Poissons

Capturés à l'épuisette puis amputés d'environ 10 % de leur nageoire caudale sous anesthésie, des poissons zèbres passent environ cinq minutes par procédure d'identification génétique. 33 600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur annonce la mise à mort des poissons génétiquement modifiés à l'issue du projet. L'objet est de déterminer si un gène appelé wt1 commande la formation des ovaires ou des testicules chez cette espèce, en modifiant son activité dès les premiers stades de l'embryon. Les effets de ces modifications restent inconnus, un retard de croissance ou une infertilité étant annoncés comme possibles, et aucune procédure autre que le prélèvement de nageoire n'est décrite pour un effectif de cette taille.

Objectifs

De nombreuses maladies humaines présentent des différences selon le sexe des patients, aussi bien dans leur fréquence que dans leur évolution. Il est donc important de prendre en compte le sexe des individus dans les études utilisant des modèles animaux. Le poisson zèbre constitue un modèle de référence pour l’étude du développement et de nombreuses pathologies humaines. Cependant, les mécanismes génétiques impliqués dans la détermination sexuelle chez cette espèce restent encore mal caractérisés dans les souches utilisées en laboratoire, ce qui limite la prise en compte du sexe comme variable biologique dans les études utilisant ce modèle. Ce projet vise à comprendre le rôle d'un gène appelé wt1, déjà connu pour être essentiel dans le développement des organes reproducteurs chez les mammifères. Comme ce gène existe également chez le poisson zèbre, nous voulons déterminer s'il joue un rôle similaire. Pour répondre à cette question, nous modifierons l'activité de ce gène dès les premiers stades du développement de l'embryon, puis nous observerons les conséquences de ces modifications sur le développement des ovaires ou des testicules et par conséquent sur tout le développement sexuel de l’individu. L'objectif est de mieux comprendre comment le sexe est déterminé chez le poisson zèbre et d'améliorer l'utilisation de cette espèce comme modèle pour la recherche biomédicale.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes de détermination du sexe dans cette espèce facilitera l’interprétation des études biomédicales utilisant ce modèle, notamment lorsque l’incidence ou la progression des phénotypes étudiés dépend du sexe. Les bénéfices attendus sont de nature fondamentale et contribueront à l’amélioration des connaissances en biologie du développement et en biologie de la reproduction.

Procédures

Les manipulations des poissons nécessitent leur capture à l'aide d'une épuisette, ce qui peut provoquer un stress temporaire. Pour les identifier, un seul prélèvement correspondant à environ 10 % de la nageoire caudale (environ 2 mm²) sera effectué sous anesthésie, après administration d'un analgésique pour limiter la douleur. L'ensemble de la procédure dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées à ce projet sont principalement liées aux procédures d’identification des génotypes et aux conséquences possibles des modifications génétiques. Le génotypage des animaux porteurs de mutations ou de transgènes nécessite un prélèvement d'un fragment de la nageoire caudale. Cette procédure invasive peut induire un stress transitoire, une gêne de courte durée ainsi qu’une diminution temporaire de l’activité de nage ou une modification passagère du comportement alimentaire. Les effets des modifications génétiques sur le développement sexuel du poisson zèbre étant encore inconnus, des effets indésirables ne peuvent être totalement exclus tels un retard de croissance ou l’infertilité.

Devenir

A l’issue du projet, les animaux étant génétiquement modifiés seront mis à mort

Remplacement

Ce projet a été conçu et sera conduit dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour étudier la biologie du développement et les mécanismes de différenciation sexuelle, qui reposent sur des processus dynamiques impliquant interactions tissulaires, vascularisation et organisation tridimensionnelle. À ce jour, les approches in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) ne permettent pas de reproduire de manière fiable ces processus complexes et présentent des limites pour l’étude du développement des ovaires et des testicules in vivo. Néanmoins, une veille scientifique sera assurée et, si des méthodes alternatives pertinentes et validées deviennent disponibles, elles seront privilégiées afin de remplacer tout ou partie de l’utilisation des poissons zèbres.

