Autres poissons

Exposés six mois durant à des microplastiques issus de pneus et de plastiques dits biodégradables, 1 920 médakas marins subissent jusqu'à cinq anesthésies pour être mesurés et pesés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre eux passe cinq jours isolée en bac individuel pour une série de tests comportementaux, dont un de quarante-deux minutes. Le porteur reconnaît ignorer si des effets sublétaux ou létaux apparaîtront au cours de l'exposition, et retient la mélanisation, les infections et la nage altérée comme points limites. Tous sont tués pour analyse moléculaire et histologique de leurs organes, et les tests comportementaux, qualifiés de non invasifs, ne sont jamais nommés.

Objectifs

La production et l'utilisation de matières plastiques ont considérablement augmenté depuis 1950. Les plastiques sont très divers par leur composition chimique en polymère(s) et en additifs. Dans certains cas l'usage d'objets en plastique conduit à l'émission dans l'environnement de plastique sous forme de petites particules appelées microplastiques (MP) pour des tailles de 1 à 5000 μm et de nanoplastiques pour des tailles inférieures. C'est le cas par exemple des pneus, de certaines peintures ou de produits phytosanitaires. Au-delà de ces cas, la mauvaise gestion des déchets plastiques fait que de nombreux plastiques finissent dans l'environnement où ils se fragmentent sous l'effet de contraintes physico-chimiques jusqu'à former des MP ou des nanoplastiques. Outre la diversité de composition et de taille déjà évoquées, les MP varient dans leur forme qui dépend de leur origine (e.g. fil, fragment, pellet). Les plastiques biodégradables sont apparus comme une alternative potentielle aux plastiques conventionnels avec, par définition, la propriété de se dégrader dans l'environnement et donc de limiter leur impact. Cependant leur toxicité chronique n'a jamais été étudiée, de même que leur potentiel à se fragmenter dans les organismes en raison de leur biodégradabilité justement. L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité chronique chez un poisson de MP issus de différents pneus (variant par leur composition) et de plastiques biodégradables en composteur industriel ou en milieu marin). Des MP de PS (polystyrène) serviront de référence pour des plastiques conventionnels.

Bénéfices attendus

Les recherches présentées dans cette demande s'attacheront à identifier les effets des MP sur les populations de poisson. Cela devrait à terme fournir des données scientifiques nouvelles sur les risques des MP pour les écosystèmes aquatiques et ainsi permettre de mieux réglementer leur rejet et informer le public sur les risques environnementaux associés à ce type de déchets.

Procédures

Durant le projet, les individus seront chacun soumis à un maximum de cinq anesthésies pour biométrie (mesures taille et poids). L’ensemble de l’intervention ne dure pas plus de 5 min par poisson (transfert en quelques secondes dans le bac d’anesthésie, biométrie ~1 min) puis transfert en bac de réveil où le poisson est laissé pendant quelques min pour récupérer. Un sous échantillon d'individus est également soumis à des tests comportementaux non-invasifs, à raison d’un test quotidien sauf en jour 1 où un test en groupe puis un test en individuel s’enchaînent (pour une durée totale de 14 min de test) avec une période de repos total de 24 h pendant laquelle le poisson est nourri et placé dans un bac individuel en contact visuel proche avec ses congénères. Ci-dessous est présenté le détail des durées des différents tests : - Test 1 (en groupe) (jour 1): 5 minutes - Test 1 (individuel) (jour 1) : 9 minutes - Test 2 (individuel) (jour 2) : 7 minutes - Test 3 (individuel) (jour 3) : 42 minutes - Test 4 (individuel) (jour 4, 5) : divisé en 3 “sessions”, chacune d’une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité lors d’expositions aiguës ou chroniques aux MP (microplastiques) de différentes natures ou de mélange de plusieurs polymères chez le medaka marin et d'autres espèces bien que certains défauts subléthaux soient notés tels qu’une diminution de la croissance (moindre gain de poids en comparaison aux contrôles) et une baisse de la fécondité (baisse du nombre d’œufs produits pas femelle). Cependant des expositions aux MP de pneus de différentes compositions, ou de MP biodégradables en composteur industriel ou en milieu marin n'ayant jamais été réalisées, l'apparition d'effets subléthaux voire léthaux au cours des 6 mois d'exposition est donc pour l’heure inconnue. Il est cependant possible d’observer des effets subléthaux précocément durant la période d’exposition et de rapidement mettre en oeuvre l'arbre de décision des points limites à respecter.

Devenir

En cours ou en fin de projet, les animaux seront prélevés après euthanasie pour l’analyse moléculaire et histologique des organes.

Remplacement

Le Remplacement n'est pas possible dans le cas présent car nous étudions des fonctions intégratives à l’échelle individuelle des effets des microplastiques sur les téléostéens.

