Xénopes

Sédatées dans un bain de benzocaïne puis injectées d'hormone gonadotropine sous la peau, des xénopes femelles sont massées le lendemain pour leur faire pondre, à raison de deux injections par an et de deux à trois massages par semaine d'expérimentation. 120 xénopes sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue : au-delà de dix-huit injections reçues depuis la naissance, une femelle est gardée en aquarium jusqu'à sa mort naturelle, sinon elle repart dans une autre procédure. Les embryons obtenus servent à étudier la formation de l'épithélium muco-cilié, un tissu que le porteur rapproche de celui des voies respiratoires humaines. Il déduit l'absence de souffrance de la ponte elle-même, écrivant que "la quantité et qualité des œufs est le signe de bien-être des animaux" et que les femelles "ne montrent aucun signe de douleur (cris, débattements)".

Objectifs

Ce projet vise ? comprendre les m?canismes de formation de l??pith?lium muco-cili?, un tissu essentiel pr?sent dans plusieurs organes humains, comme les voies respiratoires, le cerveau et les organes g?nitaux. Ce tissu est compos? de cellules s?cr?trices de mucus et de cellules multicili?es, qui forment une barri?re protectrice contre les pathog?nes et les polluants. Un dysfonctionnement dans sa mise en place peut entra?ner des pathologies graves, comme les ciliopathies, des maladies li?es ? des d?fauts de la ciliog?n?se (processus de formation des cils). Bien que la ciliog?n?se soit un processus biologique central pour le d?veloppement et le fonctionnement des organismes, certaines de ses ?tapes restent mal comprises. Cela limite la mise au point de traitements efficaces, notamment pour les maladies respiratoires chroniques, o? la r?g?n?ration de l??pith?lium muco-cili? est cruciale pour am?liorer les sympt?mes. L?embryon de x?nope est un mod?le id?al, car son ?piderme est un ?pith?lium muco-cili? tr?s similaire ? celui des voies respiratoires humaines. Chez le x?nope, cet ?pith?lium se d?veloppe pendant l?embryogen?se, recouvre l?embryon pr?coce et est compos? des m?mes types cellulaires (cellules s?cr?trices et multicili?es). Nous nous concentrerons ces 5 prochaines ann?es sur plusieurs m?canismes cl?s comme la r?partition r?guli?re des cellules multicili?es dans l??pith?lium, la diff?renciation des diff?rents types cellulaires (s?cr?trices et multicili?es) et l??tablissement d?un flux liquidien g?n?r? par le battement coordonn? des cils (qui recouvrent l?embryon). Comprendre ces m?canismes permettrait d?avancer vers des th?rapies cibl?es pour les maladies li?es aux dysfonctionnements de cet ?pith?lium, comme certaines maladies respiratoires chroniques.

Bénéfices attendus

Notre objectif ? long terme est de d?crypter les m?canismes mol?culaires et cellulaires qui r?gissent la formation, l'organisation et le fonctionnement de l'?pith?lium mucociliaire, afin d'en ?tablir une mod?lisation compl?te et applicable ? l'Homme.

Procédures

Les x?nopes femelles seront soumises ? une injection d'hormone gonadotropine par jour d'exp?rimentation puis mass?es le lendemain. Ces injections seront au nombre de deux par an et les massages de deux ? trois par semaine d'exp?rimentation.

Impact sur les animaux

La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les ans. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv? pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sous cutan?e seront l?g?rement s?dat?es puis seront plac?es dans le noir (avec un papier absorbant humide sur les yeux par exemple) pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements) lors des injections.

Devenir

? l'issue de la proc?dure, soit la femelle a re?u depuis sa naissance moins de 18 injections et elle est vou?e ? entrer dans une autre proc?dure, soit elle a atteint les 18 injections max et elle sera conserv?e en aquarium jusqu'? sa mort naturelle.

Remplacement

Notre ?quipe a mis au point une lign?e cellulaire stable de foie de xenope. Ces cellules sont capables de produire des centaines de cellules multicili?es sous l?induction d?un g?ne indispensable ? la multiciliog?se. Cette lign?e cellulaire nous permet de tester et appr?cier les effets en amont de drogues et ainsi de r?duire le nombre d?embryons utilis?s. Par contre ces cellules n?ont pas la capacit? de battement ciliaire coordonn?. Elles ne peuvent donc pas reproduire ce flux biologique puissant et indispensable ? la survie de l?embryon.

Réduction

La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les 6 mois. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv?es pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sont l?g?rement s?dat?e (niveau I) dans un bain de benzoca?ne ? 240mg/L et lors de l?injection sous cutan?e, elles sont plac?es dans le noir pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements).

Raffinement

Pour limiter le stress des femelles, g?n?r? par la pr?hension, nous les anesth?sions dans un bain de benzoca?ne ? 240 mg/L entre 7 et 8 minutes ce qui permet d?atteindre le stade I de s?dation (l?g?re anesth?sie caract?ris?e par un retard du r?flexe de retournement, un d?lai dans le r?flexe de fuite et un tonus musculaire l?g?rement relax). Les femelles sont ensuite plac?es sur un linge humide recouvrant ?galement leurs yeux, ainsi plac?es dans l?obscurit?, elles sont plus calmes.

Choix des espèces

L'esp?ce Xenopus Laevis est un organisme mod?le important dans la recherche en biologie depuis un demi-si?cle. La documentation disponible et la large communaut? scientifique en font un mod?le amphibien de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caract?ristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, temp?rature, etc.) de cette esp?ce permettent de pr?senter l'ensemble des manipulations ?l?mentaires r?alis?es lors des proc?dures exp?rimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. Les femelles doivent ?tre matures sexuellement soit des animaux ag?s de 2 ? 8 ans (l'animal a une longue dur?e de vie et la qualit? des ovocytes n'est pas alt?r?e). Nos recherches se feront sur les embryons de x?nopes, dans les soixante-douze premi?res heures de leur vie (avant le stade larvaire autonome). ? ce stade ils sont recouverts d'un ?pith?lium muco-cili? qui leur permet de lutter contre les agressions ext?rieures. Ce tissu ?tant tr?s proche de l'?pith?lium de la trach?e, l'embryon de x?nope est un mod?le de choix pour nos recherches.

