Xénopes

Fournir des ovocytes et des œufs fécondés à d'autres équipes de recherche : 100 femelles xénopes sont utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées d'une année sur l'autre. Chaque ponte suppose deux injections d'hormone dans le sac lymphatique dorsal, la femelle étant tenue en contention hors de l'eau et les yeux couverts d'un papier humidifié, puis massée une trentaine de secondes le lendemain pour récupérer les ovocytes en un seul lot. Le sperme servant à la fécondation in vitro est prélevé sur des mâles, dont le RNT ne donne ni l'effectif ni le devenir. Le porteur prévoit qu'au maximum 20 femelles atteignant un point limite, gonflement par œdème, prostration, nage anormale ou lésions cutanées, seront tuées par surdose de tricaïne.

Objectifs

La plateforme constitue une structure d’appui à la recherche qui a pour mission de fournir des ovocytes à la comunauté des chercheurs utilisant le modèle xénope dans les domaines de la biologie du développement et des neurosciences. L’obtention des ovocytes nécessite des injections d'hormones chez la femelle. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Les œufs obtenus seront ensuite fécondés de manière in vitro avec du sperme prélevé sur des mâles afin de synchroniser le développement de l’ensemble des embryons.

Bénéfices attendus

La structure d’appui à la recherche que nous constituons a pour mission de fournir des œufs fécondés ou non à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Les œufs non fécondés pourront être utilisés pour les expérimentations d’expression de canaux ioniques, canaux assurant le transport des ions dans les cellules, notamment, afin de mieux comprendre leur mécanisme de fonctionnement et plus spécifiquement l’impact de molécules pharmaceutiques sur leur régulation. Les œufs fécondés, du fait de leur transparence et de leur facilité d’accès (développement externes), sont un outils puissant pour comprendre les mécanismes du développement embryonnaire, et l’impact de mutations ou de molécules sur celui-ci.

Procédures

Les femelles sont soumises à des injections d’hormone (à 2 reprise pour une ponte), avec un total de 1 ponte par an. Ces injections sont réalisées dans le sac lymphatique dorsal en sous cutané. Les injections sont réalisées sur des animaux pris en contention et leurs yeux sont couverts avec un papier absorbant humidifié. Les injections sont très rapides (moins de 10 secondes), peu douloureuses (peu de volume injecté et aiguilles de petit diamètre avec un geste maîtrisé). Pour chaque ponte, les femelles sont mises par deux pendant 24h maximum dans des bacs rempli d'eau mais hors du système. le lendemain de la deuxième injection, les femelles sont doucement massées pendant environ 30 secondes pour récuperer les ovocytes en un seul lot.

Impact sur les animaux

La contention et la sortie de l’eau peuvent entrainer un stress chez le xénope, il peut également y avoir une légère douleur provoquée par les deux injections en sous cutanés.

Devenir

Les femelles xénopes issues de cette procédure pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans). Si certaines femelles atteignaient un point limite au cours des 5 ans du projet, alors elles seraient euthanasiées par surdose de tricaïne en balnéation. Comme décrit précédement nous estimons ce nombre à un maximum de 20, mais il est probable selon notre expérience que cela soit le cas pour moins de 5 femellees.

Remplacement

Les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier, et la production d’œufs nécessite des géniteurs vivants. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le œufs de xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).

Réduction

Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les utilisations, par exemple synchroniser les fécondations de différentes équipes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) pour les injections, les femelles peuvent être stimulées plusieurs fois à raison d’une stimulation par an dans notre plateforme 3) faire correspondre les pontes demandées par les utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie. Ainsi, le calcul des animaux utilisés va se baser sur plusieurs critères : capacité des femelles à pondre de nombreux oeufs et nécessité de stimulation de deux femelles par ponte pour assurer le nombre d’oeufs nécessaires par session (procédure optimisée sur des années d’expérience du centre de ressources biologiques xénopes). D’après les besoins expérimentaux, il est nécessaire d’obtenir 50 pontes par an. Nous aurons donc besoin de 100 femelles par an, que nous pourrons réinjecter pour stimulation les années suivantes, donc 100 femelles au total pour 5 ans. Un total donc de 100 animaux sur 5 ans

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal comme ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, l'installation de cachette. Nous avons également mis en place une diversification au niveau de la nourriture : vers de vases, cœur de bœuf, nourriture sèche qui sont donnés de façon alternés. Les animaux sont nourris 2 fois par semaine. Les paramètres de l’eau sont vérifiés en continue au moyen de sondes pour le pH et la conductivité et une fois tous les 15 jours pour les nitrates/nitrites/ammonuim/dureté ou plus si modifiaction de comportement des animaux, en particulier mues plus importante. La température est de 19 degrés et la lumière dans la pièce d’hébergement est tamisée et suit un rythme 12h de jour et 12h de nuit. Lors des procédures, en cas de comportement anormal, perte de poids rapide ou progressive d’au moins vingt pour cent, ou au contraire de gonflement suite à apparition d’un œdème, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau, le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre : administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours.

Choix des espèces

Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 à 15 ans environ.

