Xénopes

6 036 xénopes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes reçoivent une injection hormonale pour se reproduire puis retournent dans leurs aquariums, tandis que les têtards issus des pontes sont exposés à des nanoparticules de graphène et pour certains soumis à une ponction cardiaque sous anesthésie, avant d'être tués par surdose d'anesthésique. Le porteur indique travailler à de faibles concentrations et n'attendre aucune toxicité aiguë, et présente le projet comme visant la protection des écosystèmes aquatiques. Sur le remplacement, il décrit un test préalable sur des daphnies pour cibler les concentrations et réduire le nombre de têtards.

Objectifs

Le présent projet s'intéresse aux effets des nanoparticules de graphène et composites à base de graphène. Du fait de leurs applications dans des domaines aussi variés que l'électronique, la science des matériaux ou la médecine, les nanoparticules connaissent un développement extrêmement important au niveau industriel. L'intégration de ces nanoparticules dans les produits de la vie quotidienne est une réalité et on peut s'attendre dans les années à venir à retrouver ces contaminants au sein des écosystèmes. Les écosystèmes aquatiques, qui sont les réceptacles finaux majeurs des pollutions, pourraient être impactés par le relargage de ces nanoparticules au cours du cycle de vie des produits qui en contiennent (production, utilisation, fin de vie des produits). Plusieurs études se sont intéressées aux effets de ces nanoparticules au niveau in vitro ou in vivo chez les modèles murins (rats et souris). L'ensemble de ces études est très intéressant d'un point de vue des modes d'action mais n'est pas représentatif des réalités environnementales. De plus, depuis une trentaine d'années on assiste à un déclin global des populations d'amphibiens à travers le monde. Un des objectifs importants de ce projet est d'évaluer par conséquent l'impact potentiel du graphène et d'autres nanoparticules à base de graphène (dont des composites intégrés dans des produits de la vie quotidienne) au niveau de la santé humaine mais également au niveau de l'environnement. A l’heure actuelle, peu d’études se sont intéressées à la toxicité de ces contaminants émergents au niveau des écosystèmes aquatiques. Les expérimentations entreprises dans le présent projet seront inédites et seront effectuées dans un but final de protection de la faune des écosystèmes aquatiques. La toxicité de nanoparticules de carbone sera ici évaluée chez le crapaud (Xenopus laevis) comme modèle biologique représentatif des écosystèmes aquatiques et dont la pertinence d'utilisation en écotoxicologie est reconnue depuis plusieurs années. Les adultes xénopes sont utilisés pour obtenir les tétârds après injection hormonale, tétârds qui eux sont utilisés pour étudier les effets de ces nanoparticules.

Bénéfices attendus

Selon les résultats obtenus dans le présent projet, des préconisations d'emploi des nanoparticules et de nanocomposites pourront être données par le biais d'une approche Safer-by-design (pour minimiser l'écotoxicité des nanoparticules dès leur fabrication, en tenant compte de l'ensemble de leur cycle de vie jusqu’à leur mise en déchet après leur utilisation). Cette approche pourrait permettre de faire avancer la réglementation en matière de nano et notamment auprès des industriels. D'un point de vue de l'évaluation réglementaire des risques, des prérogatives pourront également être apportées pour mettre à jour les recommandations "nano".

Procédures

Les xénopes adultes sont délicatement pris en main pour recevoir une injection hormonale (gonadotropine) qui stimule l'accouplement et qui permet d'obtenir une fertilisation optimale. Les œufs sont finalement obtenus par fécondation in vivo lors de l'accouplement naturel (amplexus). Au moment de la prise, la tête dans la paume de la main de l'utilisateur, l’injection est effectuée dans les sacs lymphatiques dorsaux, c'est-à-dire l'espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, qui est divisé en compartiments séparés par des parois conjonctives (septa), remplis de liquide lymphatique et en communication avec le système circulatoire lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l’injection et la diffusion des hormones dans l’ensemble du corps de l’animal. Afin d’éviter le reflux, on pique l’aiguille dans le haut de la cuissen et on maintien appuyé au lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. - les autres interventions sont réalisées sur les têtards manipulés délicatement à l'aide d'épuisettes et après traitement à la Tricaine méthane sulfonate (ponction cardiaque réalisée sous binoculaire pour les procédures qui requièrent l'analyse de leur sang).