Vingt des 110 femelles de Xénope utilisées viennent déjà d'un projet antérieur, où elles ont subi des cycles d'ovulation similaires. Toutes reçoivent une injection hormonale destinée à induire l'ovulation, jusqu'à quatre fois sur la durée du projet et à six mois d'intervalle, et sont isolées la nuit le temps de la ponte, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit que cet isolement ne constitue pas une nuisance significative, "le Xénope étant considéré comme un animal non social à mode de vie solitaire", tout en indiquant que les femelles retournent en aquarium collectif après 48 heures. Cent d'entre elles seront tuées quand leur ponte baissera durablement en quantité ou en qualité, les dix autres restant en vie pour être réutilisées dans un futur projet autorisé.

Objectifs

Tous les organismes se développent grâce aux divisions de leurs cellules : chaque cellule copie son matériel génétique puis le répartit entre deux cellules filles. Le projet vise à comprendre comment les premières divisions cellulaires sont contrôlées au début du développement embryonnaire. Le développement précoce est largement conservé chez les Vertébrés et peut être facilement étudié chez le Xénope, car la fécondation et le développement de l’embryon ont lieu à l’extérieur de la femelle. Chez les Vertébrés, les toutes premières divisions de l’embryon sont très rapides et bien coordonnées. Elles reposent surtout sur les réserves déjà accumulées dans l’ovocyte par la mère, avant que le génome de l’embryon ne devienne pleinement actif. La réussite de ces premières divisions est essentielle, car elle permet à l’embryon de s’organiser correctement et de mettre en place ses axes, qui définiront progressivement les futures régions du corps, comme la tête, le dos, le ventre et les membres.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent d’abord une meilleure compréhension des premières divisions de l’embryon. Après la fécondation, l’embryon se divise très rapidement et de façon très coordonnée, alors même que son propre génome est encore peu actif. Ce projet permettra d’identifier les mécanismes moléculaires qui organisent ces premières divisions, notamment les voies de signalisation et les protéines qui contrôlent le cycle cellulaire. Le projet pourra ensuite aider à mieux comprendre certains échecs précoces du développement et certaines formes d’infertilité. Les études sur l’embryon humain sont très limitées, et le modèle souris ne reproduit pas toujours fidèlement tous les mécanismes précoces présents chez les autres vertébrés. Le Xénope permet d’étudier facilement ces étapes et d’identifier des gènes conservés chez l’Homme, qui pourraient être impliqués dans des défauts de fécondation, de premières divisions ou d’arrêt précoce du développement. Un autre bénéfice concerne la compréhension du cancer. Les premières divisions embryonnaires utilisent des régulateurs fondamentaux de la division cellulaire. Ces mêmes régulateurs peuvent, lorsqu’ils sont dérégulés dans d’autres cellules, contribuer à une prolifération incontrôlée. Le projet pourrait donc révéler de nouveaux acteurs importants du contrôle de la division cellulaire. Enfin, le projet permettra de mieux comprendre comment l’embryon s’organise au tout début du développement. Certaines molécules étudiées sont déjà présentes dans l’ovocyte avant la fécondation et sont nécessaires pour organiser correctement l’embryon. Leur caractérisation aidera à mieux comprendre les causes possibles d’arrêts précoces du développement ou d’anomalies dans la mise en place des axes de l’embryon, comme le futur dos, le ventre, la tête et les membres.

Procédures

Les femelles de Xénope sont soumises, à l’état vigile, à une stimulation hormonale par injection afin d’obtenir des œufs destinés aux fécondations in vitro. Il s’agit d’une intervention légère, car elle ne comporte aucun geste chirurgical et la manipulation est très courte. La contention dure moins d’une minute, uniquement le temps de réaliser l’injection avec une seringue munie d’une aiguille fine de faible diamètre. Chaque femelle peut être stimulée au maximum quatre fois sur la durée du projet, avec un intervalle d’au moins six mois entre deux stimulations.

Impact sur les animaux

Des nuisances minimales sont attendues, principalement liées à un stress transitoire associé à la contention et à l’injection destinée à induire l’ovulation chez les femelles. Les femelles reçoivent uniquement une injection afin d’induire l’ovulation. Elles sont ensuite maintenues en hébergement individuel pendant la nuit afin de permettre l’ovulation. Cet hébergement individuel temporaire, limité à la période de ponte, ne constitue pas une nuisance significative, le Xénope étant considéré comme un animal non social à mode de vie solitaire.

Devenir

À l’issue des procédures de stimulation hormonale, il est estimé qu’environ 100 femelles arriveront en fin de période de production d’œufs de qualité suffisante pour les besoins du projet, avec une baisse durable de la capacité à pondre ou de la qualité des œufs. Elles seront donc euthanasiées conformément aux points limites définis. Environ 10 autres femelles continueront à produire des œufs de bonne qualité et seront maintenues en vie afin de pouvoir être réutilisées dans le cadre d’un futur projet autorisé.