Pour produire des extraits protéiques servant à étudier la réparation de l'ADN dans les cancers, 96 xénopes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit une injection hormonale sous-cutanée destinée à provoquer sa ponte, répétée jusqu'à trois fois par animal, à douze mois d'intervalle. Le porteur affirme qu'aucun autre système biochimique ne permet d'étudier la recopie de la chromatine chez les vertébrés et qualifie le recours à ces animaux d'"indispensable". 48 xénopes sont tuées après leur troisième injection, l'établissement invoquant le caractère invasif de l'espèce qui interdit de les faire sortir de la zone, les 48 autres restant en stabulation pour être injectées à nouveau dans une saisine ultérieure.

Objectifs

Le développement tumoral est caractérisé par une multiplication incontrôlée de cellules anormales dont les voies moléculaires de surveillance et de réparation de l'ADN sont altérées. L’étude fine de ces voies de signalisation est donc primordiale pour comprendre comment combattre les cancers et comment adapter des stratégies de lutte plus efficaces. Nous proposons de disséquer ces voies moléculaires par approche biochimique. Pour ce faire nous utilisons des extraits protéiques dérivés d’œufs de xénope qui ont la particularité unique de reproduire in vitro et de manière simplifiée, les mécanismes moléculaires de la division cellulaire propres aux cellules humaines.

Bénéfices attendus

La reproductibilité et la fiabilité expérimentale reconnues dans l’utilisation d’extraits protéiques issus d’œufs de xénope ont contribué et permettent encore des avancées majeures en santé humaine grâce à la découverte et la compréhension fonctionnelle de nouveaux acteurs de la prolifération et de la réparation de l’ADN. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique de recherche fondamentale dans le but d’accroitre nos connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués dans les dysfonctionnements des voies de réparation de l’ADN et de la prolifération, à l’origine de la tumorogenesèse. Outre la diffusion des résultats obtenus dans des journaux scientifiques à libre accès, les études issues de ce système mèneront à plus long terme à l’identification de nouveaux outils de diagnostics et/ou pronostic du cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention: l'injection sous cutanée d'hormone à l'aide d'une seringue hypodermique, dans le but d'induire la ponte de l'animal

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles attendus sur l’animal lors du présent projet seront observables de manière occasionnelle et résulteront de la contention ou de l’injection hormonale: L’utilisation d’une aiguille hypodermique entraine une douleur légère de courte durée et la contention un stress de l’animal.

Devenir

Les 48 xénopes utilisés les trois premières années du projet auront reçu les 3 injections hormonales maximales que nous avons fixés par aniaml. Ils seront donc euthanasiés (car l'espèce est invasive et ne peut quitter la zone). Les 48 animaux utilisés à partir de la deuxième moitié du projet auront moins de 6 ans et auront été injectés 2 fois seulement. Ils seront maintenus en stabulation et pourront être intégrés dans une saisine ultérieure après clôture du présent projet pour une nouvelle induction hormonale.

Remplacement

A ce jour il n’existe pas de système d’étude biochimique performant de la recopie de la chromatine chez les vertébrés, autre que les extraits ovocytaires de xénope. Le recours à ces animaux est donc indispensable. Grâce à ce système expérimental, les différentes étapes de la recopie de l’ADN et de la réponse aux dommages à l’ADN peuvent être étudiées dans leur compartiment spécifique, le noyau. En fait, ces extraits ont le pouvoir de reconstituer en toute synchronie, des noyaux fonctionnels après ajout d’ADN de spermatozoïdes, ainsi que les différentes étapes du cycle cellulaire.

Réduction

L’utilisation in vitro d’un modèle ovocytaire comme système d’étude permet de limiter le nombre d’animaux. Nos besoins en extraits protéiques ont été déterminés en fonction des expériences passées. Environ 2-3 millilitres d’extraits par mois seront nécessaires ce qui correspond à l’injection de 4 grenouilles. Par ailleurs, les œufs de xenopus laevis étant relativement gros par rapport aux autres espèces d’amphibiens, le choix de cette espèce contribue également à diminuer le nombre d’animaux utilisés. Enfin, durant le projet, les xénopes seront réutilisés 2 fois, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux à injecter sont identifiés (présence d’une micropuce à radiofréquence sous cutanée), pesés puis ces données sont répertoriées. Elles seront utiles pour le suivi de chaque animal durant le projet : la quantitié et la qualité des œufs obtenus par animal seront ainsi archivées. Chaque individu possède donc un « carnet de santé ». Outre le suivi sanitaire, sa mise en place permet d’éviter des erreurs dans la rotation quant aux délais d’injection (12mois). En outre, si des animaux présentent des pertes de poids de plus de 10 % suite à une ponte précédente, ils ne seront pas réinjectés. L'injection est effectuée par un personnel formé à la contention des animaux. Le port de gants est obligatoire pour la manipulation douce des animaux dans le but de limiter l’abrasion de la couche de mucus protectrice naturellement présente sur la peau de l’animal. Pour faciliter le suivi après la ponte, les animaux injectés dans la même période sont placés ensemble dans des bacs de stabulation (avec enrichissement et alimentation vivante). Les animaux présentant des signes de perte d'appétit seront pesés régulièrement. Des visites journalières avec astreintes le week-end permettront d’assurer une surveillance régulière post-injection.