Réduction

La planification des croisements et l'identification des animaux porteurs des modifications génétiques d'intérêt permettront d'ajuster la production animale aux besoins stricts du projet et d'éviter toute surproduction. Les schémas de croisement seront optimisés afin d'obtenir les animaux présentant les caractéristiques génétiques recherchées avec un nombre minimal d'animaux. Les effectifs ont été estimés à partir des proportions mendéliennes attendues des différents profils génétiques et du sex-ratio attendu chez le poisson zèbre (environ 50 % de femelles et 50 % de mâles), ainsi que du nombre d'animaux nécessaire à la réalisation des analyses prévues. Les modifications génétiques étant susceptibles d'influencer ce sex-ratio, les effectifs seront ajustés au cours du projet en fonction des résultats obtenus si cela est nécessaire. Les groupes de reproducteurs seront constitués de manière à respecter le comportement grégaire de l'espèce, à garantir la présence des deux sexes et à disposer d'un effectif suffisant pour la réalisation des analyses, tout en prévoyant des périodes de repos. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques, les mêmes individus pourront être utilisés pour plusieurs analyses afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. La production de nouveaux animaux sera interrompue dès que le nombre d'individus nécessaire à la réalisation des analyses prévues aura été obtenu.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en œuvre afin de minimiser la douleur, le stress et la souffrance des animaux. Les prélèvements de nageoire caudale seront réalisés sous anesthésie, avec une durée d’anesthésie limitée au strict nécessaire et un prélèvement de taille minimale pour l’analyse génétique. Compte tenu de la forte capacité de régénération de la nageoire caudale chez le poisson zèbre, aucune séquelle durable n’est attendue. Une surveillance post-procédure sera assurée jusqu’à la reprise d’un comportement normal de nage et d’alimentation. Des points limites sont définis : tout animal présentant un réveil prolongé ou des troubles persistants de la nage sera euthanasié par surdose d’anesthésique afin de prévenir toute souffrance prolongée. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux recommandations pour l’espèce (densité adaptée, enrichissement du milieu et suivi sanitaire régulier) afin de limiter le stress et de favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle largement utilisé pour étudier le développement des organes et de nombreuses maladies humaines. Cependant, les mécanismes qui déterminent si un individu devient mâle ou femelle restent encore mal compris chez cette espèce. Mieux comprendre ces mécanismes permettra d'améliorer l'interprétation des études utilisant ce modèle, notamment lorsque le sexe influence les résultats. Cette recherche présente également un intérêt plus général, car elle permettra de mieux comprendre comment les mécanismes de détermination du sexe ont évolué chez les vertébrés. Elle pourrait aussi avoir des applications en aquaculture, où la maîtrise du sexe des animaux peut être utile. Enfin, le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce type d'étude grâce aux nombreux outils disponibles pour modifier son patrimoine génétique et à des conditions d'élevage bien maîtrisées. Les analyses seront réalisées sur des poissons âgés de 19 à 30 jours après la fécondation, une période au cours de laquelle les organes reproducteurs se développent progressivement et se différencient pour former des ovaires ou des testicules.

Les expérimentateurs chauffent rapidement l'eau des bacs jusqu'à ce que les poissons perdent l'équilibre. Trois espèces sont concernées, 342 vairons, gardons et gobies à taches noires juvéniles, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit un stress thermique aigu, accélération respiratoire, agitation, fatigue importante et perte d'équilibre, reconnaît un risque de non-récupération ou de mortalité malgré l'arrêt immédiat du test, et présente par ailleurs les aquariums de stabulation de deux cents litres, avec rochers, plantes et cachettes, comme un "environnement non stressant". Ils sont ensuite tués pour des analyses physiologiques de leurs tissus.

