Xénopes

Réutilisées d'une procédure à la suivante à six mois d'intervalle, 200 xénopes vont être exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans qu'aucune mise à mort ne soit déclarée à l'issue. Les femelles subissent des ovariectomies, répétées sur le même individu une fois les ovaires régénérés, ou jusqu'à trois injections d'hormone chorionique gonadotrope pour être forcées à pondre, et les mâles sont prélevés de leurs testicules. Le porteur décrit pourtant trois groupes de 140 femelles, 60 femelles et 60 mâles, soit 260 individus pour 200 déclarés. Il présente le xénope comme un "modèle alternatif" qui réduit le nombre de "vertébrés supérieurs" utilisés, dans un projet dont les points limites vont de la torpeur à l'érosion des doigts jusqu'à l'os et aux saignements des yeux.

Objectifs

Les cellules répondent aux stimuli en déclenchant des réseaux de signalisation qui définissent des propriétés permettant le développement précoce. Les stress externes (exemples : les métaux lourds, les médicaments chimiothérapeutiques) dérèglent la division cellulaire et la décision du destin cellulaire, favorisant des défauts de développement et diverses maladies. L'objectif central de cette recherche est de démêler les voies de signalisation critiques impliquées dans la méiose, la mitose et l'embryogenèse. Les travaux de recherche se concentrent sur l'interaction entre ces réseaux de signalisation et les ajout de sucres ou de fixation de sucres sur des molécules clefs. En utilisant Xenopus laevis comme modèle principal, le projet vise à identifier les principales cibles moléculaires et à déchiffrer les mécanismes d'action associés aux dérégulations conduisant à l'infertilité et à des pathologies telles que les parasitoses ou les cancers.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la compréhension fondamentale des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement et la reproduction, avec des retombées potentielles pour la recherche médicale et la santé humaine. Les résultats pourraient ainsi contribuer à la lutte contre l’infertilité, les maladies parasitaires et certains cancers.

Procédures

Nos procédures impliquent : - le prélèvement des ovaires ; - l'induction de l'ovulation par injection d'hormone chorionique gonadotrope, - la manipulation d'embryons obtenus par fécondation externe : les ovocytes sont obtenus par ponte (stimulation par injection d’hormone chorionique gonadotrope) et les spermatozoïdes sont obtenus après prélèvement des testicules. Les animaux ayant été injecté pour stimulation de la ponte ovarienne et les anmiaux subissant l'ovariectomie ne sont pas les mêmes.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées entraînent des douleurs légères de courte durée et ne provoquent pas d’effets indésirables notables à long terme. Les risques associés aux procédures chirurgicales seront évalués quotidiennement : torpeur, perte rapide de poids, tension de l’abdomen et gonflement, hémorragies cutanées. 

Devenir

La réalisation de l'induction par injection d'hormone chorionique gonadotrope peut être répétée, pour stimuler chez un même individu (6 mois d'intervalle, au minimum, et ce afin de permettre la régénération des ovaires). 3 stimulations sont considérés, au maximum, et dans l'optique de réduire le nombre des animaux utilisés. Les femelles ayant subi 3 prélèvements et 3 injections sont considérés peuvent être de nouveau considérées pour une procédure d'ovariectomie ou d'injection hormonale, en fonction de leur état et dans une perspective de réduction du nombre d'animaux utilisés. La décision est prise par le responsable du projet, en concertation avec les membres du SBEA.

Remplacement

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires.