Impact sur les animaux

Il s'agit ici d'une évaluation du risque des nanoparticules et nanocomposites. L'analyse des biomarqueurs étudiés chez ces animaux exposés pourra renseigner notamment des nuisances et des effets indésirables. Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées au maximum sur les individus issus d'une même ponte et pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun autant que possible. De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’expositions des larves de Xénope par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards éventuellement. Les concentrations environnementales auxquelles nous travaillerons étant qualifiées de faibles, aucune toxicité aiguë particulière n'est réellement attendue.

Devenir

Les adultes réintègrent leurs aquariums. Les têtards sont euthanasiées par surdose anesthésique tel que préconisé par la réglementation dans les méthodes de mise à mort.

Remplacement

Pour remplacer l'utilisation de têtards et en l'absence d'autres méthodes alternatives, le test réglementaire de détermination de la toxicité par la détermination de l'immobilisation chez les daphnies sera utilisé pour déduire la gamme de concentration à étudier ultérieurement chez les têtards. L'expérimentation chez les têtards sera alors réalisée à la concentration la plus forte n'entraînant pas de signes d'intoxication chez les daphnies exposées au préalable.

Réduction

Les xénopes adultes reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne (pas d'apport supplémentaire extérieur) et les têtards issus des pontes seront utilisés dans plusieurs procédures expérimentales. Le nombre d'animaux utilisé est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères. La distribution des données et les résultats ne peuvent pas être connus avant d'effectuer les expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront choisis parmi ceux adaptés à la distribution des données obtenues. Au cours des expositions des têtards, les lots de têtards témoins seront mutualisés autant que possible (en fonction de la disponibilité des matériaux à étudier) et seules les concentrations sans toxicité aiguë obtenues seront mises en œuvre grâce aux résultats des essais sur daphnies qui permettent donc également une réduction du nombre de têtards de xénope.

Raffinement

Les conditions d'élevage et d'exposition sont strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement (stade adulte et larvaire) pour minimiser le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs, renouvellement des milieux d'exposition des têtards pour éviter toute accumulation de déchets azotés toxiques ou une désoxygénation trop importante). L'observation des têtards sera pratiquée quotidiennement et la décision d'arrêter l'exposition pourra être prise si un comportement révélant un stress ou une souffrance importante est observé (ex : nage en « tonneaux », absence de mouvement prolongé, prise alimentaire trop faible, lésions externes, etc.). Enfin, le bien-être des têtards en exposition est aussi maintenu par la continuité des conditions d'élevage : contrôle de la température et de la photopériode, nourrissage... En plus des différentes méthodes énoncées ci-dessus, il est à noter que l'exposition des têtards s'effectuera dans un local bien séparé des zones d'élevage. Ces locaux sont thermostatés et leur accès est restreint afin d'éviter tout stress inutile aux animaux. Outre les conditions d'élevage et d'exposition détaillées plus haut, la technique de mise à mort utilisée permettra aussi de limiter au maximum la souffrance. En effet, l'immersion des individus dans la solution anesthésique permet leur mise à mort rapide (moins de 5 minutes).

Choix des espèces

Les amphibiens sont de bons modèles dans le cadre des études écotoxicologiques et leur pertinence d'utilisation a été démontrée depuis plusieurs années au laboratoire. Les stades œufs et larvaires sont particulièrement sensibles, ce qui en fait de bon indicateurs de la qualité des milieux. Ce sont des animaux sédentaires qui sont de bon indicateurs des conditions locales. Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement embryonnaire puis larvaire rapide et l'alimentation des têtards est facile. In fine, les expérimentations entreprises dans le présent projet seront effectuées dans un but final de protection de la faune des écosystèmes aquatiques. La toxicité de nanoparticules de carbone et nanocomposites est ici évaluée chez le crapaud (xénope Xenopus laevis) comme modèle biologique représentatif des écosystèmes aquatiques et dont la pertinence d'utilisation est reconnue depuis plusieurs années. Les reproducteurs Xénope seront au stade adulte (sexuellement matures : nécessaire pour la reproduction). Les têtards utilisés dans ce projet sont utilisés à des stades précis de leur développement embryonnaire car ces stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, car directement exposés à l'environnement aquatique, ainsi un nombre réduit d'animaux par rapport aux adultes est nécessaire pour détecter un éventuel effet délétère et permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Ces stades de développement sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la patte postérieure du têtard : l'anesthésie n'est donc pas nécessaire pour déterminer le stade de développement (raffinement).

