Poissons
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
La larve de poisson-zèbre comme modèle d’étude in vivo pour évaluer les effets « cocktails » de perturbateurs endocriniens sur la progression pathologique des NAFLD et le rôle des vésicules extracellulaires hépatiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.
Objectifs
Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.
Bénéfices attendus
Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.
Procédures
Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)
Impact sur les animaux
L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.
Réduction
Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p
Raffinement
Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.
Choix des espèces
Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).
Effets de la température sur la physiologie et l’écologie du médaka.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
80 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont manipulés, photographiés et pesés, puis soumis par couple à une montée rapide de température jusqu'à la perte d'équilibre, pour mesurer leur tolérance thermique dans un contexte de changement climatique. Le porteur reconnaît un stress lié aux manipulations et au stress thermique, les poissons étant mis à mort après deux semaines pour prélever leurs muscles et alimenter une banque de tissus. Il affirme que l'étude de l'écologie ne peut se faire ni sur cellules ni sur tissus isolés.
Objectifs
Les effets du changement climatique sur la faune et la flore sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est donc d’identifier les effets de ce changement sur la survie des espèces et la biodiversité. L'objectif de ce projet est d’examiner comment la température influence les réponses physiologiques du poisson médaka Oryzias latipes. Nous voulons utiliser des poissons élevés à deux températures afin de réaliser des mesures de tolérance thermique (résistance à des températures chaudes) pour déterminer si les poissons peuvent s’adapter à des températures plus élevées. Nous nous attendons à ce que les poissons élevés à des températures chaudes puissent tolérer des températures plus élevées que ceux élevés à des températures froides. L’objectif de ce projet est donc de tester cette hypothèse.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de l’adaptation des poissons à des températures plus chaudes.
Procédures
Les poissons seront soumis à des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, mesures morphométriques et pesées). Les transferts durent environ 10 secondes et le poisson est immergé dans un bac de 2L. Pour les mesures morphométriques, nous prenons des photographies des poissons dans une boite de pétri avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés mais sans possibilité de nager. La prise de photo prend 30 secondes. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et le poisson reste immergé. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température et serons sortis du groupe pour être placés en couple. L’expérience durera 4h au maximum pendant lesquelles les poissons seront exposés (par couple) à une montée rapide de la température jusqu’à la perte de l’équilibre du poisson qui est utilisée comme indicateur du CTmax. Les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Tout d’abord, les poissons subiront un léger stress lors des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, photographie et pesées). Les poissons subiront un stress plus important lors des expériences de tolérance thermique en raison du stress thermique et de la sortie du groupe (isolement en couple). Néanmoins, ce type d’expérience est pratiqué sur les poissons depuis des décennies et n’entraîne pas de mortalité. Dans notre cas, l’expérience sera de courte durée (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Devenir
Pour cette expérience, n=80 (40 mâles, 40 femelles) individus seront utilisés au total pour la mesure de tolérance thermique. Après deux semaines de récupération, ils seront ensuite mis à mort. Leurs muscles seront ensuite utilisés pour effectuer des mesures de respiration tissulaire. De plus, tous les individus seront stockés dans une banque de tissus pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'écologie a pour objet l'étude des populations et des écosystèmes. Il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses comportementales et physiologiques des poissons.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un total de 80 poissons. Puisque les mâles et les femelles ont des physiologies différentes, il est nécessaire de tester les deux sexes (mâles et femelles). Notre choix pour ce nombre de poisson est justifié par des tests statistiques qui indiquent que l’on doit tester 80 poissons pour pouvoir détecter une différence entre les poissons élevés à des températures chaudes et ceux élevés à des températures froides et pour détecter d’éventuelles différences entre les lignées.
Raffinement
Pour les transferts entre aquarium, nous utilisons un bac de 2L avec un fond noir pour ne pas stresser les poissons. Les transferts sont rapides (10 secondes). Pour les photographies, nous prenons des photographies des poissons dans une boite avec un fond d’eau afin que les poissons restent immergés. La prise de photo prend 30 secondes et la lumière est tamisée pour réduire le stress au maximum. Pour peser les poissons, chaque poisson est transféré individuellement dans un bac de 2L noir opaque, contenant de l’eau de l’élevage (cette eau est changée à chaque poisson pour limiter le stress lié à la production d’hormones). Le poisson est ensuite transféré dans un petit contenant noir opaque contenant 100mL d’eau. Le contenant et son contenu sont ensuite pesés à l'aide d'une balance de précision. Le poisson est ensuite retourné à l'élevage. Cette manipulation est rapide (1 minute par poisson) et est effectuée sous lumière tamisée. Les mesures de tolérance thermique seront les plus courtes possible (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois. Les poissons pourront observer leurs congénères dans les aquariums voisins ce qui permettra de diminuer leur niveau de stress. Aucun personnel ne sera présent dans la pièce pendant les mesures (surveillance par caméra). Nous contrôlerons la température et l’oxygène pendant l’expérience et nous stopperons l’expérience si la montée en température n’est pas conforme au protocole (1°C par 10 minutes) ou si la concentration en oxygène est trop faible. Le lendemain de l’expérience de tolérance, les poissons sont transférés dans des aquariums à leur température d’élevage (bacs d’eau fraîche et oxygénée). Les poissons seront mis par couple mâle/femelle avec 6 couples par aquarium afin de limiter le stress lié à l’isolement. Si nous constatons que l’hébergement par couple pose un problème (ex : male agressif envers la femelle), nous ajouterons des poissons de l’élevage de taille plus petites ce qui nous permettra d’identifier nos poissons « tests » sans utiliser de marquage. Les poissons seront ainsi maintenus et nourris dans ces aquariums pendant deux semaines afin de s’assurer de leur bonne récupération. Nous évaluerons l’état sanitaire des poissons 30 minutes et 1 heure après la perte d‘équilibre, ainsi que le lendemain de l’expérience et ensuite après 3, 7, 10 et 14 jours.