Réduction

3 groupes sont prévus : - 1 groupe pour les ovariectomies, composé de 140 femelles. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'ovariectomie peut être répétée sur un même individu, après une intervalle d'au minimum six mois. - 1 groupe pour les inductions d'ovulation, composé de 60 femelles. Chaque femelle peut être stimulée 3 fois, à des intervalles de 6 mois, et ce afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. - 1 groupe pour le prélèvements des testicules, où 60 mâles sont nécessaires si l'on considère que chaque prélèvement sert à la réalisation de 4 fécondations in vitro. En conclusion, par année seront réalisées (1) au minimum 30 ovariectomies (60 maximum pour les années 2 à 5, en considérant le prélèvement chez des animaux déjà opérés une fois ; le total du nombre d'ovariectomie se portera donc à 30 pour la première année et 60 maximum chaque année suivante année 1), et (2) au maximum 48 fécondations in vitro (le prélèvement des testicules chez les mâles constituera le facteur limitant du nombre possible de fécondation). Les nombres d'animaux enrôlés dans les deux premiers groupes tiennent compte d'un pourcentage d'animaux qui ne donneront pas de pontes correctes. Ce modèle "alternatif " aux mammifères permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. Les résultats obtenus dans ces modèles sont transposables chez les mammifères, dans la mesure où les mécanismes étudiés sont hautement conservés au cours de l'évolution. L'utilisation des amphibiens s'inscrit dans une démarche visant à diminuer le nombre de mammifères impliqués en expérimentation animale, et à diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les points limites sont définis chez les amphibiens, comme indiqués ci-dessous: - Postures d’effondrement, reconnaissables à l’exposition vers l’extérieur de la partie interne de la palmure des pattes postérieures - Perte rapide de poids, visible grâce à la formation de groupes d’animaux de tailles comparables voire identiques du cloaque ou rostre. - Torpeur et absence de réaction lorsque les animaux sont légèrement pincés - Abdomen tendu et gonflement - Hémorragies cutanées - Érosion des doigts avec les os effleurant la peau - Usure des mâchoires - Perforations de la peau sur la partie dorsale. - Saignements au niveau des yeux et des membranes. En présence d’un de ces points limites, l’euthanasie est considérée .

Choix des espèces

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires. L’espèce Xenopus constitue un modèle largement caractérisé et établi pour l’étude des événements du développement embryonnaire depuis près d’un siècle. Les ovocytes, des œufs et les embryons de ces espèces offrent de nombreux avantages : développement externe, fortes concentrations de protéines, synchronisation physiologique, fortes capacités de synthèse protéique et forte conservation des mécanismes moléculaires de contrôle du cycle cellulaire. Ce modèle animal s’impose également comme un modèle de choix dans les approches de criblage pharmacologique ou toxicologiques. Ce modèle alternatif permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. La régénération des ovaires chez cette espèce permet de réduire le nombre d'animaux femelles utilisés dans le protocole. Des individus des deux sexes sont nécessaires pour obtenir des oeufs fécondés et des embryons précoces.

Capturés en milieu naturel, transportés isolément en moins de trente minutes, anesthésiés puis injectés d'hormones pour déclencher la ponte : trois couples de grenouilles vertes et six couples de xénopes ouvrent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs têtards, 1 152 répartis dans 24 bacs placés en milieu naturel à raison d'un ou trois par litre, plus 165 passés en test de comportement de quinze minutes dans un aquarium d'un litre, servent à mesurer si la présence du xénope ralentit la croissance de la grenouille verte. 1 335 amphibiens sont déclarés au total. Les six grenouilles vertes adultes et leurs 636 têtards sont remis à l'eau sur leur mare d'origine, tandis que les 693 xénopes, adultes et têtards, sont anesthésiés puis tués par surdose d'anesthésiant parce que leur espèce est classée exotique envahissante.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénope lisse Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une quarantaine d’années en France. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouille verte et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouille verte seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront placés en bacs en milieu naturel. Les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densité différentes (1 et 3 têtards par litre). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes en milieu naturel. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope induirait un changement dans l’occupation spatiale des têtards de grenouille verte. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides dans l’Hexagone.

