

De nombreux tests in silico (simulations effectuées utilisant des modèles numériques) ou in vitro de toxicité ont déjà été mis en œuvre pour remplacer le recours aux animaux. Les tests actuellement disponibles ne permettent pas encore de répondre à tous les besoins pour écarter la toxicité des molécules en cours de développement. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques d'un animal qui puissent développer des effets secondaires ou toxiques après administration unique ou répétée d'un composé test.

Réduction

Les molécules d’intérêt auront préalablement fait l’objet de test sur des batteries de test in silico et in vitro permettant de ne sélectionner que les candidat médicament les plus prometteurs afin de réduire au maximum la phase vivo du développement. Pour les molécules qui sont développées en phase vivo, le nombre d'animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique tout en réduisant au maximum celui-ci. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit au minimum scientifique de 3 pour sélectionner de candidate en phase pré-clinique et cela pourra aller à 8 animaux maximum pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude si des analyses supplémentaires sont à prévoir ou une variabilité forte est attendu sur le modèle. Les recommandations de l’agence européenne des médicaments demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques et de l‘évolution de la recherche sur certaines modalités utilisées dans le système nerveau centrale. Au total ce projet pourrait utiliser 2650 animaux sur 5 ans. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de la cohorte sont traités afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur ces animaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses lors d’études type Dose Répétée ou Dose Maximale Tolérée après des administrations répétées ou une seule administration, seront administrées, autant que possible, lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures.

Raffinement

L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention vigiles sont limitées et la durée est inférieur à 5 minutes. L'hébergement individuel est nécessaire après chirurgie pour suivi (maximum 24h). L'hébergement individuel peut survenir pour des raisons vétérinaires. Dans tous les cas, des contacts olfactifs, auditifs et visuels entre congénères seront maintenus ; de plus, un surenrichissement (plus de quantité de litière, tunnel, matériel de nidation) dans le micro-environnement est prévu. Les observations des animaux sont renforcées tout au long de cette période d'hébergement individuel. Lors d'une procédure, l'observation quotidienne des animaux par le personnel dûment formé permet de détecter toute anomalie. Des critères d’alarme et/ou d’interruption ainsi qu’un arbre décisionnel d’arrêt ayant été définis et diffusés à tous les intervenants, l’apparition de trois signes cliniques notables ou d’un signe clinique sévère font l’objet d’une évaluation par le responsable de la mise en œuvre du projet en collaboration avec le vétérinaire clinicien. Les animaux sont manipulés avec des méthodes douces de contention type soft handling pour toutes les manipulations du projet.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles (de 3 semaines d’âge minimale) pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué ou si la population finale humaine pour laquelle la molécule va être utilisée est une population juvénile.

Environ 400 souris reçoivent une injection de PTZ pour déclencher des crises d'épilepsie, une partie devant atteindre un état de crise prolongée. 2 040 souris vont être utilisées en tout, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 240 un niveau modéré, avec des implantations d'électrodes de cinq heures et des injections quotidiennes pendant sept jours. Le porteur écrit que l'injection de PTZ "ne provoque pas de douleur particulière" et qualifie les crises qui suivent de stressantes et fatigantes, sans autre précision sur ce que subit l'animal pendant le status epilepticus. Après chaque procédure, le cerveau est prélevé, ce qui suppose la mise à mort de tous les animaux.