Choix des espèces

Seule l’espèce Xenopus laevis est hébergée dans l’animalerie. L'importance de cette espèce peut être présentée ainsi : une quantité d’oeufs importante et de grande taille (1 à 1,3mm), une synchronisation parfaite et naturelle à un stade précis de la division cellulaire, la proximité des propriétés physiologiques avec l'ovocyte humain. L’utilisation d’ovocyte pour la réalisation d’extraits protéique permet de limiter la sévérité des manipulations expérimentales sur l'animal. Ce modèle permet l’obtention rapide d’une grande quantité d’extraits protéiques qui ont le pouvoir de reconstituer in vitro les différentes étapes du cycle cellulaire. Les animaux utilisés doivent être sexuellement matures pour la production d’ovocyte

Injectées d'hormone dans les sacs lymphatiques la veille de la ponte, les femelles xénopes sont laissées au repos cinq mois avant d'être stimulées de nouveau. Les mâles, eux, sont tués pour prélever leurs testicules et féconder les œufs hors du corps. Sur 170 xénopes utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère, 70 sont réutilisés et 100 tués, pour étudier des enzymes impliquées dans la migration cellulaire, le porteur décrivant une espèce qui fournit "beaucoup de matériel d'étude" avec peu d'animaux mis à mort. Il ne mentionne comme effet indésirable que des nausées et des vomissements en cas de dose hormonale trop forte, et affirme que la stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles.

Objectifs

La migration cellulaire est essentielle à de nombreux phénomènes physiologiques tels que le fonctionnement normal du système immunitaire, la cicatrisation des plaies ou encore le développement embryonnaire. De plus, la migration cellulaire est impliquée dans des processus pathologique comme la dissémination des cellules cancéreuses (métastases). Le projet vise à mieux comprendre comment les cellules adaptent des capacités migratoires et comment cette migration est ensuite régulée via des interactions entre cellules ou via des informations présentes dans l’environnement des cellules. Le projet porte particulièrement sur le rôle d’enzymes de la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces enzymes sont exprimées et sécrétées par de nombreux types cellulaires au cours du développement et chez l’adulte. Elles sont principalement connues pour permettre aux cellules de modifier la matrice extracellulaire et faciliter ainsi la migration et l’invasion. Toutefois, ces enzymes sont aussi détectées à l’intérieur des cellules. Elles ont de nombreux substrats non-matriciels. Enfin, elles présentent des fonctions indépendantes de leurs capacités enzymatiques. Ces fonctions annexes restent peu ou pas caractérisées. Le projet a pour objectif de mieux définir ces fonctions non-canoniques des MMPs et de valider leurs importances physiologiques de façon expérimentale in vivo dans un modèle amphibien, le Xénope.

Bénéfices attendus

A court termes, le projet permet d’obtenir des informations cruciales sur le mode de fonctionnement des MMPs in vivo et leurs rôles sur l’initiation et le contrôle de la migration cellulaire. Ce projet a déjà donné lieu à plusieurs productions scientifiques dans lesquelles nous avons démontré des rôles précoces des MMPs en amont de l’acquisition du phénotype migratoire notamment via la régulation de la polarité cellulaire et/ou le contrôle de l’expression de gènes régulant la transition épithélium-mésenchyme. A long terme, les informations recueillies sur le rôle des MMPs chez l’embryon permettra d’affiner les analyses d’échantillon pathologique (biopsie de tumeur) et contribuera à la mise au point de protocole permettant de moduler leurs activités dans le cadre des pathologies (cancers, fibroses).

Procédures

Stimulation des femelles : La ponte des femelles d'amphibien doit être stimulée par injection d'hormone. Une injection au niveau des sacs lymphatiques est pratiquée la veille du jour de ponte. Cette procédure est suivie d'une période de repose de 5 mois (20 semaines) à l'issu de laquelle les femelles peuvent être à nouveau stimulées. Stimulation des mâles : Les mâles d'amphibien sont injectés au niveau des sacs lymphatiques. Les mâles ainsi injectés sont fertiles pendant quatre semaines. Les testicules sont prélevés chirurgicalement.

Impact sur les animaux

La stimulation de la ponte par injection hormonale peut entraîner des nausées et vomissements si la dose est trop forte et si les animaux injectés sont nourris le jour de l'injection.

Devenir

Le prélèvement des testicules requiert l’euthanasie préalable. La stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles, elles sont donc gardées en vie le plus longtemps possible.

Remplacement

Le contrôle de la migration cellulaire est impliqué dans de nombreux phénomènes physiologiques (immunité, cicatrisation) et des pathologies comme le cancer et les inflammations chroniques. Nos objectifs scientifiques (analyse de la migration des cellules) et nos stratégies expérimentales nécessitent de travailler sur des cellules animales dans des systèmes qui permettent des manipulations in vivo et in vitro. Le choix est fait d'utiliser un animal modèle (Amphibien/Xénope) qui fournit beaucoup de matériel d'étude (oeufs fécondés) avec un nombre limité d'animaux mis à mort comparativement aux modèles mammifères

Réduction

Les embryons de Xénopes sont obtenus par fécondation in vitro à partir de testicules prélevés sur des mâles mis à mort. Les testicules sont conservés en milieu de culture, au froid, pendant deux semaines ce qui permet de féconder les pontes de 4 à 8 femelles. Afin de réduire le nombre d’animaux mis à mort, nos études sont complétées par l'utilisation de lignées cellulaires de souris et d'embryons précoces de poulet qui ne nécessitent aucuns animaux mis à mort. A activité scientifique constante, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés de 40% par rapport aux projets de recherche précédents.