Réduction

Les effectifs ont été estimés à partir d’une analyse de puissance statistique afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé dans le projet tout en conservant un effectif suffisant pour avoir des résultats fiables. L’analyse des résultats se fera grâce à des tests d’analyse de variance à 2 facteurs sur les différentes variables mesurées en incluant sexe et traitement comme facteurs fixes. Ils seront suivis de tests statistiques de comparaison multiple pour identifier les différences spécifiques entre les concentrations d’un même traitement.

Raffinement

Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés (mélanisation, infection, nage altérée) sera identifié de manière précoce. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons. Enfin, lors des mesures de taille et poids, les poissons sont maintenus en groupe jusqu’à l’anesthésie et manipulés seulement sous anesthésie.

Choix des espèces

Le médaka marin est un modèle animal qui permettra d’aborder les effets physiologiques des microplastiques de différents types sur les poissons osseux en milieu marin. L'espèce est caractérisée par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions à l’ensemble des stades de vie. Le démarrage de l'exposition dépend de la taille des MP (microplastiques) utilisés. Les animaux seront exposés à partir de 2 mois d'âge (MP de pneu) ou 1 mois d'âge (pour les autres MP) et se poursuivra durant l’ensemble de leur cycle de vie afin d’étudier la toxicité des différents MP sur les différents stades aux sensibilités différentes (croissance juvénile, maturation sexuelle). Ils seront manipulés au stade juvénile (1, 2 mois) et adulte (jusqu'à 6 mois) pour des mesures de croissance, d'évaluation de la reproduction et de comportement (maturité du système nerveux optimale) respectivement.

Piégées au verveux, anesthésiées par balnéation, ouvertes pour recevoir dans la cavité abdominale un émetteur acoustique de deux grammes et une puce RFID, puis remises à l'eau au point exact de leur capture : 200 anguilles européennes et 30 silures subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'émetteur posé sur les anguilles porte un capteur qui réagit à l'acide gastrique, de sorte que la digestion d'une anguille par un silure se lise à distance. Aucun poisson n'est tué, et le porteur affirme n'avoir jamais observé de mortalité à court terme lors des marquages précédents. Les 200 individus opérés appartiennent à une espèce classée en danger critique d'extinction, ce que le porteur donne précisément comme raison de vérifier si le silure les prédate.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier les éventuelles relations trophiques entre une espèce en danger critique d’extinction (l’anguille européenne, statut Union International pour la Conservation de la Nature) et une espèce considérée comme exotique envahissante (le silure glane, classé par le centre de ressource Espèces Exotiques Envahissantes coordonné par l’UICN et l’OFB). L’impact de cette espèce sur d’autres espèces migratrices de la même famille que les anguilles a déjà été mis en évidence, notamment chez les lamproies, les aloses et les saumons. Des relations trophiques entre silure et anguille sont donc possibles, et sont déjà souvent mises en avant par une partie de la société (pêcheurs professionnels et loisirs) mais n’ont pas encore été étayées de manière scientifique et rigoureuse. Ce projet vise donc à vérifier dans un premier temps si les silures prédatent les anguilles, et si oui à quantifier cette relation trophique dans un second temps. Pour répondre à ces objectifs, un suivi en télémétrie acoustique sera réalisé sur des anguilles et des silures. Les anguilles seront équipées avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier un événement de prédation. Des silures seront aussi équipés avec des marques acoustiques afin de donner des informations sur l’utilisation temporelle des habitats.

Bénéfices attendus

La gestion du silure doit se faire sur la base de faits scientifiques avérés et robustes. Si le silure a un effet important sur les populations d’anguilles, compte tenu du statut critique de cette espèce, il sera nécessaire de prendre en compte très rapidement des mesures afin de limiter l’expansion géographique et démographique des silures. A ce titre, il est attendu de cette étude de délivrer des informations fiables sur : - la réalité d’une prédation des anguilles par les silures ; - ce taux de prédation, le cas échéant. Ces données seront utilisées dans les plans de gestion des poissons migrateurs amphihalins dont font partis les aloses, les saumons, les anguilles, ou les mulets par exemple .