Objectifs

Dans le cerveau, l’inhibition agit comme un frein qui empêche les signaux nerveux de s’emballer. Quand ce frein fonctionne mal, cela peut contribuer à des maladies comme l’épilepsie ou certains troubles psychiatriques. Pour mieux comprendre ces problèmes et imaginer de nouveaux traitements, nous avons étudié une voie de communication entre neurones, appelée SPAK, qui est anormalement activée dans certaines de ces maladies. Nous avons découvert un nouveau mécanisme qui contrôle cette voie et, grâce à des modèles informatiques, nous avons conçu des molécules capables de la réguler. En les testant sur des neurones cultivés en laboratoire et observés avec des techniques de microscopie avancée, nous avons vu que certaines molécules parviennent à bien contrôler cette voie, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Cependant, leurs effets ne sont pas identiques selon qu’elles agissent sur des neurones « freins » (inhibiteurs) ou des neurones « accélérateurs » (excitateur), ce qui rend difficile de prédire précisément leur impact dans un vrai cerveau. La prochaine étape sera de tester ces molécules dans l’organisme pour comprendre comment le blocage de la voie SPAK influence l’activité des connexions entre neurones, le fonctionnement global du cerveau et différents comportements comme la mémoire, l’anxiété, le sommeil, les interactions sociales ou encore la sensibilité aux crises d’épilepsie chez la souris. Enfin, nous chercherons à comprendre plus en détail le rôle de cette voie dans les deux grands types de neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne une voie de communication encore peu étudiée dans le cerveau, appelée voie SPAK, et à tester l’efficacité de nouvelles molécules que nous avons développées (une invention déjà déposée et en cours de brevet). Nous espérons montrer que bloquer cette voie grâce à nos molécules pourrait protéger contre les crises d’épilepsie et améliorer des fonctions comme la mémoire, l’attention et les interactions sociales, tout en préservant un sommeil de bonne qualité. En étudiant des versions modifiées de cette voie dans différents types de cellules nerveuses, nous pourrons identifier plus précisément celles qui sont impliquées. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements contre certaines formes d’épilepsie, y compris celles associées à des troubles cognitifs ou du sommeil.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, plusieurs types de procédures seront réalisées sur les animaux expérimentaux. 1. Chirurgies sous anesthésie générale (1 à 2 fois par animal) o Injections cérébrales : administration de vecteurs viraux, d’une durée d’environ 1 heure par animal. Nombre total prévu : ~624 animaux. o Implantations d’électrodes : chaque intervention dure environ 5 heures. Nombre total prévu : ~800 animaux. 2. Évaluations comportementales (animaux vigiles) Des séances d’observation et d’évaluation comportementale sont planifiées, pour un total d’environ 260 souris. 3. Induction de crises d’épilepsie aiguës (animaux vigiles, 1 fois par animal) o Les crises seront induites par administration de PTZ. o Durée de chaque session : environ 1 heure. o Nombre total prévu : 400 souris. 4. Injections répétées (animaux vigiles) o Injections intrapéritonéales (IP) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour ~312 souris. o Injections intraveineuses (IV) : même protocole et durée que les injections IP, pour ~312 souris. o Injections IV ou IP (expériences principales) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour un total d’environ 792 souris, après détermination du mode d’injection le plus adapté sur la base des expériences de contrôle.

Impact sur les animaux

Les injections (sous la peau, dans l’abdomen ou dans une veine) ainsi que les différents tests comportementaux réalisés sur les souris adultes peuvent provoquer un léger stress. Celui-ci est lié à la manipulation nécessaire pour l’injection ou au fait de se retrouver dans un environnement nouveau. Pour l’induction de crises d’épilepsie, les souris reçoivent une seule injection sous la peau d’une molécule appelée PTZ. Cette injection ne provoque pas de douleur particulière, mais les crises qui suivent sont stressantes et fatigantes pour l’animal. Dans le cadre de certaines expériences, il est nécessaire que l’animal atteigne un état de crise prolongée (status epilepticus). L’implantation d’électrodes pour mesurer l’activité musculaire, cardiaque ou cérébrale, ainsi que les injections cérébrales de virus pour cibler certains types de cellules, nécessitent des chirurgies sous anesthésie générale. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’électromyogramme (EMG) et de l’électrocardiogramme (ECG) et du potentiel de champ (LFP), ainsi que l’injection stéréotaxique de vecteurs viraux dans des types cellulaires spécifiques, impliquent une intervention chirurgicale susceptible d’induire une douleur résiduelle, considérée comme modérée après application des mesures de raffinement.