883 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués et une partie réutilisée pour d'autres projets. Les femelles sont injectées pour pondre, les têtards génotypés par écouvillon puis soumis à un test de nage, et les embryons surnuméraires comme les têtards non porteurs de la mutation sont tués avant terme. Le porteur crée cinq lignées génétiquement modifiées pour étudier l'axe thyroïdien, et anticipe le développement possible d'un goitre chez les têtards rendus hypothyroïdiens. Il affirme que la complexité de cet axe ne peut être reproduite in vitro et présente le choix d'un amphibien à un stade larvaire comme un respect des 3R.

Objectifs

Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent de nombreux processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de la signalisation de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie des êtres vivants et constituent des problèmes majeurs de santé publique et santé environnementale. Ainsi, l’étude des gènes contrôlés par les HTs est essentiel pour comprendre les mécanismes liés à cette signalisation. La complexité du système hormonal lié à la thyroïde ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de contrôles de la régulation de cet axe et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux. A l’heure actuelle, aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Le xénope dont la métamorphose est dépendante d’un pic en hormones thyroïdiennes identique à celles des autres vertébrés dont l’Homme, est un amphibien couramment utilisé comme modèle pour étudier l’axe thyroïdien et les perturbations de cet axe. Pour étudier le rôle de ces HTs, nous avons donc choisi le xénope comme modèle et des stades d'études (embryo/larvaire) qui permettent de satisfaire au mieux la règle des 3R. Notre projet a pour objectif la création de 5 lignées génétiquement modifiées chez le xénope, où l’inactivation d’un gène clé de la signalisation HTs dans chaque lignée, entraine soit une hyperthyroïdie soit une hypothyroïdie chez les animaux portant la mutation. La caractérisation de ces 5 lignées nous permettra de mieux comprendre les conséquences d’une déficience ou d’un excès en HTs sur le développement des animaux, en s’interressant plus particulièrement au développement du cerveau.

Bénéfices attendus

Le but du projet est de pouvoir développer des modèles hypothyroïdiens et hyperthyroïdiens avec l’invalidation de 5 gènes sélectionnés pour leur rôle essentiel dans la signalisation thyroïdienne. Les hormones thyroidiennes (HTs) sont conservées parmi tous les vertébrés. Les HTs jouent un rôle clé dans les transitions des cycles de vie de ces vertébrés et notamment la métamorphose des amphibiens. Les retombées de ce projet seront, au niveau scientifique, de mieux comprendre les mécanismes d’action des HTs en étudiant les fonctions des protéines invalidées (stratégie de perte de fonction). Ce projet permettra en outre, d’établir des points de comparaison entre les modifications de l’expression des gènes observées suite à l’invalidation des 5 gènes clés de l’axe thyroïdien avec celles qui ont pu être observées suite à une exposition à des produits chimiques susceptibles de perturber la signalisation par les HTs. D’un point de vue applicatif, nous pourrons tester des stratégies profilaxiques afin de traiter les patients atteints de telles mutations, mais aussi analyser les comportements associés à la perte de fonction de ces gènes et faire des comparaisons avec ce qui est observé en écotoxicologie sur certaines espèces.

Procédures

Afin d'obtenir des œufs, les femelles adultes sont induites à pondre par injections en sous-cutané dans les sacs lymphatiques dorsaux avec de l'hormone chorionogonadotropine humaine. Elles sont capturées avec une épuisette (propre et désinfectée) dans laquelle ils sont maintenus manuellement sans pression, pour éviter qu’elles ne s’échappent pendant l’injection. Une pression légère sur le point d’injection est faite pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Dans le but d’identifier les animaux portant la mutation du gène ciblé pour chaque lignée, un prélèvement de mucus sur les têtards anesthésiés est fait de façon non invasive, à l’aide d’un écouvillon frotté délicatement sur la peau de chaque animal. La durée du prélèvement est d’environ 15 secondes par animal et ne sera effectué qu’une seule fois sur les animaux à génotyper. Un test de mobilité consistant à suivre le mouvement de chaque têtard pendant 10 minutes avec une alternance de périodes lumière/obscurité sera fait pour les animaux de chacune des 5 lignées afin de contrôler si la mutation affecte ou non cette mobilité.