Procédures

Cette étude sera composée de plusieurs volets : - premièrement, un suivi en télémétrie acoustique avec marques à capteurs de prédation sera réalisé sur les anguilles. Ces marques sont des marques de télémétrie classiques (donc programmées pour émettre un signal ultrasonique régulièrement afin de pouvoir suivre les individus marqués dans le milieu) auxquelles un capteur supplémentaire a été ajouté. Ce capteur va réagir avec l’acide présent dans les estomacs des poissons prédateurs et il est donc possible de savoir si le poisson hôte dans lequel la marque a été placée au début a été prédaté ou pas. Les données issues du capteur sont envoyées classiquement par la marque acoustique via des ultrasons, qui sont captés dans le système d’étude par un réseau de récepteurs acoustiques. Sur cette action, 200 anguilles jaunes (plus de 40 cm) seront marquées en 4 lots de 50 individus, en avril, juillet 2024 et 2025. Ces marques seront placées dans la cavité péritonéale par opération chirurgicale sous anesthésie générale. Les marques mesureront 7 mm de diamètre, 1.5 cm de long et pèse 2 g, ce qui en théorie autorise le marquage dès 100 g soit 300 mm environ. Par mesure de sécurité, cette limite a été relevée à 400 mm. Les poissons seront ensuite suivis sur le marais de 2024 à 2026. Ces marques sont encapsulées dans une coque moulé en résine époxy de manière à ce que à l’échelle de la vie d’un poisson, aucun effet de ces marques n’a jamais été observée ou mis en évidence. A l’inverse, de nombreux poissons sont suivis des années sans montrer aucune modification comportementale. Un second émetteur de type RFID (aussi appelé pit-tags) sera introduit dans la cavité en même temps (donc n’entraine aucune manipulation supplémentaire) afin que les anguilles marquées puissent être identifiées facilement par le pêcheur. Ces marques sont de taille très réduite (moins de 2 mm de diamètre pour un dixième de gramme), et leur innocuité sur cette espèce a été déjà et fréquemment démontrée (moulage dans une capsule de verre incassable). - en parallèle, 30 silures seront marqués aussi avec des marques de télémétrie acoustique classiques, sans capteur de prédation, en suivant exactement la même procédure que pour les anguilles. Ce marquage a pour but d’estimer le taux d’occupation du marais par les silures en fonction de la saison et donc ainsi de relativiser une éventuelle prédation.

Impact sur les animaux

Comme toutes expériences en écologie comportementale, le stress lors des captures doit être pris en compte. Pour cela, pour les anguilles, seuls des verveux (grandes nasses en filet non maillant) seront utilisés pour les captures. Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Les silures seront aussi capturés avec des verveux mais adaptés à leur grande taille. Ces pièges seront aussi relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse des deux espèces (anguilles et silures) nous amène à être très confiants sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme n’a jamais été observée sur ces deux espèces. De plus, sur les anguilles, des tests d’effet à plusieurs semaines ont déjà été réalisés et n’ont jamais montré aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale, qui, dans l’état actuel des connaissances et bonnes pratiques vétérinaires, semble agir aussi comme analgésique chez les poissons.

Devenir

Le principe est de suivre les animaux dans leur milieu naturel et d’observer une éventuelle prédation des anguilles par les silures en utilisant des marques acoustiques à capteurs de prédation qui réagissent avec l’acidité des estomacs. Tous les animaux marqués seront donc replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs captures.

Remplacement

L’étude vise à étudier des relations de type Proies-Prédateurs en milieu naturel, il n’est donc pas possible de remplacer les animaux dans cette étude.

Réduction

Cette étude vise à vérifier et à quantifier (le cas échéant) le taux de prédation des anguilles par les silures. La méthode retenue est la télémétrie acoustique avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier une évènement de prédation. Cette prédation, si elle existe, pourrait être variable en fonction de la saison, les silures étant une espèce plus active au printemps et à l’été. Ainsi, l’étude doit porter sur une longue durée (36 mois) qui pourrait entrainer des pertes d’individus marqués par émigration naturelle. Ainsi, il est nécessaire d’avoir un effectif suffisant. L’ensemble du protocole, dont les nombres d’individus à marquer, a été validé par un comité de pilotage composé de spécialistes français en télémétrie. Le protocole prévoit 4 lots de 50 anguilles, soit 200 anguilles en tout. Ce nombre a été défini par le comité de pilotage en tenant compte de 1 – la taille du site ; 2 – les taux de perte (migration et prédation) attendus ; 3 – le respect de l’espace acoustique (trop d’individus marqués en même temps dans un même espace clos réduit les probabilités de détection). Ce nombre est donc l’effectif minimal qui permettrait de voir si la prédation a effet significatif sur les populations d’anguilles, compte tenu de toutes les limites évoquées ci-dessus. C’est la taille utilisée dans les études précédentes du même genre. Le protocole prévoit aussi le marquage d’un lot de 30 silures. La taille de ce lot est celle classiquement utilisée dans les études du même genre, et permet d’obtenir des données assez robustes pour définir l’utilisation spatio-temporelle d’un habitat par une espèce.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors des captures et des marquages. La capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures des espèces concernées, ainsi que leur stress. Les pièges seront relevés tous les jours afin de limiter le temps de captivité. La pose des marques télémétriques s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de manière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygéné jusqu’à récupération complète avant relâche dans le milieu naturel. En même temps, un second émetteur, passif (RFID) et de plus petite taille, sera aussi introduit dans chaque individu afin que le pêcheur titulaire du droit de pêche sur le marais puisse vérifier que les individus péchés par la suite lors de son activité professionnelle ne soit pas des individus suivis. Cette marque sera placée au même endroit que la marque acoustique. En cas de capture d’un individu marqué, le pêcheur aura l’obligation de le remettre immédiatement à l’eau. Après marquage, chaque individu est gardé dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant, puis remis à l’eau à l’endroit exact de la capture.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animal en danger critique d’extinction. Toutes les mesures visant à alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide. Les espèces exotiques envahissantes, et notamment le silure, sont une pression déjà identifiée sur certaines espèces migratrices comme les lamproies, les saumons et les aloses. L’impact sur les anguilles est donc possible et cette étude servira à démontrer l’effet (ou non) des silures sur les anguilles. L’étude portera sur les anguilles jaunes, le stade sédentaire de croissance des anguilles européennes, et sur les silures adultes de plus de 3 ans (30-40 cm). L’impact du silure sur la phase migratrice des anguilles (anguilles argentées) a déjà été réalisé. Ce projet vise quant à lui à étudier l’impact sur la phase de croissance sédentaire.

