Xénopes
Analyse du rôle des histones et de leurs partenaires dans le développement embryonnaire de l’amphibien Xenopus laevis
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
200 xénopes vont être utilisées, gardées en vie et réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent une injection d'hormone dans les sacs lymphatiques du dos pour provoquer la ponte, avec une contention à pleine main pour récolter les ovocytes, le porteur imposant six mois de repos entre deux pontes. L'objet est d'étudier le rôle de protéines, les histones, dans le développement embryonnaire, en lien avec des tumeurs de l'enfant. Le porteur affirme utiliser aussi des cellules humaines in vitro mais conclut que la régulation à l'échelle de l'organisme entier ne peut être modélisée en culture.
Objectifs
Notre information génétique est contenue sous forme de molécules d’ADN dans les noyaux de nos cellules. L’ADN est compactée en une structure dynamique appelée chromatine et cette organisation épigénétique est indispensable au bon fonctionnement des cellules. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, qui comprend de l’ADN enroulé autour de protéines appelées histones. Ces histones, qui sont critiques pour la régulation de l’expression des gènes, sont par ailleurs retrouvés mutés dans des formes de cancer très agressif, comme les glioblastomes pédiatriques. Dans une perspective tant scientifique que sociétale, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés aux histones dans ces fonctions cellulaires et au cours du développement de l’organisme.
Bénéfices attendus
Xenopus laevis, espèce non mammifère, est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés tétrapodes, notamment grâce à son développement embryonnaire externe et le grand nombre d’embryons qu’on peut produire par expérience. Il représente donc un outil précieux pour mieux comprendre les processus développementaux des modèles tétrapodes mammaliens dont l’homme. L’analyse du génome de xénope montre d’importantes similitudes avec le génome humain - près de 80% des gènes identifiés dans des maladies humaines sont aussi conservés chez le xénope. Parmi ces facteurs très conservés on retrouve les histones. Les mutations des histones sont fréquemment retrouvées dans certaines formes de tumeurs cérébrales très agressives et de tumeurs osseuses de l’enfant et jeune adulte. Ces mutations apparaissent très tôt au cours de la vie et les dérégulations épigénétiques associées perturbent le bon développement embryonnaire et favorisent la tumorigénèse. Introduire ces mutations responsables de pathologies humaines dans l’embryon de xénope et caractériser leurs effets moléculaires, cellulaires et développementaux permet de mieux comprendre la biologie de ces tumeurs et in fine améliorer le traitement des patients.
Procédures
Les animaux sont soumis à l’injection sous cutanée d’une substance non toxique et indolore en une seule administration (durée du geste inférieur à 20 secondes).
Impact sur les animaux
L’ovulation des xénopes femelles est induite par l’injection d’hormone gonadotrope chorionique dans les sacs lymphatiques dorsaux. Ceci implique le stress de l’animal dû à la contention pendant le geste technique et la douleur de la piqure. Les femelles en stimulation sont ensuite remises séparément dans des bacs situés à l’écart, dans une pièce isolée du passage des personnels afin d’éviter toute forme de stress qui risquerait de compromettre le succès de la ponte. La récolte des ovocytes nécessite une contention de la femelle à pleine main tout en dirigeant le cloaque vers la coupelle où les œufs doivent être déposés. Cette manipulation, plutôt délicate, nécessite de la dextérité et un peu d’habitude, afin de minimiser le stress généré chez l’animal, et est réalisée par des expérimentateurs préalablement formés.
Devenir
Animaux gardés en vie. Les femelles seront maintenues en hébergement et seront utilisées à nouveau dans des projets de recherche, selon les besoins et avis du vétérinaire.
Remplacement
Les mutations des histones touchent une partie de la protéine qui est importante pour sa fonction. Plusieurs mutations ont été découvertes et de façon frappante, elles sont associées avec des types de tumeurs spécifiques, des localisations différentes et des âges différentes des patients. Afin de caractériser les effets de ces différentes mutations, nous utilisons des approches parallèles et complémentaires. Nous avons établi des modèles de cellules humaines dans lesquelles nous avons introduit ces mutations spécifiques de différents types de tumeurs. Ceci nous permet d’analyser et comparer leurs effets génomiques et épigénomiques, moléculaires et cellulaires, et de générer des hypothèses sur le mode opératoire des histones mutantes. Cependant la régionalisation tumorale, en termes de localisation mais aussi d’âge des patients implique des régulations développementales fines au niveau de l’organisme entier, qui ne peuvent pas être modélisées dans des cellules en culture. Le xénope présente un avantage considérable en termes de 3R - le développement ex utéro des embryons présente la possibilité d’une observation non-invasive à tous les stades.
Réduction
L’utilisation d’animaux vivants dans ce projet revêt un caractère de stricte nécessité pour les raisons suivantes : - L’induction hormonale de la ponte constitue la seule méthode pour obtenir en grande quantité des embryons. De plus le recours à la fécondation in vitro permet d'obtenir le développement synchrone des embryons et des stades précis, en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques (tests de conformité à un standard). -D'autre part, il s'agit de la seule façon d’obtenir des ovocytes matures/oeufs de manière non invasive (sans chirurgie). Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet, nous prenons en compte que : -Nos analyses fonctionnelles sont restreintes aux stades embryonnaires antérieurs à la forme larvaire autonome. -Les femelles ont une période reproductive longue (15 ans et plus), et peuvent donc être induites à pondre de nombreuses fois pendant cette période. Ceci permet donc de restreindre le nombre d'animaux utilisés. -Par ailleurs, bien que la mise à mort d’animaux qui n’ont subi aucun geste expérimental et qui ne présentent pas de phénotype dommageable ne nécessite pas d’autorisation de projet, il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles euthanasiés.
Raffinement
Dans le but de réduire le plus possible toute douleur, souffrance ou stress, nous imposons une période de repos de 6 mois aux femelles entre deux pontes.
Choix des espèces
Le xénope occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère) et est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. C’est le premier génome amphibien séquencé et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain, notamment 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leur orthologues chez Xenopus. X. laevis est un modèle de choix en biologie du développement, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Il s’agit d’animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle pour qu’ils puissent se reproduire.
Étude des mécanismes cellulaires et moléculaires à l’œuvre au cours du développement et de la régénération de la rétine du xénope.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
36 832 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la grande majorité des têtards tués pour analyse et 112 femelles adultes maintenues en élevage pour la reproduction. Les têtards subissent des injections intraoculaires et des lésions physiques de la rétine sous anesthésie, pour étudier les mécanismes de régénération rétinienne propres à cette espèce. Le porteur qualifie la dégénérescence rétinienne d'"indolore" et présente la rétine comme un "organe non-vital qui régénère entièrement". Il décrit la fécondation in vitro et le recours au xénope comme relevant d'une "stricte nécessité".
Objectifs
Une maladie neurodégénérative est une altération progressive et souvent irréversible des fonctions nerveuses. Par exemple, les maladies neurodégénératives de la rétine, comme le glaucome, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) ou la rétinite pigmentaire, conduisent très souvent à une perte de la vision. Comme d’autres maladies neurodégénératives (Huntington, Parkinson ou Alzheimer), ces pathologies rétiniennes résultent de la mort de certaines cellules indispensables au fonctionnement du tissu neural : cellules ganglionnaires chez les patients atteints de glaucome ou photorécepteurs dans la DMLA ou la rétinite pigmentaire. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour réellement traiter ces pathologies. La biologie des cellules souches de la rétine est en plein essor afin de développer de nouvelles approches pour combattre la cécité. Notre programme de recherche vise à étudier la manière dont des signaux externes et des facteurs internes interagissent et se coordonnent pour finement réguler le comportement des différentes populations de cellules souches de la rétine dans des conditions physiologiques ou pathologiques (lésions et dégénérescences). Plus particulièrement, nous nous intéressons à l’influence du contexte inflammatoire. Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines. Il existe de nombreux modèles (souris et rat) de dégénérescence rétinienne mais ces derniers ne sont pas les plus appropriés pour l’étude des processus de régénération en raison d’un potentiel de réparation extrêmement limité, comme chez l’Homme. En revanche, les amphibiens, en raison de leurs capacités de régénération remarquables, constituent des modèles de choix pour l’étude de l’implication des cellules souches dans la réparation tissulaire. En ce qui concerne la rétine du xénope, plusieurs travaux dont les nôtres ont démontré une régénération très efficace après lésion ou ablation rétinienne à partir des cellules gliales de Müller ou des cellules souches de l'extrémité de la rétine. La rétine du xénope offre donc un terrain d’investigation de choix pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des processus régénératifs dans un contexte de dommage rétinien (lésions physiques et neurodégénérescence).
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent le comportement des cellules souches en général, et des cellules souches rétiniennes en particulier. Cette étude devrait par conséquent permettre d’expliquer les raisons de la perte des capacités régénératives chez les mammifères afin de trouver des pistes pour restaurer ce potentiel dans une perspective de thérapie cellulaire.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, 80 femelles adultes sauvages et 32 femelles adultes transgéniques ou mutantes seront soumises, tous les 4 mois, à une injection sous-cutanée d’hormone afin de réaliser des fécondations in vitro. Par ailleurs, des larves autonomes sont soumis à plusieurs actes expérimentaux : - 10800 individus : (i) anesthésie une fois pendant la procédure juste avant une injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. - 6480 individus : (i) anesthésie deux fois pendant la procédure, juste avant une injection intraoculaire et juste avant une lésion physique de la rétine. La durée de chaque anesthésie est d'environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. (iii) lésion physoqie de la rétine : une fois pendant la procédure. La lésion s'effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser cette lésion. - 19440 individus : (i) anesthésie deux fois pendant la procédure, juste avant chaque injection intraoculaire. La durée de l'anesthésie est d'environ 5 minutes. (ii) injection intraoculaire : deux fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 30 secondes en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection.