Devenir

Après chaque procédure, le cerveau des animaux est prélevé pour permettre des analyses scientifiques.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules de l’hippocampe, une région du cerveau, et ces tests montrent que nos molécules pourraient agir sur la voie de signalisation SPAK. Pour vérifier leur potentiel thérapeutique, nous devons maintenant les tester chez l’animal éveillé. Cela nous permettra de mieux comprendre comment ces molécules agissent sur les cellules du cerveau, sur les circuits impliqués dans l’épilepsie et sur les comportements qui sont affectés par cette maladie. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle, car elle permet de conserver les interactions naturelles entre les différents organes, ce qui n’est pas possible dans des études uniquement sur des cellules en laboratoire.

Réduction

Nous avons conçu ce projet pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en gardant un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été déterminé à partir des données de nos études précédentes et de calculs statistiques précis. En pratique, nous utiliserons 10 animaux par groupe. Les deux sexes, mâles et femelles, seront inclus dans nos expériences. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour tous les tests comportementaux, en commençant toujours par les tests les moins stressants afin de limiter leur inconfort. Enfin, les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées pour garantir la fiabilité des conclusions.

Raffinement

Toutes les procédures chirurgicales de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale ou locale, sur un tapis chauffant, et avec l’utilisation d’antalgiques pour limiter la douleur. Les injections et prélèvements seront faits en suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Les souris seront hébergées par petits groupes, avec un maximum de 5 animaux par cage, et observées régulièrement pour vérifier leur état de santé. Avant chaque intervention, le poids et l’état général de chaque animal seront contrôlés. Si un signe de douleur ou de malaise est détecté, l’animal sera retiré immédiatement du protocole. Nous faisons tout pour réduire au maximum le stress et la douleur, en mettant en place des périodes d’habituation et en utilisant des anesthésiants et antalgiques adaptés. Le suivi quotidien de l’état des animaux (attitude, aspect du pelage, poids) permettra d’administrer un traitement supplémentaire si nécessaire ou, si un seuil critique est atteint, de retirer l’animal de l’étude. Enfin, lorsque l’euthanasie est nécessaire, elle sera réalisée dans une pièce séparée, pour éviter tout stress aux autres animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé en recherche en neurosciences. Elle permet d’étudier le comportement, de modifier certaines cellules du cerveau grâce à des techniques génétiques, et de reproduire des modèles d’épilepsie qui sont bien établis pour comprendre cette maladie chez l’humain. Nos expériences seront réalisées sur des souris adultes, car les changements dans le fonctionnement des molécules que nous étudions apparaissent après la naissance, dans des maladies comme l’épilepsie, certains troubles psychiatriques ou encore des troubles du sommeil.

Une résection de 20 % du ventricule cardiaque, pratiquée hors de l'eau sous anesthésie en cinq minutes au plus : 2 700 poissons zèbres vont être utilisés dans ce projet, 1 800 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour analyse du cœur. Une partie reçoit en plus une injection quotidienne sous anesthésie hors de l'eau, sept jours de suite. Le porteur indique qu'aucune méthode d'analgésie connue ne semble compatible avec l'étude de la régénération cardiaque, les poissons ressentant après l'opération un inconfort et une douleur liés à la cicatrisation. Le poisson zèbre est retenu précisément parce qu'il régénère entièrement son cœur, capacité que les mammifères adultes n'ont pas, l'objectif étant de tester ensuite les gènes identifiés chez la souris.

Objectifs

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, les maladies cardiovasculaires sont responsables de près de 18 millions de morts dans le monde chaque année, soit 31% des décès. Alors que les mammifères adultes sont incapables de régénérer leur cœur suite à un infarctus, un certain nombre d’espèces vertébrées possèdent quant à elles cette propriété. En particulier, le poisson zèbre est capable, suite à l’ablation d’une portion du muscle cardiaque, de totalement régénérer son cœur. Nous avons précédemment développé des systèmes d’ingénierie génétique chez le poisson zèbre permettant d’étudier la fonction des gènes impliqués dans les processus régénératifs, plus précisément les gènes exprimés dans les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes). Notre principal objectif est d’identifier les différents gènes qui régulent la régénération du muscle cardiaque chez le poisson zèbre pour ensuite les tester chez les mammifères