Certains poissons subissent une montée de la température de l'eau jusqu'à perdre l'équilibre, pendant deux heures au maximum, pour déterminer leur température critique. 2 000 chevaines et spirlins pêchés dans le Rhône vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 800 tués pour l'analyse de leurs cellules et 200 relâchés sur leur lieu de capture. Chaque individu est anesthésié pour être marqué, puis à chaque transfert entre bassins, et reste isolé jusqu'à vingt-quatre heures dans un tunnel de nage. Le porteur inscrit ce travail dans un objectif de conservation des espèces du Rhône, et mentionne 800 poissons supplémentaires tués sans expérimentation préalable, qu'il choisit de ne pas comptabiliser dans le tableau récapitulatif.

Objectifs

Une augmentation de la température environnementale peut entraîner des conséquences dramatiques sur les organismes, notamment chez les animaux ectothermes, dont la température corporelle dépend directement de la température ambiante. Ce projet vise à comprendre comment les poissons d’eau douce vont réagir face au réchauffement global. En effet, une augmentation de la température de l’eau entraine une augmentation des dépenses énergétiques des organismes, ayant pour conséquences directes une diminution de la croissance et de la reproduction. Depuis plusieurs années, le réchauffement de la planète est un phénomène qui s’accélère et donc les organismes doivent mettre en place des mécanismes adaptifs plus rapidement s’ils veulent survivre. Pour ce qui est des réponses à la contrainte thermique, 2 principales hypothèses se dégagent : (1) les individus vivant dans des milieux relativement chauds pourraient être plus résistants et mieux adaptés au réchauffement et aux périodes de stress thermique par rapport aux individus vivant dans des milieux plus frais ou (2) le fait de vivre dans des conditions thermiques suboptimales pourrait rendre les organismes ectothermes plus sensibles aux stress subséquents. Cette étude a pour but de définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation à long terme et/ou d’acclimatation plus rapide face à une augmentation des températures. Afin de pouvoir étudier ces réponses physiologiques, deux espèces de poissons seront utilisées comme modèles expérimentaux : le Chevaine, espèce eurytherme présente partout dans le Rhône et le Spirlin, espèce plus abondante en aval des centrales nucléaires productrices d’énergie (CNPE), là où l’eau est plus chaude. Cette zone plus chaude pourrait être considérée comme une condition future étant donné le réchauffement actuel. Donc, étudier les différences d'adaptation entre les populations en amont et en aval s’avère pertinent. Le projet se fera le long du Rhône selon un gradient nord sud et donc les échantillonnages se feront sur 5 sites ; Brégnier-Cordon (nord), en amont et en aval de la CNPE du Bugey, et en amont et en aval de la CNPE du Tricastin (sud) afin de pouvoir comparer les capacités d’acclimatation et les préférences thermiques des différentes populations selon leur lieu d’origine.

Bénéfices attendus

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur la physiologie des poissons d’eau douce est au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs. Ce projet s’inscrit directement dans cet axe d’intérêt, et les résultats obtenus permettront notamment de donner des réponses concrètes sur les effets d’une augmentation de température de l’eau afin de réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques. Cette étude va définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et potentiellement permettre de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation et d’acclimatation face à une augmentation des températures. De plus, comme nous travaillons sur une espèce eurytherme (chevaine) et une que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques (spirlin), si ces poissons ont du mal à s’adapter au réchauffement des températures alors nous pouvons supposer que cet échauffement entraînera des conséquences d’autant plus délétères pour des poissons qui supportent moins bien le réchauffement et les variations de température. Donc, ce projet a non seulement un but de caractérisation des adaptations à la température, mais aussi un but de conservation d’espèces plutôt endémiques du Rhône. Le protocole de CTmax permet de définir la température maximale de tolérance thermique, qui n’a jamais été documentée pour les deux espèces étudiées ici. Les protocoles de mesures croisées (répétition de 3 performances de nage à 3 différentes températures) sont indispensables pour élucider les mécanismes d’acclimatation et les réponses aigues aux différentes températures, et le métabolisme énergétique pourra être ainsi abordé selon une double approche in vitro et in vivo. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes adaptatifs mis en place chez différentes populations de poissons distribuées selon le gradient naturel « haut-Rhône » froid et « bas-Rhône » plus chaud d’une part et selon l’amont ou l’aval des deux CNPE d’autre part, mettant en exergue des variations environnementales provenant directement d’activités anthropiques. Ainsi, ce projet a pour but de participer aux efforts de conservation de la biodiversité et via une connaissance accrue des capacités d’adaptation de ces espèces, permettant de mieux appréhender comment ils pourraient réagir face au changement climatique.