Remplacement

Notre objet d’étude est l’embryon précoce de Xenopus laevis. À ce stade, l’embryon se développe grâce aux molécules déjà présentes dans l’œuf, qui contrôlent les premières divisions cellulaires et l’organisation progressive de l’embryon. Ces étapes ne peuvent pas être reproduites correctement avec des cellules cultivées en laboratoire, car elles dépendent de l’embryon entier, de sa forme, de son organisation dans l’espace, des échanges entre ses différentes cellules, ainsi que des composants fournis par la mère au cours de la croissance de l’ovocyte. Il n’est donc pas possible de remplacer entièrement ce modèle par des cellules isolées, des systèmes artificiels ou une modélisation informatique. Nous devons donc utiliser des embryons intacts, obtenus par fécondation in vitro à partir de gamètes de Xénopes adultes, puis les cultiver in vitro uniquement aux stades précoces nécessaires au projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous profitons du fait qu’une femelle de Xénope peut pondre environ 1000 œufs dans le milieu extérieur après une seule stimulation hormonale. Cela constitue un avantage par rapport aux modèles mammifères, où le nombre d’ovocytes est beaucoup plus faible, environ 20 chez la souris, et où les ovocytes sont ovulés dans l’oviducte. Les œufs pondus puis fécondés issus d’une même ponte peuvent donc être répartis entre plusieurs expériences réalisées en parallèle, ce qui évite de stimuler de nouvelles femelles pour chaque expérience. Les embryons sont étudiés seulement au tout début de leur développement, avant le stade 47, c’est-à-dire avant qu’ils ne soient considérés comme des animaux dans le cadre de cette réglementation. Pour chaque condition expérimentale, nous utilisons le plus petit nombre d’embryons permettant d’obtenir des résultats interprétables, généralement 5 embryons par condition et par répétition expérimentale. Les expériences sont discutées chaque semaine au sein de l’équipe afin d’éviter les doublons et les répétitions inutiles. Au total, 110 femelles sont utilisées dans cette procédure, dont 20 proviennent d’un projet précédent, où elles ont suivi des cycles d’ovulation similaires et ont reçu moins de quatre stimulations hormonales. Les stimulations sont espacées d’environ six mois, et une même femelle peut être stimulée jusqu’à quatre fois, ce qui permet de réduire fortement le nombre de femelles nécessaires.

Raffinement

Les animaux nouvellement commandés sont placés en quarantaine puis acclimatés à leur nouvel environnement pendant quatre semaines. Les femelles sont maintenues dans des aquariums adaptés, avec une eau déchlorée, filtrée et maintenue à 20 degrés. Leur environnement est enrichi par des plantes en plastique et des objets adaptés à leur taille. Les animaux sont nourris régulièrement avec une alimentation variée, comprenant des granulés, des vers de vase et, si nécessaire, du cœur de bœuf. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et sont limitées au strict nécessaire. Lors des changements d’aquarium, les animaux sont attrapés doucement, à la main ou avec une épuisette, afin de réduire le stress. La stimulation hormonale consiste en une simple injection sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. La contention est douce et très brève, limitée au temps nécessaire à l’injection (moins d’une minute). Les Xénopes sont surveillés quotidiennement par le personnel animalier. Après la ponte, les femelles sont placées pendant 48 h en aquarium individuel afin de prévenir les infections et de vérifier leur bon état général, notamment leur mobilité et leur comportement. Elles sont ensuite replacées en aquarium collectif. Le point limite correspond à l’atteinte de quatre cycles de stimulation hormonale ou, indépendamment du nombre de cycles réalisés, à une détérioration de l’état général de l’animal constatée lors du suivi des signes cliniques et confirmée par le vétérinaire. Dans les deux cas, l’animal est euthanasié selon la méthode réglementaire.

Choix des espèces

L’embryon précoce de Xénope est un modèle très utile pour étudier les premières étapes du développement. Après une stimulation hormonale, une femelle peut pondre un grand nombre d’œufs dans le milieu extérieur, qui sont facilement fécondés in vitro. Cela constitue un avantage par rapport à la souris, chez laquelle le nombre d’ovocytes obtenus est beaucoup plus limité et leur récupération nécessite l’euthanasie de la femelle. Chez le Xénope, une seule ponte permet d’obtenir de nombreux embryons qui se développent dans le milieu extérieur, ce qui facilite les expériences et limite le nombre d’animaux nécessaires. Les œufs et les embryons de Xénope sont grands et riches en molécules importantes pour le développement. Ils permettent donc d’étudier facilement les premières divisions de l’embryon et les mécanismes qui contrôlent son organisation. Comme ces mécanismes sont en grande partie conservés chez les Vertébrés, donc le Xénope peut aider à identifier des gènes ou processus impliqués dans des défauts précoces du développement ou certaines formes d’infertilité humaine. Les animaux adultes sont utilisés uniquement pour obtenir les œufs et le sperme nécessaires aux fécondations in vitro. Les femelles utilisées sont âgées d’au moins 18 mois, sans limite d’âge supérieure prédéfinie. Elles peuvent recevoir au maximum quatre stimulations hormonales et sont identifiées individuellement par puce afin d’assurer leur suivi.

Les 150 mâles sont tués après stimulation hormonale pour qu'on leur prélève les testicules, les 48 femelles restant en vie et sollicitées à nouveau tous les quatre mois, soit 198 xénopes utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Femelles et mâles reçoivent une injection d'hormone sur animal vigile maintenu en contention de dix à trente secondes, les femelles étant ensuite isolées 48 heures pour finir de se vider de leurs ovocytes, faute de quoi leurs congénères les mordent pour manger les œufs. Le porteur indique que la ponte provoquée n'a pas d'impact négatif sur la santé des femelles et qu'elles peuvent être utilisées ainsi toute leur vie, soit une dizaine d'années en captivité. Cette structure ne mène pas de recherche propre, elle fournit ovocytes et embryons à d'autres équipes.

Objectifs

La plateforme constitue une structure d'appui à la recherche qui a pour mission de fournir des ovocytes et des embryons à la communauté des chercheurs utilisant le modèle xénope dans les domaines de la biologie du développenent et des neurosciences. L'obtention d'oeufs fertilisés nécessiste des injections d'hormones chez la femelle et chez le mâle. Ces hormones stimulent la ponte (femelles) et la maturation des gamètes (mâles) afin d'obtenir des fertilisations in vitro de qualité et en quantité.