Bénéfices attendus

Inscrit dans un cadre de recherche globale en santé humaine, l’identification des gènes/processus nécessaires à la régénération cardiaque chez le poisson zèbre, pourrait potentiellement participer au développement d’approches thérapeutiques visant à induire la régénération cardiaque chez l'homme. L’objectif de notre projet à court terme vise à identifier des nouveaux gènes impliqués dans les mécanismes de la régénération des tissus, plus particulièrement du cœur. À moyen terme, nous collaborerons avec nos collègues pour tester le rôle de ces gènes chez les mammifères adultes tels que les souris, ce qui pourrait ouvrir à long terme une transposition de ces découvertes chez l’homme.

Procédures

L’ensemble des interventions sera réalisé sous anesthésie. Les poissons-zèbres subiront une chirurgie du muscle cardiaque, une résection de l’apex du ventricule du coeur de l’ordre de 20%, durant laquelle ils seront maintenus sous anesthésie hors de l’eau pour une durée de 5 minutes maximum. Un groupe de poissons-zèbres impliqués dans le suivi de la prolifération des cardiomyocytes subira des injections quotidiennes d'un faible volume, sous anesthésie hors de l’eau pour une durée d’une minute maximum, chaque jour durant 7 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les poissons-zèbres subiront un stress léger au cours de la pêche à l’aide d’une épuisette à maille fine. Suite à la chirurgie, les poissons ressentiront un inconfort lié à une diminution de la mobilité et une douleur conséquente au processus de cicatrisation. Les poissons pourront présenter une légère inflammation au niveau du site d’injection et un inconfort lié à la répétition des anesthésies hors de l’eau.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des études histologiques et evaluer la régénération cardiaque.

Remplacement

Les mécanismes de régénération du myocarde sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles s’attache aux modèles mammifères qui ne présentent malheureusement pas cette capacité régénérative. Il n’y a pas aujourd’hui à notre connaissance d’alternative à l’utilisation de poisson-zèbre pour la mise en œuvre de ce projet

Réduction

L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédants travaux publiés qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d’animaux necessaires. Nous avons également fait appel à des tests et calculs de puissance statistiques qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d'animaux nécessaire tout en permettant d'obtenir des résultats scientifiques robustes

Raffinement

Actuellement aucune méthode d'analgésie connue ne semble compatible avec les recherches sur la régénération cardiaque. Dans notre équipe, un projet en cours de réalisation a pour objectif d’identifier des molécules analgésiques n’interférant pas avec les mécanismes de régénération du coeur, si de telles molécules sont identifiées elles seront alors appliquées à ce projet également. Dès lors nous apportons un soin particulier à déterminer précisément les stades d’anesthésie chirurgicale adaptés (immobilité, perte de conscience, mouvements respiratoires lents et absence de réaction aux stimuli). Nous apportons un soin particulier à l’étape post-opératoire, les animaux sont placés dans un aquarium contenant de l'eau préalablement stérilisée pendant 30 minutes. Pendant cette période, les animaux sont observés d'abord constamment pendant la phase de réveil (2 à 5 min), puis toutes les 5 minutes, en s’appuyant sur les éléments établis sur la feuille d’évaluation. Si les poissons ne présentent pas de signes d'inconfort, c’est-à-dire que nous observons un comportement de nage normal et la reprise d’un comportement exploratoire, ils sont replacés dans l'aquarium avec leurs congénères au bout de la période initiale de 30 minutes post-opératoires. Si les poissons montrent des signes d'inconfort ou de souffrance (immobilité, nage erratique), ils sont surveillés pendant une heure supplémentaire. Si les poissons semblent toujours mal à l'aise après cette période, ils sont mis à mort. Pendant les jours suivants la chirurgie, une attention particulière est apportée aux poissons, tous les matins, midis et soirs lors des nourrissages. Nous portons une attention particulière aux comportements suivants : nage continue au milieu de l'aquarium (ni au fond, ni à la surface), absence de mouvements erratiques, prise de nourriture. Enfin une attention maximale sera portée aux conditions environnementales (maitrise de l’asepsie, des paramètres physicochimique), à la prise en charge efficace de la douleur post-opératoire, et l’observation des animaux avec la mise en place d’une grille d’évaluation de la douleur étudiée spécifiquement pour ce projet, nous permettant d’estimer l’atteinte d’un point limite de manière précoce, et nous permettant de mettre en œuvre les mesures adaptées à la prise en charge de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le recours au poisson zèbre s'explique d'un part car il s'agit d'une éspèce domestique modèle élevée en captivité depuis plus d'un siècle, mais également par son extraordinaire capacité à régénérer son cœur. Le génome du poisson-zèbre présente 70% d’homologie avec le génome humain (estimé à 85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines). Notre projet portant sur la régénération d'un organe en contexte physiologique, l'approche sur animal vivant (poisson) est nécessaire. Nous travaillons uniquement sur des aniamaux ayant atteint le stade adulte, les phénomènes de régénaration d'un organe suite à une lésion ne pouvant être observés sur des individus encore en cours de developpement.