Raffinement

Afin de réduire la manipulation des animaux nous avons modifié le protocole de stimulation des femelles par rapport aux projets de recherche précédents. Elle s’effectue désormais en une seule injection la veille de la ponte au lieu de deux injections à 5 jours d’intervalle. Par ailleurs, avant injection les femelles sont pesées afin d’ajuster au mieux la dose d’hormone nécessaire. Cette pesée permet également un suivant sanitaire. Enfin, pour éviter les risques de nausées et de vomissements les animaux sont mis à jeûn le jour de l'injection.

Choix des espèces

Le choix du Xénope est justifié de par la possibilité d'obtenir un grand nombre d'ovocytes (1000 oeufs pondus par femelle) sans mettre à mort les femelles, par opposition à la souris notamment. Par ailleurs, nous avons choisi comme population cellulaire modèle les cellules de la crête neurale. Ces cellules utilisent un programme de développement qui est ensuite réutilisé de façon opportuniste lors des cancers. Ceci en fait un modèle extrêmement pertinent du point de vue physiologique. Cependant, cette population de cellules n'existe que chez les vertébrés ce qui exclut un remplacement du Xénope par un organisme "inférieur" comme la drosophile. Les femelles et mâles sont achetés et utilisées à maturité sexuelle. Ensuite à partir des oeufs fécondés obtenus, nous travaillons uniquement sur des embryons entre les stades 2 cellules et 3 jours de développement (avant acquisition de l'autonomie).

Une cinquantaine de xénopes seront tués parce qu'ils ne pondent plus, et 75 juvéniles seront élevés pour les remplacer. Au total 155 xénopes sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, dans un élevage qui fait naître des têtards pour des études pharmacologiques. Les reproducteurs reçoivent des injections hormonales à chaque accouplement, jusqu'à 120 injections pour un mâle sur la durée du projet, ainsi qu'un prélèvement de peau sur une nageoire arrière pour le génotypage. Le porteur justifie la mise à mort des animaux devenus peu fertiles par l'impossibilité de les replacer, "cette espèce étant considérée comme nuisible". Il indique que le choix du xénope tient à la transparence des têtards et au grand nombre d'individus qu'une femelle produit, ce qui facilite les études réclamant beaucoup d'animaux non-humains.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des têtards pour les études pharmacologiques réalisées au laboratoire, nécessitant un nombre élevé de têtards, ainsi que pour des études sur certains mécanismes présents dans des maladies neurodégénératives telle que la sclérose en plaques. Les têtards générés pour chacune des pontes sont utilisés en continu pour les différents projets qui ont lieu en parallèle. Les têtards non utilisés dans les projets sont utilisés pour renouveler les reproducteurs, c’est pour cela qu’ils doivent être génotypés et identifiés lorsque leur taille le permettra.

Bénéfices attendus

Les têtards générés par les adultes Xénopes reproducteurs permettront de produire les lots expérimentaux nécessaires à nos différents projets de recherche. Ils nous permettent notamment d’effectuer des tests pharmacologiques pour étudier l’effet de molécules dans des mécanismes présents dans certaines maladies neurodégénératives, telle que la sclérose en plaques , afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Ces études pharmacologiques nécessitent un grand nombre de têtards, ce qui explique le nombre de reproducteurs pour ce projet. D’autre part, concernant l’étude de l’effet des perturbateurs endocriniens, avec des effets plutôt délétères sur certains mécanismes dans le cerveau, les têtards utilisés permettraient de mieux comprendre l’augmentation de l’incidence de maladies neurodégénératives dans le monde. Enfin, nous utiliserons des têtards pour identifier de nouvelles voies de signalisation à l’origine de la mise en place de la myéline (enroulement de certaines cellules autour des neurones dans le cerveau), ce qui pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies neurodégénératives.

Procédures

A l’âge d’environ un an les Xénopes auront un prélèvement de peau au niveau d’une nageoire de la patte arrière, dans une zone peu vascularisée, sur animal vigile. L’acte de la contention jusqu’au prélèvement dure moins d’une minute par animal et est réalisé une seule fois. Enfin, les adultes reproducteurs ont des injections d’hormones pour chaque reproduction (2 injections par accouplement pour les mâles, 1 pour les femelles), qui sont réalisées dans le bas du dos. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles pris en contention, à l’aide de seringues fines et stériles, rapidement (moins de 10 secondes) et peu douloureuses (peu de volume injecté et aiguilles de petit diamètre, avec un geste maitrisé). Au maximum les mâles feront 60 accouplements sur la durée du projet et les femelles 15 accouplements, soit 120 et 15 injections maximum respectivement. Pour chaque accouplement, les reproducteurs sont isolés pendant 60 heures maximum (en général du vendredi soir au dimanche soir).

