Autres poissons

Capturés en rivière sous autorisation préfectorale, 480 chevesnes sauvages vont être maintenus jusqu'à six mois dans des bassins extérieurs, puis tués. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger. Deux fois par semaine pendant deux semaines, chaque poisson est anesthésié pour ingérer un mélange d'herbicide, d'antidépresseur, d'antipyrétique et d'anti-inflammatoire, avant des relevés comportementaux, une prise de sang et une mise à mort permettant de compter les parasites intestinaux et de doser les polluants dans le foie, les muscles, le rein et le tube digestif. Le porteur annonce des connaissances utiles pour orienter les politiques de protection de la biodiversité, et signale que les bassins ne sont pas régulés en température, exposant les poissons à un stress thermique qui s'ajoute à celui de la capture et de la captivité.

Objectifs

La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites intestinaux sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalius cephalus infesté par des acanthocéphales. Des premières manipulations ont été d’ors et déjà réalisées. Ces manipulations ont permis de montrer que l’allocation énergétique et le comportement des poissons sont corrélés à de la charge en parasites. Ce projet vise à tester 1) les effets cocktails de l’exposition à plusieurs polluants (résidus de médicaments et pesticides), 2) les possibles effets d’acclimatation suite à une pré-exposition aux polluants et de résilience lorsque l’exposition cesse, et 3) des conséquences sur le paramètres neurotoxiques influençant potentiellement le comportement et notamment les comportements de groupe. Les composés testés sont des molécules très présentes dans l’environnement, à savoir un herbicide, un antidépresseur, un antipyrétique, et un anti-inflammatoire non-stéroïdien. Des manipulations expérimentales seront menées chez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, et exposés à des polluants dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques.

Bénéfices attendus

Nos recherches explorent une question originale : les parasites intestinaux, en capturant certains polluants, peuvent-ils apporter un bénéfice aux poissons en milieux pollués, malgré les effets négatifs du parasitisme ? Ce point est souvent ignoré en écotoxicologie, une discipline qui étudie les effets des polluants sur les organismes vivants, mais qui se limite souvent à des expériences en laboratoire sans prendre en compte les interactions entre les espèces. Contrairement aux tests classiques, nos études reproduiront les conditions réelles d’exposition aux polluants, en tenant compte des mélanges de substances et de leur accumulation au fil du temps. Nous nous intéresserons aussi aux effets sur le cerveau et le comportement des poissons, qui restent peu étudiés. Pour cela, nous utiliserons des marqueurs innovants permettant de mesurer l’impact des polluants sur l’activité cérébrale et les dommages neuronaux. Ces outils pourront être utilisés en écotoxicologie et en écophysiologie, notamment pour évaluer le stress des poissons, y compris ceux retrouvés morts dans la nature. Nos résultats aideront à mieux comprendre les risques liés aux résidus de médicaments et aux pesticides dans les milieux aquatiques. Ces connaissances seront précieuses pour orienter les politiques de protection de la biodiversité. Enfin, notre projet est mené en collaboration avec des acteurs de terrain (syndicats de rivière, agences de l’eau, fédérations de pêche), favorisant des échanges sur l’état des cours d’eau et des populations de poissons.

Procédures

Les individus seront capturés en milieu naturel (autorisation préfectorale), hébergés pour une durée de 6 mois maximum, dans des très grands bassins extérieurs avec enrichissement du milieu. Chaque acte durera moins de deux minutes, sur des poissons anesthésiés (selon la méthode réglementaire). Les interventions consisteront à manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion sur individus anesthésiés (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes), à raison de deux fois par semaine pendant 2 semaines (temps de manipulations inférieurs à 2 minutes). Des paramètres comportementaux seront mesurés (durée de relevé des paramètres comportementaux inférieure à 15 minutes), et une prise de sang sera réalisée (sous anesthésie) afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés par une méthode réglementaire et différents prélèvements réalisés pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : le stress de la capture et de la captivité, le stress de l’administration aux agents polluants, le stress thermique (les mésocosmes extérieurs sont influencés par les températures atmosphériques). L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. L'exposition expérimentale à l’herbicide, à l’antidépresseur, à l’antipyrétique et à l’anti-inflammatoire peut engendrer des altérations physiologiques et comportementales, telles que des réponses immunitaires altérées, ou des comportements répétitifs.

Devenir

L'euthanasie, réalisée par une méthode réglementaire, se justifie par la nécessité de relever le nombre de parasites chez les poissons, et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.

Remplacement

Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.

Réduction

480 animaux seront utilisés en tout, soit 30 animaux par lot pour l’ensemble des études (30X16 lots soit 480 individus). Cet effectif a été retenu à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes, en augmentant le N pour les études comportementales où la variabilité interindividuelle est beaucoup plus élevée. L’analyse statistique des données sera réalisée afin de comparer les groupes et donc les effets de la charge en parasites et de la charge en polluants sur les poissons, avec un suivi temporel des individus.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de 12m3, entièrement tapissés de filets, pour une protection vis-à-vis des prédateurs, et la récupération rapide des poissons, réduisant ainsi le stress et les risques de blessure. Les mésocosmes disposeront de radeaux végétalisés flottants de dimension 1x1 m permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Les mesocosmes ne sont pas régulés en température, et les poissons seront donc soumis aux variations de la température extérieure, qui sera toutefois atténuée par l’ombre assurée par les radeaux végétalisés. Lors de chaque acte, les poissons seront dans des bacs oxygénés, puis transférés dans un bac avec l'anesthésiant (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes). Chaque acte réalisé sous anesthésie durera moins de deux minutes. Après manipulation, ils seront placés dans un bac de réveil (eau fraiche, oxygénée, réveil rapide de moins de 5 minutes, avec surveillance des battements operculaires), puis rejoindront le reste du groupe dans le mésocosme, une fois un état de conscience, une réactivité au stress retrouvé, une récupération totale de l’équilibre et des activités de nage. Un suivi journalier des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement [nage erratique, position au sommet de la colonne d’eau, absence d’interaction sociale, isolement, hyper ou hypo-activité], hyper ventilation, hypersécrétion de mucus, présence de lésions) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance en aquarium dédié. La fréquence d’observation sera augmentée, un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie. Une forte mortalité constatée sur l’ensemble du groupe présentera un point limite pour l’ensemble de l’expérience.