Impact sur les animaux
La mise en œuvre de ce projet requiert l’utilisation de larves autonomes. Les dommages escomptés les concernant sont limités. L’établissement de lignées transgéniques modèles de pathologies reposent sur des systèmes qui permettent l'ablation réversible d'une population de cellules bien précise à un instant choisi. Ainsi, l’apparition du phénotype se fait uniquement au stade requis et sur une durée limitée et il est important de mentionner que la déficience visuelle consécutive à une dégénérescence cellulaire, comme dans la DMLA, est indolore. En revanche, certains aspects du projet requièrent des lésions physiques via piqure d’aiguille ou des injections intraoculaires d’agents chimiques, dont le niveau de sévérité attendu est de classe modérée bien que ces actes soient réalisés sous anesthésie. Toutefois, notons également que les phénotypes concernent une population précise de cellules dans un organe non-vital qui régénère entièrement chez l’espèce concernée.
Devenir
- Procédure 1 : maintien en élevage des femelles adultes - Procédure 2 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. - Procédure 3 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. - Procédure 4 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et l’expression de gènes dans leurs rétines. - Procédure 5 : euthanasie des têtards pour analyse de la prolifération cellulaireet du devenir cellulaire des cellules de Müller dans leurs rétines.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité car : -la fécondation in vitro constitue la seule méthode pour obtenir des ovocytes matures de manière non invasive (sans chirurgie) puis des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques. - Le projet a pour objectif l’étude des mécanismes impliqués dans le développement et la régénération d’un organe, la rétine. La nécessité d’avoir recours à des animaux, les xénopes, se justifie par le fait que ces processus sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire in vivo. Des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Cependant, afin de satisfaire au principe de remplacement, - nous pratiquons des approches in silico en bio-informatique. - En amont du présent projet, nous planifions la mise au point de culture en explant de rétines ex vivo, provenant d'animaux euthanasiés sans manipulation préalable. Cette technique pourra s’avérer être un bon modèle alternatif de dégénérescence rétinienne et permettra ainsi d’étudier l’effet de molécules pro- ou anti-inflammatoires sur la capacité régénérative des cellules de Müller. Ce modèle ex vivo va permettre de sélectionner les molécules inflammatoires les plus efficaces qui pourront être ensuite utiliser in vivo.
Réduction
La réalisation de notre projet implique notamment l'injection d'hormone chez des femelles xénopes adultes pour la production d’ovocytes afin d’obtenir des embryons. Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés, nous prenons en compte que : - Les femelles, ayant une période reproductive longue (15 ans), peuvent être induites à pondre de nombreuses fois - Il est à noter que les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles sacrifiés. - Si possible, nous réalisons des fécondations naturelles évitant le sacrifice du mâle (mâles transgéniques). - Nous utilisons au moins dix animaux par groupe afin que les résultats obtenus soient statiquement valides. Nos expériences sont réalisées 3 fois.
Raffinement
Dans le but de réduire la douleur, souffrance ou angoisse, nous imposons : - des conditions d’élevage conformes aux directives européennes. - l’utilisation des femelles par roulement tous les 4 mois permettant le renforcement positif lors des manipulations. - Pour les larves autonomes, les lésions physiques induites et les injections intra-oculaires se font sous anesthésie. Nous prenons également en compte le fait que : - Le phénotype vise un organe non-vital qui régénère entièrement chez l’espèce concernée. - La dégénérescence cellulaire au niveau de la rétine, comme dans la DMLA, est un processus indolore.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique-clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Nous disposons des génomes pour les deux espèces (X.tropicalis et X.laevis) et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain : 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs équivalents chez le xénope. Par ailleurs, ces espèces sont faciles à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses d’embryologie expérimentale dès la fécondation et une observation non-invasive à tous les stades. X. tropicalis est diploïde avec un temps de génération plus court que X. laevis. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches d'étude génétique sont couramment utilisées. Dans le cadre de notre projet, le xenope, en raison de ses capacités de régénération remarquables de sa rétine, constitue un modèle de choix pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces processus régénératifs. Pour effectuer les fécondations in vitro, nous utilisons des animaux adultes ayant atteint la maturité sexuelle. Nos expériences d’étude de la régénération de la rétine nécessitent de travailler sur des stades larvaires autonomes car nous avons démontré que les cellules de Müller permettant la régénération ne se réactivent de manière efficace qu’après ce stade. Par conséquent, toutes les expériences visant à étudier l’activation des cellules de Müller et la régénération sont effectuées sur des têtards.
Etude des mécanismes évolutifs des grenouilles aquatiques de la famille des Pipidae
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Xénopes : 40
40 xénopes et 314 autres amphibiens vont être utilisés, gardés en élevage et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent deux injections sous-cutanées d'hormones pour induire la reproduction, geste pouvant provoquer une blessure ou une réaction cutanée. Le projet étudie les mécanismes évolutifs de grenouilles aquatiques, les femelles étant induites à pondre de nombreuses fois sur une vie longue. Le porteur affirme que la fécondation in vitro est la seule méthode pour obtenir des embryons en nombre, tout en indiquant explorer des lignées cellulaires pour éviter des mises à mort.
Objectifs
L’évolution des espèces met en jeu des mécanismes qui agissent à des niveaux biologiques différents : génétiques, cellulaires, comportementaux etc Notre projet cherche à mieux comprendre certains de ces mécanismes qui sont à l’œuvre chez les amphibiens, un groupe d’animaux vertébré comme l’homme. Un aspect central des recherches pour ce projet porte sur la génétique des amphibiens, la génétique de leur développement embryonnaire et l'écologie moléculaire en particulier au travers de l'étude des microbiomes d'amphibiens. Ces sujets sont développés depuis plusieurs années dans le laboratoire et font l’objet de collaborations scientifiques internationales.
Bénéfices attendus
Les travaux réalisés devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes génétiques de l'évolution des amphibiens anoures, et de comprendre l'impact de l'environnement sur leurs caractéristiques génétiques. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes évolutifs liés aux changements du nombre de chromosomes chez ces amphibiens.
Procédures
L'intervention consistera en deux injections sous-cutanées dans la région dorsale et postérieure du tronc avec contention de l'animal vigile. La durée de chaque procédure d'injection est d'environ une minute. Les deux injections doivent être réalisées à 72h d'intervalle.
Impact sur les animaux
La procédure d'injection sur l'animal vigile en contention peut entraîner une blessure de l'animal avec l'aiguille, avec possibilité de saignement. Une réaction cutanée ou systémique à l'injection de la solution d'hormone peut également appararaître.
Devenir
Les animaux adultes seront maintenus en élevage.
Remplacement
Pour notre projet, l’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité car la reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces. Des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En revanche nous explorerons la possibilité d'obtenir des lignées cellulaires des différentes espèces étudiées afin d'avoir une source de matériel biologique ne nécessitant pas l'euthanasie d'animaux.
Réduction
La réalisation de notre projet implique notamment l'injection d'hormone chez des femelles xénopes adultes pour la production d’ovocytes afin d’obtenir des embryons. Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés, nous prenons en compte que i) Les femelles, ayant une période reproductive longue (15 ans), peuvent être induites à pondre de nombreuses fois; ii) les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles mis à mort; iii) nous réalisons des fécondations naturelles évitant le sacrifice du mâle à chaque fois que c'est possible.
Raffinement
Dans le but de réduire la douleur, souffrance ou angoisse, nous utilisons des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123. Nous appliquons des points limites stricts et spécifiques aux amphibiens. L’utilisation des femelles et des mâles se fera par roulement tous les quatre mois permettant le renforcement positif lors des manipulations. Nos conditions d’élevage sont régulièrement améliorées en fonction de nos connaissances sur l’écologie et la biologie de nos espèces mais aussi en fonction des connaissances sur le bien-être, le comportement et l’éthologie des espèces aquatiques qui se diffusent dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Nous disposons des génomes pour les deux espèces (X.tropicalis et X.laevis) et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain : 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs orthologues chez le xénope. Par ailleurs, ces espèces sont faciles à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. X. tropicalis est diploïde avec un temps de génération plus court que X. laevis. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont couramment utilisées. Nous utilisons des animaux aux stades adultes car c'est le seul stade de développement permettant leur reproduction sexuée. La reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces.
XENOGREEN : Interactions entre amphibiens autochtones et amphibiens exotiques envahissants : impacts du xénope sur les populations de grenouille verte
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Xénopes : 436
872 amphibiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les grenouilles vertes relâchées et les xénopes tués. Des adultes capturés dans la nature reçoivent une injection d'hormone sous anesthésie pour obtenir des pontes, puis les têtards sont soumis à des tests de comportement face à un prédateur, en cages flottantes ou en mésocosmes. Les 436 grenouilles vertes et leurs têtards sont relâchés, tandis que les 436 xénopes et leurs têtards reçoivent une surdose d'anesthésique, cette espèce classée envahissante ne pouvant être remise dans le milieu. Le porteur présente l'étude comme utile à la conservation de la grenouille verte, quasi menacée, et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'observation directe des interactions.
Objectifs
L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs et/ou prédateurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une vingtaine d’années dans les mares, cours d’eau et rivières. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouilles vertes et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouilles vertes seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront soit placés en cages flottantes dans une mare, soit en mésocosmes placés en laboratoire. Dans les deux situations, les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densités différentes (1 et 3 têtards.L-1). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.