Impact sur les animaux

Pour les adultes utilisés pour les accouplements, un léger stress serait attendu durant la phase de capture, où les animaux sont attrapés grâce à une épuisette et scannés pour identification grâce à une puce sous cutanée. De plus, les animaux sont isolés 60h maximum avant la mise en contact entre les mâles et les femelles, ce qui peut aussi engendrer un léger stress. Lors des injections d’hormones, une contention des animaux est nécessaire, ce qui peut engendrer un stress. Une légère et brève douleur pourra être ressentie par l’animal lors de l’injection en sous cutanée. Un prélèvement de moins de 2mm2 est réalisé au niveau palmaire pour le génotypage, ce qui peut entraîner une légère et brève douleur, à laquelle s’ajoute le stress de la préhension et de la contention.

Devenir

Dans les 80 animaux reproducteurs actuels, on estime au cours du projet que 50 d’entre eux vont présenter une absence répétée de fertilisation ou une diminution de la ponte, qui nécessitera leur euthanasie, puisqu’ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés, cette espèce étant considérée comme nuisible. Nous produirons donc 75 juvéniles qui permettront de remplacer et compléter l’effectif des animaux au fur et à mesure, et qui seront en utilisation continue, ainsi que les 30 animaux reproducteurs qui n’auront pas présenté de baisse de la fertilité. Il devrait donc y avoir au final dans l’animalerie environ 105 animaux, qui seront en utilisation continue pour notre élevage.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en amont de nos projets, cependant elles ne permettent pas de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. Notre projet prévoit de générer des têtards de Xénope pour trois projets de recherches, ces trois projets nécessitant l’utilisation de Xénope car : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux

Réduction

Dans ce projet, afin de respecter la règle des 3R nous favorisons les accouplements naturels plutôt que les fécondations in vitro ce qui évite d’avoir à prélever les testicules et donc d’euthanasier les Xénopes mâles pour la réalisation de fécondation in vitro (FIV). De plus, la pré-stimulation augmente le rendement d’œufs fertilisés, donc plus de têtards générés, pour un nombre de couples limité. Cela évite de manipuler et d’isoler plus d’animaux adultes. Compte tenu de la nature du projet, les tests statistiques ne peuvent pas être appliqués, car il s’agit d’un projet élevage. Cependant, le nombre de têtard à générer pour nos projets de recherche a été déterminé par des tests de puissance statistique pour n’utiliser que le nombre de têtards nécessaires, ce qui permet de réduire au strict minimum le nombre d’accouplements à réaliser, et donc le nombre d’animaux reproducteurs utilisés. Nous mettons en moyenne 65 couples d’adultes en croisement par an pour assurer la production d’œufs et de têtards. Cette espèce accuse une perte importante au cours du développement ce qui explique la fréquence des pontes, pour obtenir les têtards nécessaires à nos études. Nous utilisons à ce jour 48 femelles et 32 mâles, soit 80 animaux qui recevront des injections et pourront être isolés. Les femelles ne peuvent être stimulées que tous les 4 mois, ce qui explique que leur nombre soit plus important que les mâles, qui eux peuvent être réutilisés tous les mois. De plus, nous travaillons avec des animaux génétiquement modifiés, il est donc nécessaire de maintenir les différents génotypes présents à l’animalerie. Nous prévoyons de conserver 75 têtards pour renouveler et compléter l’effectif des adultes reproducteurs. Sur la durée du projet, ces animaux seront identifiés, prélevés pour génotypage et potentiellement injectés et isolés au cours du projet. Ces 75 animaux permettront de remplacer 50 Xénopes, qui arrivent bientôt à l’âge de 8 ans, et qui ne pourront plus être utilisés pour la reproduction. Au total le projet impliquera donc 155 animaux.

Raffinement

Les Xénopes adultes sont hébergés dans des bacs adaptés au nombre d’individu et à la taille, maximum 10 individus par bac. Des enrichissements sont disposés pour permettre aux animaux de se cacher (tuyaux, similis rochers, plantes artificielles), et des enrichissements alimentaires sont proposés une fois par semaine aux animaux (vers de vase rouges congelés). Les paramètres physico-chimiques de l’eau des adultes sont maintenus grâce à un système d’eau circulante automatisé (maintenue à 18 degrés Celsius). Les animaux sont observés quotidiennement si l’un d’entre eux parait amaigri, gonflé, rougeurs…, il est isolé et un avis vétérinaire est demandé. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Un contrôle sanitaire de la zone est effectué de manière annuelle. Les bacs utilisés pour l’isolement et la reproduction sont opacifiés pour que les Xénopes ne soient pas perturbés par l’environnement extérieur. Ces bacs sont remplis avec de l’eau provenant de leur aquarium d’origine, changée tous les deux jours. Un temps de repos de minimum 4 mois sera respecté pour les femelles avant de les remettre en accouplement, et minimum 1 mois pour les mâles. Le génotypage est réalisé sur des juvéniles à partir d’un an, l’animal est attrapé délicatement avec une épuisette et est immobilisé pour avoir accès à une patte arrière. La zone choisie pour le prélèvement nécessaire pour connaitre le patrimoine génétique de l’animal est peu ou pas innervée, et se régénère de façon spontanée au bout d’une semaine. Après le prélèvement, un antiseptique est appliqué afin de prévenir tout saignement ou infection avant remise en bac avec les congénères, et une surveillance accrue est mise en place pendant une semaine, pour repérer tout signe anormal chez l’individu (rougeurs, apathie, gonflements… ).