Procédures

Suite à leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (2 jours à 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Certains poissons subiront une augmentation de la température de l’eau jusqu’à perte d’équilibre (3h). Certains poissons seront mis à mort après une stabulation courte à l’animalerie. Certains poissons subiront des tests de préférence thermique (12h) puis 3 tests de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

200 individus seront replacés en liberté sur leur lieu de capture. 800 poissons seront euthanasiés sans expérimentation préalable et seront utilisés post-mortem pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro. 1800 individus seront euthanasiés pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. En effet, une forte variabilité interindividuelle est attendue du fait du brassage génétique et de l’impact des différents facteurs environnementaux du milieu naturel. La taille des échantillons a été ainsi définie pour permettre une analyse statistique fiable. Pour ce qui est de la procédure expérimentale pour obtenir la température critique maximale (CTmax), minimum 20 poissons par endroit d’échantillonnage sont nécessaires car comme expliqué ci-dessus, une forte variabilité interindividuelle peut entrer en jeu. Donc 5 endroits x 2 espèces x 20 individus = 200 poissons pour la CTmax au total. Pour les mesures de bioénergétique sur populations naturelles, il y a 5 endroits x 4 saisons x 2 pêches /an x 1 espèce (uniquement les spirlins) x 20 individus = 800 individus. Mais au vu de la courte durée de stabulation au sein de l’EU, ces individus utilisés uniquement post-mortem ne seront pas comptabilisés dans le tableau récapitulatif. Pour ce qui est de la procédure d’acclimatation à la température, 1800 poissons seront utilisés, soit 1200 spirlins (5 endroits x 2 pêches/an x 2 ans x 20 individus x 3 groupes) et 600 chevaines (5 endroits x 1 pêche/an x 2ans x 20 individus x 3 groupes) ; 200 poissons supplémentaires sont prévus afin de palier d’éventuelles morts spontanées.

Raffinement

Lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage, avant le protocole de nage (Ucrit) ou de 2h dans les arènes de choix. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevaines juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 30 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement est observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le chevaine est une espèce plutôt ubiquiste du Rhône, généraliste et eurytherme avec un panel de tolérance thermique large. Le spirlin est une espèce que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques ce qui laisse supposer une bonne adaptation à des variations de températures. L’étude de cette espèce dans des environnements thermiques élevés permettra d’évaluer précisément ses capacités d’acclimatation et d’anticiper l’impact délétère du réchauffement sur des espèces moins adaptatives. De plus, ces espèces sont en statut préoccupation mineure, sur la liste rouge UICN (Union internationale pour la conservation de la nature), donc les pêcher n’aura pas de grand effet sur les populations naturelles. Enfin, les organismes avec qui nous allons pêcher font des suivis de populations et sont donc au courant des statuts des différentes espèces dans le Rhône. Aucun prélèvement n’aura d’impact négatif sur les populations naturelles. Les spirlins utilisés sont des spirlins adultes. Leur petite taille (30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevaines juvéniles seront employés.

Pêchées à l'entrée des estuaires puis élevées quinze à dix-huit mois en aquarium, avec un taux de survie estimé à 30 %, 3 000 civelles sont collectées pour que 720 anguilles européennes entrent dans les procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est exposée à l'une de quatre doses de bisphénol S et reçoit, sous anesthésie, une intubation gastrique qui l'infeste d'un ver parasite se nourrissant de son sang. Elles sont tuées par groupes vingt, quarante et soixante jours après le début de l'exposition, les surnuméraires étant relâchées dans leur milieu d'origine. L'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction depuis 2008, et le porteur en tire argument pour écrire qu'il n'est pas possible de recourir à des méthodes de remplacement de cette espèce.