Objectifs

Le changement climatique entraîne une augmentation de la fréquence et de l’intensité des vagues de chaleur. Les conséquences de ces épisodes extrêmes sur les écosystèmes aquatiques restent encore mal connues. Ce projet vise à comprendre comment des vagues de chaleur affectent les organismes vivant dans les lacs, depuis les algues microscopiques et petits invertébrés jusqu’aux poissons. Une attention particulière sera portée à trois espèces de poissons d’eau douce : le vairon, le gardon, et le gobie à taches noires. Le vairon est un petit poisson très répandu et souvent utilisé pour étudier l’impact des changements de l’environnement. Le gobie à taches noires est une espèce envahissante dont il est important de comprendre la capacité à s’adapter au réchauffement. Le gardon est une espèce très commune qui joue un rôle important dans les écosystèmes aquatiques. Étudier ces trois espèces permettra de mieux comprendre comment différents poissons réagissent à l’augmentation de la température de l’eau.Les poissons seront maintenus soit en laboratoire, soit dans des mésocosmes (bassines extérieures reproduisant un mini-lac). Ils seront ensuite exposés à une augmentation progressive de la température afin de déterminer leur limite de tolérance thermique. L’objectif est de savoir si la capacité d’un individu à résister à la chaleur permet de prédire la survie des espèces et le fonctionnement global de l’écosystème lors d’une vague de chaleur. Les résultats permettront de mieux comprendre la vulnérabilité des espèces aquatiques face au réchauffement climatique et d’améliorer les outils permettant d’anticiper les effets futurs du changement climatique sur la biodiversité.

Bénéfices attendus

Habituellement, la mesure de tolérance thermique est réalisée sur des individus isolés, en laboratoire. Ici, elle sera également étudiée dans un écosystème complet intégrant plusieurs niveaux de la chaîne alimentaire. Cette approche est importante car la présence d’autres espèces et les interactions naturelles peuvent modifier la tolérance réelle à la chaleur et conduire à des résultats différents de ceux obtenus en conditions simplifiées.

Procédures

Les poissons seront marqués individuellement pour pouvoir suivre leur comportement. 16h avant la mesure de tolérance (c.-à-d. la veille), les poissons seront mis à jeun car la digestion peut influencer la mesure de tolérance. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température jusqu’à perte d’équilibre.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances susceptibles d’être observées sont le stress lié à la capture, au transport, et aux manipulations (incluant le marquage des individus). Lors des tests de tolérance à la chaleur, les poissons peuvent présenter un stress thermique aigu se traduisant par une augmentation du rythme respiratoire, une agitation, une fatigue importante et une perte d’équilibre. Un risque limité de non-récupération ou de mortalité existe malgré l’arrêt immédiat du test dès l’apparition des points limites définis.

Devenir

Les individus seront euthanasiés afin de réaliser des analyses physiologique de leur tissus.

Remplacement

L’écologie a pour objet l’étude de la dynamique des peuplements et des écosystèmes. Les recherches en écologie nécessitent donc d’intégrer des niveaux d’organisation du vivant allant jusqu’à l’écosystèmes. Ainsi, il n’est pas possible de substituer des tissus ou des cellules à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des trois R : remplacement) étant donné qu’il s’agit ici d’étudier la réponse physiologique de poissons. Nous avons choisi d’utiliser les poissons car ils sont souvent les tops prédateurs dans les écosystèmes aquatiques. Utiliser un modèle vertébré (le poisson) est pertinent dans ce contexte car il s’ajoute au modèle invertébré, déjà présent dans cette expérimentation.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés est déterminé de manière à obtenir des résultats fiables, tout en limitant le nombre d’animaux. D’après la littérature scientifique, la température maximale supportée par le vairon est estimée autour de 32°C, celle du gardon autour de 35,8°C et celle du gobie à taches noires autour de 35°C également. Ces estimations permettent d’anticiper les seuils critiques lors des tests. Deux opérateurs assureront une surveillance continue pendant l’augmentation de la température. Dès qu’un poisson montre qu’il atteint sa limite de tolérance (perte d’équilibre), il est immédiatement retiré et placé dans un bac à température adaptée pour favoriser sa récupération. L’augmentation de la température sera organisée de façon progressive et décalée entre les différents bassins afin d’éviter que tous les poissons atteignent leur limite thermique en même temps.

