Procédures sévères

Toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 2 649 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules tumorales humaines leur sont implantées dans une veine, dans l'abdomen, dans le cerveau ou dans l'œil, ces deux dernières localisations sous anesthésie générale de vingt à trente minutes, puis la tumeur est suivie par imagerie une à deux fois par semaine. Le porteur annonce, selon la localisation, des troubles de la coordination et de la posture, une inflammation de l'œil ou une gêne respiratoire quand la tumeur comprime les tissus voisins. Ces souris ont été rendues immunodéficientes puis greffées avec un système immunitaire humain, et le RNT range les retombées attendues du côté de la recherche translationnelle et du "développement industriel de nouvelles stratégies thérapeutiques".

Objectifs

Les traitements qui utilisent les propres cellules de défense du patient pour attaquer les cellules cancéreuses ont déjà permis d’importants progrès, notamment contre certains cancers du sang. Ces thérapies, dites « personnalisées », reposent sur la reprogrammation des cellules immunitaires afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules malades. Leur fabrication reste cependant complexe : elle nécessite de prélever les cellules du patient, de les modifier en laboratoire, puis de les réinjecter, ce qui prend du temps et coûte cher. Ce projet explore une approche plus simple : faire en sorte que cette reprogrammation ait lieu directement dans l’organisme grâce à l’administration d’un produit porteur d’instructions génétiques. Ce produit, appelé vecteur thérapeutique, agit comme un messager qui délivre les informations nécessaires aux cellules de défense pour qu’elles apprennent à reconnaître les cellules cancéreuses. Les essais seront menés chez la souris, dans des modèles reproduisant certaines fonctions du système immunitaire humain. Ces modèles permettent d’étudier la faisabilité et la sécurité de l’approche dans un environnement vivant. Les tests concerneront différents types de cancers, notamment du sang, du cerveau et de l’œil. Objectif général : évaluer la possibilité de déclencher directement dans l’organisme la production de cellules de défense capables d’éliminer les cellules cancéreuses, afin de préparer de futures applications en immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider des vecteurs thérapeutiques (=plateformes de transfert génétique) capables de reprogrammer directement les cellules immunitaires dans l’organisme, sans passer par les étapes complexes de fabrication en laboratoire propres aux immunothérapies cellulaires traditionnelles. En supprimant le besoin de prélèvement, de modification ex vivo et de réinjection des cellules du patient, ces approches pourraient transformer l’accès aux thérapies personnalisées. Les approches évaluées dans ce projet pourraient permettre une administration plus simple et plus rapide, sans étape préalable de préparation personnalisée, et s’adapter à différents contextes cliniques, y compris dans des environnements où l’accès aux thérapies avancées est limité. Les plateformes évaluées dans ce projet pourraient permettre une administration rapide, potentiellement « à la demande », sans conditionnement préalable, et s’adapter à différents contextes cliniques, y compris dans des environnements où l’accès aux thérapies avancées est limité. À court terme, les expériences menées sur des modèles de souris reproduisant certaines fonctions du système immunitaire humain permettront de mieux comprendre la distribution, l’efficacité et la tolérance de ces vecteurs dans l’organisme.À court terme, les expériences menées dans des modèles de souris humanisées permettront de mieux comprendre la distribution, l’efficacité et la tolérance de ces vecteurs in vivo. Ces données bénéficieront à la recherche translationnelle et au développement industriel de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier groupe, les souris éveillées (vigiles) sont injectées une ou deux fois dans le sang (geste de quelques secondes). Un à deux jours plus tard, elles reçoivent une injection unique en quelques secondes (sur animal vigile). Des prises de sang ponctuelles (moins de dix secondes) sont réalisées sur les animaux vigiles Dans un second groupe, des cellules sont injectées aux animaux vigiles soit dans une veine, soit dans l’abdomen (geste très rapide). Dans un troisième groupe, des cellules sont injectées soient dans le cerveau soit dans l’œil des animaux. Ces gestes sont réalisés sous anesthésie générale et durent environ 20 à 30 minutes. Une semaine à dix jours plus tard, les animaux des groupes 2 et 3, reçoivent deux injections à 24h d’intervalle (sur animal vigile durée de chaque geste inférieur à 10 sec). La croissance de la tumeur est ensuite suivie une à deux fois par semaine à l’aide d’images prises sous une courte anesthésie de quelques minutes. Des prises de sang ponctuelles peuvent également être nécessaires (sur animal vigile durée du geste inférieur à 10sec).