Objectifs

Dans leurs environnements naturels, les animaux aquatiques sont exposés à une variété de contaminants biologiques et chimiques. Parmi les contaminants biologiques, les parasites affectent par définition la physiologie de leurs hôtes, les obligeant à réallouer leur énergie pour mieux résister. Parmi les contaminants chimiques, les agents plastifiants, tels que les dérivés du bisphénol, sont des polluants émergents potentiels, présents dans les débris plastiques et les eaux usées industrielles, qui contaminent l'environnement aquatique et induisent de multiples problèmes de santé qui nuisent à la survie des animaux exposés. Bien que de nombreuses études aient rapporté les effets de l'un ou l'autre, les mécanismes immédiats qui sous-tendent les effets néfastes induits par les parasites et les polluants organiques, agissant en combinaison, sur les organismes aquatiques n'ont pas encore été tous examinés. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur 1) un ver parasite connu pour être pathogène de l’anguille européenne, espèce sentinelle des milieux aquatiques, menacée d’extinction (depuis 2008, UICN) mais non protégée et, 2) un agent plastifiant, le bisphénol S (BPS), polluant émergent particulièrement préoccupant à l’heure actuelle car de plus en plus utilisé dans l'industrie comme alternative au bisphénol A interdit en France dans tous les contenants alimentaires depuis 2015. L'objectif premier du projet est d'étudier les effets du BPS et/ou du ver parasite sur la physiologie de l’anguille européenne afin de répondre aux questions suivantes : 1. L'exposition à des doses croissantes de BPS rend t’elle l'anguille européenne plus vulnérable au parasite supposé impliqué dans son déclin ? 2. L'infestation par le parasite diminue t’elle la capacité de l'anguille à faire face à l'effet du BPS ? Enfin, au delà de l’apport de connaissance scientifique relatif à l’étude de l’impact combiné de ces deux contaminants, notre deuxième objectif est d’étudier le potentiel du mucus cutané de l’anguille (le mucus est la 1ère barrière des organismes aquatiques face à l'environnement extérieur) pour appréhender de manière non létale l'état de santé/stress de ce poisson.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de répondre aux exigences et recommandations prévues dans les plans de gestion de l’anguille européenne à savoir : 1) améliorer les connaissances sur les mécanismes induits par une double contamination chimique et biologique des anguilles et identifier la réponse de ce poisson vis-à-vis des 2 contaminants ciblés (BPS et le ver parasite individuellement ou en combinaison), 2) développer des biomarqueurs à partir du mucus cutané de l'anguille afin d'évaluer son état de santé/stress à l'aide de méthodes qui ne nécessitent pas de tuer les animaux et, 3) évaluer la potentielle menace, actuelle ou future, induite par le BPS sur l’anguille afin de proposer des recommandations pour sa conservation (niveau seuil de BPS dans l’environnement).

Procédures

Exposition à 4 doses différentes de Bisphénol S et à une infestation unique par un ver parasite (intubation gastrique), cette dernière étant effectuée sous anesthésie. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales à 3 pas de temps après le début des procédures soit 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou infestation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables auxquels on peut s’attendre seront à priori assez réduits dans la mesure où les doses de contaminants chimique (BPS) et biologique (parasite) utilisées dans les procédures sont des doses relativement faibles et environnementales et que la durée de la procédure est assez courte (60 jours). Cependant, on peut toutefois s’attendre à une légère anémie des poissons infestés par le ver parasite qui se nourrit du sang de l’anguille ainsi qu'à de potentielles modification de comportement, réduction de vivacité ou diminution de l'embonpoint à la plus forte dose du contaminant chimique.

Devenir

Les animaux soumis aux procédures expérimentales seront successivement euthanasiés 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou contamination.

Remplacement

Ce projet visant à évaluer l’impact de 2 contaminants (chimique émergeant, le BPS, et biologique pathogène, le ver parasite Anguillicola crassus) sur la physiologie de l’anguille européenne (espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008 par l’UICN), il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.

Réduction

Le taux de survie des juvéniles d'anguille, après collecte et au début de leur mise en élevage en aquarium, estimé à 30%, ainsi que les potentiels échecs des infestations expérimentales par le parasite et/ou des contaminations chimiques nous contraignent à collecter et élever 3000 juvéniles d'anguille pour la bonne réalisation de l’ensemble du projet (720 juvéniles d'anguille feront l'objet des procédures expérimentales). En effet, la nécessité du maintien des civelles en élevage pendant 15 à 18 mois avant la mise en œuvre des procédures expérimentales sont des contraintes fortes qui imposent cette démarche. A la fin du projet, les anguillettes surnuméraires n’ayant pas fait l’objet des procédures expérimentales seront relâchées dans leur milieu d’origine.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, plusieurs mesures seront prises pour limiter inconfort, stress et souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à la fin des procédures expérimentales. La manipulation des juvéniles d’anguille sera effectuée à l’aide d’une épuisette à maille fine afin de ne pas les blesser, en pratiquant des gestes lents et délicats afin de ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide et non traumatisante. Par ailleurs, les juvéniles d’anguille étant grégaires et fuyant la lumière, des tuyaux en PVC alimentaire seront placés dans les aquariums pour que ces jeunes stades puissent s’y regrouper et s’y cacher. De même, un éclairage indirect sera privilégié pendant les temps d’éclairement afin de réduire au maximum tout stress induit par une intensité lumineuse trop forte sur les aquariums et de simuler au sein de ceux-ci des zones moins éclairées, refuges naturels pour ces animaux qui se cachent durant la journée. L’alimentation des juvéniles d’anguille sera également adaptée afin de les habituer progressivement à passer à une nourriture artificielle inerte. De plus, toutes les mesures (poids et taille) ainsi que les infestations expérimentales par le ver parasite s’effectueront sous anesthésie, optimisée pour ces jeunes stades de vie.