Raffinement

Les aquariums où les poissons sont maintenus avant les expériences contiendront des rochers, des plantes et des cachettes afin de leur offrir un environnement non stressant. Leur grand volume (200 litres) permet aux poissons de s’isoler et d’avoir des comportements naturels. Les aquariums utilisés pour les tests seront plus petits et simples afin d’observer clairement les réactions des poissons. Trois côtés seront opaques pour réduire les stimulations visuelles liée aux déplacements de l’observateur, accompagné d’un système de surveillance vidéo à distance. Tous les aquariums seront bien oxygénés et alimentés avec une eau identique à celle des aquariums de stabulation. La température et la qualité de l’eau seront contrôlées régulièrement. Les poissons seront manipulés avec précaution : capturés un par un, placés brièvement dans un petit bac sombre pour les transferts (environ 30 secondes), et maintenus par deux afin de limiter l’isolement. L’éclairage des pièces sera tamisé pour réduire le stress. Des critères d’arrêt précis (points limites) sont définis afin d’interrompre immédiatement l’expérience en cas de signe de souffrance.

Choix des espèces

Le vairon, le gardon et le gobie à taches noires ont été choisis pour leurs caractéristiques écologiques complémentaires et leur pertinence pour l’étude des réponses aux stress thermiques. Le vairon est une espèce d’eau douce couramment utilisée en toxicologie, sensible aux variations environnementales et bien adapté à la manipulation expérimentale, ce qui permet de relier des mesures physiologiques en laboratoire à des réponses observables en mésocosmes. Le gobie à taches noires est une espèce exotique envahissante à fort impact écologique, dont l’étude de la tolérance thermique permet de mieux comprendre son potentiel de persistance dans un contexte de réchauffement climatique. Finalement, le gardon est une espèce généralise et très abondantes dans les écosystèmes aquatiques. Il est plus tolérant que le vairon. Seuls des individus juvéniles seront utilisés afin de s’affranchir des effets liés à la reproduction et d’attribuer les variations observées uniquement aux traitements thermiques.

Tous tués en fin de projet parce qu'ils sont génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, 1 920 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour produire des lignées mutantes croisées avec des lignées fluorescentes dont d'autres travaux se serviront ensuite pour étudier la cicatrisation de la peau. Une minorité subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour l'identification génétique, ce qui suppose un isolement pouvant durer jusqu'à dix jours. Ces poissons sociaux peuvent alors s'immobiliser comme s'ils dormaient profondément ou changer de couleur sous l'effet du stress, et une partie des lignées développe à partir de six mois une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. Le porteur justifie le choix du poisson zèbre par ses capacités de réparation de la peau, du cœur ou de la queue et par la transparence de ses embryons, et décrit cet élevage de mutants comme un outil "puissant et indispensable".

Objectifs

Cette demande d'autorisation concerne la création de poissons zèbres génétiquement modifiés. Une meilleure réparation de la peau après blessure est une préoccupation majeure chez l'homme. Ainsi, dans la plupart des cas, après blessure, la surface de la peau se répare bien, au contraire de la partie inférieure de la peau. Il y a alors souvent formation d'une cicatrice qui peut être associée ou non à une perte de fonctions. Le poisson zèbre, lui, est un modèle de choix pour étudier la cicatrisation, car il présente des capacités étonnantes de réparation de sa peau mais aussi de plusieurs de ses organes (le cœur ou le cerveau par exemple). Pour autant, on ne sait pas précisément comment le poisson zèbre arrive à réparer aussi bien sa peau après blessure. L'objectif de notre projet est d'étudier la cicatrisation du poisson zèbre. Cette demande d'autorisation concerne plus particulièrement la nécessité, pour le projet, d'élever des poissons mutants. Ces mutations ciblent différents acteurs de la cicatrisation. Les poissons mutants seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise à disposition de poissons qui pourront être utilisés pour l'étude de la cicatrisation cutanée. Ces poissons mutants ciblent différents acteurs de la cicatrisation de la peau et seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple). A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de cicatrisation cutanée pourrait être précieuse en médecine humaine. L'épiderme conserve une grande capacité de réparation chez l’homme tandis que la réparation de la couche dermique profonde entraîne, dans la majorité des cas, la formation d'une cicatrice qui peut être associée à une perte substantielle de sa structure, de ses propriétés mécaniques et de sa fonction d'origine. Faciliter et améliorer la cicatrisation cutanée et minimiser l'impact esthétique sur le patient en améliorant la restauration de l'épiderme mais surtout du derme restent donc des préoccupations majeures pour garantir une bonne réparation des tissus et améliorer le bien-être des patients.