Choix des espèces
Nous avons choisi le médaka car il vit naturellement dans les milieux peu profond et riches en nutriments, typiquement les rizières (d'où le nom du genre, Oryzias). Ces milieux sont très chauds en été et très froids en hiver. Ils sont donc naturellement très rustiques. Nous utiliserons des poissons adultes à l’optimum physiologique (âgés de 200 jours) correspondant à un standard concernant les mesures physiologiques puisque ces dernières peuvent différer selon l’âge des poissons.
Création d’un modèle de dégradation de la paroi intestinale chez la truite arc-en-ciel en vue du développement d’un additif alimentaire correcteur
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
40 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant vingt-huit jours, elles reçoivent une alimentation dosée à dix fois la limite réglementaire européenne en déoxynivalénol, une mycotoxine, pour dégrader leur paroi intestinale, avec marquage par transpondeur et prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever l'intestin. Le porteur décrit une perte de poids, un refus de s'alimenter et une inflammation de l'anus. Il indique que les tests in vitro sur cellules humaines ne suffisent pas et qu'il faut connaître le mode d'action de la toxine chez le poisson visé, en vue d'un additif alimentaire.
Objectifs
Le projet présenté ici a pour objectif de développer un modèle de dégradation de la paroi intestinale chez la truite arc-en-ciel en vue du développement d’un additif alimentaire comme stratégie de prévention aux mycotoxines retrouvées dans les régimes alimentaires de poissons. Les mycotoxines sont des métabolites secrétés par des moisissures.Elles sont produites par une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après la récolte. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent entraîner des conséquences sur leur santé et leurs performances. Les effets des mycotoxines varient en fonction de leur nature, de leur concentration et des espèces contaminées. Leur particularité et leur danger tiennent aussi à une forte résistance à la chaleur, même après l'extrusion de l'aliment. Parmi toutes les mycotoxines, la déoxynivanélol, est celle la plus couramment trouvé représentant un facteur de stress « naturel » avec comme voie d’entrée le tractus digestif, son effet est difficilement décelable sans recours à des analyses spécifiques. Contrairement aux possibles utilisations de produits chimiques ou autres toxines pour induire le délabrement intestinal, la déoxynivalénol est une toxine qui est présente naturellement dans l’alimentation des poissons. Elle constitue donc un moyen pour développer le modèle de délabrement intestinal, tout en permettant de mieux appréhender son mode d’action qui sera utile et applicable aux actuels problèmes de l’industrie aquacole. Cependant, selon le groupe CONTAM de l’EFSA (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments), les données disponibles sur la toxicité de la déoxynivalenol sont limitées pour les poissons d’élevage et aucun critère d'effet spécifique pour les effets aigus n'a été identifié. De plus, les données disponibles sont relatives aux effets sur les paramètres immunitaires, hépatiques ou neuroendocriniens mais pas sur les paramètres intestinaux. À la vue du peu de données disponibles, il a été choisi de doser la toxine dans des conditions permettant d’induire un plausible délabrement de la paroi intestinale soit à un niveau d’inclusion de 50 mg/kg d’aliment correspondant à 10 fois la dose règlementaire européenne mais aussi à une dose suffisante pour bien comprendre le mode d’action et détecter les effets au moyen des méthodes d'analyses sélectionnées.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet à court terme permettront de comprendre le mode d’action de cette mycotoxine au niveau intestinal et contribueront ainsi à répondre aux problèmes actuels de l’industrie aquacole et aussi à développer un additif alimentaire correcteur chez la truite arc en ciel. Les résultats de ce projet aideront à revoir à la baisse le nombre d’animaux utilisés par traitement. En effet, à ce jour, aucune donnée n’est disponible sur l’effet de cette mycotoxine sur les paramètres étudiés chez la truite arc en ciel. Le fait de mieux connaitre les écarts types de nos paramètres d’intérêt permettra de raffiner les tests statistiques utilisés pour définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour répondre à l’hypothèse de l’étude. De plus, si une corrélation est faite entre les effets au niveau de l’intestin et le niveau de biomarqueurs ciblant la santé intestinale au niveau sanguin, un seul et même animal pourrait être utilisé pour évaluer l’effet aigu et chronique de la mycotoxine (cinétique sanguine) dans une prochaine étude pilote d’évaluation de l’effet d’un additif correcteur, diminuant au moins de moitié le nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 28 jours. Chaque poisson anesthésié sera identifié une fois au début de la procédure par un transpondeur placé dans le muscle du dos. La moitié des animaux (soit 20 poissons) seront soumis à un prélèvement sanguin à jour 7 et l’autre moitié à la fin de l’étude (J28). A chaque temps (J7 et J28), un volume sanguin de 4 ml nécessaire et suffisant, pour analyser la concentration plasmatique des mycotoxines et des biomarqueurs, est prélevé en une seule fois sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. A la fin de la prise de sang, les poissons sont euthanasiés (procédure sans réveil) pour le prélèvement des contenus et des tissus intestinaux.
Impact sur les animaux
Perte de poids, diminution du facteur K (coefficient révélant l'état physiologique des poissons en terme de poids, de longueur, relation taille-poids), refus de s’alimenter, inflammation de l’anus.
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements biologiques tels que les intestins et les contenus intestinaux.
Remplacement
Des alternatives non animales, réalisées in vitro ont démontré l’effet néfaste et cytotoxique de la déoxynivalenol sur des lignées cellulaires intestinales humaines. Ces méthodes confirment l’effet délétère de la mycotoxine, la déoxynivalenol. Cependant, le développement d’un additif alimentaire correcteur implique de connaitre le mode d’action de la mycotoxine chez l’animal auquel il est destiné. La procédure expérimentale utilisant des animaux vivants, est, sur la base des connaissances acquise in vitro, nécessaire pour comprendre et évaluer l’effet de la mycotoxine au niveau de l’intestin de la truite arc en ciel spécifiquement.