Procédures

Le transport sera assuré jusqu’au laboratoire en moins de 30 minutes. Les femelles préalablement anesthésiées seront injectés d’hormones une fois (durée d’injection : 30 secondes) pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Après isolement et éclosion des pontes, les têtards seront répartis dans des bacs placés en milieu naturel sous deux densités différentes (1 têtard par litre et 3 têtards par litre) et en interaction inter- et intra-spécifique (plurispécifiques ou monospécifiques). D’un côté, nous testerons quatre réplicats pour chaque modalité, nous aurons donc 24 bacs et 576 têtards de grenouille verte et 576 têtards de xénopes en tout. Au moment de la métamorphose (dès la sortie de la première patte) les individus seront pesés et mesurés. D’un autre côté, des têtards seront répartis, au sein de quatre bacs pour les xénopes et trois bacs pour les grenouilles vertes (env. 1 têtard par litre). Nous aurons besoin de 60 têtards de grenouille verte et 105 têtards de xénopes. Une fois que les individus ont trois jours, ils seront placés par groupe dans un dispositif de test de comportement (aquarium de 1 L contenant de l’eau de mare). Les têtards seront placés en acclimatation pendant 15 minutes dans le dispositif (3 réplicats de 5 grenouilles vertes seules, 3 réplicats de 5 xénopes seuls puis 3 réplicats avec trois densités différentes (5, 10, 15) de xénopes confrontés à 5 grenouilles vertes). Le test durera 15 minutes puis les individus seront tous replacés dans un bac à part afin de ne pas repasser les mêmes individus en test. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards de grenouilles vertes seront replacés dans le milieu naturel sur leur site d’origine. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des têtards et des adultes.

Impact sur les animaux

Fort de notre expérience, nous ne prévoyons aucun problème lors de la capture d’adulte et le transfert vers l’EU. Il est envisageable qu’un amphibien soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et donc développe une maladie. Pour l’injection d’hormones (1 fois pendant la durée de la procédure, douleur légère et temporaire (10 secondes) lors de l’injection), les amphibiens seront anesthésiés pendant 15 minutes. Le transport (1 fois pour les xénopes, 2 fois pour les grenouilles vertes) entre le site de prélèvement et l’EU (< 30 km), est un stress léger à modéré sur la durée (30-40 minutes). Afin de limiter les agressions entre les individus ils seront transportés isolément dans leur boîte. Seront contrôlés pendant l’expérimentation, l’activité et la décoloration de la peau. Le nourrissage se déroulera en fin de journée (intervention de 5 minutes maximum dans l’EU). La bonne prise alimentaire sera vérifiée par la prise de poids.

Devenir

Les 6 grenouilles vertes adultes et les 636 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les 12 xénopes adultes et les 636 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie et la croissance des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouille verte et les six couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et six femelles et six mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs nécessaire pour l’expérimentation en bacs. Par ailleurs, la densité de têtards (1 ou 3 têtards par litre), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés et à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront alors disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau, un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en bacs, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu. Enfin, il y aura une période de 15 minutes d’acclimatation dans l’arène avant de commencer le test de comportement. Le bien-être sera évalué par une grille déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénope lisse Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières . Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie. Les animaux impliqués dans la première procédure seront des adultes. Notre objectif étant d’obtenir des pontes, nous n’avons la possibilité que de travailler sur des animaux matures et prêts à se reproduire et des femelles prêtes à pondre. C’est pour ces raisons que les animaux ne seront mis en captivité que lorsqu’ils seront prêts à s’accoupler. Pour la seconde procédure, les animaux utilisés seront des têtards des deux mêmes espèces. Notre objectif est d’étudier l’impact de la présence d’un compétiteur ou non sur le comportement de fuite, sur l’activité ainsi que sur les potentielles capacités des individus à se regrouper pour se défendre dès les premiers stades de vie.