Choix des espèces

Le choix du Xénope se justifie par plusieurs raisons : 1) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction en cas d’étude longitudinale), 2) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil de protéines des cellules cérébrales différent dans le système nerveux central et périphérique, ce qui est un avantage pour les projets scientifiques que nous menons. Les animaux utilisés à la reproduction sont des adultes, en capacité de se reproduire, donc de plus de 3 ans. Le génotypage est réalisé sur des animaux à la limite du stade juvénile et adulte, soit à partir d’un an, quand ils ont atteint une taille suffisante pour faciliter la manipulation.

32 xénopes (Xenopus laevis) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis remis dans les bacs d'élevage. Chaque individu reçoit deux injections d'hormone hCG dans les sacs lymphatiques à trois jours d'intervalle pour déclencher la reproduction et fournir œufs ou têtards aux tests OCDE 231 et 241, qui dépistent les perturbateurs endocriniens. Le porteur indique une douleur légère et temporaire liée aux injections, et prévoit un repos de six mois pour les femelles et trois mois pour les mâles avant toute nouvelle stimulation. Il affirme que la cryoconservation des ovocytes ne fonctionne pas encore, ce qui rend selon lui l'animal vivant "indispensable".

Objectifs

L’objectif est de provoquer artificiellement la reproduction de couples de Xenopus laevis par injection d’hormone HCG (Human Chorionic Gonadotropin) dans le cadre des tests OCDE 231 et OCDE 241 afin d'obtenir des oeufs ou des tétards utilisés dans ces essais. Ces tests permettent de dépister les effets perturbateurs endocriniens de substances chez les larves d’amphibiens. Les résultats obtenus sont utilisés dans les dossiers d'homologation, permettent l’étiquetage des substances et la réalisation de l’évaluation des risques des substances introduites dans l’environnement.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre d’obtenir les larves nécessaires à la réalisation des tests OCDE 231 et 241 relatifs aux effets perturbateurs endocriniens potentiels des substances

Procédures

2 Injections d'HCG dans les sacs lymphatiques espacées de 3 jours. L'injection pratiquée par du personnel qualifié dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

- Légère douleur suite aux injections (durée temporaire)

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront remis dans les bacs d'élevage.

Remplacement

La cryoconservation des gamètes pourrait être une solution alternative en permettant de faire des fécondations in-vitro. Malheureusement, bien que la cryopréservation fonctionne avec les spermatozoïdes, ce n’est pas encore le cas avec les ovocytes. L’utilisation d’organismes vivants reste donc indispensables et l’injection d’HCG permet d’éviter de sacrifier des animaux pour prélever leurs gonades. Dans le cas du puçage, cette méthode est une alternative au sectionnement des phalanges utilisé jusqu'à présent pour identifier les amphibiens.

Réduction

Dans le cadre de l’injection hormonale, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en optimisant les chances que la reproduction fonctionne. Ainsi, les normes recommandent de ne pas injecter plus de 3 couples à la fois. De plus une veille bibliographique est réalisée régulièrement pour se tenir informer de toutes nouvelles méthodes alternatives (exemple : amélioration des procéder de cryopréservation).

Raffinement

Dans le cas de l’injection hormonale, un temps de repos de minium 6 mois pour les femelles, et de 3 mois pour les mâles, est respecté avant de réaliser toute nouvelle injection d’HCG pour éviter d’user les organismes et de limiter l’apparition du syndrôme d’hyperstimulation ovarienne chez les femelles. De plus, toute manipulation du xénope se fait avec des gants humides pour limiter le stress et les lésions sur la peau des organismes. Les xénopes peuvent être placés dans un bain de tricaïne à 300-500 mg.L-1 jusqu’à atteindre le stade d’anesthésie légère.

Choix des espèces

Il s’agit d’une espèce modèle des amphibiens anoures. Cette espèce est demandée par les guidelines OCDE. car elle possède de nombreux avantages : - Elle est facile à obtenir, entretenir et à observer ; - Elle est très résistante aux maladies et aux parasites ; - Les différents stades de développement sont facilement observables à l’œil nu, ou à la loupe binoculaire, et sont bien décrits dans la table de Nieuwkop et Faber (1994) ; - Il est possible d’induire une reproduction tout au long de l’année grâce à l’injection d’hormone HCG. De plus, un grand nombre d’œufs est produit à chaque reproduction. Les individus utilisés dans les procédures seront des individus adultes sexuellement actifs.

6 702 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués et 680 femelles réutilisées. Les femelles reçoivent des injections d'hormone tous les quatre mois pendant toute leur vie pour produire des ovocytes, tandis que les mâles et les larves sont tués pour prélèvement. Un test de réponse à la lumière évalue la vision des larves. Le porteur présente le xénope comme une "méthode alternative de remplacement" des modèles mammifères.