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet recevront des injections contenant du matériel génétique destiné à modifier certaines cellules de défense. Ces injections, réalisées par voie intraveineuse, sont habituellement bien tolérées et ne provoquent qu’une gêne passagère au point d’injection. Dans de rares cas, une réaction plus marquée peut survenir, se traduisant par une baisse d’activité, une perte de poids ou une inflammation au point d’injection. Dans certaines expériences, des cellules tumorales humaines seront implantées afin d’étudier la réponse du système immunitaire. La croissance de ces tumeurs pourra entraîner différents signes selon leur localisation. Lorsque la tumeur se développe dans le sang ou dans plusieurs organes, les animaux peuvent présenter une perte de poids ou une baisse d’activité en fin de suivi. Dans les modèles de tumeur cérébrale, des troubles de la coordination ou de la posture peuvent apparaître. Dans les modèles oculaires, l’augmentation du volume tumoral peut provoquer une gêne visuelle ou une inflammation de l’œil. Dans les modèles localisés dans d’autres organes, une gêne abdominale ou respiratoire peut survenir si la tumeur comprime les tissus voisins. Les produits testés ont été choisis pour leur bonne tolérance dans des études antérieures. Des réactions transitoires, telles qu’une légère baisse d’activité ou une perte de poids temporaire, peuvent toutefois survenir.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Avant tout essai chez l’animal, les vecteurs thérapeutiques de transfert génétique envisagées dans ce projet seront testées sur cellules humaines en laboratoire (in vitro). Ces essais permettront d’évaluer leur efficacité, leur capacité de ciblage, et leur absence de toxicité directe. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas reproduire les conditions biologiques d’un organisme vivant, comme la distribution dans tout le corps, la complexité des interactions cellulaires ou la réponse immunitaire intégrée. L’objectif de ce projet est d’évaluer, dans un environnement plus proche de la réalité humaine, la capacité de ces vecteurs thérapeutiques à reprogrammer des cellules immunitaires directement dans l’organisme. Ces approches nécessitent un système vasculaire fonctionnel et un environnement immunologique actif, qui ne peuvent être reproduits qu’in vivo.

Réduction

Le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Des outils d’imagerie non invasifs permettent de suivre l’évolution des tumeurs et des cellules modifiées chez les mêmes animaux tout au long de l’étude. Cela évite des prélèvements intermédiaires et réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Les analyses réalisées après la fin de l’expérience combinent plusieurs approches sur les mêmes tissus, afin d’obtenir le plus d’informations possible pour chaque animal

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place dans ce projet pour limiter les nuisances sur le bien-être animal et garantir une surveillance attentive tout au long des protocoles. À leur arrivée, les animaux bénéficient de quelques jours d’acclimatation afin de s’habituer à leur environnement. Les gestes nécessitant une grande précision, comme les injections dans le cerveau ou dans l’œil, sont réalisés sous anesthésie générale. En revanche, les injections réalisées dans la veine ou dans la cavité abdominale (pour l’administration de cellules immunitaires ou tumorales) ne nécessitent pas d’anesthésie. Elles sont effectuées en contention douce afin de réduire le stress ressenti par l’animal. Des soins sont prodigués avant et après les interventions pour prévenir toute douleur ou inconfort : maintien de la température corporelle pendant et après l’acte, surveillance rapprochée, et alimentation hydratante jusqu’à la récupération complète après anesthésie. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant les périodes critiques, notamment les deux semaines suivant les injections de vecteurs thérapeutiques, y compris les week-ends et jours fériés. En dehors de ces phases à risque, le suivi est assuré à une fréquence adaptée à l’état des animaux, conformément aux recommandations éthiques et vétérinaires. En cas de réaction légère, des soins de soutien (réhydratation, alimentation enrichie) sont proposés. Si des signes de souffrance plus marqués apparaissent ou s’aggravent, l’animal est retiré de l’étude et une euthanasie indolore est pratiquée pour éviter toute douleur prolongée.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche biomédicale car elle offre un bon compromis entre la pertinence scientifique et le respect du bien-être animal. Sa petite taille, sa biologie bien connue et la disponibilité de nombreux outils génétiques permettent de mener des études fiables en appliquant rigoureusement les principes de réduction et de raffinement des procédures. Dans ce projet, des souris dites “humanisées” sont utilisées : elles possèdent un système immunitaire humain, ce qui permet d’étudier des traitements ciblant des cellules humaines dans un organisme vivant. Ce modèle de souris humanisée est reconnu comme l’un des plus pertinents pour les études d’immunothérapie car il permet de répondre à la question scientifique dans des conditions expérimentales bien contrôlées, tout en respectant les principes éthiques des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). L’utilisation de la souris réduit le nombre d’animaux nécessaires grâce à des méthodes de suivi non invasives et permet d’appliquer des mesures de raffinement limitant la douleur et le stress. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines, afin qu’elles aient terminé leur croissance et présentent un état physiologique stable. Ce stade correspond au jeune adulte et permet d’éviter les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Bien que ces animaux soient immunodéficients, leur utilisation à ce stade garantit de meilleures conditions pour la greffe de cellules humaines et la mise en place d’un modèle humanisé fiable. Des groupes d’animaux d’âge similaire seront utilisés pour chaque protocole afin de limiter la variabilité expérimentale.