Réduction
Les alternatives non animales décrites dans la littérature sur l’effet de la déoxynivalenol chez la truite arc en ciel ont ciblés des paramètres immunitaires, hépatiques ou neuroendocriniens mais pas intestinaux. Une seule étude a montré l’impact de la déoxynivalénol ajoutée à 5.5 mg/kg sur l’intégrité intestinale chez le saumon. Sur la base des résultats rapportés dans cette étude, un test statistique de référence a permis de réduire le nombre d'animaux par groupe à 10 sans affecter l'effet attendu. Ainsi, 2 groupes d’animaux seront considérés avec 2 temps de prélèvements (7 j post traitement avec la mycotoxine et 28 jours post traitement). Pour chaque temps de prélèvement, 10 animaux par groupe seront utilisés et prélevés afin de pouvoir bien évaluer les paramètres d’intérêt de ce projet.
Raffinement
Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont sédatées puis anesthésiées à. Utilisation d'un anesthésique local par voie intramusculaire une fois l'animal marqué afin de réduire la douleur après le marquage. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée individuelle des animaux et pour le marquage au-dessus de la ligne media et les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin (
Choix des espèces
Les additifs alimentaires susceptibles d’être développés afin d’atténuer les effets des toxines, sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux poissons d’eau froide. Il peut s’agir de la truite qui fait partie de la famille des salmonidés, utilisée comme modèle pour les poissons d’eau froide car il est taxonomiquement proche du saumon, et également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, avec un taux de croissance plus élevé. Truites jeunes/adultes pesant entre 550 et 650 grammes. Cette taille de poisson est nécessaire pour pouvoir effectuer les échantillonnages de tissus et les prélèvements de sang demandés par l’étude
Suivi des migrations des aloses par radiotélémétrie
- Conservation des espèces
400 aloses, grandes aloses et aloses feintes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées dans le milieu naturel. Chaque poisson est capturé au passage d'une passe, anesthésié puis équipé d'un émetteur radio inséré dans l'estomac, avant d'être remis à l'eau pour suivre sa migration. Le porteur décrit une manipulation de moins de trois minutes et un marquage intragastrique choisi pour éviter une incision. Il justifie le recours à des géniteurs sauvages par l'objectif de connaître le comportement migratoire d'espèces en fort déclin et juge le remplacement impossible.
Objectifs
Pour accomplir leur cycle biologique certaines espèces de poissons doivent effectuer des migrations entre l’eau douce des rivières et l’eau salée des océans. Ce sont les poissons migrateurs amphihalins. Les populations mondiales de poissons migrateurs se sont effondrés de 76% depuis 1976 à cause principalement des entraves à la migration, la destruction des habitats et une pêche non maitrisée. Ce chiffre est particulièrement marqué sur la période en Europe avec une chute estimée à 93%. Parmi les espèces de poissons migrateurs, les aloses, appartenant à la famille des Clupéidés (harengs, sardines), grandissent en mer plusieurs années et viennent se reproduire au printemps en eau douce. Le Comité Français de l’UICN a classé en 2019 la grande alose, Alosa alosa, en danger critique et l’alose feinte, Alosa fallax, quasi menacée.
Bénéfices attendus
Le suivi des grandes aloses et aloses feintes va apporter de nombreuses informations sur l’écologie des espèces suivies sur un cours d'eau : zones colonisées, période de présence, facteurs influençant les comportements et la survie. Ainsi, par la mise en œuvre de ce suivi, il va être possible de renforcer et d’acquérir des connaissances sur le comportement migratoire des aloses en vue d’améliorer la connaissance du cycle de vie et des paramètres qui l’impactent pour cibler une meilleure gestion de la population, actuellement en forte régression, afin de les sauvegarder.
Procédures
Pour apporter des éléments à ces questions scientifiques, un suivi des 2 espèces d'aloses sera réalisé par marquage individuel en radiotélémétrie. 400 individus seront marqués afin de recueillir suffisamment de données pour obtenir des résultats fiables. Ils seront divisés en 5 lots de 80 individus par année. Ainsi, dès la sortie de l’estuaire, les poissons sont capturés lors de leur passage dans la passe-à-poissons. La capture est réalisée dans un piège présent par conception dans le dernier bassin de la passe multispécifique. La manipulation sera réalisée de façon individuelle. Chaque alose sera transférée dans un bac (brancard) préalablement rempli d’une solution anesthésiante et mis dans l’obscurité le temps d’atteindre une sédation d’immobilisation. Le poisson est marqué par l’insertion d’un émetteur intragastrique radio dans l’estomac. L’alose est transférée dans une structure de réveil (filet immergé dans la retenue amont de l’ouvrage). Lorsque le manipulateur observe le réveil, le poisson est relâché directement dans le milieu naturel pour poursuivre sa migration. Des récepteurs de radiotélémétrie sont disposés tout le long du parcours à des endroits stratégiques afin de pouvoir cartographier les déplacements spatio-temporel entre les habitats, le comportement devant les ouvrages et le franchissement des passes-à-poissons.
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations seront faites pour éviter des nuisances et un stress supplémentaire sur les poissons. Les aloses seront marquées avec des émetteurs permettant de respecter le ratio inférieur à 2% s’assurant que la marque de perturbe pas le comportement et la flottaison du poisson. Pour réduire le stress, les poissons seront capturés de façon individuelle et transportés dans un brancard contenant une solution anesthésiante le temps de l’insertion de l’émetteur dans l’estomac, puis ils seront placés dans une structure de réveil directement dans le milieu naturel dans une zone calme mais avec un faible courant afin que dès le réveil total ils puissent poursuivre leur migration.