Choix des espèces

L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, rendant le couple chevesnes-acanthocéphales idéal pour cette étude, 2. cette espèce ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. des précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm, taille nécessaire pour que les poissons présentent des parasites acanthocéphales.

Immobilisés jusqu'à huit heures dans un gel, parfois paralysés par un bain chimique, 2 600 Danionella cerebrum âgés de une à six semaines vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, tous tués à l'issue. Chaque poisson peut enchaîner trois sessions par jour pendant cinq jours, de trente minutes à deux heures chacune, tête fixée sous un microscope. Le porteur présente pourtant ce projet comme une contribution aux 3R, l'espèce devant "remplacer au moins partiellement" les mammifères en neurosciences. La mise à mort tient au statut sanitaire de l'élevage, aucun animal sorti de l'animalerie n'y étant réintroduit, et le porteur ajoute qu'en milieu naturel une infime proportion seulement atteindrait l'âge adulte.

Objectifs

Comprendre les mécanismes fondamentaux qui contrôlent le développement neuronal ou l'apprentissage, permettant l'acquisition ou l'adaptation du comportement à des changements environementaux ou physiologiques, est un enjeu fondamental des neurosciences. Étudier ces processus nécessite de pouvoir enregistrer de manière simultanée l’activité neuronale à l’échelle cellulaire dans une large portion du cerveau, à différents stades de développement, ce qui est difficile, voire impossible, chez les mammifères en raison de la taille et de l’opacité de leur cerveau. Ce projet se propose d'exploiter les atouts uniques de Danionella cerebrum, un petit poisson d'eau douce originaire de Birmanie, dont la petite taille et la transparence du cerveau permettent de réaliser des enregistrement par imagerie fonctionnelle tout au long du développement. En combinant approches comportementales, réalité virtuelle, imagerie calcique et modélisation numérique, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de maturation cérébrale qui accompagnent l’apparition ou le raffinement de comportements sensorimoteurs et d’apprentissage chez le vertébré.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques attendus de ce projet sont multiples : 1) Avancées fondamentales sur le fonctionnement cérébral : En étudiant les mécanismes essentiels du développement et de la plasticité neuronale, ce projet contribuera à une meilleure compréhension des dynamiques cérébrales à l'échelle des réseaux neuronaux et de leur implication dans les comportements complexes. 2) Applications pour la modélisation théorique et computationnelle : Les données produites, rendues accessibles librement, fourniront une base précieuse pour tester et affiner les modèles théoriques et computationnels des réseaux neuronaux biologiques. Ces résultats pourront également nourrir des recherches en intelligence artificielle inspirées du fonctionnement cérébral. 3) Validation d’un nouveau modèle vertébré : Ce projet participera à l’établissement de Danionella cerebrum comme un modèle vertébré de référence en neurosciences intégratives et développementales. Sa simplicité structurelle et son accessibilité permettront de répondre à des questions complexes tout en réduisant la dépendance aux modèles mammifères traditionnels. 4) Impact sur la recherche éthique : En promouvant l'utilisation de Danionella cerebrum, ce projet contribuera au remplacement, à la réduction et au raffinement (3R) des études sur les mammifères dans le cadre des neurosciences, réduisant ainsi l'impact éthique et pratique de ces recherches.

Procédures

Certaines expériences ont lieu en milieu ouvert : les poissons sont libres de nager dans une cuve et leur mouvement est suivi au moyen d'une caméra, et soumis à un stimulus visuel (écran sous la cuve). Chaque session dure jusqu'à 2h. Les animaux peuvent effectuer jusqu'à 3 sessions par jour, pendant un maximum de 5 jours. Pour les autres procédures, les animaux sont partiellement immobilisés dans un gel aqueux qui permet de maintenir leur tête fixe. Nous observons leur comportement (le mouvement de la queue) avec une caméra. Chaque session dure entre 30 minutes et 2h. Les animaux peuvent effectuer jusqu'à 3 sessions par jour, pendant un maximum de 5 jours. Après 3 sessions (espacées d'une heure), les animaux sont libérés du gel et peuvent nager librement dans une boite de Petri, jusqu'à la session suivante. Dans un nombre limité d'expériences, et afin de réduire les mouvements des animaux, ceux-ci sont exposés à une solution de paralysant. Lors de ces expériences tête fixée, nous enregistrons l'activité cérébrale de l'animal de façon non-invasive via des méthodes optiques. Par ailleurs, dans certaines de ces expériences, nous activons et/ou inactivons certaines populations de neurones au moyen d'une lumière infrarouge.

Impact sur les animaux

Pour les expériences en nage libre, les animaux sont isolés, ce qui peut engendrer de la peur. Pour les expériences en réalité virtuelle et d'imagerie cérébrales, les poissons sont partiellement immobilisées dans un gel aqueux pendant une période de 8h maximum. Cette opération de fixation dans le gel se fait sous anesthesie, donc il n'y a pas de douleur impliquée mais cette immobilisation peut causer du stress et de la peur. Certains animaux sont également paralysés au moyen d'un bain dans une solution contenant un agent paralysant, avant d'être montés dans le gel. Cette paralysie peut induire du stress et une douleur légère. Enfin, durant les expériences d'optogénétique, certains neurones sont activés ou désactivés de façon non invasive avec de la lumière, ce qui peut également générer du stress chez les poissons.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience. En effet, afin de préserver le statut sanitaire du système d'élevage et protéger les colonies adultes contre toute infection, il est impératif de ne pas réintroduire les animaux une fois qu'ils ont quitté l'animalerie. Il est important de noter qu'en milieu naturel, seule une infime proportion des individus atteint l'âge adulte. Dans un environnement d'élevage, si le nombre d'individus n'était pas artificiellement limité, la population augmenterait de manière exponentielle. Par conséquent, seule une petite proportion des embryons produits est utilisée pour renouveler la population d'adultes.