Bénéfices attendus
Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de xénope induirait des comportements anti-prédateurs. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides du Maine-et-Loire.
Procédures
Le transport durant 30 minutes sera assuré dans une double boite réduisant les risques de chocs. Femelles et mâles seront injectés d’hormones pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Avant l’injection, les amphibiens seront anesthésiés dans un bain de sédatif (endormissement en 15 minutes, réveil en 10 minutes). Après l’accouplement et l’ovulation, les œufs seront laissés dans les bacs et les adultes seront déplacés dans un autre mésocosme avec les mêmes conditions environnementales. Une partie des têtards obtenus (n=250 têtards de grenouilles vertes et n=250 têtards de xénopes) seront répartie dans les cages flottantes dans la mare et une autre partie des têtards obtenus (n=180 têtards de grenouilles vertes et n=180 têtards de xénopes) seront répartis en mésocosmes sous conditions contrôlées. Ces têtards élevés en milieu contrôlé seront au bout de trois jours (stade 25) passés en tests de comportement. Ces tests seront au nombre de trois (avec 48h entre chaque test), deux face à un prédateur (xénope adulte et grenouille verte adulte) et un face à un contrôle (grenouille en plastique). Les tests seront filmés et dureront 30 minutes (15 minutes d’acclimatation puis 15 minutes de test). Chaque groupe expérimental passera une fois le test dans chacune des trois conditions. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards seront replacés dans le milieu naturel pour les grenouilles vertes après avoir été pêchés de leur bac d’élevage, placés dans une double boite de transport puis rapportés sur leur site d’origine après 30 minutes de transport. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront en revanche placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des xénopes adultes.
Impact sur les animaux
Il est envisageable qu’un individu soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et par conséquent développe une maladie. L’effet indésirable le plus probable est le stress lié au transport et aux conditions d’hébergements. De plus, à leur arrivée dans le laboratoire, certains animaux pourraient ne pas s’acclimater à leur environnement.
Devenir
Les six grenouilles vertes adultes et les 180 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les six xénopes adultes et les 180 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie en balnéation car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante. Les 250 têtards de xénope placés dans les cages seront après métamorphose mis à mort avec une surdose d’anesthésiant et les 250 têtards de grenouille verte après métamorphose seront libérés dans la mare.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie, la croissance et le comportement des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur et d’un prédateur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition et face à la prédation car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.
Réduction
Les trois couples de grenouilles vertes et les trois couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et trois femelles et trois mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs et donc la quantité de têtards nécessaire pour l’expérimentation en cages flottantes et en mésocosmes. Pour l’étude sur les têtards en mésocosmes, les trois réplicats par modalité (grenouilles vertes ; xénopes ; grenouilles vertes – xénopes) sont le minimum pour obtenir des résultats statistiques viables (modèle linéaire permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés). Par ailleurs, la densité de têtards (3 têtards.L-1), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.
Raffinement
Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (au-delà des seuils précités), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie en balnéation avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en mésocosme, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu jusqu’à ce que la qualité d’eau revienne aux seuils exigés ci-dessus. Enfin, les tests de comportement seront toujours précédés d’un temps d’acclimatation (15 minutes) au dispositif afin que les individus puissent revenir à un taux d’activité normal après le transfert des mésocosmes vers le dispositif de test. Il est prévu également un repos de 48h entre chaque test. Le bien-être sera évalué par une grilles déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).
Choix des espèces
Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières de Maine-et-Loire. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie.
Réalisation d’injection en vue de fécondation in vitro sur l’espèce Xenopus laevis dans le cadre de la formation aquatique niveau concepteur
- Formation professionnelle
30 xénopes femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réutilisées pendant plusieurs années selon un cycle de quatre à six mois. Chacune reçoit dix à quinze injections d'hormone ou de solution physiologique sur cinq ans pour déclencher la ponte, lors de séances de formation aux techniques sur espèces aquatiques. Le porteur affirme que les femelles ne montrent aucun signe de douleur et que la qualité des œufs témoigne de leur bien-être. Il indique que la fécondation in vitro, qui suppose la mise à mort d'un mâle, restera optionnelle pour éviter de sacrifier un mâle à chaque session.
Objectifs
L'objectif du projet est de permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques, notamment une espèce modèle d'amphibien exclusivement aquatique, le xénope. Ce projet a donc un but éducatif, puisqu'il permet d'expliquer la mise en reproduction des xénopes en laboratoire. Il est à noter que les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie "Procédure faiblement invasive : théorie et pratique", illustrée dans ce projet.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques de stress, de maladie ou de douleur des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux (à savoir l'élevage et le maintien d'espèces aquatiques en animalerie de recherche) acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection d'hormone gonadotropine ou de solution physiologique par session de travaux pratiques. En milieu naturel, la reproduction des xénopes a lieu lors de la saison des pluies, ce qui est impossible à recréer en laboratoire. Ici, l'hormone gonadotropine va donc stimuler la ponte de façon artificielle chez les femelles. La solution physiologique n'a aucun effet sur la ponte. Sur 5 ans, une femelle xénope sera soumise à 10-15 injections d'hormones ou de solution physiologique (une tous les 4 à 6 mois). La durée d'une injection est très courte (quelques secondes).
Impact sur les animaux
La réduction du nombre d'animaux se fait par la ré-utilisation des femelles tous les 4-6 mois. Si les femelles produisent des oeufs en grand nombre et de bonne qualité à chaque injection, cela montre qu'elles ont retrouvé pleinement leur état de santé et de bien être général entre 2 injections. En effet la quantité et qualité des oeufs est le signe de bien être des animaux. Les femelles lors de l'injection sous cutanée sont placées dans le noir (avec un papier absorbant humide sur les yeux par exemple) pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (ni cris/couinement, ni débattements) lors des injections.
Devenir
Les xénopes femelles peuvent être réutilisées pendant plusieurs années, selon un cycle de 4 à 6 mois.
Remplacement
Le projet consiste en la formation des utilisateurs du modèle xénope. Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible. Le xénope est utilisé essentiellement pour ses gamètes et le suivi de développement (domaine de la génétique, biologie du developpement, biologie cellulaire). Il est donc nécessaire de pratiquer des mises en ponte, avec contention des animaux et injection (d'hormone ou de solution physiologique) afin d'expliquer les bonnes pratiques d'expérimentation sur cet animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (une femelle par trinôme de stagiaires) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions voire plusieurs années. Le fait que les femelles soient pucées permet un suivi individuel de celles-ci, afin qu'un cycle de 4 à 6 mois soit respecté concernant l'injection d'hormone. La fécondation in vitro (et donc le sacrifice du mâle) sera optionnelle ou pourra s'effectuer si besoin avec une solution de spermatozoides de l'équipe hébergeant les xénopes, afin de ne pas sacrifier un mâle à chaque session.
Raffinement
Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux et sur leur hébergement. Les animaux sont nourris avec des granulés trois fois par semaine. L’enrichissement est constitué de section de gouttières en PVC. Ces gouttières présentent l’avantage de ne pas introduire de pathologies (parasites cutanés en particulier) dans les aquariums et leur permettent de se réfugier dans ces "tunnels". L'animalerie est récente (2017) et est complètement automatisée. La composition de l'eau pH, température, salinité et conductivité) est calibrée et constante. L'injection sous-cutanée d'hormone se fait sur animal vigile et ne semble pas produire de douleur ni de souffrance chez l'individu. Lors de cette injection, les femelles sont placées dans le noir (avec un papier absorbant humide sur les yeux par exemple) pour limiter leur stress.
Choix des espèces
L'amphibien Xenopus laevis est un organisme modèle important dans la recherche en biologie depuis un demi-siècle. Sa facilité d'élevage, la documentation disponible et la large communauté scientifique en font un modèle amphibien de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, température, etc.) de cette espèce permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. En France plusieurs dizaines de laboratoires ont établi le modèle xénope dans leurs locaux, il est donc nécessaire de former les utilisateurs pour de bonnes pratiques zootechniques sur cet animal aquatique. Les femelles doivent être matures sexuellement soit des animaux agés de 2 à 8 ans (l'animal a une longue durée de vie et la qualité des ovocytes n'est pas altérée).
Etude de la régulation des divisions méiotiques de l’ovocyte chez le xénope
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
92 xénopes femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ou plusieurs ovariectomies partielles par laparotomie sous anesthésie, jusqu'à trois fois avec six mois de repos entre chaque, avant d'être tuée une fois ses ovaires entièrement prélevés, le tout étalé sur cinq ans. Les ovocytes prélevés servent à étudier in vitro les mécanismes de la division méiotique, une recherche fondamentale sur le cycle cellulaire. Le porteur affirme qu'aucune cellule ne se différencie en ovocyte in vitro et que l'animal ne peut donc pas être remplacé.