Impact sur les animaux

Pour les 5 gènes choisis, l’invalidation des différents gènes ciblés devrait conduire soit à une baisse des HTs circulantes entrainant une hypothyroïdie générale de l’animal, soit au contraire à une augmentation des HTs circulantes entrainant une hyperthroïdie de l’animal. Pour les invalidations de gènes qui sont succeptibles d’induire des hypothyroïdies, nous anticipons la possibilité pour les têtards de développer une hypertrophie de la glande thyroïde (goitre).

Devenir

Procédure 1 : Induction de la ponte des femelles xénope (18 femelles de type sauvage dites Wild Type) et récolte des œufs. Toutes les femelles sont gardées et pourront être impliquées dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 2 : Création et élevage des animaux de chaque lignée où chacun des 5 gènes ciblés a été inactivé. Dans un 1er temps les 325 animaux impliqués dans cette procédure (soit 50 par lignée donc 250, et 75 animaux contrôles) seront élevés jusqu’au stade têtard pour être génotypés afin d’identifier et de conserver les animaux où le gène ciblé est bien inactivé, lesanimaux partiellement ou non invalidés ne seront pas conservés. Ensuite seuls les animaux pleinement invalidés sont élevés jusqu’au stade adulte où 2 couples d’animaux par lignée (soit 2x5 femelles et 2x5 mâles) seront conservés pour établir les 5 lignées qui serviront à produire les animaux portant chacune des mutations voulues. Tous les adultes des 5 lignées sont gardés et pourront être impliqués dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 3 : Analyse moléculaire et comportementale des 5 lignées. La mobilité des animaux mutants pour chacune des 5 lignées sera étudiée. Cela comprendra l’analyse de 540 têtards pour le comportement de nage (90 animaux x 5 lignées + 1 lignée contrôle) au stade NF48 (15 jours post fécondation). Puis sur les 540 têtards, seuls 90 têtards (15 têtards par groupe) seront conservés afin de réduire le nombre d'animaux en expérimentation et ils seront élevés jusqu'au stade NF55 (33 jours post fécondation) pour prélever différents tissus destinés à être analysés.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de comprendre les effets d’une déficience ou d'un excès en hormones thyroïdiennes au cours du développement. La complexité de l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de régulation de cet axe et nécessite de recourir à des animaux modèles. Aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Nous avons choisi un modèle (amphibien) et des stades d'études (embryon/larve) qui permettent de satisfaire au mieux de la règle des 3R.

Réduction

La production d’animaux est réduite au maximum de façon à atteindre les objectifs. Pour les procédures 1 à 2, correspondant à la production de lignées, le nombre d’animaux utilisés correspond au meilleur compromis pour parvenir à établir le nombre de mutants, avec une reproductibilité sur au moins trois expériences indépendantes. Lorsqu’une ponte fournira plus d’embryons que nécessaire pour une expérience prévue, les embryons surnuméraires seront euthanasiés avant la fin des stades éleuthero-embryons.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage adapté à leur croissance et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés quotidiennement (température) ou de façon hebdomadaire (salinité, concentration en nitrate-nitrite et pH). Les têtards sont nourris avec de la poudre d’ortie avec un apport en proteines, puis après métamorphose les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche ainsi que de la nourriture riche en protéines (vers de vase), afin d’assurer aux animaux une croissance optimale. Ils sont maintenus à une densité recommandée par la directive européenne afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Enfin, les animaux sont l’objet d’un suivi quotidien et tout animal présentant des signes de maladies est isolé et soigné pour éviter toute propagation.