Remplacement

Nos études visent à comprendre comment les capacités computationnelles émergent de l'organisation à toutes les échelles du cerveau chez le vertébré lors de son développement. Compte-tenu de la complexité structurelle et fonctionnelle du système nerveux, une telle recherche ne peut être menée sur des modèle in vitro ou in silico. La morphogénèse d'un système nerveux central complet et pleinement fonctionnel ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui nécessite de recourir à des organismes modèles animaux pour de telles études. Nos travaux permettrons à terme de définir des paramètres pour une meilleure modélisation in silico afin d'élaborer des hypothèse préalables à la phase expérimentale ce qui permettra de réduire le nombre des animaux utilisés en expérimentation.

Réduction

Afin d’appliquer le principe de réduction, nous suivons les méthodes suivantes : (1) Le nombre d’animaux utilisés est limité au strict minimum permettant de produire des résultats statistiquement significatifs et robustes. Des tests statistiques, adaptés à chaque expérience, seront utilisés pour permettre de limiter ce nombre. Au total, ce projet utilisera 2600 Danionella cerebrum (larves et juvéniles), agés entre 1 et 6 semaines. (2) Nous utilisons des protocoles séquentiels pour éviter de mobiliser des animaux inutiles en cas d’échec technique. (3) L’utilisation de modèles numériques issus des expériences permettra de réduire à terme le recours à de nouveaux animaux pour des tests exploratoires.

Raffinement

Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse des animaux. Dans toutes les expériences menées, afin de déceler une éventuelle souffrance de l’animal, nous suivons systématiquement plusieurs paramètres physiologiques et comportementaux : apparence des animaux, position dans l'eau, cinétique de nage, circulation sanguine, rythme cardiaque, etc. En cas d'anomalie sur l'un de ces paramètres, nous considérerons l’animal en souffrance auquel cas nous interrompons immédiatement l’expérience et procédons à une euthanasie. Concernant l’élevage, nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement des points limites). Les poissons trop vieux pour la ponte ou présentant des signes de maladie sont euthanasiés afin d’éviter tout risque de souffrance. Les conditions salines et de température de l’eau sont contrôlées en permanence et quotidiennement reportées sur un registre. En cas d’anomalie, les conditions sont modifiées pour revenir à la normale. Les teneurs en ammoniaque, nitrates et nitrites sont vérifiées hebdomadairement. Une filtration de l’eau et un renouvellement quotidien de un dixième de l’eau sont réalisés pour maintenir des conditions d’hébergement stables et adéquates. Un enrichissement est réalisé, en nourrissant quotidiennement les animaux avec de la nourriture vivante (artémias). Pour les expériences d’imagerie, les poissons sont anesthésiés avant de les immobiliser dans un gel d'agarose pour limiter stress et douleur. L’anesthésie est confirmée par l’absence de mouvements. L’imagerie utilise une lumière relativement intense : nous réalisons donc un cache qui protège les yeux de l’animal de toute exposition directe à la lumière, prévenant ainsi tout stress supplémentaire.

Choix des espèces

Danionella cerebrum est actuellement le seul vertébré connu dont les caractéristiques de taille et de transparence du cerveau sont compatibles avec les méthodes d'enregistrement et de perturbations optiques pendant tout le développement cérébral. Sa proximité génétique et morphologique avec le poisson zèbre permet un transfert rapide des méthodes (transgénèse, imagerie) de l'un à l'autre. L'utilisation de ce modèle permettra de remplacer au moins partiellement l’expérimentation sur des mammifères. Toutes les expériences seront réalisées avec des animaux âgés de 1 à 6 semaines, le projet ayant pour objectif d’étudier les mécanismes de maturation cérébrale associés à cette période de développement.

Capturées en estuaire, transportées une heure dans des sacs gonflés à l'oxygène, puis immergées trois heures ou treize minutes et demie dans un colorant fluorescent, 630 civelles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont ensuite maintenues en aquarium puis en mésocosme, soixante jours pour une partie, jusqu'à deux cent quarante jours pour les autres. Quatre-vingt-dix d'entre elles sont tuées pour que la fluorescence de leurs otolithes soit lue au microscope, et les 540 autres sont remises en liberté sur les sites de repeuplement, dont cent vingt après anesthésie et lecture externe de la marque. L'effectif de départ intègre une mortalité attendue de 40 à 55 % en captivité, que le porteur rapporte à la qualité des civelles récupérées chez le mareyeur.

Objectifs

Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). L’observation de ces structures nécessite toutefois la mise à mort des individus. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés de 2022 à 2024 ont confirmé la présence de marques dans les nageoires des civelles, détectables après 180 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de tester différents fabricants du colorant, sachant que de récents travaux ont montré des différences importantes selon les fabricants sur l’intensité des marques fluorescentes détectées dans les otolithes d’anguilles.

Bénéfices attendus

LLa lecture externe des marques fluorescentes sur des individus vivants permettra en premier lieu la préservation des civelles analysées (pas de mise à mort), une simplification du protocole de détection, la réduction du temps de lecture des marques et l’augmentation de la taille de l’échantillon analysé dans un soucis de représentativité statistique.

Procédures

Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de colorant fluorescent, selon 6 traitements et un contrôle. La durée des marquages sera de 3h (pour 3 traitements en balnéation longue) ou 13.5 minutes (pour 3 traitements en balnéation "flash"). 90 individus des traitements en balnéation longue seront prélevés, mis à mort, mesurés, pesés et la fluorescence de leur otolithe observé à l’aide d’un microscope à épifluorescence. 90 individus des traitements à balnéation flash seront prélevés, anesthésiés, mesurés, pesés et leur fluorescence externe (nageoire) observée à l’aide du lecteur portatif. La durée totale de l’intervention hors d’eau sera de 1 minute.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage, le maintien en captivité et l’anesthésie avant lecture de fluorescence. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.