L'agent inducteur est injecté dans la trachée après ouverture de la peau du cou, ou dans la veine de la queue jusqu'à cinq fois par semaine, au risque d'une nécrose de la queue. 1 668 souris vont être utilisées, 1 056 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 612 un niveau modéré. Le porteur annonce une perte de poids "significative mais contrôlé" et des difficultés respiratoires liées à l'installation de la fibrose, alors que le projet est déposé sur la bronchopneumopathie chronique obstructive et que les bénéfices avancés portent sur la fibrose pulmonaire idiopathique et ses 30 % de patients devenus résistants. Toutes les souris sont tuées au terme de chaque procédure pour prélever les organes.

Objectifs

Les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) ont une incidence en constante augmentation ce qui en fait la 3eme cause de mortalité dans le monde. Les BPCO sont caractérisées par une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires associée à une réponse inflammatoire chronique. Elles sont à l’origine d’obstruction des voies respiratoires et d’emphysème. Les traitements actuels ne peuvent que ralentir l’évolution de la maladie à l’aide d’une prise en charge multidisciplinaire (arrêt tabac, réhabilitation respiratoire) associée à des molécules non-spécifiques. Ces dernières années, de gros progrès ont été faits dans la compréhension de la réponse immunitaire et il est évident aujourd’hui que le système immunitaire, qui est le principal acteur dans les maladies inflammatoires, est une cible prometteuse. Les nouvelles stratégies d’immunothérapies cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. Ces approches vont cibler des populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de fibroses pulmonaires

Bénéfices attendus

Les traitements actuels utilisés contre les Fibroses Pulmonaires Idiopathiques font appel à des traitements de type anti-fibrotique limitant l’installation de la fibrose pulmonaire et ralentissant le déclin respiratoire. Une résistance à ces traitements apparait chez 30% des patients au bout de 6 mois de traitements. De plus le changement de traitement par un nouvel anti-fibrotique n’améliore pas la survie de ces patients, montrant une désensibilisation des patients à ce type de traitements. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules diminuent l’installation de l’inflammation et permettraient potentiellement de ralentir l’installation de la fibrose et d’améliorer les fonctions respiratoires. Chez l’animal nous espérons diminuer l’infiltration pulmonaire aux temps précoce et diminuer l’installation de fibrose au temps tardif du modèle. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.

Procédures

Les agents inducteurs seront injectés sur animaux anesthésiés et analgésiés, allant d'une injection à 5 injections par semaine par différentes voies d'administrations . Les traitements seront administrés 3 fois par semaines sur une durée de 3 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole).

Impact sur les animaux

L’injection intratrachéale induira de la douleur chez l’animal dû à l’ouverture de la peau du cou puis à l’injection d’un agent inflammatoire dans la trachée. Dépendant du modèle, l’inflammation pulmonaire sera de courte durée (24h) où de longue durée (J28) avec pour les modèles longs des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire ainsi qu’une perte de poids significative mais contrôlé. L’injection en intraveineuse de bléomycine sur animaux vigiles engendrera une douleur modérée lors de l’injection ainsi qu’une nécrose possible de la queue à la suite des injections répétéq sur ce site. Ce modèle induira une perte de poids ainsi que des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton

Choix des espèces

Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

Les souris témoins non traitées atteignent toutes les points limites en trois semaines et sont mises à mort, comme le rapporte le porteur pour le projet précédent. 1 160 souris vont être utilisées ici, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 360 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue ou avant d'atteindre un point limite. Greffées par voie intraveineuse avec des cellules de leucémie aiguë myéloblastique humaine, elles développent la maladie, subissent deux ponctions intrafémorales sous anesthésie, un traitement cinq jours sur sept et une séance d'imagerie hebdomadaire. Le porteur teste des molécules déjà utilisées chez l'être humain pour d'autres indications, et ramène ses lots de 25 à 20 souris greffées après avoir constaté que les cinq animaux supplémentaires n'ajoutaient rien à la significativité des résultats.