Sorties de leur aquarium, anesthésiées, posées sur un champ glacé, 107 xénopes femelles subissent le prélèvement d'une partie d'un ovaire, opération de quatre à dix minutes répétée jusqu'à trois fois dans leur vie, à six mois d'intervalle au moins. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le projet en prévoit 43 par an. Elles vivent ensuite un à trois ans dans l'animalerie, tant que leurs ovaires reconstituent leur stock d'ovocytes. Sur les 107 animaux, 72 seront tuées parce que leurs ovaires ne régénèrent plus, et 35 seront réutilisées.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les divisions méiotiques de l'ovocyte. Tous les êtres vivants se développent grâce aux divisions de leurs cellules : la cellule duplique son génome puis en redistribue une copie dans chacune des deux cellules filles. La méiose est un mode de division spécialisé spécifique aux cellules reproductrices. Chez les femelles, dans les ovaires, les ovocytes sont bloqués en début de méiose. Cet arrêt permet à l’ovocyte d’accumuler les composants nécessaires au développement du futur embryon. Lors de l’ovulation, un signal hormonal lève le blocage et l’ovocyte réalise les divisions de méiose. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires déclenchés par l’hormone qui conduisent à la division. Ces mécanismes sont encore inconnus et leur étude est très importante pour comprendre la formation de la cellule reproductrice femelle, qui est à la base de la reproduction des individus. Notre étude renseigne aussi sur la division des cellules, qui assure le développement et le maintien de l’intégrité des organismes vivants. Chez l’amphibien Xénope qui est utilisé dans ce projet, la progestérone déclenche dans l’ovocyte l’activation en cascade de différentes protéines, ce qui aboutit à la reprise de la méiose. Sur le plan moléculaire, le blocage de l’ovocyte dépend d’une enzyme qui phosphoryle les protéines. La progestérone induit une diminution de son activité. Ceci provoque la synthèse de nouvelles protéines qui conduisent aux divisions de méiose. Le projet vise à identifier les cibles de l’enzyme et à élucider le mécanisme par lequel elles déclenchent la division. Ce projet a des retombées importantes dans deux domaines : celui du cancer, qui résulte d’une dérégulation de la prolifération cellulaire, et celui de l’infertilité humaine, qui repose en grande partie sur la dérégulation des divisions de l’ovocyte.

Bénéfices attendus

Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l'homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l'origine d'interruptions de grossesses ou d'anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l'espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse. L’atout majeur de l’utilisation du Xénope dans ce domaine a d’ailleurs été à l’origine de l’attribution du Prix Nobel en 2001.

Procédures

Les interventions consistent en un prélèvement d’une partie d’un ovaire, effectué sur un animal anesthésié en conditions stériles et placé sur un champ froid qui supprime la douleur. L’opération dure 4 à 10 min. Seules les extrémités des ovaires sont prélevées pour éviter tout saignement. L’ouverture est suturée sans contraindre les tissus ce qui évite les risques d’hématomes et d’abcès. Le réveil s’effectue en 20 à 30 min, et l’animal est ensuite surveillé pour vérifier la bonne cicatrisation cutanée. Puis il regagne son aquarium. Le projet requiert 43 opérations par an. Chaque femelle est opérée au maximum 3 fois pendant sa vie, chaque opération étant espacée d'au moins 6 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus en post-opératoire portent sur la douleur, le stress et des risques de complication dûs à l’opération. Le stress peut être provoqué par le prélèvement de l’animal dans l’aquarium et l’opération chirurgicale. À noter que le stress thermique potentiellement lié à l’anesthésie, le stress social qui serait engendré par l’isolement post-opératoire et le stress du jeûne pré-opératoire de 5 heures ne sont pas applicables : animal poïkilotherme « à sang froid », à vie solitaire, et nourri tous les 3 jours en conditions normales. La douleur peut être induite par la chirurgie. Les risques de complication sont de légers saignements temporaires de la cicatrice.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie tant qu’ils régénèrent leurs ovocytes suite aux opérations (maximum de 3 opérations par animal, aucun animal n’est opéré plus de 3 fois). Ils demeurent en vie dans l’animalerie entre 1 et 3 années. Ils sont euthanasiés par une méthode réglementaire de façon à lui éviter toute douleur. L’euthanasie est justifiée quand, après une seconde ou une 3ème ovariectomie partielle, les ovaires ne régénèrent plus leur contenu. Le projet reposant intégralement sur l’étude des ovocytes, les animaux ne produisant plus d’ovocytes ne sont donc plus utilisables pour le projet. À l’issue des 5 années du projet, 72 des 107 animaux du projet auront été euthanasiés. 35 seront encore en vie, après avoir subi une ou deux opérations. Ils seront ré-utilisés.