Devenir

630 civelles seront capturées, transportées, marquées puis maintenues en captivité. Un effectif de 270 civelle sera maintenu en aquarium puis en mésocosmes pendant 60 jours, parmi lesquelles 90 seront mises à mort. Les autres individus seront remis en liberté. Le maintien en mésocosme sera prolongé jusqu’à 240 jours pour les 360 civelles restantes pamis lesquelles 120 seront anesthésiées, mesurées, analysées (mesure de fluorescence), puis remises en liberté. Tous les autres individus seront remis en liberté en fin d’expérience.

Remplacement

La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).

Réduction

L’effectif initial prévu de 630 individus répartis dans 7 traitements tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 40-55%, en fonction de la qualité des civelles récupérées chez le mareyeur), pour garantir un effectif d’au moins 30 individus analysables après 60 jours (traitements T1 à T3) et 240 jours (traitements T0 et T4, T5, T6). A 60 jours après marquage, 30 individus par traitement T1 à T3 sera mis à mort et analysé. Les autres individus de ces traitements seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (180 individus maximum). A 240 jours, les 120 individus analysés (lecture directe de la fluorescence) seront préalablement anesthésiés puis relâchés dans le milieu naturel après réveil. Les individus non analysés seront relâchés simultanément (240 individus maximum). L’effectif analysé de 30 individus par traitement est un minimum pour prendre en compte la variabilité inter-individuelle de la fluorescence, potentiellement importante au regard des résultats obtenus au cours des projets précédents.

Raffinement

Lors du transport, les civelles seront réparties dans deux sacs de transport gonflés à l’O2 et contenant un volume d’eau adapté. La densité de civelles sera très faible comparé aux densités de stockage observées chez les mareyeurs et lors des opérations standards de marquages effectuées depuis 2011 pour les repeuplements. La durée de transport est limitée au minimum et estimée à environ 1 heure, ce qui permet de garantir le maintien d’un niveau d’oxygénation très élevé dans les sacs (très faible consommation par les civelles). Pour le marquage, l’oxygénation des solutions sera maintenue à 100% à l’aide de diffuseurs d’oxygène, point essentiel en raison des fortes densités d’individus. Les aquariums seront enrichis à l’aide caches constituées de tubes PVC puis des flottangs seront utilisés dans les mésocosmes, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival. Lors des contrôles de fluorescence (à 60 et 240 jours), les civelles seront anesthésiées individuellement puis au moment de la lecture de fluorescence, leur tête sera protégée des rayonnements laser à l’aide d’un cache opaque. La durée totale de la manipulation hors d’eau n’excèdera pas 1 minute.

Choix des espèces

L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.

Plongés cinq jours dans des cultures de cyanobactéries du genre Microcystis, 360 poissons médakas adultes ne subissent aucune autre intervention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Tous seront tués en fin d'exposition pour prélever leurs organes, seule voie d'accès selon le porteur aux compartiments biologiques étudiés. L'objectif porte sur l'effet des métabolites produits par ces bactéries sur le microbiote des poissons et, par ricochet, sur leur santé, un sujet que le porteur qualifie de "vierge". Il indique que les doses employées n'atteignent pas celles qui entraînent une souffrance "visible" au niveau morphologique ou du comportement, sans préciser ni les signes surveillés ni la fréquence des observations, alors qu'il attend par ailleurs un inconfort digestif et hépatique.

Objectifs

Les altérations des milieux aquatiques par les proliférations de cyanobactéries sont susceptibles de modifier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Les préjudices associés à ces efflorescences comprennent : des perturbations de la chaîne trophique, une diminution de la pénétration de la lumière dans l’eau, une diminution de l’oxygène dissous disponible, mais également la production de métabolites secondaires potentiellement bio-actifs et parfois toxiques pour certains organismes qui y sont exposés. En effet, de nombreux genres de cyanobactéries sont susceptibles de produire et/ou de relarguer dans le milieu aquatique des molécules aux propriétés éminemment, ou potentiellement, bio-actives, délétères, voire toxiques. Si les effets toxicologiques (sensu stricto) de ces microorganismes et de leurs métabolites sont connus sur certaines cellules ou tissus de vertébrés, notamment chez certains poissons, on ignore leur impact sur la communauté microbienne associée et les répercussions sur la santé de l’organisme hôte. Des travaux menés ces dernières années ont montré que le microbiote, localisé à l’interface entre un organisme et le milieu extérieur, peut jouer un rôle important dans la physiologie de l’hôte, mais aussi dans de nombreux paramètres biologiques chez les Vertébrés, parmi lesquels la résistance aux pathogènes. Le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses représentatives des conditions environnementales de divers efflorescences de cyanobactéries sur le poisson modèle en écotoxicologie aquatique, le médaka. A ce jour, peu d’études se sont ainsi efforcées de caractériser la réponse des poissons à différentes compositions d’efflorescences de cyanobactéries au niveau de l’holobionte (organisme hôte + microbiotes) et de tâcher ainsi de prendre en compte la réponse au niveau des différents compartiments biologiques et des différents organes.

Bénéfices attendus

Cette étude constituera un prérequis indispensable au développement de ce sujet encore vierge. La caractérisation du microbiote de poissons n’en est en effet qu’à ses débuts et dévoile déjà une large diversité microbienne inattendue. Les interactions entre hôte, son microbiote associé et l’environnement sont peu explorées, encore moins dans le cadre de stress écotoxicologiques, et pourraient s’avérer informatives de processus biologiques méconnus. A terme ces travaux permettront de mieux appréhender les conséquences (éco)toxicologiques des efflorescences de cyanobactéries et de la production de métabolites bio-actifs associés.