Objectifs

Le projet concerne la validation de démarches thérapeutiques pour des molécules en repositionnement c'est à dire qui sont déjà utilisées chez l'homme mais pour d'autres applications. Après avoir valider ces approches et les molécules impliquées in vitro, ex vivo et dans des modélisations tissulaires, nous sommes arrivés au niveau préclinique ou nous devons valider chez la souris (modèles in vivo utilisés en hématologie) les molécules en repositionement.

Bénéfices attendus

Les résultats in vitro et in vivo du précédent projet ont montré que certaines cibles étaient importantes pour prévenir les rechutes. Par exmple, l'utilisation in vivo d'une molécule possédant une autre indication thérapeutique a permis de guérir pour la première fois des souris leucémiques auxquelles on avait greffé des cellules de leucémie aiguë myéloblastique. Le traitement combiné a conduit à une surivie de 11 mois sans rechute après traitement (mise à mort au bout d'un an) alors que les souris contrôles (non traitées) ont toutes atteint des points limites en 3 semaines et ont été mises à mort.

Procédures

Les animaux vont être manipulés, injectés pour la greffe, prélevés pour des confirmations sanguines et médulaires à deux reprises, recevoir des traitements puis injectés et anesthésiés pour l’imagerie . Ces prélèvements intrafémoraux sont réalisés sur animal anesthésiés. Ces inconvénients bien que réduits au minimum existent. La greffe par injection est rapide pour chaque animal et ne nécessite que 2 min en boite de contention. Les prélèvements mandibulaires demandent une préhension adéquate et ne demande que 2 min par animal. Le traitement est réalisé après une contention adéquate et ne prend que 30 sec. Il est réalisé 5 jrs par semaine (2 jrs de repos). L’imagerie demande l’injection en moins de 1 min puis l’anesthésie en 5 min, le rasage en 1 min et l’imagerie en 10min. Aucune imagerie n'est réalisée plus d'une fois par semaine. Chaque étape a été raccourcie à son minimum.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet sont greffées par injection intraveineuse, développent une leucémie aiguë (fatigue et aplasie) qui est prise en charge précocément pour amener l'animal en rémission. Les animaux recoivent alors la molécule d'intérêt aux doses décrites dans la littérature. Les animaux vont être manipulés fréquemment, recevoir des injections, être prélevés en intrafémorale, présenter des symptomes (amaigrissement) et devoir être anesthésiés hebdomadairement pour suivre la leucémogenèse, la rémission et la rechute ou non par imagerie bioluminescente. Les traitements administrés le sont 5 jours par semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure ou avant d'atteindre les points limites car les animaux développent une leucémie réfractaire ou en rechute.

Remplacement

Pour répondre à nos objectifs tout en diminuant au maximum le recours à des animaux, nous utilisons la modélisation in vitro et ex vivo de la moelle osseuse qui nous permet de valider in vitro et ex vivo les résultats dans les conditions spécifiques de la moelle osseuse. De plus, au fil du temps le suivi bibliographique nous permet d'avoir des updates important et réguliers pour savoir si nous devons poursuivre la validation d'une molécule ou en changer.

Réduction

Combinaison des lots témoins lorsque l'on teste deux molécules sur la même cible. Utilisation d’un test de puissance pour définir le nombre d’animaux/groupe. Tests statistiques utilisés pour l’analyse des résultats. De plus, l’expérimentation ne comportera plus que 20 animaux greffés par lot au lieu de 25 car l’analyse statistique a montré à postériori que 25 animaux (10 contrôles et 15 traités) n’augmentent pas la significativité comme cela était supposé par un calcul de puissance.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe (5 souris/cage) et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique (5 par cage et bénéficie de cabane et de tuyaux). Les différentes procédures sont réalisées de manières à prévenir tout phénotype dommageable. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire. Des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Lors d’une greffe et les 21 jours qui suivent, la nourriture donnée est enrichie. Les manipulations prévues dans le précédent projet notamment en termes de prélèvements ont été revus et corrigés. Par exemple, les prélèvements intra-fémorales sont planifiés à deux temps seulement. En effet, un suivi en imagerie, même ne permettant pas une quantification comme avec les lignées cellulaires, autorise une détection des cellules leucémiques dans la moelle. Cette approche mise au point, nous avons un système de correction qui permet d’évaluer la quantité de cellules leucémiques et ainsi permet de prévoir un prélèvement intrafémorale au meilleur temps.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour ce projet d'hématopoîèse leucémique car la reconstitution de l’hématopoïèse humaine est possible chez cet animal et elle est bien documentée, en particulier dans les souches immunodéficientes qui permettent la xénogreffe de cellules humaines. 1. La souche immunodéficiente est utilisée en raison de sa capacité à développer le processus étudié (leucémie aiguë myéloblastique) de par sa forte immunodépression. 2. La capacité d´extrapoler les résultats. 3. L´expérience d´utilisation des chercheurs. 4. Existence de l'équipement nécessaire. 5. Pertinence des installations. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines. Ceci est l’âge optimal pour une bonne prise de greffe médullaire.