Devenir
Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.
Remplacement
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat des grandes aloses et des aloses feintes en milieu naturel, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (géniteurs d’aloses en migration) afin d’obtenir des données pertinentes.
Réduction
L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement des aloses pendant leur phase de migration. Il s'agit d'une approche intra-spécifique où la variabilité des trajectoires individuelles sera décrite à l'aide de statistiques descriptives et de cartographie de déplacement. Dans un système ouvert de moyenne taille comme la Charente, le choix de 400 individus sur la durée du projet correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités intra-spécifique (sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif) et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (débit, température, habitats, blocages…). Cet échantillon de 400 poissons sera divisé par lot de 80 individus marqués par année et réparti entre 50 grandes aloses et 30 aloses feintes. Le nombre annuel de géniteurs de grande alose (50) a été défini pour acquérir suffisamment de données pour fournir une image de la diversité des comportements de migration sur la partie médiane et amont du fleuve. Pour les aloses feintes, le choix de 30 individus annuellement est jugé suffisant pour des tests de faisabilité et suivre les comportements de migration sur la partie aval du fleuve. Egalement, nous avons considéré comme déterminant le franchissement des 4 ouvrages en amont du site de capture et, en se basant dans la littérature sur une perte de 40% de poissons à chaque franchissement de passe, sur 80 poissons relâchés en amont du premier ouvrage, 17 pourraient se présenter au pied du 4ième ouvrages, et 10 le franchir, ce qui permettrait d’avoir un jeu de données sur le site (rampe à macrorugosités dimensionnée pour les aloses).
Raffinement
Avant le marquage, les individus présentant des lésions externes ou amaigris sont écartés du suivi afin de ne pas leur faire subir de manipulation. Cependant, s’il est estimé que les poissons peuvent récupérés et, dans la mesure du possible, ils seront soignés notamment en ce qui concerne les lésions externes par un pansement hydrostatique. Puis, l’individu est mis dans un brancard de stabulation contenant 25 ppm de solution anesthésiante de Benzocaïne 10%. L’individu se retrouve dans l’obscurité du brancard. L’eau est claire permettant une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus. Le recours à une anesthésie adaptée permet de manipuler le poisson sans risque pour celui-ci et de diminuer son stress. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Pour cela, nous observerons que le réflexe de redressement et la mobilité sont absents, et que la réaction au stimulus et la fréquence des battements operculaires branchiaux soient réduits. Une fois le stade de l’immobilisation atteint, les émetteurs stériles, sont délicatement insérés dans l’estomac avec un tube d’insertion désinfectés. Nous avons choisi le marquage par insertion intragastrique afin de réduire la souffrance en évitant une intervention chirurgicale puisqu’il ne génère pas d’incision du muscle et donc pas de blessure. L’insertion de la marque sera rapide pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des poissons et, d’expériences dans l’insertion de ce type de marque, la manipulation n’excédera pas 3 min minutes puis les aloses seront placées dans une structure flottante (filet cage) de réveil d'1m3 directement située dans le milieu naturel dans la retenue de l’ouvrage. Un léger courant permet d’assurer de bonnes conditions de réveil et de préparer le poisson à son lâché. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : Pas de changement d’eau (brancard rempli avec de l’eau de la rivière), • Tri des poissons afin de marquer des poissons sains, Capture avec épuisette réduite pour limiter les risques de pertes d’écailles et de blessure (Un seul passage unique en épuisette (de 43 cm de large et un filet en mailles fines de 4mm), Structure de réveil (filet cage) dans l’eau de la rivière pour observer le comportement du poisson marqué avant la relâche, Surveillance des poissons pendant toutes les phases, de la capture au lâcher.
Choix des espèces
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et l’utilisation de l’habitat des grandes aloses et des aloses feintes en milieu naturel, il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (géniteurs d’aloses en migration). Nous utiliserons les géniteurs d'aloses lors de la phase de remontée sur frayère pour suivre leur comportement de migration de reproduction.
Impact du lopéramide sur la composition du microbiote chez le poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 566 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés vingt-quatre heures au lopéramide, un antidiarrhéique, puis tués par homogénéisation pour analyser leur microbiote et mesurer taille et poids hors de l'eau. Le porteur n'attend aucun effet délétère, la dose étant décrite comme non toxique dans la littérature, et prévoit de ne pas conserver les larves au-delà de onze jours. Il indique que l'effet sur la dynamique du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo, le stade larvaire présentant selon lui un système digestif comparable à celui des mammifères.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine mais peut être affectée par diverses perturbations extérieures telles que les antibiotiques ou stress chimique. L’étude de l’impact de ces perturbations dont les médicaments sur le microbiote connait un intérêt grandissant afin de développer à l’avenir des approches complémentaires pour réduite leurs effets indésirables. Ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-microbiote. Notre objectif est ici d’analyser l’impact du lopéramide, un médicament anti-diarrhéique couramment prescrit en clinique et utilisé pour mimer les dysfonctionnements intestinaux sur modèles animaux, sur la composition et la stabilité du microbiote naturel du poisson zèbre et d’identifier les éventuelles conséquences sur l’hôte.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et les perturbations pouvant l’affecter sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. En effet, ceci s’intègre dans l’intérêt grandissant pour l’étude de l’impact de médicament couramment utilisés chez l’Homme sur le microbiote et le développement futur d’approches complémentaires pour contrer ou réduire les effets indésirables ainsi identifiés.
Procédures
Les poissons-zèbres au stade larvaire seront exposés pendant 24 heures au lopéramide, une molécule qui réduit le mouvement péristaltique intestinal. Cette procédure est considérée comme légère puisque cette molécule n’est pas létale à la dose utilisée ni même n’a jamais montré d’effets indésirables dans la littérature.