Objectifs
Le développement, la croissance et la reproduction des organismes vivants sont assurés par la division de leurs cellules. Les cellules somatiques en prolifération se divisent par la mitose. Les cellules germinales mâles et femelles, ovocytes et spermatozoïdes, se divisent par une division particulière, la méiose, qui consiste en la succession de deux divisions, la méiose I et la méiose II, sans duplication de l’information génétique. Ce processus réduit de moitié l’information génétique parentale et permet de former un nouvel individu à la fécondation par la fusion des gamètes mâle et femelle. Chez la femelle, la formation d’un ovocyte fécondable se fait dans l’ovaire lors de l’ovogénèse. Les ovocytes prolifèrent, débutent la méiose puis se bloquent en début de méiose I (Prophase I). Ils subissent alors une phase de croissance pour accumuler les acteurs développement embryonnaire et acquérir la capacité à reprendre la méiose. Au moment de l'ovulation, les ovocytes qui ont finalisé leur croissance, les stades VI chez le xénope, reprennent la méiose en réponse à une hormone, la progestérone. Ils progressent alors jusqu’en métaphase de méiose II (métaphase II) et se bloquent à ce stade pour attendre la fécondation chez les vertébrés. La progression de la prophase à la métaphase II est la dernière étape de l’ovogénèse et est fondamentale pour la reproduction sexuée. Le but de ce projet est d’élucider les mécanismes moléculaires qui régulent la méiose femelle et qui permettent donc la formation d'embryon viable après fécondation. Pour cela, nous utilisons comme modèle expérimental l’ovocyte d’un amphibien, le xénope. Les régulations méiotiques sont conservées avec les mammifères. Les ovaires de cette espèce contiennent des milliers d'ovocytes à tous les stades de l'ovogénèse. Ils sont collectés par laparotomie puis mis en culture pour analyser la méiose femelle in vitro. Notre projet est ainsi au cœur du domaine de la reproduction sexuée, du cycle cellulaire et de la fertilité chez les vertébrés. Pour ce projet, 92 animaux seront utilisés dans le respect de la règle des 3Rs.
Bénéfices attendus
L'ovocyte est un modèle de référence pour l'étude de la division cellulaire. Les découvertes de ce projet bénéficieront à la communauté scientifique internationale qui étudie la reproduction sexuée sur le court-terme. Les régulations de la méiose femelle sont conservées entre vertébrés, y compris chez les mammifères. La dérégulation des complexes Cdk1 et des Cyclines est associée à des problèmes de stérilité chez la femme. En ce sens, notre recherche pourrait avoir des retombées dans le domaine de la procréation médicalement assistée en élucidant les mécanismes de formation d’un ovocyte parfaitement fonctionnel sans lequel il n'y a pas de reproduction. A plus long terme, notre projet bénéficiera également à la communauté scientifique internationale qui travaille sur le contrôle de la division cellulaire. En effet, la méiose femelle partage des acteurs et des mécanismes communs avec ceux de la mitose, le mode de division qui assure le renouvellement des tissus et des organes. Si dérégulées, la kinase Cdk1 et les Cyclines conduisent à une prolifération cellulaire anarchique à l’origine de processus cancéreux dans l'espèce humaine. Notre recherche pourrait ainsi avoir des retombées dans le domaine du cycle cellulaire et révéler des mécanismes insoupçonnés de contrôle de la division méiotique et mitotique.
Procédures
Le prélèvement de lobes ovariens (laparotomie) est effectuée par une opération chirurgicale de quelques minutes, maitrisée depuis plus de 20 ans. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Un animal est opéré toutes les semaines (43/an). Les ovaires de Xénope ayant la capacité de régénérer les ovocytes, les femelles peuvent être opérées jusqu'à 3 fois, avec une période de repos de 6 mois entre chaque chirurgie. Un total de 92 animaux sera utilisé sur 5 ans.
Impact sur les animaux
Chaque xénope sera soumis à une ovariectomie partielle sous anesthésie générale pour une durée totale de 30 minutes. L’anesthésie n’a que peu d’effets indésirables et les animaux sont surveillés pendant toute la procédure. Pendant l'ovariectomie, les risques d’infection sont très faibles. Les instruments utilisés sont stériles et à usage unique. La chirurgie pouvant induire de la douleur post-opératoire de quelques jours, l’animal est isolé dans un aquarium et surveillé quotidiennement, y compris le week-end, pour s’assurer de son bien-être et de sa bonne cicatrisation pendant 14 jorus. Si l’animal montre des signes de souffrance (difficultés à nager ou à manger, comportement d’évitement) ou une mauvaise cicatrisation (nécrose, gonflement, hyperinflammation), il sera mis à mort.
Devenir
Les animaux sont mis à mort une fois que la totalité des ovaires est prélevée.
Remplacement
Notre équipe de recherche fondamentale étudie la méiose de l’ovocyte de vertébré en utilisant comme modèle expérimental, Xenopus laevis. Cette étude est élargie à celle plus générale des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire des eucaryotes. Notre matériel de base est donc l’ovocyte. Chez les vertébrés, les ovocytes reprennent la méiose au moment de l’ovulation et se divisent dans le tractus génital de la femelle, ce qui les rend difficile d'accès. Enfin, aucune cellule ne se différencie en ovocyte in vitro. Nous sommes donc amenés à prélever et à cultiver in vitro des ovocytes de Xénope de la prophase à la métaphase II pour étudier les différents stades de la méiose femelle. L’animal ne peut donc pas être remplacé dans le cadre de notre projet et requière l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3Rs et afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ovariectomie partielle (laparotomie) est planifiée chaque semaine et coordonnée avec l’ensemble des membres de l’équipe. Une veille bibliographique hebdomadaire est également conduite pour ne pas reproduire des expériences déjà réalisées. Les femelles Xénope peuvent être opérées plusieurs fois en respectant une phase de repos de 6 mois entre chaque chirurgie pour que l'ovaire renouvelle son stock d’ovocytes bloqués en prophase, et cela pendant plusieurs années. Cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs du projet et un total de 92 animaux sera utilisé sur 5 ans.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont acclimatés à leur nouvel environnement pendant 2 semaines. Les femelles sont surveillées tous les jours, week-end inclus, et sont maintenues dans des conditions d'hébergement parfaitement adaptées à leur bien-être (cycles jour/nuit de 12h, 19°C, eau déchlorée, filtrée et renouvelée en totalité deux fois par semaine). Leur milieu est enrichi dans les aquariums par la présence de nénuphars en plastique et de gouttières de PVC de taille différente et adaptées à la taille des animaux, ce qui leur permet de s'isoler et de se cacher. La procédure expérimentale se déroule sous anesthésie générale et l’euthanasie. elles sont pratiquées au sein de l’animalerie dans une pièce dédiée à l'expérimentation afin de ne pas stresser les animaux hébergés. L'état de santé des animaux est surveillé pour intervenir dès le moindre signe de souffrance. Une grille de score et l'utilisation de points limites adaptés (mauvaix état de la peau, desquamation, amaigrissement excessif, défauts de nage, blessure) sont prévus afin de prendre en compte d'éventuels effets inattendus et de décider de la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
L’ovocyte de Xénope est un modèle employé depuis des décennies pour analyser les mécanismes biochimiques qui régulent le cycle cellulaire et la division. Chaque ovaire contient des milliers d’ovocytes. Les ovocytes collectés sont de très grande taille (1.2 mm de diamètre) et sont manipulés individuellement pour réaliser des expériences de gain et de perte de fonction par micro-injection. Ils sont très riches en protéines pour des approches de biochimie sur cellule unique ou large échelle. Ce modèle est donc particulièrement adapté à notre thématique de recherche. De plus, les résultats ne peuvent être obtenus qu’à partir d’ovocytes bloqués en prophase qui sont localisés dans l'ovaire. Seules les femelles adultes ayant atteint leur maturité sexuelle (2 ans) sont utilisées afin d’obtenir les ovocytes bloqués en prophase de stade VI, seuls capables de réaliser la méiose femelle in vitro.
Contrôle sensoriel du développement des réseaux moteurs et de leurs coordinations
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 900 xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les groupes, ils subissent des destructions ou des lésions chimiques des organes de l'équilibre, des sections de nerf, des centrifugations de plusieurs jours ou la pose d'électrodes, avant dissection du système nerveux, pour étudier le développement des réseaux moteurs pendant la métamorphose. Le porteur décrit une gêne transitoire, l'animal lésé ne nageant plus qu'en hélice, et affirme une récupération rapide. Il indique recourir à la modélisation informatique mais juge "indispensable" d'interroger le système nerveux à chaque niveau.
Objectifs
Le but de nos travaux est de comprendre comment se construisent les réseaux de neurones impliqués dans la locomotion et comment se mettent en place leurs interactions avec les autres réseaux moteurs (notamment oculaires, posturaux et respiratoires) au cours du développement. Pour cela, nous avons choisi d’étudier un modèle d’amphibien anoure, Xenopus laevis, dont la métamorphose complète implique une refonte globale de son appareil posturo-locomoteur et des réseaux neuronaux qui le contrôlent. Ainsi, nous analysons les mécanismes qui permettent les adaptations motrices observées lors de la transformation entre le têtard et la grenouille. Par des analyses multiples et complémentaires (physiologiques, morphologiques, comportementales), nous comprendrons les mécanismes fins qui commandent à la construction du système nerveux, ainsi qu’à son fonctionnement et son adaptabilité.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet de recherche fondamentale dont l'objectif principal est de comprendre comment se mettent en place les réseaux de neurones moteurs au cours du développement et comment ces réseaux interagissent et s'adaptent pour assurer la fonction motrice la meilleure possible, quelles que soient les conditions intrinsèques ou extrinsèques à l'animal. De ces mécanismes fondamentaux d'adaptation pourront être identifiés, par la suite, des cibles potentielles de réadaptation fonctionnelle (notamment dans le cadre de lésions du système nerveux).