Remplacement

Notre objet d'étude est l’ovocyte, la cellule reproductrice femelle. Cette cellule est extrêmement spécialisée. Son organisation interne très complexe lui permet de réaliser les divisions qui vont lui permettre d’être fécondé par un spermatozoïde. Ces divisions particulières sont également importantes pour les premières étapes de la vie de l’embryon qui sera issu de la fécondation. L’ovocyte n’est donc comparable à aucune autre cellule, et ne peut être reproduit ou « créé » artificiellement par synthèse ou par des cellules souches ou par une modélisation virtuelle. C’est pourquoi nous sommes dans l'obligation d'utiliser des ovocytes intacts issus d’animaux, dans notre cas les Xénopes (des amphibiens), pour les étudier ensuite en laboratoire. Le modèle Xénope lui-même s’inscrit dans une stratégie de remplacement. L’autre modèle utilisé dans les laboratoires pour l’étude du même sujet, la formation de l’ovocyte, est la souris (ou le rat). Les ovaires de Xénope contiennent chacun jusqu’à 6000 ovocytes (contre une vingtaine chez la souris) et ont la capacité de régénérer (ce qui n’existe pas chez la souris). Utiliser le Xénope au lieu de la souris permet donc de limiter énormément le nombre d’animaux utilisés en laboratoire. Enfin, en parallèle à l’utilisation expérimentale des ovocytes, nous utilisons des outils bioinformatiques très récents (moins de cinq ans), basés sur l'intelligence artificielle, en amont des expériences. Ils permettent de guider et cibler les expériences au lieu de travailler de manière exploratoire comme par le passé. Cela permet de limiter le nombre de cellules utilisées, et donc d'animaux.

Réduction

Les expériences de l’ensemble des membres de l’équipe sont planifiées, coordonnées et synchronisées de façon à n’opérer qu’un minimum d’animaux. Les besoins en ovocytes pour les expériences d’une semaine de travail sont précisément estimés, et oscillent entre 1000 et 2000 ovocytes. En conséquence, une seule femelle est opérée chaque semaine. Les 1000 à 2000 ovocytes requis correspondent à un à deux tiers du contenu d’un ovaire. Le contenu de l’ovaire n’est jamais vidé entièrement de façon à préserver les cellules souches qui vont assurer la régénération. En outre, les Xénopes ont la capacité de renouveler leur stock d’ovocytes au bout d’une période minimale de 6 mois : nos statistiques indiquent que 81 pour cent des animaux régénèrent après une opération, et 57 pour cent d’entre eux après une seconde. Ces capacités régénératives nous permettent de ré-utiliser une même femelle jusqu’à trois fois, limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de femelles utilisées par le projet est de 107. Enfin, des outils statistiques et des modèles prédictifs sont utilisés en amont des expériences et permettent d’orienter les expériences nécessaires à réaliser, au lieu de travailler de manière exploratoire en multipliant les expériences comme par le passé. Ainsi, la propriété de régénération du Xénope, la synchronisation des demandes d’ovocytes de tous les membres de l’équipe et les nouveaux outils bioinformatiques disponibles réduisent considérablement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en aquarium de 25 L d’eau déchlorée, filtrée, oxygénée, à 20 degrés. Au-delà de 25 degrés, l’animal entre en léthargie. Des sondes surveillent en temps réel température, acidité et conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes PVC où certains animaux aiment à se cacher, bien que le comportement préféré soit de rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums avec une brosse ou une lingette est effectué tous les 15 jours. 6 à 12 animaux sont regroupés par aquarium. Dépasser 12 peut induire un stress. Aucun stress n’est relevé si le groupe est réduit ou l’individu isolé, car les individus sont solitaires chez cette espèce. À leur arrivée, les animaux sont mis en quarantaine pendant 4 semaines. Ils sont ensuite acclimatés en aquarium pendant au moins 2 semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Ils sont nourris à satiété 2 fois par semaine (vers de vase, cœur de bœuf et granulés de poisson). Ils sont prélevés à la main ou avec une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de ne pas les stresser. Une grille de cotation répertorie toute anomalie et lui attribue un chiffre, de 1 à 3 : 1, surveillance attentive ; 2, surveillance accrue, isolement de l’animal pendant une semaine et soins éventuels, puis réévaluation de l’état de l’animal ; 3, point limite, euthanasie. À un niveau 2, des soins portant sur les affections cutanées peuvent être apportés. L’anesthésie, le prélèvement et l’euthanasie sont pratiqués dans une pièce isolée afin de ne pas stresser les autres animaux. La durée de la chirurgie est minimisée (4 à 10 min). Les opérations sont pratiquées sous anesthésie. L’animal est placé sur le dos sur un champ glacé, ce qui a un effet analgésique. Une surveillance post-opératoire est effectuée pendant 2 semaines.