Impact sur les animaux
Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique. Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Devenir
L’ensemble des poissons utilisés dans cette étude sera mis à mort pour pouvoir analyser l’impact du traitement sur la composition du microbiote et ses éventuelles conséquences sur la croissance et/ou le développement des larves. La mise à mort des poissons est nécessaire car d’une part l’analyse du microbiote se fait par extraction après homogénéisation des poissons et d’autre part, l’impact sur la croissance (détermination du poids et mesure de la taille) ne peut se faire qu’hors eau, c’est-à-dire une fois les poissons mis à mort.
Remplacement
Tandis que l’impact du lopéramide sur les bactéries commensales fait l’objet d’une caractérisation in vitro, l’impact sur la composition et la dynamique de réponse du microbiote et ses éventuelles conséquences ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et cette procédure implique de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est ainsi basé essentiellement sur des données précédemment publiées. Dans le cas des analyses de la composition du microbiote par séquençage 16S, le nombre de larves par groupe a été calculé à partir de donnés précédemment publiée, et a donc été fixé au nombre de 5 à chaque temps d’exposition pour chaque condition. Ce nombre permettra d’aborder la variabilité liée à ce type d’échantillon sans affecter la puissance statistique des tests choisis. L’analyse statistique pour la comparaison du microbiote par séquençage des larves au cours du temps s’appuiera ainsi sur l’utilisation d’un modèle comparatif du type modèle de Kruskal-Wallis. Les p-valeurs seront ajustées par une méthode type Benjamini-Hochberg afin de prendre en compte la multiplicité des tests. Pour l’analyse morphométrique des larves au cours du temps, le test statistique de Kruskal-Wallis non-paramétrique suivie de Wilcoxon sera appliqué, avec 10 larves par temps d’échantillonnage et par condition pour comparer les larves traitées au lopéramide contre celles contrôles exposées au DMSO.
Raffinement
La procédure consiste à exposer des larves de poissons-zèbres ayant une flore naturelle ou contrôlée à une dose non toxique de lopéramide puis à suivre l’impact sur la composition du microbiote au cours du temps et les conséquences éventuelles. Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique (Shi, 2014). Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau. Nous nous appuierons également sur certains des critères présentés pour l’évaluation quantitative de points limites qui sont applicables dans ce modèle comme comme la prostration ou la nage anormale et certains aspects physiques. Les anomalies de développement et/ou morphologie seront ainsi recherchées. La détection d’un de ces points limites conduira à la mise à mort du poisson.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et leur réponse aux stress sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques rationnelles complémentaires aux existantes pour le traitement de la diarrhée, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, réalisée dans l’animalerie Zorgl’Hub, qui nécessite des poissons-zèbre adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.
Impact de l’insuline sur la neurogenèse chez le poisson-zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
20 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on perce l'os du crâne avec une aiguille pour injecter de l'insuline dans les ventricules cérébraux, puis les cerveaux sont prélevés 24 heures plus tard, afin d'étudier la neurogenèse chez l'adulte. Le porteur décrit une procédure invasive mais rapide et affirme n'avoir jamais observé de troubles après ce type d'injection. Il conclut que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie ainsi le recours à l'animal.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer l'impact de l'injection intracérébroventriculaire d'insuline sur la neurogenèse chez le poisson-zèbre adulte. Bien que la neurogenèse soit un phénomène se produisant principalement au cours du développement du système nerveux, de nombreuses études ont démontré que ce processus pouvait se produire au niveau de certaines régions particulières du cerveau adulte. Les données de la littérature ont montré que la neurogenèse chez l'adulte pouvait être impactée tout au long de la vie par différents facteurs tels que le stress et les dommages cérébraux (accidents vasculaires cérébraux, traumatismes crâniens et maladies neurodégénératives). Dans le cadre de ce projet, nous nous intéressons à la prolifération des cellules souches neurales à la suite d'une injection intracérébroventriculaire d'insuline, en évaluant l'activité proliférative au niveau des niches neurogéniques des poissons zèbres adultes. Notre objectif est de comprendre si la stimulation des voies de l'insuline pourrait permettre d'augmenter la neurogenèse afin de contrecarrer l'effet de certaines maladies impactant négativement la neurogenèse (maladies neurodégératives, diabète, obésité).
Bénéfices attendus
Ce projet participera à une meilleure compréhension du rôle de l'insuline ainsi que des mécanismes au niveau moléculaire qui se mettent en place dans le processus de neurogenèse chez l'adulte. Il pourra permettre d'envisager à termes certaines solutions thérapeutiques visant à maintenir un certain niveau de neurogenèse indispensable à la mémorisation et à l'homéostasie cérébrale.
Procédures
Tous les animaux (n=20) seront soumis à une seule injection (véhicule ou insuline) au niveau des ventricules cérébraux. Il s'agit d'une procédure invasive mais rapide et réalisée sous anesthésie générale. Pour cela, le poisson est anesthésié sous tricaïne (0.02 %), un orifice au niveau de l'os du crâne à la jonction télencéphale/rhombencéphale est réalisé avec une aiguille 30G ½ et une injection intracérébroventriculaire d'insuline (1 à 2 μL) est effectuée au niveau de cet orifice via un micro injecteur. L’ensemble de la procédure dure environ 2 min.
Impact sur les animaux
L'injection, si mal réalisée, peut entrainer des troubles locomoteurs du poisson. Cependant, cette procédure sera réalisée par une personne qualifiée et expérimentée. Lorsque les poissons sont replacés dans de l’eau propre, la récupération est rapide (moins de 30 secondes). Un stress post-anesthésique peut être observé pendant cette période (
Devenir
A la fin de l'expérimentation (24h post-injection), les animaux sont mis à mort et les cerveaux sont prélevés afin de permettre l'étude de la prolifération des cellules souches neurales au niveau des niches neurogéniques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place. Le modèle animal permet de considérer l'ensemble des processus tels que l'activation de différentes voies de signalisation ainsi que l'activation de différents types cellulaires qui se mettent en place à la suite d'une injection d'insuline au niveau du ventricule.