Choix des espèces

Le xénope (Xenopus laevis) est un modèle reconnu pour l’étude du système hormonal lié à la thyroïde. En effet la métamorphose est entièrement dépendante d'un pic en Hormone thyroïdienne. Ce pic a lieu à la naissance chez les humains (et la plupart des vertébrés) et permet la maturation du système nerveux. Cette espèce, comme tous les vertébrés, possède les mêmes hormones que les Hommes. Elle offre l'avantage 1) de ne pas être un mammifère et d'avoir un développement externe qui permet un traitement avec des différentes molécules par balnéation et non par gavage ou par injection, 2) d'être un vertébré tétrapode (à la différence des poissons) et d'être évolutivement relativement proche de l'Homme. De plus, son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés obtenus par fécondation in vitro, la transparence des embryons, les possibilités de transgénèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les femelles adultes de type sauvage permettront d’assurer la production des œufs qui serviront à créer les 5 lignées génétiquement modifiées présentant chacune l’inactivation d’un gène clé de la signalisation thyroïdienne. Pour établir les 5 lignées, les têtards seront élevés jusqu’au stade adulte pour sélectionner 20 adultes, soit 10 mâles et 10 femelles matures sexuellement correspondant à 2 couples par lignée créée. Pour caractériser les 5 lignées, les couples permettront d’assurer les reproductions, puis les tests de mobilité (comportement de nage) seront pratiqués sur les têtards issus de ces reproductions au stade NF48 (15 jours post fécondation) et les tissus seront prélevés pour analyse au stade NF55 (33 jours post fécondation).

9 460 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes reçoivent des injections hormonales pour se reproduire puis retournent en aquarium et servent à nouveau, tandis que les larves et les œufs exposés sont tués par surdose d'anesthésique, pour évaluer l'écotoxicité d'effluents de station d'épuration. Le porteur indique recourir d'abord à un test sur daphnies pour réduire le nombre de vertébrés. Il présente le xénope comme un indicateur pertinent de la qualité des milieux.

Objectifs

De nombreux composés chimiques sont retrouvés en entrée de stations d'épuration de part les activités humaines et notre société de consommation. Les traitements actuels sont peu efficaces pour traiter ce genre de composés et une majorité d'entre eux (les micropolluants) sont retouvés dans l'environnement. Le présent projet est issu de 2 projets de recherche différents qui s'intéressent aux traitements des effluents d'origine humaine (station d'épuration, eaux résiduelles urbaines, effluents hospitaliers, etc.) dont l'objectif est de mettre en évidence l'absence d'écotoxicité des matrices (effluents, lixiviats de boues) traitées par les procédés de traitement mis en oeuvre et cela avant leur rejet dans le milieu naturel et de définir une stratégie de traitement d'effluents optimale qui fournit un effluent final adapté à la réutilisation, en se conformant à une qualité d'eau chimique et biologique sécûre. Les 2 projets ont été évalués par des organismes scientifiques français et européens et des financeurs publics. Les expérimentations porteront d'une part sur l'évaluation de l'effet de cocktails de micropolluants à des concentrations faibles couramment retrouvées dans l'environnement. D'autre part, les expérimentations auront pour but d'évaluer l'efficacité et l'innocuité de traitements innovants des eaux usées issues de stations d'épuration.

Bénéfices attendus

L'enjeu environnemental est important, avec à la clef un possible changement/amélioration des pratiques de traitement des eaux usées à l'issue des connaissances scientifiques qui seront acquises. Les bénéfices attendus sont donc des impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau et les gestionnaires à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé).