Bénéfices attendus

Notre structure d’appui à la recherche a pour mission de fournir des œufs fécondés ou non à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Les oeufs non fécondés pourront être utilisés pour des expérimentations de biochimie (quantification de protéines, expériences sur des extraits). Les oeufs fécondés, du fait de leur transparence et de leur facilité d'accès (développement externes) sont des outils puissants pour comprendre les mécanismes du développement embryonnaire. Par exemple, parmis les équipes qui bénéficieront de la production d'ovocytes, certaines utilisent actuellement le xénope pour développer un nouveau système modèle pertinent et robuste pour étudier et comprendre des maladies humaines liées au développement précoce du cerveau et à l'émergence des tumeurs pédiatriques. Une autre équipe étudie les mécanismes fondamentaux de la dépense énergétique dans le développement.

Procédures

Femelles : Les femelles seront soumises à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la ponte. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Après récolte de leurs œufs, les femelles sont ensuite maintenues en hébergement individuel durant 48h pour surveillance. Cette période permet à la femelle de se vider de ses ovocytes matures, ce qui évite que ses congénères ne la mordent en voulant manger les ovocytes. Les femelles retournent ensuite dans leur groupe d’origine. Mâles : Les mâles seront soumis à une administration d’hormone sur animal vigile en contention afin de stimuler la production de sperme de qualité. Cet acte dure de 5 à 10 secondes. Les mâles seront ensuite euthanasiés pour récupérer leurs testicules.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement, mais le stress social n’est pas applicable chez cette espèce. Le Xénope est en effet un animal poïkilotherme, à comportement solitaire en conditions normales d’élevage. Les nuisances attendues lors de la stimulation hormonale des femelles et des mâles vigiles sont principalement de type inconfort et stress, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Le stress et l’inconfort peuvent être liés : 1. à la capture de l’animal dans l’aquarium, 2. au maintien en contention, d’une durée brève (10 à 30 secondes), 3. à la manipulation nécessaire à la récolte des ovocytes chez les femelles. Une douleur légère et transitoire peut également survenir lors de la stimulation hormonale.

Devenir

Chez la femelle Xenopus, la ponte est déclenchée par une injection lorsqu’elle est adulte. En respectant un délai suffisant entre deux stimulations (environ 4 mois), cette procédure n’a pas d’impact négatif sur sa santé et peut être répétée plusieurs fois au cours de sa vie. Les femelles peuvent ainsi être utilisées tout au long de leur durée de vie. Les mâles, quant à eux, sont utilisés pour la production de spermatozoïdes nécessaires à la fécondation in vitro. Après stimulation hormonale, ils sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des testicules et ne sont donc pas maintenus en vie après la procédure.

Remplacement

La production d'embryons permettra d'explorer les étapes précoces du développement chez les vertébrés. Nous intervenons sur les animaux adultes dans un seul but : stimulation hormonale de l’ovulation des femelles vivantes dans le but de récolter les ovocytes suite à leur ponte qui seront ensuite fécondés in vitro pour la production des embryons. Il n’y a pas de méthode de substitution possible. Les équipes utilisent au maximum des approches in silico et si possibles des approches dans des cellules mammifères en culture en complément de nos approches in vivo. De plus le vertébré tétrapode non mammifère Xenopus tropicalis répondent idéalement aux recommandations des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner. L'amphibien Xenopus tropicalis possède une longévité et une période de reproduction remarquables (10 ans) ce qui en fait un excellent modèle pérenne pour les études d’ordre génétique.

Réduction

Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur le fait qu’un petit nombre d’adultes permet d’obtenir un grand nombre d’embryons par fécondation in vitro. Les expériences sont organisées de manière à optimiser l’utilisation de ces embryons, en coordonnant le travail de plusieurs expérimentateurs et en regroupant les essais. Nous adaptons en permanence nos pratiques grâce à une veille scientifique régulière et nous ne réalisons des expériences sur les animaux que lorsqu’elles sont indispensables. Les résultats obtenus sont analysés afin d’ajuster au plus juste le nombre d’animaux nécessaires. En pratique, une à deux fécondations sont réalisées par semaine, en utilisant 3 à 4 femelles, avec généralement un seul mâle suffisant pour chaque série. Les mâles reçoivent également une injection hormonale et sont donc inclus dans le nombre total d’animaux. Les femelles peuvent être sollicitées plusieurs fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois, afin de limiter leur stress et de réduire le nombre total d’individus utilisés. Lorsque cela est possible, des femelles issues de projets précédents sont réutilisées. Au total, sur toute la durée du projet, le nombre maximal d’animaux adultes utilisés est estimé à 48 femelles et 150 mâles, soit 198 animaux. Cette estimation prend en compte la réutilisation raisonnée des animaux, le respect de périodes de repos et l’optimisation des procédures expérimentales.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des aquariums ayant une capacité de 10 litre par aquarium, contenant de l’eau déchlorée, filtrée et oxygénée, à 20 degrés . Des sondes surveillent en temps réel la température, le pH et la conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes en plastique où certains animaux peuvent se cacher, ainsi que par des aménagements intérieurs (plantes artificielles et petites billes), bien que le comportement majoritaire consiste à rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums est effectué tous les 15 jours. Six à huit animaux sont regroupés par aquarium. Aucun stress n’est observé lorsque le groupe est réduit ou lorsque l’individu est hébergé seul, cette espèce présentant un comportement solitaire. Lors de la réception, les animaux sont placés dans des bacs individuels et observés pendant deux semaines avant leur introduction dans le circuit fermé. Ils sont ensuite acclimatés pendant deux semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Les xénopes adultes sont nourris deux fois par semaine à satiété avec des granulés de poisson et des vers de vase et/ou du cœur de bœuf. Les animaux sont prélevés à la main ou à l’aide d’une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de limiter le stress. Une grille de score est réalisée à intervalles réguliers, avec des points limites définis afin d’assurer le suivi et l’évaluation des paramètres observés.

Choix des espèces

Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 1 an environ pour X. tropicalis, jusqu’à leur mort (environ 10 ans en captivité).