Procédures

Mis à part la balnéation avec les biomasses de cyanobactéries qui aura lieu pendant les 5 jours de l’expérimentation, aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les poissons seront exposés 5 jours par balnéation à différentes doses environnementale de cultures de souches de cyanobactéries. Certains métabolites produits par les cyanobactéries pourraient induire des effets physiologiques occasionnant un inconfort alimentaire pour les poissons (digestif, hépatique). Les doses n’atteignent pas les doses toxicologiques entrainant de la souffrance visible au niveau morphologique ou du comportement.

Devenir

Les poissons seront euthanasiés en fin de procédures et leurs organes prélevés pour analyses. Seuls les prélèvements tissulaires post-mortem permettent d’avoir accès aux différents compartiments biologiques qui seront ici investigués.

Remplacement

Seul ce type d’analyse intégrée portant sur des organismes entiers permet de générer une compréhension fine des processus écotoxicologiques qui en oeuvre chez ces modèles biologiques complexes (organismes + microbiote associé).

Réduction

Notre expérience dans ce type de travaux nous a permis de raffiner le design expérimental au niveau du temps d’exposition qui passe ici de 28 jours à seulement 5 jours. Par ailleurs, nos travaux mettront en oeuvre une approche de comparaison de la variance des différents paramètres biologiques ici renseignés (composition bactérienne et métabolique) afin d’estimer à la fois les variabilités biologiques et expérimentales. Nos expérimentations seront réalisées à des concentrations environnementales (en teneurs en cyanobactéries) et avec des effectifs nécessaires et minimums pour être en mesure de démontrer l’occurrence d’effets moléculaires d’un nombre réduit d’organismes.

Raffinement

Nos travaux sont développés dans le contexte de la caractérisation de biomarqueurs précoces (et également plus sensibles) de stress au niveau du microbiome et du métabolome (ensemble des métabolites retrouvés dans un échantillon biologique, et sa concentration) des poissons Médaka. En en accord avec le principe de raffinement de la règle des 3R pour l’expérimentation animale, les expérimentations seront menées à des concentrations en cyanobactéries produisant des cocktails bio-actifs proches de la concentration minimale induisant les premiers effets détectables toxicologique, afin de limiter les potentiels effets toxicologiques. Durant toute l’expérimentation, les organismes seront maintenus en groupe dans des conditions d’élevages standards, correspondants aux critères de raffinement préconisés par l’Organismes de Coopération et de Développement Economique pour l’élevage et l’expérimentation sur cet organisme.

Choix des espèces

Oryzias latipes : Espèce modèle aquatique vertébrée couramment utilisée en expérimentation scientifique pour des travaux de développement, d’écologie ou d’écotoxicologie avec différents types de contaminants environnementaux Jeunes adultes (entre 3 et 5 mois), afin de pouvoir aisément les sexer et d’éviter qu’ils ne présentent les altérations cellulaires qui commencent à apparaître après l’âge de 6 mois chez cette espèce.

Immobilisés une à deux secondes par un courant électrique dans leur rivière, 65 vairons et chevaines sont pêchés, transportés au laboratoire et acclimatés à la température de l'eau. Avec 25 truites fournies par une pisciculture, ils sont sédatés, mesurés au millimètre, laissés au repos, puis lâchés dans un canal expérimental où ils dévalent une goulotte devant une caméra, jusqu'à cinq fois chacun, soit deux à deux heures et demie de manipulation par individu. Ces 90 poissons subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous sont relâchés, les vairons et chevaines sur leur site de capture, les truites sur un site déjà rempoissonné par le fournisseur. Les images doivent entraîner une intelligence artificielle à reconnaître et mesurer les truites qui descendent les rivières, avant d'investir dans une installation sur un ouvrage hydroélectrique, le porteur indiquant avoir préféré des poissons sauvages relâchés à des poissons d'élevage qu'il aurait fallu tuer.

Objectifs

La compréhension des besoins de déplacement des poissons est nécessaire pour proposer des mesures de restauration de la continuité écologique adaptées et efficaces. Contrairement aux espèces amphihalines (qui effectuent des migrations entre les milieux marins et les eaux douces), les besoins de déplacements des espèces résidentes en cours d’eau sont moins connus. Les adultes de truite fario (Salmo trutta fario) effectuent des migrations reproductives, en remontant dans des zones de frayères essentiellement situées en tête de bassin versant, mais les patrons de dispersion des juvéniles dans leurs premières années de vie sont beaucoup moins connus, à cause de la difficulté à étudier les déplacements des petits individus. Toutefois, un mouvement de ces juvéniles vers l’aval des cours d’eau (dévalaison) est attendu. De nombreux aménagements hydroélectriques sont implantés dans les zones de montagne ou de piémont, à peuplement majoritaire de truite. Ces aménagements fragmentent le milieu et peuvent avoir un impact fort puisque, lorsqu'ils dévalent, les poissons transitent bien souvent par les turbines, sources de mortalité élevée voire totale. L’installation d’un système de protection est possible mais souvent couteuse et techniquement complexe, et il est nécessaire d'améliorer nos connaissances sur le phénomène de dévalaison des truites pour concevoir et dimensionner au mieux les dispositifs de réduction d’impact, avec un rapport coût/efficacité optimisé (quelle temporalité ? pour quelles tailles de poissons ? ...). Pour y répondre, un suivi par vidéocomptage des flux d'individus dévalants est envisagé dans un dispositif de dévalaison installé sur un site de montagne. Compte tenu des conditions beaucoup plus contraignantes pour l’acquisition de l’image que ce qui est classiquement le cas pour des poissons comptés en montaison dans les dispositifs de franchissement (vitesse de passage plus élevée, présence de bulles et de feuilles), la présente étude vise à tester l’efficacité de l’intelligence artificielle (IA) pour reconnaitre les poissons dévalants et estimer leur taille en condition de laboratoire (canal expérimental permettant de reproduire les conditions d’écoulements de la goulotte réelle), avant d’engager l’investissement nécessaire à une installation in situ.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de tester la possibilité de suivre la dévalaison des truites par vidéocomptage dans un dispositif de dévalaison en exploitant les données par l’intelligence artificielle. C’est uniquement en cas de résultats positifs que l’installation du système de vidéocomptage sur le site envisagé pourrait intervenir au printemps - été 2025. Le système, si opérationnel, pourra être utilisé sur d’autres sites, ce qui contribuera à améliorer les connaissances des besoins en déplacement des poissons de rivière. Ces observations permettront de mieux concevoir et dimensionner les dispositifs de protection des poissons au niveau des ouvrages hydroélectriques, avec un rapport coût/efficacité optimisé, prenant notamment en compte les périodes de dévalaison et la taille des individus concernés.