Réduction
L'expérimentation a été conçue afin d'utiliser le moins d'animaux possible. Les expérimentations seront réalisées sur un nombre total de 20 poissons (10 animaux/groupe). Les données de précédentes études chez le poisson-zèbre au sein du laboratoire ont montré qu’un nombre minimal d’environ 10 poissons/groupe était suffisant afin de s’affranchir de la variabilité inter-individuelle et d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
A la suite de l'injection intracérébroventriculaire, les animaux sont regroupés dans un aquarium avec un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront appliqués et tout signe de souffrance sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de la plasticité cérébrale puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre.
Analyse fonctionnelle des gènes codant pour les récepteurs aux hormones corticostéroïdes chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Une partie subit des tests de performance comportementale, une autre une exposition de 48 heures à une eau appauvrie en sel qui provoque un déséquilibre osmotique, avant prélèvement des tissus. Le projet utilise des lignées dont les récepteurs au cortisol, l'hormone de stress, sont inactivés, pour comprendre leur rôle. Le porteur relie ces travaux au bien-être des animaux non-humains en élevage et à l'amélioration des méthodes d'aquaculture, bénéfices renvoyés au développement futur d'indicateurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de chaque récepteur au cortisol (hormone de stress) dans la régulation de l’homéostasie ionique et hydrique ainsi que dans des activités comportementales du poisson. L’exposition du poisson à une situation stressante active l’axe corticotrope et conduit très rapidement à la libération de cortisol dans le sang. Ce cortisol va modifier différents processus comportementaux et métaboliques, dont le métabolisme hydrominéral, via des voies de signalisation mettant en jeu les 2 récepteurs au cortisol. Concernant l’homéostasie ionique et hydrique (métabolisme hydrominéral), plusieurs études ont montré le rôle déterminant du cortisol dans la régulation des échanges ioniques et la perméabilité de la branchie, principal organe impliqué dans la régulation de la balances hydrominérale. Par contre, pour des raisons techniques, le rôle des récepteurs au cortisol dans le maintien de l’homéostasie ionique et hydrique est controversé. Plusieurs travaux ont aussi étudié les rôles de ces 2 récepteurs sur le comportement des poissons. Tout comme pour le maintien de l’homéostasie, des résultats contradictoires sont mesurés sur le rôle des récepteurs. Plusieurs travaux suggèrent une notion de complémentarité fonctionnelle des 2 récepteurs et l'hypothèse d'une réponse compensatrice, quand l'un des 2 récepteurs est muté. Mais pour l’instant, rien n’a été clairement démontré. Dans ce contexte, afin de caractériser les rôles respectifs des 2 récepteurs au cortisol dans la régulation des fonctions branchiales (organe-clé de l’homéostasie chez le zebrafish) et des activités comportementales, nous proposons d'utiliser des lignées de zébrafish pour lesquels les gènes codant pour les récepteurs au cortisol sont inactivés et non fonctionnels. Les rôles de ces récepteurs seront étudiés en condition contrôle et lors de stress.
Bénéfices attendus
Des stress en relation avec la qualité d'eau et/ou conditions d'élevage ont clairement des effets néfastes sur l’homéostasie et le comportement du poisson qui peuvent se traduire par une baisse de la productivité et l’établissement de situations de mal-être alors que le bien-être des animaux en élevage est un objectif important pour la profession en réponse à la demande sociétale. Une meilleure connaissance des réponses au stress, que l'on peut obtenir dans cette étude, devrait permettre le développement d’indicateurs biologiques d’état ou d’indicateurs prédictifs de bien-être chez les poissons et le cas échéant de problèmes de santé potentiels. Ces indicateurs seront utiles pour l’amélioration des méthodes d’élevage en aquaculture, pour le choix d'espèces à domestiquer et comme critères phénotypiques dans la sélection pour des caractères d’adaptation à l’environnement.
Procédures
Un nombre de 180 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère une seule fois de 30s pour la plus courte, à 9 minutes pour la plus longue. Un autre nombre de 90 individus seront exposés à une eau appauvrie en sels pendant 48 heures une seule fois. La diminution de la quantité en sels de l’eau se fera progressivement sur 24heures.
Impact sur les animaux
Afin de mesurer les capacités à maintenir leur homéostasie ionique et hydrique, les poissons seront exposés à un stress osmotique: exposition à une eau appauvrie en sel. Ce stress va induire un déséquilibre de la teneur en sels du poisson.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthaniés puis prélevés pour différentes analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n'est pas possible d'étudier in vitro les fonctions des récepteurs sur - 1. le maitien de l'homéostasie ionique et hydrique des poissons, car nous ne disposons pas de lignées cellulaires pour les différents organes et type cellulaires impliqués dans cette fonction - 2. le comportement, parce que les analyses comportementales complexes que nous envisageons ne peuvent être réalisées que sur animal et qui plus est seulement caractérisables chez l'adulte.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre une évaluation statistique de la variabilité individuelle des réponses.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pour la fonction en relation avec le maintien de l'homéostasie ionique et hydrique, le challenge osmotique aura lieu progressivement et ne durera que 48h, à des concentrations en sels déjà utilisés dans plusieurs autres études publiées récemment. De plus l'eau sera supplémentée en oxygène via un bullage d'air. Pour la partie comportement, un seul test comportemental sera réalisé par jour. En dehors des procédures les poissons seront élevés en groupe dans des structures d'élevage adaptées à l'espèce.