Procédures

Les adultes xénopes s'accouplent naturellement après l’injection hormonale dans les sacs lymphatiques dorsaux (prise en main : tête dans paume de la main de l'utilisateur). L’injection est effectuée dans l’espace entre la peau et le plan musculaire sous-jacent, divisé en compartiments séparés par des parois conjonctives, rempli de liquide lymphatique et en communication avec le système lymphatique. Cette disposition anatomique favorise l’injection et la diffusion des hormones dans l’ensemble du corps de l’animal. Pour éviter un reflux, on pique l’aiguille dans le haut de la cuisse à travers le septum et on maintient appuyé au lieu d’injection pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Les 20 adultes ne seront jamais mis à mort mais réintégrés à l’élevage. Les autres interventions sont réalisées sur les têtards après traitement au Tricaine Méthane Sulfonate. Ils seront exposés à différents types de mélanges en micropolluants organiques ou à des effluents traités pendant des durées variables (4-12-21 jours) et différents aspects biologiques seront étudiés : cassures de l'ADN, métamorphose, croissance, De plus, pour se rapprocher le plus possible du milieu naturel, des expérimentations seront menées en étudiant les effets au niveau de chaînes alimentaires recréées en laboratoire. Pour l'ensemble des procédures 9440 têtards seront utilisées. Le nombre total d'animaux impliqués sera donc égal à 9460 en considérant les têtards et les adultes. Du point de vue du raffinement, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs). Afin de réduire le nombre d'animaux, une même ponte sera mutualisée pour plusieurs essais et procédures permettant de réduire considérablement le nombre de reproducteurs. De même, les expérimentations seront regroupées au maximum (les contröle seront mises en commun pour réduire le nombre de têtards). De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’exposition des larves par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards. Un même têtard sera utilisé pour mesurer de nombreux biomarqueurs évitant de multiplier le nombre de têtards avec le nombre de biomarqueurs. Enfin une anesthésie stricte est utilisée à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les bénéfices attendus sont donc les impacts sur la société et l'économie, en incitant l'industrie de l'eau à protéger l'environnement des rejets d'effluents contenant des contaminants tout en prenant en compte le concept sociétal du"One Health" (une seule santé). On fait une évaluation écotoxicologique des effets des contaminants potentiels qu'on peut retrouver dans un effluent après traitement en comparaison avec avant traitement. L'analyse des biomarqueurs utilisés chez ces animaux exposés pourra renseigner notamment des nuisances et des effets indésirables. Afin de réduire le nombre d’adultes xénopes, les expérimentations seront regroupées au maximum sur les individus issus d'une même ponte et pour réduire le nombre de têtards, les conditions témoins seront mises en commun autant que possible. De plus, des essais préliminaires de toxicité chez les invertébrés daphnies seront utilisés pour cibler les concentrations d’expositions des larves de Xénope par la suite, et éviter ainsi des mortalités aigües des têtards.

Devenir

Les adultes réintègrent leurs aquariums. L'ensemble des larves et oeufs exposés sera euthanasié selon la méthode de mise à mort recommandée : surdose de l'anesthésique Tricaine methanesulfonate à 0,2 g/L (solution tamponnée au bicarbonate de sodium : pH 7.0).

Remplacement

Un test réglementaire de détermination de l'immobilisation chez les invertébrés daphnies (OCDE TG202) sera utilisé chaque fois que la toxicité aiguë d'un effluent ou d'un cocktail sera recherchée. Par conséquent, les gammes de concentration étudiés chez les xénopes seront établies en fonction des résultats de toxicité aiguë enregistrés chez la daphnie. Nous utilisons le test Daphnie, pour réduire le nombre de vertébrés utilisés et en l'absence de méthodes alternatives permettant d'étudier la toxicité de cocktails de polluants.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux : - Les reproducteurs utilisés proviennent d'un élevage interne et les larves issues des pontes seront utilisées dans les différentes procédures ==> Pas d'importations supplémentaires de nouveaux géniteurs: réduction du nombre d'animaux utilisés. - Le nombre d'animaux utilisé dans chaque procédure est calculé selon un minimum requis pour pouvoir conclure statistiquement sur de potentiels effets délétères et les embryons ou larves témoins négatifs sont mutualisées autant que possible en fonction de la disponibilité des matrices à étudiers

Raffinement

Raffinement -Les reproducteurs qui sont injectés en vue de la reproduction servent au maximum 3 fois par an ==> période de récupération de 4 mois. Leur manipulation est douce et est réalisée par du personnel expérimenté. Par exemple, l'injection de gonadotropines sera réalisée uniquement par deux membres du projet qui sont parmi les plus expérimentés (25 ans d'expérience). Autre exemple, l'animal est saisi dans l'aquarium en mettant délicatement sa tête dans la paume de la main et la partie abdominale est légèrement massée avec le pouce (ces gestes exercent une action calmante sur l'animal). L'injection se réalise en immobilisant l'individu dans la main. Les solutions hormonales sont sorties du réfrigérateur puis mises à température ambiante pour ne pas être douloureuse à l'injection. -Dans le but de réduire le stress des reproducteurs, les conditions d'élevage et d'exposition seront strictement contrôlées en fonction des besoins physiologiques de chaque stade de développement pour réduire le stress et la souffrance au maximum (ex: période de repos après stimulation des reproducteurs).