54 souris subissent deux injections dans le cerveau au cours d'une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes, et une partie d'entre elles une seconde opération de une à six heures sans réveil, pendant laquelle leurs neurones sont stimulés et enregistrés. 30 de ces 54 souris relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à la fin pour des analyses histologiques. L'objectif tient en une phrase, déterminer quels mécanismes contribuent à la plasticité synaptique, et les bénéfices annoncés se limitent à mieux comprendre les troubles de la mémoire à plus long terme. Les seules atteintes décrites sont une douleur post-opératoire de vingt-quatre à quarante-huit heures, un stress léger lors des pesées et un stress aigu de deux secondes pendant un test comportemental que le porteur ne nomme pas.

Objectifs

La mémoire repose sur la modification des connexions neuronales dans l'hippocampe, un processus appelé plasticité synaptique. Ce projet de recherche fondamentale vise à déterminer quels mécanismes contribuent à ce processus.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de la mémoire. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles de la mémoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, une première permettant deux injections intracérébrales durera environ 90 minutes et une seconde pour les enregistrements de l’activité neuronale et la stimulation des neurones à dopamine durera de 1 à 6 heures.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront soit une, soit deux chirurgies : la première, d’une durée inférieure à 90 minutes, pourra induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48 heures. Le suivi post-opératoire comprendra des pesées régulières pouvant induire un stress léger de quelques dizaines de secondes. La seconde chirurgie, sans réveil, durera entre 1 et 6 heures pour les enregistrements électrophysiologiques et la stimulation des neurones. Les animaux soumis à une seule chirurgie seront soumis à un test comportemental provoquant un stress aigu mais de courte durée de 2 secondes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le projet vise d'une part à déterminer comment la dopamine déclenche la plasticité synaptique dans l’hippocampe. Cette question nécessite l’intégrité fonctionnelle du cerveau. D'autre part, l’évaluation des conséquences de ces mécanismes sur les performances mnésiques impose la réalisation de tests comportementaux, qui requièrent l’utilisation d’animaux vivants et conscients. Pour ces raisons, l’utilisation de l’animal in vivo demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir de nos données antérieures de manière à obtenir une puissance statistique a priori de 90%. Sur cette base, 12 souris par groupe seront incluses pour les analyses électrophysiologiques et 15 souris par groupe pour les analyses comportementales.

Raffinement

Les animaux seront habitués une semaine aux conditions d’élevage après réception puis progressivement entraînés à la manipulation afin de limiter le stress avant les procédures expérimentales. Tout au long du protocole, une surveillance quotidienne sera assurée, avec une attention accrue en période postopératoire. Des mesures spécifiques seront mises en place pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux : maintien de la température corporelle pendant et après la chirurgie et mise à disposition de gel réhydratant et d’aliments faciles d’accès et gestion systématique de la douleur en post opératoire. En cas d’altération de l’état général d’un animal, une évaluation clinique structurée sera réalisée afin de définir la conduite à tenir.

Choix des espèces

Les outils nécessaires pour stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une précision de l’ordre de la milliseconde sont disponibles uniquement chez la souris. Les structures impliquées dans la mémoire étudiées dans ce projet sont conservées chez la plupart des mammifères. Ce qui nous permet d'extrapoler nos conclusions tirées de cette étude chez l’humain. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois afin d’éviter des effets du développement ou du vieillissement.