Réutilisées d'une ponte à l'autre pendant des années, avec au moins six mois de repos entre deux stimulations, 200 femelles xénopes reçoivent une injection sous-cutanée d'hormone gonadotrophine puis un massage abdominal de quinze à trente secondes pour libérer leurs œufs. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger et les femelles sont gardées vivantes, remises avec leurs congénères après chaque série de pontes. Les embryons obtenus sont utilisés pour étudier la formation des tissus embryonnaires. Le porteur présente le xénope comme un modèle qui "a le potentiel de remplacer avantageusement les modèles mammifères", et affirme qu'un cycle de ponte régulier est bénéfique pour la femelle, celle-ci digérant ses ovules non utilisés à défaut de stimulation.

Objectifs

Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des tissus durant le développement embryonnaire. Les mêmes mécanismes sont aussi essentiels chez l’adulte durant la cicatrisation et la régénération des tissus, ainsi que lors du développement du cancer, en particulier l’apparition de métastases. Nous étudions ce processus durant le développement précoce de l’embryon de Xénope. Les découvertes faites dans ce modèle peuvent être généralisées non seulement aux autres embryons de vertébré, y compris mammifères et humains, mais aussi pour l’étude du cancer.

Bénéfices attendus

Le thème de notre recherche concerne une des grandes questions fondamentales du développement embryonnaire. Les découvertes dans le domaine des sciences biologiques fondamentales ont depuis toujours été le grand moteur des avancées de la société, en particulier en médecine. Dans le cas spécifique de notre recherche, nos résultats auront des impacts à moyen-long terme pour la médecine à plusieurs niveaux, incluant la compréhension de défauts causant la mort ou de graves anomalies du fœtus, la dérégulation des fonctions et pathologies des tissus adultes, en particulier le cancer, ainsi qu’au progrès dans le domaine de la régénération des tissus. Un autre bénéfice important de ce domaine de recherche fondamentale concerne l’impact des déréglements de l’environnement sur la biodiversité, car le développement embryonnaire est une étape extrêmement sensible, en particulier chez les amphibiens.

Procédures

Procédure standard d’induction de la ponte d'ovocytes par la femelle xénope par injection sous-cutanée. La procédure est légère. La femelle reçoit une injection sous cutanée de l’hormone gonadotropine, qui induit la ponte chez les amphibiens et autres vertébrés. Cette hormone est naturellement produite par la femelle sexuellement mature lors de la période de reproduction. L’injection est effectuée par le personnel formé et en prenant soin d'éviter douleur et stress à l'animal. La durée totale de la manipulation est de 15 à 30 secondes L'injection est réalisée dans une pièce de l'animalerie dédiée à l'injection et à la ponte. La femelle est immédiatement replacée dans son bac après injection. Une ponte de quelques centaines d’œufs est obtenue après un massage doux de l’abdomen d’env. 15 à 30 secondes. Il est possible d’obtenir 2 à 3 pontes successives en répétant le massage toutes les 1-2 heures. A la fin de la phase de ponte, qui dure quelques heures, la femelle est remise avec ces congénères pour une période de repos d’au moins six mois. Durant cette période, la femelle non seulement recupère, mais recommence un cycle naturel de maturation d’ovules, en vue d’une nouvelle phase de ponte. Les femelles peuvent ainsi être réutilisées après ce temps de repos. A noter qu’un cycle de 6 à 12 mois de ponte est bénéfique pour l’animal. En l’absence d’une nouvelle stimulation hormonale, la femelle entre dans une phase « anormale » où elle « digére » les ovules non utilisés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables se limitent à la nécessité d’immobiliser temporairement la grenouille (en prenant la grenouille dans la main), à l’injection sous-cutanée et au massage doux pour favoriser la ponte. La douleur et le stress sont dans tous les cas légers et de courte durée (quelques secondes).

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux sont mis au repos au minimum pendant 6 mois, et réutilisé ensuite pour la poursuite du projet.

Remplacement

Les processus impliquant la formation des tissus sont très sophistiqués, et il n’est actuellement pas possible de les reproduire avec fidélité dans des systèmes in vitro. Par contre, les embryons sont des modèles intermédiaires de choix, qui nous donnent des informations précieuses pour comprendre aussi les processus actifs chez les organismes adultes. De plus, le modèle Xénope est un excellent substitut aux modèles mammifères, tels que la souris, car les embryos sont obtenus par simple ponte externe. Les résultats obtenus sur les embryons de Xénope sont parfaitement pertinents pour la compréhension de processus essentiel dans le développement humain ainsi que pour les pathologies, en particulier le cancer. C’est donc un modèle alternatif qui a le potentiel de remplacer avantageusement les modèles mammifères. Il est un complèment essentiel aux systèmes in vitro, encore très imparfaits.

Réduction

En centrant nos projets sur le xénope, l’utilisation d’animaux est énormement réduite par rapport à la souris. Un œuf de xénope est cent fois plus gros qu’un embryon de souris. Cette grande taille permet de conduire plus d'analyses sur un nombre plus restreint d'embryons. Nous nous efforçons aussi de réduire au minimum le nombre de Xénopes utilisés. Nous organisons nos expériences autant que possible de façon à ce que la ponte d’une femelle puisse être utilisée pour deux expériences en parallèle. Ceci dépend du nombre d’œufs obtenu, qui est variable, mais souvent suffisant pour deux expériences. Nous prévoyons deux femelles par jour d’expérience, basé sur l’observation qu’en moyenne une femelle sur deux produit une ponte de bonne qualité. Dans le cas où les deux femelles produisent de bons oeufs, nous en profitons pour dupliquer l’expérience. Ainsi l’utilisation des œufs est optimisée au maximum. De plus, les femelles xénopes peuvent être réutilisées après un période de repos de six mois, et ceci durant plusieurs années, ce qui réduit encore le nombre d’animaux. Les femelles xénopes peuvent vivre en parfaite forme jusqu’à plus de dix ans d’âge (la vie d’une femelle en captivité peut aller jusqu’à 20 ans), en continuant à obtenir des pontes de qualité. Nous pouvons sans problème réutiliser les femelles durant des années en garantissant leur bien-être. Ainsi les 200 femelles xénope que nous souhaitons utliser seront suffisantes pour une durée de 5 ans afin de mener à bien ce projet.