Choix des espèces

L’ovocyte de Xénope (une espèce de crapaud) est un modèle très adapté pour l’étude de la division des cellules, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Comprendre la formation de ces cellules est important pour trouver des thérapies soignant l’infertilité humaine et le cancer. Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d'étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d'ovocytes, ce qui limite le nombre d'animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l'ovocyte humain que ne l'est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme. Les animaux utilisés sont des femelles adultes parce qu’elles ont des ovaires pourvus en ovocytes, les cellules que nous étudions. Les embryons et les têtards en sont dépourvus. Les femelles achetées chez un fournisseur agréé ont entre 2 et 3 ans, âge de la maturité sexuelle chez le Xénope.

16 800 têtards de xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 240 individus par molécule testée pour trente-cinq molécules. Ils baignent dans une eau contenant les perturbateurs endocriniens pendant trois jours ou jusqu'à trente jours, après dix jours d'exposition au métronidazole en incubateur opaque pour une partie d'entre eux, et sont anesthésiés jusqu'à quatre fois pour le comptage des cellules du nerf optique. Le porteur estime la mortalité liée à l'exposition à 10 % sur trois jours et 20 % sur un mois, à quoi s'ajoutent 10 % de morts prématurées pendant le développement. Il retient le xénope entre autres parce que l'espèce "génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d'animaux".

Objectifs

Au cours de ces 40 dernières années, des milliers de produits chimiques ont été introduits dans notre environnement. Connues sous le nom de perturbateurs endocriniens (PE), ces molécules ont des effets néfastes sur la santé en agissant sur le système endocrinien, en mimant l’action physiologique des hormones. Les PE agissent sur certaines hormones, qui agissent sur des cellules présentes dans le cerveau. En sachant que l’exposition chimique influence, dans le cerveau en développement et chez l’adulte, le destin des cellules, nous pensons que les PE auraient un impact sur des cellules spécifiques appelées les oligodendrocytes, qui forment une gaine isolante autour des axones (prolongement des cellules nerveuses) appelée la myéline. Ces cellules sont impliquées dans des mécanismes de myélinisation (processus de formation de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). L’objectif de notre projet est donc d’évaluer chez le têtard de Xenopus Laevis les effets des perturbateurs endocriniens sur la myélinisation et la remyélinisation et ainsi vérifier s’il existe une corrélation avec certaines maladies comme la sclérose en plaque, dont les cas ont augmenté depuis l’apparition de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre les effets des substances identifiées comme ayant des propriétés perturbatrices sur le système endocrinien, et les conséquences qu’elles peuvent avoir sur la myéline (membrane qui protège les axones de nos neurones) dans différentes conditions. Premièrement, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de myélinisation (processus de la formation de la myéline), permettrait de comprendre quelles molécules impactent ce processus et de voir s’il existe une corrélation avec les troubles neurodéveloppementaux observés chez les enfants ayant été exposés à ces molécules. Ensuite, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de remyélinisation (processus de régénération de la myéline) permettraient dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaque (où la myéline est détériorée, SEP), de comprendre s’il existe une corrélation entre l’augmentation du nombre de cas de SEP et celle de l’utilisation des PE. De plus, notre implication dans un projet international permet de répondre aux besoins réglementaires, scientifiques et sociétaux pour une meilleure évaluation des dangers et des risques chimiques des substances identifiées comme PE.

Procédures

Afin de procéder à un comptage des cellules d'intérêt dans les nerfs optiques, les animaux seront anesthésiés au maximum 4 fois pour une durée de 15 minutes maximum avec un minimum de 3 jours entre chaque anesthésie. Une partie des têtards sont mis en contact avec une molécule permettant de mettre en place le modèle pendant 10 jours, dans leur eau de balnéation. Puis ils seront exposés pendant 3 jours aux perturbateurs endocriniens pour étudier leur effet. Une autre partie des têtards sera mise en contact direct avec les perturbateurs endocriniens pendant 30 jours maximum pour étudier leur impact sur le développement. Les perturbateurs endocriniens sont aussi préparés dans l’eau de balnéation des têtards. Tous les têtards sont euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire pour la réalisation d’analyses sur leurs tissus.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines concentrations de perturbateurs endocriniens testées soient toxiques et entrainent la mort des têtards. Nous estimons cette perte liée à l’exposition aux perturbateurs endocriniens à 10 pour cent pour 3 jours et 20 pour cent pour 1 mois d’exposition. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent. Lors des différentes procédures, les animaux sont délicatement attrapés avec une pipette. Cette manipulation induit un léger stress. Lors des tests comportementaux, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac ce qui peut provoquer un léger stress chez nos animaux lors du déplacement (bacs sur un chariot).