Choix des espèces

L'anguille européenne joue un rôle écologique majeur et revêt une valeur économique importante. Suite à la diminution drastique de sa population, elle est classée comme espèce en danger critique d’extinction par l’IUCN (2008) mais non protégée. Parmi les facteurs potentiellement responsables de l'effondrement de sa population figurent les contaminants chimiques (dont le BPS) et biologiques (parasite Anguillicola crassus, pathogène de l’anguille). Dans ce contexte de fort déclin et volonté de contribuer à sa préservation (R(CE) 1100/2007), il convient en 1er lieu de combler le manque de connaissances lié à l’impact de ces contaminants agissant en combinaison (conséquences physiologiques du stress induit). Il devient également urgent de tenter de développer un outil non létal de l'état de santé/stress de ce poisson pour en assurer le suivi en conditions naturelles (développement de protocoles non létaux inscrit dans le Plan de Gestion pour les Poissons Migrateurs 2022-2027, volet anguille). Les individus qui feront l’objet des procédures expérimentales sont des juvéniles d’anguille qui auront été maintenus en élevage pendant 15 à 18 mois après leur collecte dans le milieu naturel. En effet, nous devons collecter des individus d’une même cohorte (même âge) à leur entrée dans les eaux de transition (estuaires, lagunes…) afin qu’elles soient exemptes du parasite, dont nous voulons étudier l’impact, avant le début de l’expérience (dans les conditions naturelles, elles s’infestent dans les eaux de transition). En outre, la période d'élevage de 15 à 18 mois avant le début de l’expérimentation est nécessaire pour permettre aux anguillettes d'atteindre une taille suffisante pour être infestées expérimentalement par le parasite (intubation gastrique).

Une puce de radiofréquence de douze millimètres de long injectée dans la cavité abdominale : trois poissons clowns nés en captivité subissent cette procédure, déclarée de souffrance modérée, et sont ensuite gardés vivants dans une structure d'aquariologie. Ils sont anesthésiés par balnéation, marqués, puis placés une semaine dans un bassin de 100 litres pour vérifier que les antennes détectent bien la puce. Le porteur reconnaît un risque de complications inférieur à 5 %, comprenant inflammation de l'abdomen, infection, ulcération et perforation d'un organe interne. Ce test doit préparer le marquage de trente poissons clowns sauvages en Polynésie française, dont l'étude en milieu naturel rend selon lui l'usage d'animaux "incontournable".

Objectifs

L'objectif du projet de doctorat est de travailler sur la structure sociale des poissons clowns, qui vivent en symbiose mutualiste avec les anémones de mer. Parmi les traits biologiques généraux communs aux 28 espèces d'anémones, une caractéristique particulière est l'organisation de leur hiérarchie de taille à l'intérieur d'une colonie "classique" composée d'une anémone de mer, d'un couple monogame reproducteur et de zéro à quatre juvéniles immatures non reproducteurs. Néanmoins, d'autres types d'assemblages ont été décrits dans la littérature comme de "grandes colonies", composées de manière atypique d'agrégations de plusieurs anémones de mer dans lesquelles 2 couples au moins et des juvéniles vivent ensemble, que l'on peut trouver principalement au Japon et en Polynésie française. Le terme de "mégacolonie" a été récemment introduit pour décrire toutes les colonies à l'exception des colonies "classiques". L'organisation des mégacolonies remet en cause ce que l'on sait de celle des colonies classiques notamment en ce qui concerne la sexualité et la reproduction, la hiérarchie, les territoires et toutes les interactions entre les individus. Ce projet de thèse vise à étudier l'organisation sociale et spatiale des poissons clowns vivant en mégacolonies en Polynésie française et au Japon, en analysant le statut écophysiologique des populations de poissons clowns et les conséquences sur leur système neuroendocrinien. Dans l'objectif de répondre à la première problématique concernant l'organisation spatiale des poissons clowns, il est nécessaire de pouvoir établir un suivi de leurs déplacements au sein d'un champs d'anémones. Cette problématique sera étudiée sur les mégacolonies de Polynésie française. La turbidité élevée de l'eau à ces endroits et la surface des zones étudiées ne permettent pas un simple suivi de leurs déplacements par l'utilisation de caméras. Afin de récolter des données précises quant à leurs mouvements au sein des territoires, ce projet vise à utiliser un dispositif de télémétrie d'Identification par Radio Fréquence (RFID) avec l'implantation de puces (2,12x12mm) par injection dans la cavité abdominale des poissons clowns adultes. Les mouvements des poissons équipés de puces pourront ainsi être précisément détectés et enregistrés par des antennes reliées à des lecteurs placées au sein du champs d'anémones de mer.