Objectifs

Ce projet englobe les questions scientifiques de notre institut utilisant le modèle Xénope et qui sont développé avec l'objectif de réduire en les mutualisant les expériences. Les objectifs sont l’étude : a) de la division des cellules de l'épiderme embryonnaire par des approches d’imagerie en temps réel dans des larves aux stades neurula. b) de la cataracte dans la larve de xénope. Le développement du cristallin est aisément observable dans l’embryon de xénope et dépend de l’expression de gènes dont la mutation est à l’origine de cataracte humaine. Les études dans la larve de xenope permettent d’analyser la fonction de ces gènes dans le développement de l’œil in vivo. c) au cours du développement (stades 1 à 45) de l’expression d' ARN circulaires pouvant servir de régulateurs de l'expression des gènes. d) du controle du fuseau de division cellulaire par des approches de microscopie electronique. Le fuseau permet la répartition fidèle du matériel génétique entre deux cellules filles. La taille et la structure du fuseau sont essentielles pour sa fonction. Cependant, malgré des décennies d'étude, on ignore comment le fuseau adopte une morphologie optimisée pour sa fonction.

Bénéfices attendus

Les 4 sujets de recherche développés dans cette demande d’autorisation de projets visent à l’avancée des connaissances scientifiques sur des sujets liés à la Biologie/Santé. En particulier le projet a) vise à préciser le rôle des acteurs de la cytokinese des épithéliums. La majorité des cancers provenant de tissus épithéliaux, la connaissance des mécanismes contrôlant ces divisions participent à la lutte anti-cancéreuse. Le projet b) vise à identifier et caractériser des gènes potentiellement impliqués dans le développement des cataractes et ainsi à ouvrir la voie à l’identification de cibles potentielles pour le traitement ou la prévention de la cataracte. Le sujet c) vise à décrire de nouveaux acteurs des régulations des gènes lors du développement embryonnaire et à analyser les mécanisme contrôlant leur production. Le sujet d) vise à la compréhension des mécanismes de contrôle de l’architecture du fuseau mitotique en tirant profit d’une comparaison inter-espèce.

Procédures

Une solution d'hormone (HCG) est injectée afin d'induire la ponte ou la spermatogenese. Cette opération dure une quinzaine de seconde. Pour les males il s'agit d'une injection unique. Dans le cas des femelles cette procédure est répétée environ tous les 4 mois tout au long de leur vie pour obtenir des ovocytes. Les larves issues de fécondation in vitro sont injectés au stade 1 à 8 cellules (environ 30' à 2h30min après fécondation, à un stade larvaire non autonome). Dans le cadre du sujet cristallin, un test comportemental unique de réponse à la lumière permet d'évaluer la fonction visuelle de chaque larve.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites dans cette demande impliquent l'administration d'hormones par injection sous cutanée dans l'animal. Les nuisances associées à ces injections sont a) l'isolement temporaire des animaux et le stress induit par la maniupulation et la contention le temps de l'injection. La procédure s'appliquant aux larves de stades supérieurs à 45 est une procédures d'évaluation de la fonction visuelle par des test comportementaux sans nuisances particulières associé à ce test. Les larves expérimentales ont été microinjectés aux stades 2-8 cellules puis se sont développés jusqu'au stade 48. Les phénotypes attendus sur ces animaux devrait etre associés à la fonction visuelle sans préjudice autre a priori.

Devenir

Xenopus laevis ne peut être adopté puisqu'il s'agit d'une espèce invasive. Les animaux femelles sont en utilisation continue pour la production d'ovocytes (680 animaux) tout au long de cette DAP. La durée de vie de ces animaux étant supérieure à 10 ans, et les procédures étant légères, les animaux sont conservés à l'issue du projet et réutilisés dans le cadre des nouveaux projets. Les males et les larves sont sacrifiés pour prélèvement.

Remplacement

Le modèle xénope permet par sa capacité de ponte élevé l’obtention de nombreuses larves dont le développement est externe. Ceci permet donc l’étude des phénomènes complexes impliqués sont le développement embryonnaire. L’utilisation du modèle xénope dans un contexte d’étude du développement embryonnaire en général est donc en soi une méthode alternative de remplacement de modèles mammifères, murins en particulier. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de gènes d’intérêt dans l’organogenèse (épithélium, cristallin, embryon entier), ces processus complexes ne peuvent être reproduits en leur globalité en culture cellulaire et nécessite donc l’utilisation de ce modèle animal. L’une des forces de ce modèle est de permettre, en intervenant dans le cadre de procédures sur quelques animaux adultes, d’obtenir en quantité de nombreux stades larvaires permettant l’expérimentation et une bonne puissance statistique des analyses. Par ailleurs, l’utilisation du modèle Xénope nous permet d’obtenir les ovocytes servant à la préparation d’extraits cytoplasmiques capables de reproduire in vitro les évènements du cycle cellulaire associé à la formation du fuseau de division et de les observer par microscopie electronique. La génération in vitro de tels fuseaux ne peut être réalisée qu'avec ces extraits d’ovocytes, de plus ce projet repose sur l'étude comparative entre X. laevis et X. tropicalis. C’est pourquoi aucune autre méthode, y compris les extraits de cellules en culture, ne peut être utilisée comme substitut.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous cherchons à mutualiser entre les différents sujets l’utilisation des animaux entrant dans le cadre d’une procédure. 1) Pour cela les larves obtenues lors d’une FIV seront potentiellement utilisées pour tous les sujets. En effet, en microinjectant les larves à différents stades de développement nous pouvons étaler les expériences et ainsi utiliser au mieux les larves produites lors d’une FIV. De ceci découle que le nombre de procédures FIV et le nombre d’utilisations d’animaux adultes sera diminué. 2) Des mâles doivent être mis à mort pour la collecte des testicules nécessaire aux FIV. L’utilisation des testicules issus de ces mâles est mutualisée lors de la réalisation des FIV et les testicules sont conservés au froid pour permettre la réalisation de FIV sur environ 2 semaines. 3) Le travail expérimental utilisant un nombre d’échantillons élevé pour l’analyse statistique est réalisé uniquement sur des stades larvaires. 4) Les femelles Xénopes ont une espérance de vie en captivité de l’ordre de 20 ans. Ces animaux subissant pour toute procédure des injections d’Hormone Chorionique Gonadotrophique (HCG) tous les 4/5 mois sont réutilisés tout au long de leur vie.