Devenir

Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux perturbateurs endocriniens testés, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immuno-histologiques plus poussées sur leurs tissus pour compléter les observations faîtes du vivant de l’animal.

Remplacement

Les perturbateurs endocriniens sont connus pour avoir un effet toxique sur les cellules en culture, ce qui explique pourquoi ce modèle ne peut pas être utilisé dans notre cas. L ’intérêt est de comprendre les effets des perturbateurs endocriniens au sein d’un organisme vivant, et d’étudier leurs impacts sur le comportement et les processus physiologiques. Le recours à des têtards, qui ont un système nerveux comparable (présence et importance de la myéline dans le fonctionnement) à ce qui est retrouvé chez l’Homme, peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo, ce que les modèles cités précédemment ne permettent pas. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus Laevis repose donc sur les arguments suivants : -Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro -La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal sans euthanasie à des temps donnés pour prélever des échantillons -Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux pour leur interprétation -Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus Mammifères) pour transposer nos observations sur cette espèce à l’Homme.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules qui nous intéressent dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards. Nous estimons qu’il faudra environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée deux fois à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle, ce qui fait un total de 8 groupes, avec 15 têtards par condition, donc 240 têtards au total. Le nombre de 15 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée des têtards liée au développement et celle liée à l’exposition aux molécules (molécule qui permet la mise en place du modèle et celles à évaluer). 35 molécules sont à tester suivant ce modèle, soit au total environ 8 400 têtards pour la myélinisation, et 8400 pour la remyélinisation, ce qui fait un nombre total de têtards de 16 800 têtards pour ce projet.

Raffinement

Au cours de leur développement, les têtards sont placés dans un bac de 4L d’eau adaptée à leur physiologie (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à 23degrès Celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée de façon hebdomadaire pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets (un changement d’eau trop fréquent entraine un stress avec une perte de nos têtards). Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les déchets liés au surplus de nourriture sont retirés de l’eau quotidiennement pour maintenir de bonnes conditions environnementales. De plus, des bûches flottantes artificielles sont placées dans les bacs, ce qui permet de complexifier leur milieu (enrichissements). Enfin, nous utilisons une alimentation, majoritairement composée de végétaux et d’algues, adaptée à leur développement. La profondeur de l'anesthésie est surveillée et est adaptée à nos besoins pour garantir une immobilisation et limiter le stress des animaux. Pour optimiser le réveil et la bonne récupération des animaux, nous favorisons une oxygénation de l'eau avec un bulleur et réintégrons les têtards auprès de leurs congénères pour limiter le stress Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations la préhension des animaux est faite délicatement avec une pipette, Pour le comportement, les têtards sont amenés dans leur bac jusqu’à la pièce dédiée, et attrapés par une pipette pour les placer dans une large boite de Pétri avec leur milieu de nage pour limiter le stress. Les têtards sont isolés très peu de temps (5 min) avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit ne semble pas leur être préjudiciable vue que cette espèce a une préférence naturelle pour les zones peu éclairées. Afin de déterminer les concentrations optimales non toxiques lors du passage au modèle animal, les effets des perturbateurs endocriniens sont d’abord étudiés, sur des tranches de cervelet de souris.

Choix des espèces

La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre 3 jours (stade 21) et 1 mois (stade 50) post-fertilisation. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des cellules d’intérêt (oligodendrocytes in vivo) et sans recours à l’euthanasie des animaux.