Bénéfices attendus

Acquérir des mesures précises quant aux déplacements des adultes au sein des territoires du champ d'anémones de mer nous permettrait de mieux comprendre la gestion des territoires par les individus, et de mieux comprendre la hiérarchie sociale au sein des mégacolonies de poissons clowns.

Procédures

Une première phase de test est prévue en laboratoire, afin de vérifier la détection de la puce RFID (identification par radio-fréquence) par les antennes. Trois individus poisson clowns (A. frenatus) reproduits et élevés en captivité, seront anesthésiés par balnéation (MS222) et équipés d'une puce RFID et placés dans un bassin de 100L d'eau de mer artificielle en présence des antennes afin d'enregistrer leurs mouvements. Cette expérimentation est prévue sur un intervalle d'une semaine. La deuxième phase du projet consiste à utiliser ce dispositif en milieu naturel sur les mégacolonies en Polynésie française.

Impact sur les animaux

La survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID est jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm selon plusieurs études scientifiques. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité intra-coelomique ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation. Même si elles sont rares, des complications post-injection, de l'ordre inférieur à 5%, peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de l'abdomen, infection, ulcération, perforation d'un organe interne). Tous les actes pré- et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. L'absence de ces effets, et plus généralement l'absence de toute indication d'inconfort, seront systématiquement vérifiés par un examen à un et deux jours après l'injection des animaux ayant subi cette procédure, vérification d'absence d'anomalie de l'abdomen (gonflement, infection), vérification que les comportements natatoires sont normaux.

Devenir

Phase 1 : Les 3 individus seront gardés en captivité au sein de la structure d'Aquariologie de Banyuls-sur-mer. Phase 2 : Les 30 individus ayant subi successivement les deux procédures resteront dans leur milieu naturel.

Remplacement

Les mégacolonies représentent une structure particulière ne pouvant pas être reproduites en laboratoire ou modélisées. Afin d'étudier les déplacements des poissons clowns au sein de ce type de structure (deuxième phase), il est indispensable de suivre directement et précisément leurs déplacements en milieu naturel à l'aide d'un système de télémétrie. Ainsi, le modèle animal et en particulier l'utilisation des poissons clowns en milieu naturel est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer comprendre ce processus d'organisation sociale. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants par des méthodes alternatives. De fait, l'utilisation du modèle animal est incontournable.

Réduction

Toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre ont été optimisées statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs (3 individus pour la première phase de test, et 15 couples (soit 30 adultes) pour la mégacolonie durant la deuxième phase en Polynésie Française. L'approche expérimentale choisie est la plus optimale pour enregistrer les mouvements des poissons clowns tout en minimisant l'impact sur leur état physiologique.

Raffinement

Durant la première phase de test, une attention particulière sera accordée au bien être des individus via la présence de personnel compétent 7j/7j pour l'observation et le soin des animaux. Concernant la deuxième phase, pour minimiser tout stress avant anesthésie des poissons en milieu naturel, les animaux ne seront pas sortis de l'eau et seront directement anesthésiés sous l'eau à l'aide d'eugénol. Les deux marquages se feront rapidement en simultané après la capture de l'animal et celui-ci sera relâché près de son anémone de mer et surveillé pendant plusieurs minutes jusqu'à récupération complète de ses fonctions natatoires. Afin de réaliser une intervention rapide et la plus précise possible, la personne compétente réalisera plusieurs injections intra-coelomiques de puces RFID et d'injections sous cutanées d'élastomères en entraînement sur des poissons non vivants récupérés dans le commerce. De plus, la survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID a été étudiée et jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité abdominale ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation.

Choix des espèces

Depuis plusieurs années, les poissons clowns sont un excellent modèle d'étude dans les domaines de l'écologie, de l'évolution et du développement. La symbiose établie entre les poissons clowns et leur anémone de mer et en particulier l’organisation hiérarchique de ces poissons représentent un intérêt majeur pour ce projet. La structure particulière en mégacolonie n'ayant été observée jusqu'à présent uniquement chez cette famille, les poissons clowns représentent un modèle de choix pour comprendre l'organisation sociale. Afin de réduire au maximum les effets indésirables mais non délétères de l'implantation d'une puce dans la cavité abdominale d'un individu, seulement des individus juvéniles et adultes de plus de 6cm sont sélectionnés.