Choix des espèces
Les lignées de zebrafish avec inactivation des récepteurs au cortisol sont appropriées pour notre étude visant à étudier le rôle de chaque récepteur dans le maintien de l'homéostaise ionique et le comportement des poissons. De plus, les mécanismes impliqués dans le maintien de la balance hydrominérale ainsi que les différents traits de comportement sont bien caractérisés chez cette espèce. L'étude sera réalisée au stade adulte afin de mesurer les réponses des 2 sexes.
Imagerie fonctionnelle du cerveau chez les poissons cichlidés par IRM
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent une injection unique de manganèse, un produit de contraste que le porteur décrit lui-même comme neurotoxique et s'accumulant dans le cerveau, subissent des tests comportementaux après une phase d'entraînement de vingt jours, puis une IRM d'environ deux heures sous anesthésie, avant que leur cerveau soit prélevé. L'objectif est de comprendre le rôle d'une structure cérébrale propre aux poissons téléostéens et l'évolution des capacités cognitives. Le porteur affirme qu'une étude fonctionnelle de ces espèces est "indispensable" et que la taille du cerveau du poisson zèbre ne suffit pas pour cette imagerie.
Objectifs
Des études montrent que certains poissons comme les labres et les cichlidés (du groupe des poissons téléostéens) sont doués de capacités cognitives dites « supérieures ». Par exemple, des tests ont mis en évidence qu’ils sont capables d’utiliser des outils, qu’ils ont la faculté de se reconnaitre (test du miroir) ou encore qu’ils ont une communication multimodale complexe. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente de ceux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et des travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés via une étude IRM à la fois anatomique et fonctionnelle, nécessitant la mise en place de test comportementaux chez les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont une taille, une anatomie cérébrale et des comportements différents. La visualisation de l’activité cérébrale du cerveau des cichlidés à la suite des tests comportementaux permettra d’élucider la fonction de leur lobe inférieur. Connaître la fonction du lobe inférieur chez plusieurs espèces de cette classe de poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux, très différents de ceux des mammifères par exemple, ont pu permettre l’émergence de comportements complexes.
Bénéfices attendus
Cette étude fonctionnelle de recherche fondamentale permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes (amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères) et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires et ainsi d’élucider certains mécanismes de l’évolution de fonctions aussi complexes.
Procédures
Injection unique d’un produit de contraste sous anesthésie (moins de 5 minutes), tests de comportements pour étudier les capacités cognitives (une session d’une heure par jour pendant 2 jours post-injection, et une phase d’entrainement d’une session d’une heure par jour pendant 20 jours pré-injection) et imagerie par résonnance magnétique (IRM) sous anesthésie durant environ 2 heures afin de visualiser l’activité cérébrale induite par les tests de comportement. Le poisson est maintenu dans un tube rempli d’eau contenant de l’anesthésiant puis placé dans l’IRM pour la durée de l’acquisition (environ 2h). La température de l’eau est surveillée tout au long de l’acquisition. Chaque animal ne peut être scanné qu’une seule fois, le manganèse s’accumulant dans le cerveau et étant neurotoxique.
Impact sur les animaux
Les seules nuisances attendues sont liées au stress de l’isolement, du transport et de l’anesthésie des poissons. De plus, une douleur au site d’injection du produit de contraste est également possible.
Devenir
Même si ce projet est constitué uniquement d’une procédure de classe légère, les animaux ne pourront pas être réutilisés pour des tâches de comportement, puisqu’ils ne seront plus naïfs. De ce fait, il n’est pas possible de les réutiliser. Le replacement ou l’adoption des animaux n’est pas une solution retenue en raison du nombre d’animaux impliqués, et du fait que les effets à long terme d’injection de manganèse sur la santé des poissons ne sont pas connus. Il a été décidé de procéder à leur euthanasie. Suite à l’euthanasie, les cerveaux des animaux seront prélevés et serviront à des expériences de neuroanatomie.
Remplacement
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. Afin de limiter la souffrance potentielle pour les animaux, nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles de mal-être. Avant l’injection de manganèse, une anesthésie sera réalisée. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Le transport sera de courte durée et les poissons seront maintenus au chaud par des chaufferettes, puis placés dans un incubateur permettant de les maintenant à la temperature necessaire en attente de leur passage à l’IRM. Une fois anesthésiés et dans l’IRM, l’anesthésie et la température de l’eau seront contrôlées en continue tout au long de l’acquisition.
Choix des espèces
Les poissons ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour étudier les régions du cerveau impliquées dans les comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez les espèces de poissons cichlidés. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Pour notre étude, nous utilisons des animaux adultes, puisque les comportements qui nous intéresse ne sont réellement développés qu’à l’âge adulte chez ces animaux.
Création et maintien de lignées transgéniques de poissons zèbres
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
170 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur prélève un morceau de nageoire caudale sous anesthésie pour génotypage, puis on les isole jusqu'à trois jours, dans le but de créer des lignées génétiquement modifiées rendant fluorescentes des vésicules extracellulaires. Le porteur indique que les poissons sont réutilisés pour maintenir la lignée et gardés en vie jusqu'à leur an et demi, avant d'être mis à mort. Il conclut qu'aucune méthode de remplacement in vitro n'est possible parce que le projet repose sur la modification du génome d'un organisme vivant.