Procédures
* Injection de traceurs cellulaires sous anesthésie profonde - 460 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Destruction unilatérale des organes vestibulaires sous anesthésie profonde - 650 animaux - durée de l'intervention: 4 min; * Section du nerf de la ligne latérale sous anesthésie profonde - 80 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Lésion chimique des organes vestibulaires sous anesthésie profonde - 640 animaux - durée de l'intervention: 2 min; * Centrifugation - 480 animaux - durée de l'intervention variable: 10, 20 ou 30 jours; * Electromyographie (EMG): mise en place des électrodes sous anesthésie profonde - 50 animaux - durée de l'intervention: 3 min; durée des enregistrements des activités musculaires sur l'animal vigile: 20 min; retrait des électrodes sous anesthésie légère: 30 sec; * Etape finale de toutes les expérimentations, dissection complète du système nerveux sous anesthésie profonde - 1900 animaux – durée moyenne de l'intervention: 45 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont très limitées dans les protocoles que nous employons sur l'animal in vivo. Les incisions de la peau nécessaires aux lésions sensorielles et/ou l'injection de marqueurs neuroanatomiques cicatrisent extrêmement vite chez ces animaux et aucun signe d'infection n'est observé ensuite. La récupération de l'anesthésie est aussi très bonne et rapide. Seules les lésions sensorielles peuvent induire une gêne relativement importante de par une impossibilité transitoire de nager de façon normale, puisque l'animal ainsi lésé ne peut produire que des déplacements de type hélicoïdal. Néanmoins, cette gêne est très temporaire comme en attestent le retour rapide (moins de 2h pour l’hémilabyrinthectomie) à des comportements normaux (nutrition normale, déplacements spontanés, interactions normales avec les congénères…) et un taux de survie comparable aux animaux témoins. En effet, l’animal vestibulo-lésé reste capable de se déplacer librement, de se nourrir et de remonter respirer à la surface (juvénile) sans problème, et aucun signe de dépérissement particulier n'est observé en comparaison des animaux témoins qui ne subissent aucune intervention.
Devenir
Nos procédures incluant toutes une analyse électrophysiologique et/ou neuroanatomique sur système nerveux isolé in vitro, la totalité des animaux sera finalement mise à mort.
Remplacement
Pour remplacer les animaux dans nos études, nous avons recours à la modélisation informatique du comportement et/ou des réseaux de neurones impliqués afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, puisque nous réalisons une étude intégrée du développement de la fonction locomotrice (au sens large), il nous est alors indispensable d’interroger le système nerveux à chaque niveau, partant d’une analyse du comportement chez l’animal in vivo jusqu’à l’enregistrement sur système nerveux central isolé in vitro des propriétés électriques et morphologiques des neurones qui sous-tendent ce comportement.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons recours à des tests statistiques standards (t-tests, ANOVA) ou circulaires (souvent mieux adaptés aux comportements rythmiques tels que la locomotion). Le nombre d’animaux utilisés correspond au nombre minimal pour valider les résultats.
Raffinement
Tout au long de l’année, les animaux sont recueillis au stade d’embryons auprès d'une animalerie agréée et élevés dans l’animalerie xénope du laboratoire sous surveillance journalière, jusqu’aux stades développementaux d’intérêt. Les animaux ayant subis des interventions dans l’annexe de l’animalerie au laboratoire sont replacés, après 2 jours d’observation accrue (toutes les 2 heures en journée, par des personnels formés, selon une grille d'évaluation validée par le vétérinaire référent du Département), dans l’animalerie aquatique pour y poursuivre leur croissance sous contrôle journalier. Pour tous les animaux, et plus particulièrement ceux ayant subi une intervention, l’attention est mise sur les marqueurs potentiels de la douleur, bien que les interventions que nous pratiquons ne semblent pas générer de souffrance des animaux à ces stades. Toutefois, si des signes de souffrance devaient être observés chez un de ces jeunes animaux aquatiques (perte de poids, gonflement excessif, absence de réaction, perte anormale de pigmentation sont les points limites classiquement suivis), l’animal serait immédiatement retiré du protocole et mis à mort par immersion prolongée dans un bain concentré d’anesthésique.
Choix des espèces
Nous étudions la réorganisation dynamique du système nerveux et des fonctions sensori-motrices chez Xenopus, un anoure qui subit une métamorphose complète de son système locomoteur nécessitant le remodelage progressif des réseaux moteurs spinaux et supra-spinaux et de leurs afférences sensorielles. De plus, de très nombreuses études neurobiologiques ont été réalisées sur le développement du système locomoteur axial de cet animal, de l'éclosion jusqu’aux stades pré-métamorphose, nous offrant une base de données précieuses sur la structure, les propriétés fonctionnelles et la plasticité du réseau moteur qui contrôle la nage avant la métamorphose. Notons enfin que Xenopus joue depuis plusieurs années un rôle clé dans l'étude de l'organogenèse et de ses mécanismes moléculaires avec, entre autres, la production d'animaux transgéniques. Certains d'entre eux seront fort utiles, à l’avenir, pour nous aider à déterminer le rôle des afférences sensorielles dans la plasticité développementale des réseaux moteurs. Nous travaillons autour de la métamorphose, entre la fin de la période larvaire et le juvénile. En effet, c'est sur cette période que les réseaux et coordinations de type adulte se mettent en place à partir de l'organisation larvaire. Les lésions vestibulaires sont par exemple faites au stade larvaire pré-métamorphose, lorsque le système sensoriel est terminé et totalement fonctionnel et avant la mise en place des réseaux posturo-locomoteurs de la grenouille. Toutefois, certaines interventions sur les organes vestibulaires peuvent avoir lieu plus tôt, avant leur formation.
Etude des mécanismes moléculaires régulant la maturation méiotique des ovocytes de xénope.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
100 xénopes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Les femelles sont opérées jusqu'à quatre fois au cours de leur vie pour prélever des ovocytes, ou reçoivent jusqu'à six injections hormonales, avant mise à mort. Le porteur étudie les mécanismes de la division des ovocytes et justifie ce modèle par le grand nombre d'ovocytes obtenus par individu, plusieurs centaines contre quelques unités chez la femme. Il décrit l'ovocyte de xénope comme "indispensable" à son étude et situe les retombées pour la reproduction humaine à long terme.
Objectifs
Notre laboratoire étudie les mécanismes moléculaires régulant les deux divisions cellulaires qui définissent la maturation méiotique (passage d’un ovocyte immature et ovocyte mature). Nous nous intéressons en particulier aux protéines qui contrôlent le bon déroulement de la méiose et à leurs modifications post traductionnelles impliquant des protéines kinase et phosphatase. Ce modèle est propice pour cette étude compte tenu du nombre d’ovocytes qu’il est possible d’obtenir par individu (plusieurs centaines). Ce nombre est à comparer avec celui d’une souris (quelques dizaines) ou d’une femme (quelques unités). Les connaissances actuelles montrent que l’ovocyte de xénope est un modèle de choix pour comprendre comment les ovocytes des vertébrés supérieurs (xénope, souris, femme) se divisent et deviennent haploïdes avant d’être fécondables et fécondés. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de comprendre avec plus d’information et de précision les connexions entre les voies de signalisation qui conduisent un ovocyte immature à devenir la cellule essentielle avec le gamète mâle pour la formation du futur embryon.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes gouvernant la maturation des ovocytes est un enjeu majeur de la recherche fondamentale. De plus, le modèle de l’ovocyte de xénope pallie l’absence quasi totale en recherche de l’ovocyte humain. Les résultats obtenus devraient permettre à court terme d’avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces acteurs protéiques, des voies de signalisation qu’ils contrôlent et des régulations qui en résultent. A plus long terme, ils pourraient contribuer au développement de connaissances des mécanismes qui régissent la maturation méiotique des ovocytes humains.
Procédures
Le projet comporte deux procédures permettant l'obtention d'ovocytes : 1. par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes) pour obtention d’ovocytes immatures 2. par injection hormonale pour obtention d’ovocytes matures La durée de vie de ces animaux étant d’une dizaine d’années, les femelles issues de ces procédures pourront être opérées à plusieurs reprises (4fois) au cours de leur vie en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du SBEA et du vétérinaire chaque année. Un autre lot de xénope dédiée à l’injection hormonale sera injecté plusieurs fois (6fois) au cours de leur vie au laboratoire tout en respectant un délai minimum de 4 mois. Ici encore le SBEA et le vétérinaire seront sollicités pour avis et conseil.
Impact sur les animaux
Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. L’animal sera mis sous observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères. La durée de vie de ces animaux étant longue (une dizaine d'années), les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées (4 fois, en respectant un intervalle de repos de 4 mois au minimum entre chaque opération) avec accord du vétérinaire. Pour les individus injectés avec l’hormone, une procédure plus légère sera appliquée avec une surveillance de deux jours et une nouvelle injection après 4 mois minimum de repos.
Devenir
La durée de vie des xénopes est longue (une dizaine d'années). Les femelles issues du lot de la procédure chirurgie pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 4 mois entre chaque opération et après accord du SBEA et vétérinaire. Le suivi de l'animal à une fréquence journalière permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations. De plus, les animaux seront systématiquement mis "au repos" pendant 4 mois de plus au moindre doute. Les animaux âgés ayant subi 4 chirurgies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce. En ce qui concerne les individus du lot de la procédure injection, ils seront injectés 6 fois en respectant une période minimum de 4 mois. Ces animaux seront aussi gardés sous surveillance journalière. Au moindre doute, l’animal sera écarté et traité individuellement afin qu’il retrouve un état normal. A la fin de la 6éme injection, l’animal sera mis à mort en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.