Procédures

Les tests consistent à faire nager les poissons dans un canal expérimental, aménagé en dispositif de dévalaison, et filmer leur passage vers l’aval. Les tests seront conduits avec 3 espèces différentes : la truite en priorité (d’origine pisciculture), le vairon et/ou le chevaine (issus de milieu naturel) pour remplacer les tailles des truites cibles indisponibles en pisciculture au moment des tests. Les vairons et les chevaines nécessaires seront temporairement prélevés dans un cours d’eau et relâchés sur leur site d’origine après l’expérimentation. Utiliser des vairons et des chevaines sauvages (avec retour dans la nature) est apparu plus adapté qu’utiliser des vairons d’élevage avec l’obligation de mise à mort après l’expérimentation (impossibilité de placement ou de les relâcher dans la nature). Le prélèvement se fera par pêche à l’électricité, technique de capture la plus efficace compte tenu de la faible activité des poissons pendant la période d’expérimentation, tout en réduisant au maximum les dommages sur les individus et le dérangement du milieu. Les poissons seront transportés et mis en hébergement au laboratoire. Avant les tests, tous les poissons (90) seront sédatés, mesurés (au mm près) et laissés au repos 15-30 min avant le lancement des tests dans le canal expérimental pour récupérer complètement des effets de la sédation. Les poissons seront ensuite libérés, individuellement ou en groupe, directement dans la partie amont du canal expérimental, aménagée en goulotte de dévalaison. Après leur passage filmé vers l’aval, les poissons seront repêchés à l'épuisette, placés dans des viviers/seaux et laissés au repos env. 10 minutes avant le passage suivant. Chaque poisson sera utilisé au maximum 5 fois. Il est estimé qu’un individu sera manipulé en tout au maximum 2-2.5 heures (sédation, récupération, 5 passages filmés dans le canal, séparés par 10 min. de repos).

Impact sur les animaux

La réalisation de ce projet nécessite 1/ la capture de vairons et de chevaines (65 ind.) en milieux naturel par pêche à l’électricité (les truites (25 ind.) seront fournies par une pisciculture), 2/ le transport de tous les individus au laboratoire et leur manipulation dans les installations expérimentales. 1/ L’appareil utilisé pour la pêche est un engin portatif, capable de produire un courant continu, le moins impactant pour le poisson. La prospection des habitats sera partielle (prospection uniquement des habitats favorables aux espèces recherchées) afin de réduire l’impact de l’opération sur les populations du secteur pêché. L’immobilisation des individus à l’électricité sera de très courte durée (1-2 sec), la récupération de leur activité respiratoire est presque immédiate. Des effets indésirables plus graves (blessures) peuvent subvenir mais dépendent de l’intensité du champ électrique, de la durée d’exposition, des conditions environnementales et de l’opérateur. Tout le personnel participant à l’opération de pêche est formé et tout sera mis en œuvre pour éviter les dommages sur les poissons capturés : réglage de l’engin de pêche, retrait rapide des individus hors du champ électrique, stabulation en eau fraiche et oxygénée). 2/ L’unique nuisance attendue sur les animaux lors des diverses manipulations (transport, mise en hébergement, sélection des individus, réalisation des tests) est le stress et le risque de dommage en cas d'échappement. Pour réduire ces nuisances, la biométrie des poissons se fera sous sédation. Le transport des truites sera assuré par le fournisseur, équipé à cet effet. Les poissons prélevés dans la nature seront transportés par notre équipe dans un vivier (1*1m) adapté au transport, rempli d’eau constamment oxygénée à l’aide d’un bulleur pendant le trajet. A l’arrivée au laboratoire, les poissons seront acclimatés progressivement à la température de l’eau avant le transfert dans les bacs de stabulation. Les autres manipulations seront réalisées avec rapidité mais précaution pour éviter tous dommages des individus. Les conditions de stabulation seront surveillées à tout moment (circulation d’eau, oxygénation, obscurité pour tranquilliser les poissons). La sédation en soi pouvant être considérée comme une source de risque (si incorrectement réalisée), les doses d’anesthésiant les plus faibles seront appliquées (avec des délais d’exposition réduits), et progressivement augmentées si l’effet recherché n’est pas atteint.

Devenir

Toutes les truites en bonne santé seront relâchés en milieu naturel sur un des sites où l’espèce est déjà rempoissonnée par le fournisseur. Les vairons et les chevaines seront libérés sur leur site d’origine.