Procédures

Certains poissons seront soumis à une unique biopsie d'un fragment de nageoire réalisée sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Pour certains poissons, à partir de 6 mois, les signes à surveiller sont l'apparition d'une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. De plus, pour connaître l'identité génétique des poissons, il est nécessaire de prélever un petit bout de sa nageoire caudale, ce qui peut causer du stress chez le poisson, étant donné qu’il faut le capturer et le manipuler. Enfin, par nature, les poissons-zèbres sont des animaux sociaux qui ont besoin d’interaction avec leurs congénères afin de vivre au mieux durant les périodes de repos et d’activités. Les poissons zèbres placés en isolement lors de la période d'identification peuvent donc développer des comportements anormaux comme une apparence de sommeil profond, ou encore un changement de couleur dû au stress. La période d'isolement ne dure pas plus de 10 jours et est communément bien plus courte mais les délais d'obtention des cartes d'identité génétique peuvent nécessiter un isolement jusqu'à 10 jours maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet. Les animaux étant tous génétiquement modifiés, on ne peut donc pas les faire adopter en fin de procédure.

Remplacement

Le processus de réparation de la peau intervient dans un environnement complexe qu'il n'est pas possible de reproduire entièrement in vitro. Par exemple, le recrutement des cellules de défense de l'organisme est un paramètre important. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour ce projet.

Réduction

La capacité de fécondation externe des poissons zèbres permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. La sélection des poissons fluorescents (au stade embryonnaire) permet de n'élever et ne conserver que les poissons intéressants. Une minorité de poissons élevés pendant les 2 ans subira le prélèvement nécessaire pour établir son identité génétique. Le nombre de poissons nécessaires a été optimisé afin d'assurer la pérennité de chaque lignée.

Raffinement

Les poissons génétiquement modifiés susceptibles de développer des symptômes seront suivis avec une fréquence rapprochée, en portant une attention particulière aux signes préoces connus pour cette lignée. Des points limites adaptés à la procédure et suffisamment prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être et souffrance des animaux. Les accouplements sont réalisés sur des paillasses recouvertes de photographies de flore aquatique afin de limiter le stress le plus possible. La réalisation des prélèvements de l’extrémité de la nageoire caudale (située à l'extrémité du tronc du poisson) sera effectuée sous anesthésie générale. Lors des périodes d'isolement, les animaux seront placés par 2 dans un bac avec un séparateur au milieu afin qu'il y ait échange hormonal et que les poissons isolés puissent tout de même voir et sentir leur congénère. De plus, lors de cet isolement les poissons bénéficieront de nourriture vivante (artémia).

Choix des espèces

Les outils génétiques disponibles chez le poisson zèbre peuvent aider à identifier le rôle des acteurs impliqués dans la réparation parfaite de la peau après blessure et de les suivre en temps réel . Ce projet d'élevage et de création de mutant va ainsi constituer un outil puissant et indispensable pour permettre ensuite de comprendre le rôle de ces acteurs. Le poisson zèbre est un modèle de choix pour étudier la réparation parfaite de ses organes chez les vertébrés car il montre des capacités de réparation étonnantes comme celle du cœur ou encore de sa queue. D'autres avantages comme le développement externe et rapide des embryons, leur transparence ainsi que celle des jeunes alevins et leur traçabilité génétique en font pourtant un modèle idéal pour l'imagerie de la dynamique de la cicatrisation. Dans nos conditions d’élevage, les poissons adultes atteignent leur maturité sexuelle à 6 mois et sont donc utilisés comme reproducteurs entre 6 et 12 mois pour produire les géniteurs de la génération suivante. L'identification génétique par biopsie d'un fragment de nageoire est réalisée sur des poissons de 3 à 5 mois car la distinction entre mâles et femelles ne peut pas être détectée plus tôt (pas de chromosome sexuel). Aussi nous pouvons préserver un bon ratio mâle-femelle dans nos élevages.