Pour évaluer si l'inactivation d'une protéine protège les vaisseaux de la thrombose et de l'inflammation, 178 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, dont 54 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reste sous anesthésie jusqu'à sept heures d'affilée pour l'observation de ses vaisseaux, puis est tuée par excès d'anesthésique. D'autres subissent la ligature d'un vaisseau abdominal, avec un risque de saignement important, un réveil difficile, une douleur au site d'incision et une paralysie transitoire possible des pattes arrière, ou une inflammation généralisée provoquée par injection dans le ventre. Le porteur indique que les souris reçoivent des aliments enrichis en analgésiques, et qu'une souris qui ne réagit plus aux stimulations est tuée immédiatement.

Objectifs

L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme protecteur de l’intégrité endothéliale et de la barrière vasculaire dans le contexte thrombo-inflammatoire des accidents cardiovasculaires cérébraux. L’inhibition d’une protéine d’intérêt a été identifié par nos collaborateurs comme agissant sur la conservation d’un état protecteur des vaisseaux sanguins. En effet au niveau cérébral le sang contenu dans les vaisseaux n’est pas capable de s’en échapper et les amas de plaquettes sont plus petit chez ses animaux. Dans ce contexte, l’objectif de cette demande qui sera réalisé sur deux établissements utilisateurs présents sur le même campus, est d’évaluer en précliniques l’impact de son inactivation sur les propriétés inflammatoire des vaisseaux et sur les amas de plaquettes en temps reel. L’impact de cette molécule d’intérêt sera évalué grâce à des souris génétiquement modifiées et en utilisant des molécules inhibitrices candidates générées par nos collaborateurs.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permettra d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro, les capacités anti-thrombotique ou/et anti-inflammatoire de la protéine d’intérêt et des molécules d’intérêts testées. Nous pourrons notamment évaluer le statut inflammatoire du vaisseau dépourvu de la protéine d’intérêt mais également le développement et la solidité du thrombus (amas plaquettaire) ainsi que sa capacité à emboliser (à se détacher du vaisseau). Ces amas plaquettaires circulants sont critiques car ils sont à l’origine des obturations des vaisseaux cérébraux ou pulmonaire. Mieux comprendre l’impact de cette molécule est indispensable pour clarifier les mécanismes impliqués dans la thrombose et pour évaluer son potentiel en tant que cible thérapeutique. Cette étape est également cruciale pour envisager, à terme, le développement de molécules inhibitrices spécifiques.

Procédures

Trois types d’interventions sont réalisées sur des lots différents d’animaux : 1-Une injection intraveineuse la veille de l'expérimentation sera réalisée sur certains lots. L’intervention dure moins de 5 minutes dans EU1. Dans EU2, Le lendemain Les animaux sont, sous anesthésie profonde, préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins, afin d’étudier la thrombose ou l’inflammation. Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. 2- Dans EU2,Des lots différents sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés. 3-Dans EU2 Les derniers lots d'animaux sont soumis à une inflammation généralisée par une injection intrapéritonéale. 24h après cette induction les animaux sont anesthésiés et préparés pour visualiser les vaisseaux sanguins et la réponse inflammatoire grâce à la mobilité des globules blancs. Ces animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et euthanasié après une heure d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intérêt sont viables et ne présentent aucun défaut morphologique apparent ni de reproduction. Les Animaux seront maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 7 heures et seront mis à mort par excès d’anesthésique. Concernant les procédures sévères : Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. L’induction du sepsis va entrainer une inflammation généralisée chez les souris. L’inflammation sera étudiée à 24h post induction puis les souris seront euthanasiées par excès d’anesthésique.

Devenir

Les procédures utilisées étant invasives, il est nécessaire d'euthanasier les animaux en fin de procédures car ils ne pourraient pas survivre aux interventions.

Remplacement

Le recours à l’espèce souris est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes et la nature des différentes cellules misent en jeu ne sont pas modélisables par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Dans la mesure du possible, dans les experimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas le lot en entier. De plus, si aucune différence n’est obtenu avec les souris exprimant une forme inactive de la protéine d'intêret, nous ne réaliserons pas les expériences avec les molécules inhibitrices.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de 5, en présence de coton de nidification, avec boisson et nourriture à volonté. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisée pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont surveillés tous les jours par du personnel. Le transport entre les deux établissements sur le même campus est effectué de sorte à minimiser les bruits et les vibrations pouvant être perçu par les animaux. Les actes invasifs sont tous réalisés sous anesthésies. Les injections permettant le maintien de l’anesthésie tout au long de l’expérimentation sont minutées et dosés pour assurer un état stable sans réveil des animaux. Cependant, si un animal venait à avoir un réveil même léger il sera immédiatement anesthésié. Pour les procédures necessitant un suivi: les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus (amas plaquettaire) et le développement d'une inflammation dans les souris est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nos collaborateurs ont établi une lignée de souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt qui nous permet d’étudier spécifiquement son impact sur la thrombose et l’inflammation. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 25 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes maturess.