Les souris de ce projet portent la mutation d'enfants atteints d'une encéphalopathie épileptique et font des crises d'épilepsie, avec hyperactivité et gestes répétés. 336 vont être utilisées, 192 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles passent un test comportemental par jour pendant dix jours, arène éclairée, enfouissement de billes, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objets, labyrinthe en croix surélevé, interaction sociale à trois chambres, et une partie subit en plus une chirurgie de quarante à quatre-vingt-dix minutes pour implanter des électrodes dans le cerveau, suivie de quarante jours de logement séparé et de soixante jours d'enregistrement quotidien. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort, le porteur avançant que ces données alimenteront des "cerveaux virtuels" qui pourraient à terme réduire le recours aux animaux non-humains.

Objectifs

Ce projet étudie des souris porteuses d’une mutation génétique dans une composante des cellules du cerveau, essentiel pour transmettre les signaux électriques. Chez certaines personnes, une mutation dans ce gène provoque une maladie du cerveau. Les enfants touchés présentent souvent des crises d’épilepsie ainsi que des difficultés d’apprentissage et de concentration. Les souris étudiées portent la même mutation que ces enfants. Elles permettent donc de mieux comprendre la maladie. Elles montrent déjà certains signes similaires : crises d’épilepsie, hyperactivité, gestes répétés et un niveau de stress plus faible que les souris normales. Les chercheurs veulent maintenant vérifier si ces souris reproduisent bien l’ensemble des symptômes observés chez les patients. Pour cela, ils réaliseront cinq types d’expériences : • D’abord, ils confirmeront quelles souris portent la mutation (génotypage). • Ensuite, chaque souris participera à une seule des quatre autres expériences, qui serviront à : 1. Mieux comprendre comment et quand apparaissent les crises d’épilepsie. 2. Analyser le comportement des souris. 3. Observer ce qui se passe dans le cerveau, au niveau des cellules et de l’activité électrique, pendant les crises. Grâce à ces travaux, les chercheurs espèrent mieux comprendre cette maladie et, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements pour les enfants concernés.

Bénéfices attendus

Cette étude cherche à mieux comprendre pourquoi certaines maladies du cerveau provoquent de l’épilepsie. Ces maladies sont liées à des dysfonctionnements des certaines molécules présentes dans les cellules du cerveau, qui permettent de transmettre les signaux électriques. Les souris étudiées portent une mutation dans l’un de ces molécules, semblable à celle observée chez certaines personnes malades. En les observant, les chercheurs veulent comprendre comment cette mutation modifie le fonctionnement du cerveau. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement pour ces maladies, qui restent aujourd’hui sans solution. Une partie des données recueillies servira aussi à créer des modèles informatiques. Ces modèles, comparables à des « cerveaux virtuels », permettent de simuler les effets d’une mutation. À long terme, ce type d’outil pourrait réduire l’utilisation d’animaux dans la recherche, car certaines expériences pourraient être reproduites directement sur ordinateur.