Remplacement

Les images acquises ont une double utilité. Elles serviront d’abord à l’entrainement de l’IA pour reconnaitre des poissons adoptant diverses positions sur l'image, puis à tester l’efficacité de cette reconnaissance (pourcentage d'individus détectés, évaluation de leur taille). Il est donc nécessaire de réaliser les tests avec des poissons vivants, qui adoptent des comportements de nage en réponse aux conditions d’écoulement dans la goulotte, tout en présentant une variabilité interindividuelle. En effet, le mouvement actif des poissons influence leur position dans la colonne d’eau (surface ou fond), la direction de leur corps lors du passage (tête ou queue en avant : certains individus empruntent la goulotte "en marche arrière", en nageant à contre-courant, de manière à freiner et contrôler leur descente), leur vitesse de déplacement dans la goulotte (vitesse potentiellement plus ou moins rapide que l'écoulement en fonction de leur positionnement en marche "avant" ou "arrière") et surtout la silhouette détectée par le système d'analyse d'image (les images de corps en mouvement ne sont pas comparables à celles prises sur des individus rigides). Cette variété de situations possibles doit être également prise en compte dans la calibration de l’acquisition d’une séquence, car il est prévu que l’enregistrement ne se lance que suite à une détection effective du passage d'un poisson. Il ne serait donc pas informatif de conduire des tests avec des maquettes de poissons ou des poissons morts, qui ne se positionneront et ne se déplaceront pas dans la goulotte comme des individus vivants.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, il a été décidé de travailler sur moins d’individus et de répéter les manipulations, sans toutefois dépasser 5 répétitions par individus. La méthodologie a été conçue de manière à pouvoir relier chaque individu à l’image enregistrée (pour mesurer l’efficacité à évaluer la taille) sans besoin d’un marquage individuel (par transpondeur ou marquage externe) qui engendrerait une nuisance supplémentaire aux animaux. De plus, seront testés uniquement des individus de taille entre 3 et 15 cm (maxi 20 cm selon la disponibilité des poissons auprès du fournisseur). Les tailles supérieures ne seront pas testées puisque nous partons de l’hypothèse que si des individus entre 10-15 cm sont détectés avec une bonne fiabilité, cela vaudra également pour les individus plus grands. L’expérimentation est de courte durée (quelques jours de captivité au maximum) et tous les poissons seront libérés après les tests : les truites sur un des sites déjà empoissonnés par le fournisseur, les vairons et les chevaines sur leur site d’origine.

Raffinement

Pêche - L’appareil utilisé est un engin portatif qui produit un courant continu, le moins impactant pour le poisson. La prospection des habitats sera partielle afin de réduire l’impact de l’opération sur les populations du secteur pêché. L’immobilisation des individus à l’électricité sera de très courte durée (1-2 secondes), la récupération de leur activité respiratoire est presque immédiate. Tout le personnel participant à l’opération de pêche à l’électricité est formé et tout sera mis en œuvre pour éviter les dommages sur les poissons capturés. - Biométrie sous sédation - Temps de calme de 10 minutes entre les différents passages dans le canal - Très bonnes conditions de stabulation (température, oxygène) et surveillées deux fois par jour - Bassins couverts pour réduire la luminosité et tranquilliser les poissons, éviter l’échappement. - Faible densité dans les bassins/seaux. - Manipulation rapide, remise en liberté des poissons après tests.

Choix des espèces

L’étude envisagée in situ vise uniquement la truite fario (cf. justification dans le paragraphe 5.5.1.). L’intelligence artificielle doit être paramétrée pour la reconnaissance de cette espèce et pour cela, il est nécessaire de rester, autant que possible, sur la même espèce. Cependant, en cas de l’impossibilité de se fournir en truite fario pour l’ensemble des tailles cibles, il a été décidé d’utiliser, pour les tailles manquantes, une autre espèce disponible avec une morphologie du corps proche : le vairon ou le chevaine . La reconnaissance d'individus de taille comprise entre 3 et 15 (20) cm est principalement visée. D’une part, il est nécessaire pour l’étude à venir de vérifier l'efficacité à suivre les individus de ces tailles, qui correspondent aux individus d’âge 0+ à 2+, supposés d’effectuer un déplacement vers l’aval dans les cours d’eau. Les tests sur des individus de tailles supérieures à 15 (20) cm n’apparaissent pas nécessaires puisque nous partons de l’hypothèse que si les individus entre 10-15 (20) cm sont détectés avec une bonne fiabilité, cela vaut également pour les individus plus grands.

Un demi-degré de plus par jour, jusqu'à cinq degrés au-dessus de la température habituelle : c'est le réchauffement que subiront des gardons nourris de moules contaminées au mercure. 160 poissons sont capturés au piège puis sexés par prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les 80 mâles seront tués pour mesurer la bioaccumulation dans leurs organes, les 80 femelles retournent à l'étang et pourront être utilisées dans d'autres études. Le porteur retient le gardon parce qu'il est le principal prédateur de la moule Dreissena polymorpha en Europe et parce qu'il figure parmi les poissons consommés par les humains, en sélectionnant des adultes de 15 centimètres et 40 grammes.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans les préoccupations actuelles du changement climatique global. Son originalité réside dans l'approfondissement des relations existants entre la présence d’un contaminant chimique présentant une activité biologique et une modification climatique issue des prédictions du GIEC pour 2100. Ce projet vise à améliorer nos connaissances sur le transfert et les effets toxiques du méthyl-mercure dans un contexte de réchauffement climatique par l'alimentation de la moule Dreissena polymorpha aux poissons Rutilus rutilus. Le transfert vers l’homme sera aussi estimé grace à une expérience de digestion par des fluides intestinaux artificiels. La bioaccumulation et la toxicité du methyl-mercure alimentaire pour R. rutilus sera analysée par des approches à haut débit et des approches ciblées moléculaires et cellulaires, donnant une vision holistique du phénotype.

Bénéfices attendus

Très peu d’études cherchent actuellement à mener de front les effets d’une modification des paramètres physiologiques des poissons en présence de contaminants chimiques dans un contexte de changement climatique. Ces connaissances fondamentales sont essentielles pour mieux comprendre et prédire la propagation des effets entre les niveaux trophiques des systèmes aquatiques d'eau douce et pour identifier des biomarqueurs innovants et précoces pour une meilleure évaluation des risques liés aux polluants. Ce projet permettra d’acquérir des connaissances fondamentales essentielles afin d’améliorer l’évaluation des risques liés aux contaminants dans le contexte du changement climatique. Dans ce cadre, trois hypothèses peuvent être formulées. Premièrement, le changement climatique ne va pas induire d’effet plus notable que celui du contaminant ; deuxièmement, la physiologie des individus va être fortement déstabilisée par la combinaison des deux stress ; troisièmement, l’effet du stress chimique peut être amoindri par l’apparition d’un stress supplémentaire. L’originalité de ce projet est de tenter de mieux comprendre l’interaction existant entre ces différents stress pour les poissons. Par ailleurs cette compréhension est cruciale pour évaluer les conséquences du changement global sur la fitness individuelle, susceptibles d'affecter les services écosystémiques.