Jusqu'à quinze séances d'imagerie de trois heures par animal, précédées pour une partie d'entre eux de deux chirurgies de quarante-cinq minutes et d'une heure : 548 souris vont être utilisées, dont 404 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur inclut dans son calcul d'effectif environ 20 % de mortalité par groupe. L'objet est de comprendre comment le flux sanguin cérébral évacue le CO2 et régule le pH du cerveau, chez des souris saines, vieillissantes, puis porteuses d'une angiopathie amyloïde, avec un prolongement vers la rétine pour tester si l'œil pourrait servir de fenêtre de diagnostic. Les souris du modèle pathologique sont utilisées entre six et dix-huit mois, âge auquel les plaques amyloïdes sont installées, et leur état en fin de procédure, avec une implantation crânienne lourde, exclut selon le porteur tout replacement.

Objectifs

L’objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle du flux sanguin dans la régulation du pH et du CO2 cérébral dans un contexte sain et pathologique. Le CO2 est un déchet métabolique produit par l’activité cellulaire. Il doit être éliminé du cerveau via la circulation sanguine pour préserver l’homéostasie du pH tissulaire, car une accumulation de CO2 conduit à une acidose, qui perturbe le fonctionnement neuronal. Le CO2 est donc un régulateur majeur du débit sanguin cérébral. Toutefois, la façon dont le CO2 est échangé à travers la paroi des différents types de vaisseaux du cerveau et le rôle des cellules de l’unité neurovasculaire dans cette régulation demeurent non élucidé car les techniques pour étudier ces phénomènes manquaient jusqu’à présent. De récents travaux ont permis de développer des biosenseurs ou colorants fluorescents sensibles au pH ainsi que des approches méthodologiques pour étudier le rôle de la vascularisation cérébrale dans l’élimination du CO2. Ce phénomène sera étudié chez des souris saines, au cours du vieillissement, et dans un modèle murin d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une pathologie cérébrovasculaire fréquemment observée chez les individus atteints de la maladie d’Alzheimer, qui se caractérise par une accumulation de plaques amyloïdes au niveau des vaisseaux du cerveau. En effet, il semblerait que la régulation du pH cérébral soit altérée dans la maladie d’Alzheimer et l’AAC pourrait en être une des causes en perturbant l’intégrité et la fonction vasculaire. Les astrocytes sont des cellules de l’unité neurovasculaire impliquées dans la régulation du pH cérébral. Nous étudierons leur rôle dans la régulation des échanges de CO2 et de pH à travers la barrière hémato-encéphalique en modulant de manière génétique (souris transgéniques spécifiques) ou pharmacologique des transporteurs ou canaux de ces cellules impliqués dans le transport d’ions. Finalement, les résultats obtenus dans le cerveau seront également étendus à la rétine afin de vérifier si l’imagerie de l’œil pourrait être utilisé comme biomarqueur des pathologies cérébrovasculaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourraient avoir un impact majeur sur la compréhension de la neurophysiologie et la neuropathologie. Il est en effet fondamental de caractériser comment le cerveau régule son pH tissulaire, élimine le CO2 et réagit aux changements de pH et de CO2, et quelle est la contribution du flux sanguin cérébral et des astrocytes dans ce phénomène d’homéostasie. Cette caractérisation permettra ensuite de mieux comprendre les processus neuropathologiques des maladies cérébrovasculaires, plus particulièrement de l’angiopathie amyloïde vasculaire qui touchent les petites artères cérébrales par l’accumulation de dépôts de protéines. Enfin, les résultats sont concluants, ils pourraient mettre en lumière un nouveau biomarqueur pour ces pathologies qui pourraient être évaluées de manière non invasive avec l’imagerie rétinienne.