Remplacement
L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude fonctionnelle de régulateurs de la méiose. Ces ovocytes sont de grosses cellules (1mm de diamètre) et leur taille permet une manipulation aisée. Ils peuvent être micro-injectés par de nombreuses protéines, Morpholinos, Anticorps dont les effets sont ensuite facilement caractérisables et analysable grâce, entre autres, à des méthodes biochimiques. De plus, cette cellule étant biologiquement proche des ovocytes de souris et humains, les voies de signalisation caractérisées pourront s’avérer importantes pour aborder une étude de la méiose des ovocytes humains. D’autres alternatives à l’utilisation des ovocytes immatures de xénope ont été envisagées en utilisant à chaque fois que cela était possible les ovocytes pondus. En effet, ces ovocytes pondus sont obtenus après injection de l’hormone. Toutefois, le stade cellulaire des ovocytes obtenus par chirurgie est différent de celui obtenu après injection hormonale et il est impossible de réaliser la totalité des expériences sur les ovocytes pondus. Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour notre étude.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs de l’équipe de recherche seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (6 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Nous pourrions également envisager de mutualiser les opérations avec d'autres Etablissements Utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 2000 ovocytes qui peuvent être conservés plusieurs jours suivant l'étude).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre de ce projet: 1. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 40 à 50 individus (xénopes pour injection hormonale) et 4 à 6 individus (xénopes pour la chirurgie) (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) 2. en laissant à leur disposition des refuges (tuyaux à plusieurs entrées/sorties) dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. 3. Enfin, une attention particulière sera accordée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier des zootechniciens personnalisé de l'animal opéré. 4. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal dans un bac à faible densité (puçage sous-cutanné pour l'identification de l'animal). 5. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques, les statuts sanitaires) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux. Nous nous baserons sur notre grille de score qui mentionne les points limites et les actions à mener.
Choix des espèces
L’ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 50 ans comme modèle de choix dans l’étude des mécanismes impliqués dans les problématiques de cycle cellulaire et de développement embryonnaire. Ces ovocytes permettent de réaliser des études fonctionnelles car ils sont capables d’évoluer, hors de l’ovaire, du stade immature à celui de mature. Ce processus peut être perturbé par la micro-injection de protéines, ARNm, Morpholinos, Anticorps capables de mettre en évidence la fonction de la protéine ciblée. Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire. Les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser par les utilisateurs formés. Les injections d’hormones pour obtenir les œufs pondus sont aussi facilement réalisables. Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans.
Programmation et reprogrammation épigénétique du destin cellulaire chez Xenopus Laevis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Chaque semaine, une femelle xénope est mise à mort pour le prélèvement de ses ovaires et un mâle pour celui de ses testicules, soit environ 250 de chaque sexe sur le projet. 600 xénopes, des amphibiens, vont être utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère ou sans réveil, et une centaine de femelles reçoivent tous les six mois deux injections d'hormones pour pondre, sans nourriture la veille, avant d'être réutilisées. Le porteur affirme que les xénopes "subissent uniquement des injections" et décrit des "effets modérés", pour un projet déclaré de souffrance légère. Il évoque aussi l'amputation de membres in vivo pour étudier la régénération, alors que son décompte des 600 xénopes ne comprend que les pondeuses et les individus tués pour leurs organes.
Objectifs
Le projet vise à décrire les mécanismes épigénétiques permettant la programmation et la reprogrammation du destin cellulaire. Nous abordons trois questions en relation avec cette thématique. 1-Dans quelle mesure les modifications associées aux histones retenues dans le spermatozoïde contribuent a la régulation du développement embryonnaire précoce ? Pour cela nous décrivons le paysage épigénétique du spermatozoïde par des techniques de ChIP-seq quantitative puis évaluons l’effet de perturbation de ces instructions épigénétiques paternelles sur le développement de l’embryon. 2-Quels sont les mécanismes épigénétiques qui stabilisent le destin des cellules somatiques ? Nous réalisons des expériences de clonage au cours desquels un embryon est généré par transplantation du noyau d’une cellule différenciée dans un œuf énucléé. Le développement d’un tel clone est limité par des verrous épigénétiques présent au sein de la chromatine de la cellule donneuse. Pour identifier ces mécanismes de stabilisation du destin cellulaire, nous désactivons des voies épigénétiques de la cellule différenciée et évaluons si cela réduit la résistance a la reprogrammation par les composantes de l’œuf (ce traduisant par une amélioration du clonage). 3-Quels sont les mécanismes moléculaires et cellulaires qui gouvernent les processus de régénération ? Nous tirons bénéfice du fait que les têtards de Xenopus Laevis présentent des capacités de régénération (queue, pattes) qui varient au cours du développement pour réaliser des études comparatives permettant d’identifier les processus moléculaires et cellulaire associées a un bon déroulement de la régénération. Nous focalisons nos études sur l’influence du système immunitaire dans la réponse régénérative.
Bénéfices attendus
Notre recherche fondamentale a pour objectif de mieux comprendre des mécanismes moléculaires et cellulaires dont la compréhension a un fort potentiel pour la santé humaine : 1- Compréhension des mécanismes de transmission d’information épigénétiques entre générations. Une meilleure description/compréhension de ces mécanismes, en particulier de la possibilité que la lignée germinale male puisse transmettre à la descendance l’effet de l’exposition paternelle a l’environnement peut aider à orienter les politiques de santé publique. 2-Compréhension des mécanismes stabilisant le destin cellulaire. Un déséquilibre de ces mécanismes peut contribuer a des pathologies chez l’homme (déstabilisation dans le cas de cancer par Example). 3- Le déchiffrage des processus permettant la régénération, très efficace chez le Xenope, peut identifier des voies moléculaires et cellulaires a cibler pour améliorer les processus régénératifs chez l’homme.
Procédures
Les animaux subissent uniquement des injections d'homones. Pour les femelles il sagit de deux injections en sous-cutannee espacees de 2 a 7 jours , repetees tous les 6 mois. Les animaux sont manipulés pour moins de une minute: prelevement du bac d’elevage pour immobilisation sur paillasse humide suivie d’injection (quelques secondes) puis retour en bac de ponte.
Impact sur les animaux
Les procédures decrites ont des effets modérés sur les animaux. Il s’agit uniquement d’injection sous cutanées d’hormones pour stimuler la ponte. L’injection sous-cutanée ne provoque pas de saignement et n’induit pas de douleurs pour l’animal. Le produit injecté n’est pas toxique pour les animaux. Par précaution les animaux soumis à injection ne sont pas nourris le jour précédant, car les injections provoquent quelques fois des phénomènes de regurgitations
Devenir
Apres stimulation de la ponte les femelles sont mise au repos puis reutilisees ulterieurement pour de nouvelles pontes. Ceci permet d'obtenir regulierement des oeufs de bonne qualite tout en lilitant le nombre d'animaux utilises. Dans le cas des prelevements d'organes, les animaux sont mis a mort.
Remplacement
Il n’y pas d’alternative actuelle a l’utilisation d’animaux pour l’obtention de cellules germinales fonctionnelles. Les efforts actuels, chez la souris en particulier, de production de cellules germinales in vitro à partir de cellules souches ne permettent pas d’atteindre des cellules pleinement différentiées. L’utilisation de dérivés de cellules souches mimant le développement embryonnaire précoce n’est également pas une option car nous nous intéressons a l’influence de l’épigénome de la lignée germinale sur le déroulement du développement embryonnaire précoce. Cependant, les études de la spermatogenèse en cours dans notre laboratoire nous amène a développer un modèle de spermatogenèse Ex-vivo qui pourrait conduire á la mise en place d’un protocole de spermatogenèse in vitro, réduisant ainsi l’utilisation de males.1
Réduction
Les pratiques pour réduire l’utilisation des animaux dans notre laboratoire sont les suivantes : 1-Mutualisation des animaux utilisés : Étant donne l’abondance des œuf/ovocytes produits par une femelle, le matériel produit permet dans la majeure partie des cas la réalisation d’une multitude d’expériences. En conséquence, la planification de l’utilisation des animaux est optimisée pour accommoder les besoins du plus grand nombre possible d’expérimentateurs. 2-Reutilisation des animaux : Les femelles utilisées pour la ponte sont réutilisées suite à une période de repos. 3-Optimisation de l’utilisation des testicules pour les fécondations in vitro. Les testicules issus d’un males peuvent être utilisées pour réaliser plus de 10 fécondations in vitro. La durée de stockage de ces testicules est de 15 jours. En conséquence les expériences impliquant les FIVs sont regroupées dans le temps afin de maximiser l’utilisation des testicules et limiter le nombre de males sacrifiés. 4-De la même façon nous avons optimisé l’utilisation des ovaires en améliorant les conditions de d’utilisation des organes prélevés. Les ovocytes sont dissociés par une solution enzymatique, tries manuellement, puis stockes a 14 degré dans une solution contenant des antibiotiques. Chaque jours, une élimination des ovocytes défectueux et un renouvellement du milieux de culture permet d’étendre la survie de ces cellules au-delà d’une semaine. La détermination du nombre d’animaux utilisés est basée sur les calculs suivants : Nous envisageons l’utilisation de ~350 femelles et de ~ 250 males Xenopus Laevis. L’utilisation se décompose en 3 modes : 1/Animaux réutilisés au cours du projet : Les femelles sont utilisées par lot de 2 pour la ponte. Deux pontes par semaine en moyenne >soit environ 200 pontes par an> 100 femelles (les femelles sont induites pour ponte tous les 6 mois). 2/ Prélèvement d’ovaires. Sacrifice d’une femelle par semaine pour prélèvement d’ovaires > ~ 250 femelles 3/ Prélèvement de testicules. Sacrifice d'un male par semaine pour prélèvement de testicules et purification de cellules germinales > ~250 males
Raffinement
Un nouveau protocole de stimulation de ponte a été testé permettant l’utilisation d’une même femelle pour deux pontes successives espacées de 1 a deux semaines, l’animal étant ensuite mis au repos pour ~3mois. Ce protocole permet d’obtenir deux fois plus d’œufs, de qualité comparable, a partir d’une même femelle, réduisant ainsi le pool d’animaux utilse2 pour la ponte. Pour les expériences de régénération nous avons mis au point une protocole de régénération ex-vivo qui permet de recapituler certaines étapes de la régénération d’un membre. Ce protocole permet d’étudier la régénération après euthanasie, réduisant ainsi la souffrance de l’animal. En outre il permet d’amputer les deux membres d’un animal plutôt qu’un seul lorsque les études sont réalisées in vivo.