Raffinement

Des raffinements spécifiques aux xénopes ont été implémentés, las bacs contenant des nénuphars en plastique et tuyaux PVC qui servent d’abris/cachette, ainsi qu’un complément alimentaire contenant des vers.

Choix des espèces

Le Xénope est un modèle établi pour l’étude du développement embryonnaire chez les animaux vertébrés. C’est un modèle avec de nombreux avantages sur les autres modèles animaux, notamment : a) une ponte externe, induite par injection d’hormone, qui ne nécessite pas de sacrifier l’animal pour étudier le dévelopemment. b) des pontes abondantes (plusieures centaines d’œufs) et une grande taille des œufs (1 mm), qui permet de récolter un nombre maximun de données pour un nombre minimum d’animaux utilisés. c) Tant les gènes et protéines, que les propriétés des cellules et des tissus et les mécanismes de migration cellulaires durant l’embryogénèse sont très proches de celles des mammifères et de l’homme. Les résultats fournissent donc des informations immédiatement pertinentes pour une meilleure compréhension du développement de l’homme ainsi que pour les pathologies associées. Nous utilisons des femelles sexuellement matures pour obtenit des œufs. Les expériences elles-mêmes ne nécessite pas d’animaux, elles se font sur les embryons précoces.

Pour mesurer comment la présence de deux espèces introduites affecte des têtards de grenouille verte, 1 980 têtards sont exposés six heures par jour à un xénope ou à une perche soleil enfermés dans une boîte perforée. Ces 2 034 animaux non-humains, têtards, 18 xénopes, 18 perches soleil et 18 poissons rouges témoins, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Capturés deux jours après éclosion dans des mares proches du laboratoire, les têtards sont manipulés à l'épuisette ou à la pipette, transportés, pesés, puis soumis à des tests comportementaux de moins de trente minutes. Les têtards devenus grenouilles retournent sur leur site de capture, les xénopes et les perches soleil sont tués parce que la réglementation interdit de relâcher des espèces exotiques envahissantes, et les poissons rouges restent en captivité.

Objectifs

Cette étude vise à mieux comprendre comment la présence de deux espèces exotiques, un amphibien appelé xénope et un poisson nommé perche soleil, affecte le développement et le comportement des jeunes grenouilles locales. Pour cela, les têtards, c’est-à-dire les grenouilles avant leur transformation, seront placés dans des bassins où ils seront exposés chaque jour, pendant six heures, à ces deux prédateurs. Trois situations différentes seront testées selon le nombre de têtards dans chaque bassin : peu nombreux, moyennement nombreux ou plus nombreux, afin de voir si la densité a un effet sur leur croissance et leur survie. En plus, d’autres groupes seront observés sans prédateur, avec un poisson rouge inoffensif ou en présence d’un objet vide, pour comparer les réactions. L’étude analysera comment ces conditions influencent la durée de développement des têtards, leur taille à la transformation, leur survie, et leurs comportements face aux prédateurs. Cette recherche durera environ cinq mois, depuis la collecte des têtards jusqu’à leur libération sur leur lieu d’origine, après observation. Les prédateurs utilisés, xénopes et perches soleil, étant des espèces exotiques envahissantes, ne seront pas relâchés dans la nature à la fin de l’étude, afin d’éviter tout risque pour les écosystèmes locaux. À long terme, ce projet permettra de mieux comprendre l’impact des espèces envahissantes sur les amphibiens locaux, ce qui aidera à développer des stratégies pour protéger ces populations fragiles. Les résultats contribueront à la conservation des grenouilles et à la gestion des milieux naturels, en limitant les effets négatifs de ces prédateurs étrangers sur la biodiversité.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment les jeunes grenouilles vertes réagissent à la présence de deux espèces étrangères qui ont été introduites dans la nature : le xénope lisse et la perche soleil. Ces espèces peuvent menacer les grenouilles locales en les mangeant ou en dégradant leurs conditions de vie. Nous allons étudier comment ces jeunes grenouilles grandissent, survivent et se comportent quand elles sont en contact avec ces prédateurs. À long terme, les résultats aideront à trouver de meilleures façons de protéger les grenouilles et leurs habitats naturels, comme les mares et les étangs. Ces informations seront utiles aux personnes responsables de la protection de la nature pour décider comment limiter la progression de ces espèces étrangères et préserver la faune locale. Ainsi, ce projet apportera des connaissances importantes pour protéger la biodiversité tout en respectant le bien-être des animaux étudiés. Les désagréments causés aux grenouilles seront temporaires et sans conséquences durables pour leur santé.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront principalement soumis à des manipulations non invasives, consistant à les transférer entre leur habitat naturel, leur transport, les bassins d’élevage, et des dispositifs d’observation pour étudier leur comportement. Ces manipulations concernent environ 1980 têtards de grenouille verte ainsi que 54 prédateurs (18 xénopes lisses et 18 perches soleil, 18 poissons rouge). • Têtards de grenouille verte : Capturés à leur stade jeune (2 jours après éclosion) dans des mares situées à moins de 30 km du laboratoire, ils seront transportés pendant environ 30 minutes jusqu’aux bassins d’élevage. Ils seront manipulés à l’aide d’épuisettes fines ou de pipettes larges, sans anesthésie, pour minimiser le stress et éviter les blessures. Chaque têtard sera manipulé plusieurs fois lors des transferts et des tests, avec des manipulations de moins de 5 minutes par individu. • Prédateurs (xénopes, perches soleil et poissons rouge) : 18 individus de chaque espèce seront maintenus en élevage et temporairement placés dans des boîtes perforées pour l’exposition aux têtards, 6 heures par jour. Leur manipulation se fera manuellement, sans anesthésie. Aucune procédure chirurgicale, prélèvement invasif ou anesthésie ne sera réalisée. Toutes les interventions seront réalisées en respectant le bien-être animal et en limitant au maximum le stress.