Procédures

Tous les poissons seront capturés par piège passif. Le sexage se fera sur prélèvement d’un fragment de nageoire pris sous anesthésie par balnéation et dure moins de 2 minutes. Après le prélèvement le poisson est placé 5 minutes dans de l'eau propre sans anesthésiant et bien oxygénée. A son réveil, il est retourné en aquarium. Les femelles seront directement retournées à l'étang. Les lots de mâles subiront différentes conditions d’exposition impliquant une augmentation de température graduelle un demi degré par jour pour 5 degré Celsius au total ou température standard avec ou sans alimentation avec dreissenes préexposées au mercure pendant 4 jours. A l’issue de la période d’exposition, les poissons seront euthanasiés par une méthode règlementaire afin de procéder aux différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Pour le sexage, une anesthésie et un petit prélèvement de nageoire (fin clip) seront nécessaire. La manipulation des individus avant anesthésie génère du stress sur l’animal. L’anesthésie pourrait provoquer une baisse de la respiration et donc de l’apport en oxygène. Nous n’avons jamais remarqué de nuisances liées à l’anesthésie (très courte durée, moins de 2 minutes) ni au prélèvement. Le prélèvement est vraiment minime et n’occasionne pas de gêne dans la nage. Une douleur légère de courte durée pourrait être associée à ce geste. L’augmentation de la température de l’eau peut également générer un stress; elle sera donc très graduelle pour le limiter au maximum. Pour l’exposition au mercure, nous attendons des effets à l’échelle moléculaire et cellulaire de faibles intensités pour le mercure et la température.

Devenir

Les males seront euthanasié par une méthode réglementaire. L’expérience implique un prélèvement des organes pour mesurer la bioaccumulation, les réponses moléculaires et les réponses cellulaires. Les femelles seront retournées à l'étang. Les femelles qui ne sont pas impliqués dans cette étude d’exposition aux changement climatique, seront retournées à l’étang et pourront être utilisées dans le cadre de la reproduction et/ou d’autres études ultérieures, le cas échéant.

Remplacement

Ce projet nécessite une chaine alimentaire réaliste. La prise alimentaire, l’absorption intestinale et surtout la distribution dans les organes ne peut pas être mimé par des méthodes se substituant à l’utilisation des gardons entiers vivants

Réduction

Au total 160 poissons sont concernés. Nous estimons que le nombre de femelles est équivalent au nombre de males. Ainsi, 160 poissons sont nécessaires pour obtenir 80 poissons males qui seront euthanasiés, les 80 femelles seront relachées. Le sexage concernera 80 femelles et 80 males. Le sexage permettra de réduire le nombre de poissons utilisés au strict nécessaire tout en préservant la pertinence statistique des données indispensable pour une interprétation fiable des résultats. 4 poissons sont nécessaire pour mener toutes les analyses. Au total, nous aurons 4 conditions à tester avec 20 animaux par conditions afin de mettre en œuvre les différentes analyses nécessaires. Ils seront répartis en 20 bacs de 4 poissons, soit 80 poissons mâles et 160 au total incluant la partie identification du sexe.

Raffinement

Les individus ne seront pas transportés car présents sur site. Une acclimatation progressive à la température et à la nourriture sera menée pendant 3 semaines, la concentration d'exposition au mercure est réaliste sur une durée courte. Cette exposition par l'alimentation provoquera des effets à l'echelle moléculaire et cellulaire de faibles intensités, sans, à notre connaissance, produire de douleur, de perte de poids ou de modifications comportementales. Un enrichissement sera fourni aux poissons grâce à l'alimentation par proie vivante. Les aquariums seront equipés de parois transparentes et percées pour ne pas perturber le comportement grégaire. Une cachette dans l'aquarium sera fournie. Le prélèvement d'un fragment de nageoire se fera sous anesthésie. Des points limites permettront de juger de la pertinence d'arrêter les expositions. Afin de maximiser le bien être animal, les poissons bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine dans la salle d'essai dédiée à l'expérimentation animale (thermoregulée, cycles nyctheméraux adaptés aux besoins physiologiques des poissons, faible passage du personnel) avant exposition. De même pour avoir une qualité d'eau optimale, les paramètres physicochimiques sont vérifiés à minima une fois par semaine. Les animaux sont nourris tous les jours avec une alimentation appropriée et leur eau est changée quotidiennement. Les poissons sont transferés delicatement dans un aquarium contenant le milieu renouvelé. Si une mortalité anormale est observée dans les aquariums témoins, l'expérimentation est immédiatement stoppée.

Choix des espèces

Le transfert du mercure par l'alimentation constitue un problème majeur de santé publique, susceptible de s'aggraver avec les changements climatiques. Cependant, les effets du mercure transmis par l'alimentation sur la faune sauvage sont encore peu documentés, en particulier à des concentrations réalistes. Le gardon, très répandu dans les plans d'eau en France, est couramment utilisé en aquaculture, capturé lors de compétitions de pêche et figure parmi les poissons populaires consommés par les humains. Il représente également le principal prédateur de Dreissena polymorpha en Europe, une espèce qui pourrait constituer une voie d'entrée du mercure dans son alimentation, puis dans celle des humains. Dans le cadre de cette étude sur le transfert alimentaire du mercure, nous nous intéresserons aux gardons matures (15 cm, 40 g) possédant une mâchoire pharyngienne, indispensable pour se nourrir de D. polymorpha.