Choix des espèces
Les espèces ont été choisie en raison de l’abondance, de l’accessibilité du matériel biologique étudié (ovocytes, spermatozoïdes, embryons). Ce modèle permet la réalisation a grande échelle d’expériences de clonage, d'• Injection Intracytoplasmic de spermatozoide (ICSI), et de production d’embryons haploïdes. Enfin il présente des caractéristiques uniques de la spermatogenèse (remodelage partiel des nucléosomes) permettant des analyses épigénétiques qui ne sont pas possibles dans d’autres modelés animaux tel que souris, zebrafish, drosophille, ou le nématode Caenorhabditis Elegans. Une autre caractéristique cruciale de ce tétrapode est l’existence d’une période étendue (8 division cellulaire) entre la fécondation et l’initiation de la transcription du génome zygotique. Cette caractéristique est cruciale pour l’étude de la transmission des caractères epigenetiques dérivés de la lignées germinales. En effet cette fenêtre temporelle de 8 cycle cellulaires permet par example de perturber la transmission des marques epigenetiques derivées du spermatozoide et d’en etudier l’impact sur l’activation des genes zygotiques. Enfin l’abondance des œufs permets la production d’extrait qui peuvent etre utiliser pour identifier les facteurs maternelles impliques dans la reconaissance/propagation des signaux epigenetiques issus du spermtozoide. Les animaux sont sexuellement matures, soit >= 1 an chez Xenopus Laevis
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
Autres poissons : 60
216 animaux aquatiques (xénopes, poissons-zèbres, carpes koï) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée à l'issue, d'autres adoptés ou réutilisés d'une session à l'autre. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone puis un massage abdominal pour prélever des ovocytes, les poissons-zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire, le tout lors de travaux pratiques de formation. Le porteur présente ces séances comme une obligation réglementaire et emploie surtout des animaux "de réforme". Il affirme que le remplacement des animaux vivants est "impossible" pour la pratique, tout en l'évoquant pour la théorie.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séance, les expérimentateurs maitriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.
Impact sur les animaux
La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation (tricaïne ou benzocaïne) limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourra it apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.
Devenir
Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (IPS, organoïdes, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années.
Raffinement
Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de miniser toute douleur potentielle. Des points limites prédictifs stricts et adaptés au projet de formation sont mis en place et appliqués dès leur seuil atteint.
Choix des espèces
Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'œufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés
Impacts directs et multigénérationnels d’obésogènes et de perturbateurs métaboliques sur le xénope tropicalis (Silurana xenopus tropicalis)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour comprendre comment les perturbateurs endocriniens contribuent au déclin des amphibiens, 4 640 xénopes tropicalis vont être utilisés sur trois générations, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. 1 500 têtards sont exposés pendant une dizaine de mois, jusqu'à l'âge adulte, à un mélange de six polluants dont le tributylétain et le triclosan, et 1 500 autres forment le groupe témoin. Pour les tests de glycémie, 400 xénopes sont piqués au doigt toutes les heures pendant six heures, 200 sont tués trente minutes après une injection de glucose, et les mâles stimulés aux hormones pour la reproduction sont tués deux heures après la seconde injection. Le porteur écrit que l'exposition peut entraîner "une surmortalité ou des malformations", et qu'"il n'est pas possible d'évaluer le degré de souffrance" qu'elle engendre. Les données doivent selon lui aider les décideurs à protéger les amphibiens sauvages, et chaque xénope des trois générations est mis à mort.
Objectifs
Des études récentes suggèrent que les effets métaboliques transgénérationnels induits par les perturbateurs endocriniens (PE) sont des facteurs impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant leur capacité à se reproduire. Cependant, plusieurs questions se posent : Comment les PE agissent chez les amphibiens ? Quelles sont leurs effets sur les autres axes endocriniens ? Quel parent transmet l’effet à la descendance ? Quels sont les mécanismes responsables de la transmission des effets sur plusieurs générations ? Ce projet répondra à ces questions en étudiant les effets d’une mixture de 6 PE à concentrations environnementales sur 3 générations de X. tropicalis (F0 directement exposée, F1/F2 non exposées). Les effets seront évalués à chaque génération par l’étude du développement, des effets reproducteurs, thyroïdiens et neuro-développementaux, des perturbations métaboliques et de la transmission des effets entre générations.
Bénéfices attendus
D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de la transmission des effets au cours des générations et de l'écotoxicologie. Les informations sur l'impact transgénérationnel des PE chez les vertébrés font défaut et les méthodologies d'exposition des animaux à de faibles concentrations de polluants tout au long de leur vie doivent être testées. Ce projet permettra de comprendre quel sexe transmet les effets des PE à la descendance. D'un point global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Les amphibiens représentent une proportion élevée de la diversité des espèces mondiales et sont largement répandus. Plusieurs études ont démontré que plus la biodiversité des amphibiens est grande dans les zones humides, plus l'écosystème est protégé contre les maladies, y compris celles qui touchent les humains. En fournissant des résultats sur les effets transgénérationnels métaboliques des PE, les données obtenues peuvent être appliquées non seulement aux amphibiens mais aussi aux vertébrés supérieurs, y compris les humains. Comme le modèle xénope partage de nombreuses voies métaboliques avec l'homme, il est de fait un bon prédicteur des effets des PE chez l'homme. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes. Un objectif important est d'identifier des biomarqueurs précoces potentiels de perturbations métaboliques qui seront applicables à différentes espèces d'amphibiens vivant dans des écosystèmes pollués. La recherche proposée soutiendra l'élaboration de politiques et de lignes directrices qui guideront la conservation des populations d'amphibiens et la gestion des PE.
Procédures
Les xénopes de la génération F0 seront exposés à un mélange de perturbateurs endocriniens (tributylétain, di-2-éthylhexyl phthalate, polybromodiphényle éther 47, triclosan, benzo[a]pyrene, et 4,4’-dichlorodiphényldichloroéthylène) du stade têtard (stade 10 de Nieuwkoop et Faber) au stade adulte pendant une génération (F0) (~10 mois). Au total 1500 têtards seront exposés aux PE et 1500 serviront de contrôles. Pour les tests de tolérance au glucose et de résistance à l’insuline, des injections sont effectuées sur animaux vigiles dans le ventre (intrapéritonéale) ou dans les sacs lymphatiques dorsaux. A la suite de ces injections des dosages de glycémie sont effectués par prélèvements digitaux toutes les heures pendant 6 heures (2 lots d’animaux, exposés et témoins, pour la génération F0 et 4 lots pour les générations F1 et F2 soit un total de 400 animaux (80 F0, 160 F1 et 160 F2). Pour les tests de sécrétion d’insuline, les xénopes subissent une injection intrapéritonéale de glucose 1mg par gramme (20 µl de volume) à T0 et sont euthanasiés 30 minutes après. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests de de sécrétion d’insuline après injection de glucose à chaque génération soit un total de 200 animaux (40 F0, 80 F1 et 80 F2). Pour la fécondation in vitro, les animaux reçoivent deux injections dans les sacs lymphatiques dorsaux d’hCG à 20 heures d’intervalle. A la suite de la seconde injection, les femelles sont laissées tranquilles dans des aquariums pour attendre la ponte qui se fait de manière naturelle environ deux heures après. Les mâles sont euthanasiés deux heures après la deuxième stimulation. Les femelles sont euthanasiées à la fin de la période de ponte. 15 mâles et 15 femelles par condition (traités et non traités pour F0 et les 4 conditions issues des 4 modalités d’accouplement pour F1 et F2) seront utilisés à chaque génération pour les accouplements en vue d’obtenir la génération suivante. Le nombre total d’animaux sera de 300 (60 pour F0, 120 pour F1 et 120 pour F2).
Impact sur les animaux
Les concentrations utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Elles ne sont pas senser induire de souffrance chez les animaux. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations mais il n’est pas possible d’évaluer le degré de souffrance engendré par l’exposition. Les prises de sang digitales pour les tests de tolérances au glucose ou de résistance à l’insuline et les injections intrapéritonéales de glucose ou d’insuline dans les sacs lymphatiques sont susceptibles d’entrainer des douleurs légères. Au stade têtard des déformations de la colonne vertébrale sont décrite comme pouvant survenir lors d’un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d’organes ou des tests métaboliques.
Remplacement
Les manipulations réalisées sur ces animaux ne peuvent pas être substituées par des manipulations sur cultures cellulaires car les effets observés sont le jeu d’actions et d’interactions entre différents organes et systèmes. Le modèle xénope pour évaluer l’effet des PE en milieu aquatique permet le « Remplacement » du modèle rongeur classiquement utilisé en toxicologie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats significatifs statistiquement (plan d’expérience élaboré avec des statisticiens). Chaque animal est utilisé pour plusieurs types de manipulation et l’utilisation des différents lots n’est justifié que par la petite taille des organes et des volumes possibles de prélèvements sanguins qui limitent le nombre de manipulations possible sur un même échantillon.