Impact sur les animaux

Les animaux impliqués dans cette étude seront exposés à des manipulations douces et non invasives. Les têtards de grenouille verte seront capturés, transportés et transférés dans des bassins où ils seront observés. Ils seront également placés temporairement près de prédateurs dans des boîtes perforées, mais sans contact direct. Ces interventions peuvent provoquer un stress léger et temporaire, lié principalement au transport et à la manipulation, mais aucun acte douloureux ou invasif (comme des injections ou des interventions chirurgicales) ne sera réalisé. Les prédateurs seront eux aussi manipulés de manière non invasive, placés dans des contenants perforés pour permettre une interaction visuelle avec les têtards, sans contact direct. Aucun prélèvement biologique ou procédure douloureuse ne sera effectué sur les animaux. Tous les soins et manipulations seront réalisés pour limiter au maximum le stress et l’inconfort.

Devenir

À l’issue de la première procédure, les têtards de grenouille verte, après exposition aux différents prédateurs et contrôles, seront pesés puis relâchés sur leur site naturel de capture afin de respecter leur cycle de vie et limiter l’impact sur les populations locales. Les prédateurs impliqués dans l’étude comprennent le xénope lisse et la perche soleil, deux espèces exotiques envahissantes interdites de remise en liberté pour éviter leur propagation nuisible à la biodiversité locale. Ces animaux seront donc euthanasiés de manière éthique conformément aux normes réglementaires. Le poisson rouge, espèce non invasive utilisée comme contrôle, sera quant à lui maintenu en captivité dans de bonnes conditions ou remis à des structures appropriées si possible. Concernant la seconde procédure, qui consiste en des tests comportementaux réalisés sur les mêmes têtards prélevés puis replacés dans leurs bassins, aucun animal ne sera euthanasié à l’issue des tests. Tous les têtards continueront leur développement naturel dans leur milieu d’élevage avant d’être relâchés. Cette approche limite au maximum la souffrance animale et respecte les exigences éthiques.

Remplacement

Dans ce projet, les animaux utilisés sont essentiels pour répondre aux questions scientifiques posées, car il s'agit d'étudier des comportements et des réponses biologiques qui ne peuvent être reproduits de manière satisfaisante par des méthodes alternatives, comme des simulations informatiques ou des tests en laboratoire sans animaux. Cependant, nous avons veillé à utiliser des méthodes qui minimisent le nombre d’animaux nécessaires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été soigneusement calculé pour être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Au total, environ 1 980 têtards seront observés, répartis en groupes correspondant aux différentes situations testées (présence ou non de prédateurs, et densités différentes). Chaque condition sera répétée trois fois pour garantir la fiabilité des comparaisons. Avant de lancer cette étude, des essais sur de petits groupes ont été réalisés afin d’ajuster au mieux la durée de l’expérience et la taille des groupes nécessaires. Les mêmes individus seront suivis tout au long du projet, ce qui évite de devoir en prélever de nouveaux. Les têtards devenus grenouilles seront relâchés sur leur site d’origine. La durée totale du projet (environ 4 à 5 mois) est adaptée à leur cycle de vie naturel.

Raffinement

Tout est mis en place pour que les animaux ne subissent ni douleur ni stress inutile. Aucune opération ni manipulation invasive n’est prévue. Les têtards seront observés dans des bassins extérieurs reproduisant les conditions naturelles, tandis que les prédateurs (xénopes, perches soleil et poissons rouges) seront placés dans des boîtes percées, empêchant tout contact direct. Les manipulations nécessaires, comme la pesée ou le transfert pour les observations de comportement, dureront peu de temps et seront réalisées dans le calme et à température stable. Les tests de comportement ne dépasseront pas 30 minutes, et chaque animal sera immédiatement replacé dans son bassin d’origine. La qualité de l’eau sera surveillée chaque semaine (température, oxygène, pH, nitrates…) pour garantir un environnement sain. En cas de problème, l’eau sera changée et les tests suspendus jusqu’à un retour à la normale. Lors des déplacements, les animaux seront transportés dans des bacs couverts et sombres afin de limiter leur stress. Avant chaque test, un temps d’adaptation de 15 minutes leur permettra de retrouver un comportement normal. L’état de santé des animaux sera contrôlé tous les jours. Si un individu montre des signes de stress, de blessure ou de fatigue, il sera isolé, observé plus attentivement, et retiré si nécessaire. En cas de souffrance trop importante, l’animal sera euthanasié sans douleur à l’aide d’un anesthésiant.

Choix des espèces

L’étude porte sur la grenouille verte, une espèce locale très commune dans les mares et zones humides de la région. Elle est classée comme espèce menacée et joue un rôle essentiel dans l’équilibre des écosystèmes aquatiques. Son choix est pertinent car elle représente un bon modèle pour comprendre comment les amphibiens réagissent face à des changements dans leur environnement, notamment à la présence de nouveaux prédateurs. Les tests portent sur les têtards, c’est-à-dire la phase larvaire des grenouilles, car c’est à ce stade qu’ils sont les plus vulnérables à la prédation. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre comment ces jeunes amphibiens s’adaptent ou réagissent à des signaux de danger. Les prédateurs utilisés sont le xénope et la perche soleil, deux espèces introduites en France depuis plusieurs années et considérées comme envahissantes. Leur présence modifie l’équilibre naturel des mares en entrant en compétition avec les espèces locales. Une troisième espèce, le poisson rouge, est utilisé comme témoin : il n’est pas un prédateur des têtards mais permet de vérifier que les réactions observées sont bien dues à la présence de véritables prédateurs. Ces espèces ont été choisies car elles sont faciles à maintenir dans de bonnes conditions en captivité, ne nécessitent pas de manipulations invasives et permettent de simuler des situations écologiques réalistes. À la fin du projet, les grenouilles seront relâchées sur leur site d’origine, tandis que les espèces exotiques (xénope et perche soleil) seront euthanasiées conformément à la réglementation, car leur remise en milieu naturel est interdite.