Choix des espèces

Les amphibiens sont de bons modèles dans le cadre d'études écotoxicologiques et leur pertinence d'utilisation a été démontrée depuis plusieurs années : - Les stades larvaires sont particulièrement sensibles, ce qui en fait de bon indicateurs de la qualité des milieux. - Ce sont des animaux sédentaires qui sont de bon indicateurs des conditions locales. ==> Le xénope est pertinent dans le cadre de notre projet car il possède un taux d'éclosion élevé, une disponibilité tout au long de l'année après un traitement hormonal des reproducteurs, un développement larvaire rapide et l'alimentation des larves est facile. Les reproducteurs de X. laevis seront utilisés au stade adulte (sexuellement mâtures : nécessaire pour la reproduction). Les larves de xénope utilisées dans ce projet sont agées de 2 à 3 semaines. Elles sont utilisées à ces stades de développement précis pour différentes raisons. Les stades larvaires sont particulièrement sensibles à la présence de polluants, ainsi un nombre réduit d'animaux par rapport aux adultes est nécessaire pour détecter un éventuel effet délétère (réduction). Ces stades sont facilement repérables car ils correspondent à l'apparition du bourgeon de la pâte postérieure et l'anesthésie n'est donc pas nécessaire pour déterminer ce stade de développement (raffinement).

2 300 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un centre de ressources les produit et les élève pour approvisionner des laboratoires, injectant des hormones à 1 900 femelles pour stimuler la ponte et pratiquant sur 400 autres jusqu'à quatre laparotomies pour prélever des fragments d'ovaire. Les femelles hormonées peuvent être réutilisées, celles opérées à répétition étant ensuite réutilisées pour l'enseignement ou tuées. Le porteur revendique le xénope comme "organisme modèle de choix" et met en avant sa longévité, jusqu'à trente ans, comme argument de réutilisation.

Objectifs

La plateforme est au service de la communauté scientifique travaillant avec le modèle xénope. Elle reprend les activités du Centre de Ressources Biologiques Xénopes qui servait près de 60 équipes de recherche en France depuis 20 ans. Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Pour cela, le centre devra produire, maintenir et élever des animaux propres à la vente. Aucun apport extérieur ne sera réalisé, nous maintiendrons le cheptel minimum nécessaire aux besoins de la communauté. Les animaux pourront être produits par reproduction semi-naturelle ou par fécondation in vitro, pour lesquelles des injections d'hormones chez la femelle sont nécessaires. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Par ailleurs, pour répondre aux besoins de certains laboratoires utilisateurs concernant les fragments d'ovaires, il est nécessaire de pratiquer sur les femelles une laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) sous anesthésie générale. Une fois suturée, les femelles feront l'objet d'une surveillance post-opératoire afin de détecter un éventuel signe de souffance.

Bénéfices attendus

Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes.

Procédures

Puçage (tous) Injection d'hormones (1900) ou prélèvement de fragment d'ovaire par laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) (400)

Impact sur les animaux

La présence d’un stress est tout de suite visible par l’émission de venin par les glandes épithéliales. Dans ce cas l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est mis en observation. Après manipulation, les femelles retournent en stabulation dans les animaleries. Le personnel animalier s’assure que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général. En cas de comportement anormal (perte de poids rapide ou progressive de au moins 20%, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau entraine la mise à mort de l'animal), le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre (administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours).

Devenir

Les femelles xénopes issues de la procédure 1 pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans) Les femelles issues de la procédure pourront, après avoir subi 4 laparotomies, être réutilisées à des fins d'enseignement ou seront euthanasiées.

Remplacement

les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).

Réduction

Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les commandes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) opérer 3 à 4 fois maximum un seul individu (opérations espacées de quelques mois) et ensuite le destiner à des fins d’enseignement. 3) faire correspondre les pontes demandées par nos utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal (ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, installation de cachette). Lors des chirurgies, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés.

Choix des espèces

Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 ans environ pour X. laevis et 6 mois pour X. tropicalis (le temps de développement de cette espèce est plus rapide).