Raffinement

Le milieu est enrichi par l'adjonction d'artéfacts permettant aux animaux de se dissimuler, tandis que les aquariums sont partiellement dissimulés par des plaques opaques afin de limiter l’apport de lumière directe dans les aquariums. Les espaces d'élevages sont séparés des espaces de manipulation et à l’écart des bruits et circulations parasites. Les femelles en procédures sont isolées en bacs individuels lors de cette période qui s'étend au maximum sur 48 heures.

Choix des espèces

De par son mode de fécondation externe, il est possible de récupérer les ovocytes de Xénope après une simple stimulation hormonale, sans chirurgie ni mise à mort. Ces ovocytes permettent soit la réalisation d’extraits cytoplasmiques reproduisant le cycle cellulaire, soit, après fécondation in vitro, d’obtenir de nombreuses larves au stade une cellule qui peuvent être microinjecté par des molécules traceurs ou des molécules interférant avec l’expression des gènes afin d’analyser l’impact de certains produits de gènes sur l’expression des gènes, le développement embryonnaire et l’organogenèse, ou la dynamique des divisions cellulaires des épithéliums. Seuls des animaux adultes sexuellement rentrent dans nos procédures expérimentales. Les stades larvaires expérimentaux sont généralement arrêtés avant le stade 45, les larves allant au stade 48 sont utilisés pour un test fonctionnel non invasif. Les larves surnuméraires non expérimentales pourront être utilisées pour générer des animaux adultes.

156 animaux, 140 poissons zèbres et 16 xénopes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les poissons zèbres tués à l'issue et les xénopes femelles réutilisées d'une année sur l'autre. Les xénopes reçoivent une injection d'hormone puis un prélèvement d'ovocytes par massage abdominal, les poissons zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire sous anesthésie. Ces gestes servent à des travaux pratiques de formation réglementaire, pour que des stagiaires s'entraînent aux manipulations, anesthésies et mises à mort sur espèces aquatiques. Le porteur indique privilégier des animaux de réforme et affirme que le remplacement par un modèle alternatif est "impossible" pour la partie pratique.

Objectifs

Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.

Bénéfices attendus

A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.

Procédures

Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous utilisons deux modèles expérimentaux, le xénope et le poisson zèbre, qui ne sont pas soumis aux mêmes procédures. Pour les Xénopes, les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée pouvant induire une douleur brève et localisée au point d’injection. De plus, ils peuvent ressentir du stress lors de la contention qui est nécessaire à l’immobilisation de l’animal. Les poissons zèbres sont exposés à une anesthésie par balnéation à faible dose d’anesthésiants qui est maitrisée depuis plusieurs années et n’induit pas d’effet indésirable.

Devenir

Poisson-zèbre : En fin de procédure les animaux seront euthanasiés. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.

Remplacement

Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.

Réduction

le nombre total d’animaux impliqués dans cette demande est de 156 animaux pendant 5 ans(140 poissons-zèbre, 16 xenope). Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal. des plantes en plastqiues sont presents dans les aquariums de Xénopes. Les poissons sont toujours hebergés en groupe. Les poissons et xénopes sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect physique ou comportement anormal et de lui attribuer un score . Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie.

Choix des espèces

Les poissons-zèbres et les xénopes sont couramment utilisés à des fins scientifiques en raison de leur facilité d'élevage, de la disponibilité d'une vaste documentation et de l'existence d'une large communauté scientifique travaillant sur ces espèces. Ils sont considérés comme des modèles de choix en raison de leurs caractéristiques biologiques et des connaissances zootechniques disponibles. Ces deux espèces présentent des caractéristiques spécifiques qui les rendent adaptées aux procédures expérimentales telles que le prélèvement du sperme et d’ovocytes afin de réaliser des fécondations in vitro. Pour obtenir des pontes ou prélever du sperme, il est important d'utiliser des animaux matures sexuellement. Les xénopes nécessitent généralement une période d'environ un à deux ans pour atteindre cette maturité, tandis que les poissons-zèbres peuvent être utilisés à partir de trois mois, car ils ont un développement plus rapide.