Une injection d'hormone d'une trentaine de secondes, puis un massage du ventre le lendemain pour provoquer la ponte : dix femelles xénopes subissent ce protocole chaque année, et les 1 200 embryons ainsi obtenus servent aux travaux pratiques. Un mâle est anesthésié et tué chaque année juste avant le prélèvement de ses testicules, utilisables une quinzaine de jours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger, la contention imitant la prise du mâle pendant l'accouplement, les yeux de la femelle recouverts pour réduire le stress. Les dix femelles sont réutilisées après six mois de récupération, celles qui ne pondent pas deux fois de suite étant mises à mort, et les étudiants n'interviennent qu'ensuite, sur des embryons déjà fixés.

Objectifs

Il s'agit de former les étudiants aux techniques courament utilisées en biologie du développement et de développer leur sens de l'observation afin de leur permettre de distinguer différents stades de développement durant l'embryogenèse chez l'amphibien Xénope, ou d'interpréter l'expression de différents gènes. Le nombre d'étudiants participant aux TP de M1 est au maximum de 20. Les TP de L2 regroupent 160 étudiants en plusieurs groupes. Ces TP nécessitent l'obtention d'environ 1200 embryons par année obtenus par stimulation hormonale de la ponte de femelles adultes suivie d'une fécondation in vitro. Il est a noté que les étudiants ne participent pas à la première phase du projet impliquant des animaux adultes. Les étudiants vont utiliser les embryons fixés obtenus durant cette phase préparatoire.

Bénéfices attendus

Acquisition par les étudiants de connaissances pratiques et du sens de l'observation dans le cadre d'un enseignement en biologie du développement.

Procédures

Il s'agit de stimuler la ponte d'ovocytes par les femelles de xénope afin de réaliser une fécondation in vitro. La durée de la stimulation hormonale est brève, environ 30 secondes. Le lendemain ces femelles sont massées une à deux fois pour induire la ponte des oeufs. Un male est anesthésié et les testicules sont prélevés. Le mâle est mis à mort juste avant l'opération. Compte tenu de l'efficacité relative de la stimulation hormonale et de la fécondation in vitro, une dizaine de femelles semble nécéssaire pour obtenir 1200 embryons par an, à raison d'une seule stimulation hormonale par femelle et par an. Un seul mâle sera euthanasié par an afin d'obtenir des testicules utilisables pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Stress induit par l'injection d'hCG pour les xénopes femelles. Stress induit par l'anesthésie pour le xénope mâle. Le jour de la fécondation in vitro, le ventre de la femelle est massé pour provoquer la ponte, par pression légère afin de mimer la pression naturelle apliquée sur l'abdomen par le mâle.

Devenir

A la suite de la stimulation hormonale, les femelles sont transférées dans un bac de réserve pour ne pas les mélanger avec les femelles qui n'ont pas encore été injectées et un délai de 6 mois de récupération est respecté avant une nouvelle injection. Les femelles qui ne pondent pas deux fois de suite sont mises à mort. Les autres femelles sont maintenues en vie tout au long du projet. Dans le cas d'animaux malades, des points limites ont été établis pour limiter la souffrance et permettre leur prise en charge adaptée.

Remplacement

La fécondation in vitro constitue la seule méthode permettant d'obtenir des embryons qui se développent de manière synchrone. Aucune méthode alternative n'a pour l'instant été mise au point permettant d'obtenir des embryons de xénope à différents stades du développement. Dans la mesure où il s'agit de travaux pratiques portant sur l'étude du développement , il est nécessaire pour les étudiants d'acquérir des compétences pratiques en effectuant les expériences d'hybridation in situ sur différents stades du développement.

Réduction

Les femelles xénopes pondent plusieurs centaines d'oeufs à chaque fécondation in vitro permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés et de préparer les embryons pour deux travaux pratiques. Les embryons qui se développent, sont systématiquement fixés et peuvent être conservés plusieurs années dans de l'éthanol à -20°C pour de simples observations morphologiques. Pour les expériences d'hybridation in situ, le temps de conservation est moins long. Nous allons conserver certains embryons expérimentaux d'une année sur l'autre et tester l'efficacité de l'hybridation in situ. Si l'hybridation in situ reste aussi efficace, nous pourrions prévoir une période de microinjection de 15 jours pour deux années de TP. Par ailleurs, les expériences sont effectuées sur une période de 15 jours permettant l'utilisation d'un seul xénope mâle pour le prélèvement des testicules.

Raffinement

la durée de l'injection est minimisée afin de limiter le stress. La contention de l'animal est réalisée en mimant la prise du mâle lors de l'accouplement et en cachant les yeux de la femelle pour réduire le stress. A la suite de la ponte les femelles sont laissées à l'isolement pendant 24 heures pour faciliter la récupération. L’observation des animaux permet de mettre en place des critères observables définissant des points limites afin d’évaluer la douleur de l’animal et d’entamer des procédures de soins ou d’euthanasier les animaux. L’euthanasie s’effectue par dose léthale d’anesthésiant évitant toutes douleurs à l’animal.

Choix des espèces

Le xénope est un modèle standard de l'étude de l'embryogenèse. La femelle pond des centaines d'ovocytes, permettant de réaliser une fécondation in vitro à l'aide d'un broyat de fragment de testicule. Le développement est externe et peut s'effectuer dans de simples bacs ou aquariums. La fécondation in vitro permet un développement synchrone des embryons. De plus, les oeufs de l'espèce utilisée, le Xenopus Laevis font 1.2 mm de diamètre. Les changements de morphologie sont facilement observables à l'aide d'une simple loupe binoculaire. La réalisarion d'expériences de gain ou de perte de fonction se fait à l'aide d'un sytème standard de microinjection dès le début du développement. Les embryons fournis aux étudiants sont fixés et sortent du cadre des dispositions d'expérimentation animale à des fins scientifiques. Notre projet s'appuie donc exclusivement sur le suivi et la prise en charges de xénopes adultes nécessaires pour la stimulation hormonale de la ponte d'ovocytes et la fécondation in vitro.