Procédures

Une partie des animaux recevra un traitement par injection (sans anesthésie) durant 3 jours consécutifs durant moins d’une minute. Une partie des animaux sera soumis à deux interventions chirurgicales (d’environ 45 minutes et 1 heure) à 5 jours d’intervalle minimum, sous anesthésiesie générale et analgésie. Tous les animaux seront observés au microscope biphotonique ou en imagerie ultrasonore sous anesthésiesie ou sous sédation durant 3 heures maximum ou éveillé durant 1 heure maximum et ce, au total 15 fois maximum durant le projet, toute imagerie et tout état confondu. Une partie des animaux recevra une injection de colorant (sans anesthésie) la veille de l’expérience d’imagerie durant moins d’une minute (une fois toutes les deux semaines maximum). Une partie des animaux pourra recevoir une injection de colorant juste avant l’imagerie, sous anesthésie durant moins de 10 minutes, maximum 4 fois, avec un intervalle de minimum 1 mois entre chaque injection. Durant les expériences d’imagerie, les animaux pourront recevoir une injection unique (durant moins d’une minute) ou une perfusion lente de colorants ou agent de contraste (durant le temps de l’expérience soit au maximum 3 heures), sous anesthésie. Les animaux observés éveillés suivront au préalable une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront régulièrement manipulés par les expérimentateurs, ce qui pourra provoquer un stress. Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur chez l'animal éveillé au moment de l’introduction de l’aiguille. Les expériences d’imagerie de la rétine peuvent dans des cas très rares causer une lésion oculaire. Certaines injections pourront provoquer une douleur locale et transitoire au site d’injection et dans de rares cas des lésions locales. Les animaux sont exposés à un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie ou sédation. Une partie des animaux subiront des procédures chirurgicales, sous anesthésie générale, qui peuvent provoquer une douleur transitoire et une perte de poids les 3 jours suivants. Les animaux pourront être observés éveillés sous le microscope après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage. Une partie des animaux recevra une perfusion de colorant (sous anesthésie ou sous sédation), durant l’expérience d’imagerie, ce qui peut provoquer parfois provoquer une douleur et un saignement transitoire.

Devenir

La condition des animaux en fin de procédure (âgés et avec une implantation chirurgicale importante) ne nous permettant pas de procéder à un replacement, ces derniers seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 100 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires.

Remplacement

Notre étude porte sur l’étude du cerveau, un organe très complexe, composé de nombreux types cellulaires, encore mal connu, et dont il n’existe pour le moment aucun modèle de remplacement fiable et pertinent pour répondre à notre question précise, qui est la régulation du pH cérébral. Par ailleurs nous étudions le flux sanguin cérébral, qui est absent dans tous les modèles in vitro et ex vivo. Finalement, notre étude de neurophysiologie nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme entier afin de préserver la communication entre les différents organes et le système cardio-respiratoire (cerveau, cœur, poumons, …).

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons 548 animaux. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles et en prenant en compte une certaine marge d’erreur inhérente aux aléas expérimentaux, dont environ 20% de mortalité par groupe Notre expertise d’imagerie fonctionnelle in vivo a un avantage considérable : elle permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos études car nous réalisons nos expériences d’imagerie sur des animaux vivants et en bonne condition physiologique. Nous pouvons ainsi réutiliser le même animal plusieurs fois au cours de l’étude. Aussi, nous pouvons étudier le cerveau et la rétine au sein du même animal, ce qui permet non seulement de réduire le nombre d’animaux, mais aussi d’augmenter considérablement la puissance statistique (analyses pairées) de nos observations et de nos corrélations en analysant des données de ces deux organes différents au sein du même animal.

Raffinement

Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois à ronger, cotons pour nidation, et igloo et roue), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal (SBEA) pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie ou sédation et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie et la sédation, un gel ophtalmique est déposé sur les yeux, un suivi de température est réalisé et l’animal reçoit un apport d’air oxygéné. La chirurgie sera effectuée en condition stérile, sous anesthésie générale, analgésie et anti-inflammatoire ainsi que des anesthésies locales adaptés. Après la chirurgie et l’imagerie, les animaux recevront un antidote de l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Ils recevront une gelée nutritive après la chirurgie et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours avec pesée quotidienne sera mis en place. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie et à l’expérimentateur pour diminuer le stress lié à cette procédure.

Choix des espèces

La souris est une espèce de mammifère dont la génétique et la physiologie est relativement proche de l’Homme, et chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Pour étudier l’impact de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser des animaux âgés, chez lesquels la pathologie amyloïde est bien installée. Aussi, pour la lignée transgénique pathologique et les contrôles, nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 18 mois afin de suivre l’évolution de la maladie dans le cerveau et la rétine et d’analyser les paramètres physiologiques à différents stades de la maladie (stade précoce, modéré et avancé). Pour les autres lignées, les souris seront utilisées à l’âge adulte, soit entre 2 mois et 12 mois maximum, car il est nécessaire d’observer des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.