Deux à trois cents ovocytes prélevés chaque semaine sur un même animal, six prélèvements par an pendant cinq ans : 30 xénopes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque prélèvement passe par une immersion de quarante à quarante-cinq minutes dans un bain anesthésiant, une incision abdominale d'un centimètre et demi et une suture. Le porteur qualifie la technique de méthode alternative permettant de s'affranchir de manipulations in vivo, alors que ces manipulations sont exactement ce qu'il décrit, l'ovocyte servant de support pour étudier des canaux ioniques humains. Le champ structuré du devenir ne déclare aucun animal maintenu en vie, quand le texte indique que les xénopes sont réutilisées d'un projet à l'autre et gardées jusqu'à leur mort naturelle.

Objectifs

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est centrale dans nos thématiques de recherche dont les objectifs principaux sont les suivants : ​études pharmacologiques cellulaires et moléculaires, caractérisation du mode d’action de ligands naturels ou synthétiquec des canaux ioniques, étude du mode d’action de médicaments ou de toxines, caractérisation de l’impact fonctionnel par approche in vitro de variants de gènes de canaux ioniques, suspectés associés à des pathologies humaines ,​ études des relations structure-fonction des canaux ioniques (caractérisation des domaines fonctionnels), études toxicologiques (évaluation de l‘activité de certaines substances ou molécules sur des canaux ioniques, reflétant leur toxicité au niveau cellulaire, neurotoxicité, cardiotoxicité...).​

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter des connaissances scientifiques dans différents domaines, tels que : 1) mieux comprendre les effets bénéfiques ou averses d'agents pharmacologiques actifs sur les canaux ioniques (médicaments, toxines, toxiques...), 2) caractériser les impacts fonctionnels par une approche alternative, de mutations desgènes de canaux ioniques causant des pathologies parfois graves. La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Procédures

Les xénopes sont anesthésiés par immersion dans un bain d'anesthésie pendant 40 à 45 minutes. Après induction de l’anesthésie, une incision de 1,5 cm maximum est réalisée pour accéder aux sacs ovariens. Après prélèvement, la plaie est suturée immédiatement; cette étape durant environ 10 minutes. Pour préserver la bonne santé des animaux, chaque prélèvement sur un même animal doit être espacé de 2 mois.

Impact sur les animaux

La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Devenir

200-300 ovocytes prélevés sur un animal par semaine. Après prélèvement, les xénopes sont mis au repos pendant 2 mois. Nous avons une utilisation continue des xénopes : avec 6 prélèvements annuels, durant 5 ans . Les xénopes ont une longévité de 15 ans en moyenne.

Remplacement

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est incontournable pour l’investigation au niveau cellulaire et moléculaire des effets toxiques, du mode d’action de médicaments, voire de l’impact de certains variants sur la fonction des canaux ioniques. ​Cette technique permet également de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Cette approche constitue une méthode alternative à l’utilisation des rongeurs pour réaliser des cultures primaires de neurones, par exemple. ​

Réduction

​Pour un projet visant à caractériser l’impact fonctionnel d’une mutation ou l’effet d’une molécule, les analyses statistiques nécessitent l’utilisation de 10 ovocytes par mutation ou concentration de molécule, provenant de 3 animaux différents. Etant données nos activités de recherche, ceci implique l'utilisation de 30 xénopes pour 5 ans au maximum. Les animaux sont préservés jusqu‘à leur mort naturelle. Ils sont utilisés ou réutilisés dans plusieurs projets. Un vétérinaire les examine 1 fois par an au minimum pour vérifier leur état de santé.

Raffinement

​​Le prélèvement est réalisé sur des animaux anesthésiés. Les sutures sont réalisées avec un fil résorbable. Les animaux sont ensuite réveillés progressivement par rinçage à l’eau claire, et surveillés avant d’être replacés avec leurs congénères. Les aquariums sont enrichis avec des pots en terre cuite qui leurs servent de cachettes.

Choix des espèces

Les xénopes produisent des ovocytes de grande taille (1-1,5 mm) qui facilitent leur transfection par injection intracellulaire de matériel génétique. L’ovocyte de xénope constitue un système d’expression hétérologue incontournable pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques des récepteurs et des canaux ioniques, depuis 1990. L’utilisation de ce modèle cellulaire est très pratique pour des études pharmacologiques in vitro, assez simple à réaliser, et permet de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (1-5 ans) correspondant à un stade où les femelles produisent de nombreux ovocytes.