Procédures

1. Prélèvement pour identifier les souris Un petit morceau (2mm) de queue sera retiré (durée environ 10 secondes). 2. Tests de comportement Les souris réaliseront un test par jour pendant 10jours, d’une durée de 5 à 30 minutes. Les procédures prévues sont : • Exploration d’une arène éclairée. • Enterrement de billes. • Parcours dans un labyrinthe en Y. • Test de reconnaissance d’objets. • Parcours dans un labyrinthe en croix surélevé. • Test d’interaction sociale à trois chambres. 3. Chirurgie pour poser des électrodes Certaines souris subiront une intervention de 40 à 90 minutes pour l’implantation de très fines électrodes dans le cerveau. Elles seront ensuite hébergées séparément pendant 40 jours. 4. Enregistrements cérébraux L’activité électrique du cerveau sera enregistrée chaque jour pendant 60 jours. Avant chaque enregistrement, la souris sera connectée à l’appareil par une manipulation de 30 à 60 secondes. Elles seront hébergées séparément pendant 60 jours.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées présentent des problèmes de santé : elles ont des crises d’épilepsie et un comportement différent de celui des autres souris. Pour certaines procédures, une opération chirurgicale d’implantation d’électrodes sera réalisée. Après l’opération, les souris peuvent ressentir une légère douleur pendant quelques jours et montrer des signes de stress. Elles seront hébergées séparément, mais resteront dans un environnement où elles pourront voir, entendre ou sentir les autres souris, sans être totalement isolées. Les test de comportement peuvent causer un stress léger lié à la manipulation et la nouveauté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les cerveaux et réaliser des analyses.

Remplacement

Ce projet veut comprendre ce qui se passe dans le cerveau quand certaines maladies causent de l’épilepsie et des difficultés de développement. Pour cela, il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré qui gardent toute la complexité du cerveau et du comportement. Les informations recueillies seront aussi utilisées pour créer des modèles informatiques du cerveau. Ces modèles aident à comprendre comment les erreurs dans les gènes changent le fonctionnement du cerveau, sans toujours avoir besoin de nouvelles expériences sur les animaux. À long terme, ces méthodes pourraient permettre de faire moins d’expériences sur les animaux, en aidant à remplacer ou réduire leur utilisation tout en continuant à apprendre sur le cerveau.

Réduction

On utilisera juste assez de souris pour obtenir des résultats fiables, mais pas plus que nécessaire (calcul effectué avec des approches statistiques). Les tests de comportement qu'on utilisera ont déjà été essayés avant sur des souris similaires, et ils ont déjà un plan précis. Cela veut dire qu’on n’aura pas besoin de refaire des tests préliminaires de perfectionnement.

Raffinement

L’état de santé des souris sera régulièrement surveillé à l’aide d’une grille d’évaluation pour repérer d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort. En cas de douleur, elles recevront de l’anti-douleur pour être soulagée. La surveillance sera renforcée durant la semaine suivant une intervention au niveau du cerveau. Cette intervention sera réalisé avec une prise en charge adaptée de la douleur (anesthésie et traitement antidouleur).

Choix des espèces

Même si la maladie est pédiatrique, on utilise des souris adultes car il est nécessaire qu’elles aient atteint un stade de développement stable pour réaliser certaines procédures en toute sécurité, comme les évaluations comportementales ou l’implantation d’électrodes. Chez des souris trop jeunes, ces interventions seraient moins fiables et pourraient présenter davantage de risques. On choisit les souris comme espèce parce qu’elles partagent de nombreux gènes et fonctions cérébrales avec l’humain, et qu’elles sont bien adaptées à des études en laboratoire. Leur taille, leur reproduction rapide et la possibilité de contrôler leur environnement en font un modèle pratique et fiable pour étudier les mécanismes de la maladie. Par ailleurs, à l’âge adulte, les effets de la mutation sont déjà clairement exprimés. On peut ainsi observer la maladie de manière stable et obtenir des données plus robustes et comparables.