Filmés trente minutes dans un bac pour classer leurs performances de nage, traités par un antalgique, endormis, puis injectés dans la cavité abdominale avec un vaccin, 270 killis turquoise d'Afrique sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces poissons vieillissent vite, six mois de vie en captivité, et le porteur attend chez eux une perte de pigmentation, une émaciation, une baisse de la prise alimentaire et des changements de comportement qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation. Les individus sont observés entre 2 et 6 mois, par groupes de 6 à 10, pour relier des populations immunitaires à la perte de mobilité au cours du vieillissement. Tous sont tués et disséqués à l'issue, afin d'extraire les cellules immunitaires de leurs organes.

Objectifs

Aujourd’hui, les personnes âgées de plus de 60 ans représentent 1/4 de la population française et pourraient en représenter 1/3 en 2050. Si l’espérance de vie en France après 50 ans s’avère élevée, le nombre d’années vécues en bonne santé reste inférieur à celui de plusieurs pays de l’UE. Il est donc urgent d’intervenir pour ralentir cette progression défavorable et améliorer la qualité de vie au cours de l’avancée en âge. Dans ce contexte, l'OMS a identifié 5 domaines, la mobilité, la vitalité, les capacités neurosensorielles, le psycho-social et la cognition, qui doivent être préservées ou restaurées chez la personne âgée pour promouvoir son "bien vieillir". L’objectif de ce projet est de caractériser les modifications du système immunitaire associées à la perte de mobilité spontanée, une des grandes fonctions à préserver pour vieillir en bonne santé, en utilisant un modèle animal présentant un vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu au cours du vieillissement. Nous pourrons évaluer quelles populations immunitaires sont associées à la diminution de la locomotion. Les outils développés dans ce projet pour cartographier les réponses immunitaires avec l’âge seront mis à disposition de la communauté scientifique. A plus long terme, les résultats permettront d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de proposer de nouvelles approches d'immunomodulation afin de préserver la mobilité et favoriser le "bien vieillir".

Procédures

Nous utiliserons des poissons mâles pour caractériser les populations immunitaires modifiées avec la perte de mobilité associée au vieillissement. Les principales populations identifiées chez le mâle seront testées chez les femelles. Puis, nous évaluerons la réponse à une vaccination chez les poissons en comparant les réponses immunitaires induites par l'injection intrapéritonéale de vaccin contenant ou non un composé pro-inflammatoire. Les poissons seront traités par un antalgique avant d’être endormis pour prévenir la douleur liée à l'injection et réduire l’angoisse associées à cette intervention. Les poissons injectés seront également traités par un antalgique après l’injection. Les poissons seront filmés au préalable (trois jours à une semaine avant la vaccination) pendant 30 min dans un bac pour enregistrer les mouvements de nage spontanés et permettre de classer les individus âgés en fonction de leur performance physique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent l’injection du vaccin et les conséquences de la vaccination. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).

Devenir

Au terme des procédures, tous les animaux (n=270) seront mis à mort et disséqués afin de récupérer différents organes pour extraire les cellules immunitaires ou pour procéder à des analyses histo-pathologique et transcriptomique.

Remplacement

Le processus de vieillissement est très variable d'un individu à l'autre. Pour mieux comprendre ces différentes trajectoires de vieillissement à l'échelle individuelle, il est nécessaire d'étudier l'évolution des fonctions, comme la mobilité, chez des organismes vivants. Les individus âgés nous permettront d’étudier les réponses immunitaires dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement in vivo. Le Turquoise Killifish est un modèle unique et indispensable pour étudier, de manière intégrée, à l'échelle de l'organisme entier, les réponses immunitaires en fonction de la qualité du vieillissement des individus.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’individus, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les poissons sont observés aux âges extrêmes de la vie (2 mois à 6 mois) et leur capacité de locomotion est évaluée. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques et fonctionnels généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 à 10 individus au total seront constitués pour mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction). Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles pour un même individu.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire) ou l'amaigrissement (creusement de la partie ventrale du poisson). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à un suivi du poids sur 1 semaine. Si la perte de poids est trop importante, le protocole expérimental sera interrompu. La surveillance du poids se poursuivra jusqu'à stabilisation ou atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort de l'individu.

Choix des espèces

Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce de choix, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur en terme de tissus et de cellules présents. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un vieillissement systémique, là aussi comparable à celui des rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d’une exploration fonctionnelle in vivo couplée à des études biologiques intégrées et à la caractérisation de sous-populations cellulaires ex vivo. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.