Raffinement
Les protocoles d’exposition mis en œuvre permettent de mimer les conditions du milieu (exposition par l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce genre d’exposition n’entraine pas de souffrance chez l’animal contrairement à l’injection de polluant par voie intrapéritonéale classiquement utilisée en toxicologie. Des points limites ont été définis et adaptés au modèle xénope
Choix des espèces
Le choix de l’espèce xénope tropicalis est justifiée par deux raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (~10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet des polluants sur plusieurs générations et 2) c’est une espèce dont le génome est entièrement séquencé et diploïde permettant ainsi des études transcriptomiques ou épigénétiques. C’est un modèle dont nous maitrisons l’élevage au laboratoire (certificat de capacité obtenu) et pour lequel nous avons déjà réalisé des études multigénérationnelles. Les animaux seront utilisés du stade gastrula au stade adulte mature sexuellement. Les PE agissent sur de nombreuses cibles au stade larvaire et durant tout le cycle de développement jusqu'au stade adulte mature sexuellement. Il est donc important de regarder les impacts de ces polluants à différents stades du développement des animaux.
Etude de systèmes de transport végétaux par expression en ovocyte de xénope
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
30 xénopes femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée et le reste réopéré à plusieurs reprises. Chacune subit une chirurgie de prélèvement d'ovocytes d'une dizaine de minutes sous anesthésie, répétée jusqu'à dix fois au cours de sa vie avec un intervalle minimal de six mois, pour étudier des systèmes de transport végétaux. Le porteur indique qu'une infection au site opératoire reste possible et que les femelles de plus de onze ans ou ayant subi dix laparotomies ne sont pas réveillées puis euthanasiées. Il qualifie l'ovocyte de xénope de modèle "indispensable" reconnu depuis plus de trente ans, difficilement remplaçable par des cellules en culture plus petites.
Objectifs
Notre laboratoire étudie les mécanismes permettant aux plantes de mieux répondre aux stress environnementaux liés notamment au changement climatique. Nous nous intéressons en particulier aux systèmes de transport membranaires nécessaires à l'acquisition et au transport d'eau et de minéraux par les plantes et les champignons vivant en symbiose avec les plantes. Pour nos travaux, l'utilisation d'ovocytes de grenouilles xénopes est cruciale. Ce système est reconnu depuis plus 30 ans comme modèle pour l'étude des transporteurs et canaux ioniques de plantes. Dans notre laboratoire, l'utilisation d'ovocytes de xénopes a par exemple contribué de manière déterminante à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des canaux potassiques végétaux impliqués dans les mouvements des stomates (pores qui assurent les échanges gazeux avec le milieu extérieur et permettent la résistance des plantes au déficit hydrique) et des aquaporines qui permettent le transport de l’eau depuis la racine. Ce projet se déroulera sur 5 ans et permettra de caractériser les systèmes de transport impliqués en combinant des approches pluridisciplinaires (génomique, biophysique, physiologie moléculaire, modélisation) pour comprendre comment les plantes coordonnent leur développement en s'adaptant aux contraintes environnementales.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes gouvernant la nutrition minérale des plantes et leur réponse aux stress environnementaux est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en Sciences des Plantes. Les résultats de nos travaux devraient notamment permettre à court terme d'avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces systèmes de transports chez la plante (conditions ioniques saturant leur activité, sélectivité, régulation de leur activité en fonction de différents stimuli environnementaux, ...), des voies de signalisation qu’ils déclenchent et des régulations cellulaires qui en résultent. A plus long terme ils pourraient contribuer au développement d’une agriculture durable, économe en ressources naturelles et respectueuse de l’environnement.
Procédures
Le projet ne comporte qu'une seule procédure permettant l'obtention d'ovocytes par chirurgie sur animal anesthésié (procédure chirurgicale simple d'une dizaine de minutes). La durée de vie de ces animaux étant longue (une quinzaine d'années en captivité, une dizaine d'années dans notre animalerie) les femelles issues de la procédure pourront être opérées à plusieurs reprises au cours de leur vie (jusqu'à 10 fois en respectant un intervalle de repos de 6 mois au minimum entre chaque opération), en s'assurant de la complète récupération de l'animal et après accord du vétérinaire chaque année.
Impact sur les animaux
Toutes les mesures seront prises pour limiter au maximum tout stress et toute douleur à l'animal lors de la procédure de chirurgie (10 min) en réduisant notamment au maximum les étapes de manipulation de l'animal pour ne pas lui causer de stress au moment de l'anesthésie et du réveil. Une infection au site de prélèvement restant possible, l’animal sera mis en observation pendant quelques jours afin de s’assurer qu'il a pleinement recouvré son état de santé avant de retourner en stabulation avec ses congénères.
Devenir
La durée de vie des xénopes est longue (une quinzaine d'années). Les femelles issues de la procédure pourront être à nouveau opérées, en respectant un intervalle de repos d'au minimum 6 mois entre chaque opération et après accord du vétérinaire. Le suivi du poids de l'animal à une fréquence semestrielle et la pesée avant chaque opération permet également de s'assurer de la bonne récupération de l'animal entre 2 opérations (5 à 10% de tolérance de perte de poids) et les animaux seront sytématiquement mis "au repos" pendant un an au moindre doute. Les animaux âgées de plus de 11 ans ou ayant subi 10 laparotomies ne seront pas réveillées à la fin de la procédure et seront euthanasiées en respectant les dispositions règlementaires propres à l'espèce.
Remplacement
L'ovocyte de xénope est un modèle de choix pour l’étude de certaines protéines végétales permettant le passage des éléments minéraux, des sucres, des hormones au travers des membranes des cellules de la plante : les canaux ioniques et les transporteurs. Les ovocytes de xénopes sont de grosses cellules (1 mm de diamètre) capables de produire en quantité importante des protéines végétales fonctionnelles sur leur membrane qu’il est ensuite facile de caractériser, notamment car la grande taille des ovocytes rend leur manipulation simple à réaliser. De plus, cette cellule étant d'origine animale, les canaux ioniques et transporteurs animaux initialement présents dans les ovocytes sont de nature clairement différente de celle des canaux ioniques et transporteurs végétaux que nous souhaitons caractériser, et il est donc aisé de distinguer les deux. Les autres alternatives à l'expression en ovocyte de xénopes ont été envisagées et nous réaliserons, quand cela sera possible et parallèlement aux expérimentations sur ovocyte de xénopes, des études sur cellules animales en culture (non humaines) et/ou végétales. Cependant, les cellules animales en culture et les cellules végétales sont beaucoup plus petites (quelques dizaines de micromètres), ce qui nécessite d'autres savoir-faire et équipements beaucoup plus délicats à mettre en oeuvre que sur ovocytes, et engendre des temps de caractérisation rallongés d'un facteur 5 à 10. Les cellules végétales possèdent de plus une paroi autour des cellules qui rend l'accès à la membrane plasmique impossible pour des mesures directes et elles ont de plus de nombreux systèmes de transport natifs actifs sur leur membrane contrairement aux ovocytes qui sont des cellules "au repos". Tout ceci rend l'utilisation des ovocytes de xénope indispensable pour étudier de façon précise les systèmes de transport végétaux.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Ainsi les besoins des utilisateurs seront regroupés pour limiter le nombre d'opérations réalisées (2-3 opérations par mois en moyenne) et à chaque procédure les ovocytes obtenus sur une xénope femelle serviront pour les lots contrôles (non-injectés) et pour les lots injectés. Il pourra également être envisagé de mutualiser les opérations avec d'autres établissements utilisateurs toujours pour réduire le nombre d'animaux opérés (chaque opération peut permettre d'obtenir plus de 5000 ovocytes qui peuvent être conservés une semaine environ pour l'étude).
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour favoriser le bien-être de l’animal dans le cadre du projet. Les xénopes sont élevées dans une animalerie agréée où elles bénéficient d'un environnement social et physique enrichi en étant regroupées par bac de 4-5 individus (ce qui autorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur besoin d'interaction) et en laissant à leur disposition des cachettes dans chaque bac. Lors de la chirurgie, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés et l'utilisation d'une alèse humidifiée permettra de maintenir une hydratation permanente de la peau. La manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre un réveil d'anesthésie sans stress en abaissant le niveau de l'eau dans le bac de réveil. Enfin une attention particulière sera apportée à ne pas isoler longtemps un animal après son opération tout en lui apportant un soin optimal qui sera poursuivi lorsqu'il aura rejoint son bac en stabulation grâce à un suivi journalier personnalisé de l'animal opéré. Ceci sera rendu possible par l'identification aisée de l'animal au vu du nombre limité d'animaux par bac. Les possibilités de raffinement supplémentaire seront explorées tout au long du projet par la structure du Bien-être animal (qui comprend un vétérinaire spécialisé dans les espèces aquatiques) et testées pour continuer à améliorer en permanence le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le système ovocyte de xénope est reconnu depuis plus de 30 ans comme modèle de choix pour l'étude des canaux ioniques et transporteurs animaux comme végétaux. Les ovocytes permettent de réaliser facilement des études fonctionnelles car ils sont capables d’exprimer de nombreuses protéines en grande quantité qu’il est ensuite aisé de caractériser. Les autres modèles de cellules animales en culture ou de cellules végétales modifiées pour éliminer leur paroi (protoplastes), sont beaucoup plus difficiles utiliser et à mettre en oeuvre notamment en raison de leur très petite taille (de l'ordre du micromètre alors qu'un ovocyte de xénope fait un millimètre de diamètre). Pour pouvoir obtenir des ovocytes, les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés d'au moins 2 ans. Les ovocytes doivent être obtenus par chirurgie et non après ponte afin que les systèmes de transport endogènes de l'ovocyte restent peu actifs (ce qui n'est pas le cas lorsque la grenouille a été stimulée par injection d'hormones pour pondre). Outre ces caractéristiques propres à l'ovocyte, le xénope est facile à élever et à maintenir en laboratoire et les opérations de chirurgie pour récupérer les fragments d'ovaires sont simples et rapides à réaliser.