Objectifs
Les vésicules extracellulaires sont des petites particules qui sont sécrétées naturellement pas les cellules de l’organisme. Bien que ces vésicules semblent intervenir dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques, leur caractérisation dans des organismes vivants est encore très limitée, notamment du fait de leur petite taille, ce qui entrave leur utilisation en tant que marqueur ou véhicule thérapeutique. Pour permettre cette caractérisation, l’utilisation du poisson zèbre apparait comme un modèle prometteur du fait de son développement rapide et en dehors de leur mère, mais également de sa transparence au stade embryonnaire, qui rendent possible la visualisation de ces vésicules en temps réel chez l’animal vivant. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées de poissons zèbres qui exprimeront un marqueur de ces vésicules qui sera fluorescent, jouant ainsi le rôle d'une étiquette, ce qui permettra de visualiser directement ces vésicules dans les différents tissus de notre choix (muscles, vaisseaux sanguins, neurones...) puis de les suivre dans tout l'organisme. Nous réaliserons la sélection des individus présentant l’étiquette fluorescente dans le tissu d’intérêt et par technique de génotypage, respectivement. Ces nouvelles lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles de ces vésicules chez l’animal, pour chacun des tissus choisis.
Bénéfices attendus
La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données importantes sur leur potentiel thérapeutique.
Procédures
Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.
Devenir
Les animaux seront réutilisés à la fin de la procédure pour maintenir la lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées de poissons zèbres dont le génome sera modifié pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaires en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.
Réduction
Selon des tests statistiques, nous avons réduit le nombre de poissons à 10 de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives. Nous estimons que des groupes de 10 animaux seront suffisants pour la durée de ce projet, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées de poissons restent encore inconnues.
Raffinement
Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, un enrichissement de milieu sera mis en place, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production en plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du génotypage, un analgésique (lidocaïne) et un anesthésique (benzocaïne) seront utilisés. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes. Enfin, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.
Étude sur l’utilisation de l’habitat des esturgeons européens juvéniles
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
750 esturgeons européens juvéniles vont être utilisés, maintenus vivants puis relâchés en milieu naturel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de reproduction en bassin, ils sont capturés puis opérés sous anesthésie pour l'implantation chirurgicale d'un émetteur acoustique, afin de suivre par télémétrie leurs déplacements en vue d'une réintroduction de l'espèce. Le porteur situe les bénéfices sur le "long terme", pour la faisabilité de cette réintroduction. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au suivi télémétrique et qu'il est nécessaire de doter chaque individu d'un émetteur.
Objectifs
L'objectif principal de l'étude est de mieux comprendre les fonctionnalités des zones estuariennes et des deltas pour la réintroduction de l'esturgeon européen (Acipenser sturio). Selon les lignes de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) pour les translocations de conservation, une analyse de la qualité de l'habitat et de son utilisation par l’espèce est obligatoire avant que la réintroduction ne puisse commencer. Pour étudier les mouvements de juvéniles d'esturgeons européens marqués, un réseau de suivi des esturgeons comprenant 70 récepteurs a été mis en place. Des recherches télémétriques dans ces zones permettront d'observer la distribution, les voies de migration, et d'identifier les zones d'alimentation et de repos des esturgeons juvéniles.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de cette étude est de renforcer l'évaluation de la faisabilité d'une future réintroduction de l’esturgeon européen dans un bassin versant. Par ce lâcher expérimental et ce suivi individuel à grande échelle par télémétrie, nous visons à identifier les possibilités et les problèmes potentiels pour les juvéniles d'esturgeons européens.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'anesthésie ne durera que quelques minutes. Au préalable les animaux sont soumis à une capture dans des bassins d'élevage.
Impact sur les animaux
Les esturgeons juvéniles seront marqués avec de petits émetteurs acoustiques. Ces émetteurs respectent le ratio de 2% du poids du poisson, n'entrainant aucune perturbation dans le comportement. Au fur et à mesure que le poisson grandit, le poids de ce petit émetteur interne sera de moins en moins perceptible par le poisson. Le comportement des individus une fois remis à l'eau pourra être perturbé par le stress du transport de longue durée, et les changements d'eau. L'impact des captures dans les bassins est minime puisque la capture se fait avec l'aide d'un plongeur professionnel qui va chercher les poissons délicatement. La chirurgie est réalisée par du personnel formé, et est faite sous anesthésie en limitant au maximum le stress des poissons.
Devenir
Tous les animaux marqués seront conservés vivants, et relâchés dans le milieu naturel, tel que prévu dans le cadre du Plan National d'Actions pour la sauvegarde de l'esturgeon européen 2020-2029, et plus spécifiquement son volet en lien avec la coopération internationale.
Remplacement
L'esturgeon européen était autrefois naturellement présent sur le bassin concerné. L'espèce est révélatrice d'un système fluvial amélioré en ce qui concerne la qualité de l'habitat et la migration. En raison de la quasi-absence d'esturgeons européens dans le système étudié, les esturgeons issus de ces lâchers expérimentaux fourniront un aperçu du comportement migratoire local, annuel et saisonnier et des zones d'utilisation de l'habitat par l’espèce. A cette fin, une utilisation spécifique est faite du suivi télémétrique des individus dans ce milieu. Il n'y a pas d'alternative disponible pour cela. Il est nécessaire de doter ces individus d'un émetteur ; il s'agit donc d'une expérimentation animale pour laquelle l’espèce-cible ne peut être remplacée.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser ne peut pas être déterminé par des modèles ou des méthodes statistiques existants, car l'étude est menée dans un environnement non contrôlé. Le nombre d'animaux est choisi sur la base de l'expérience pratique et des résultats de la littérature, notamment en termes de mortalités attendues. Les expérimentations précédentes mettent en avant un nombre trés faible de mortalités après lâchers en milieu naturel. L'esturgeon européen est une espèce protégée, il est important de réduire au maximum le nombre d'individus utilisés. 750 individus permettront d'avoir des retours intéressants et permettant de conclure sur les capacités de migration. Le nombre a été établi en lien avec des études précédentes réalisées sur d'autres territoires, et en lien avec la multiplication des connections et des voix de migration. Les reproductions assistées sont complexes à mettre en oeuvre, et le nombre d'individus disponibles ne peut être supérieur en l'état actuel du succès des reproductions assistées.
Raffinement
Basé sur des recherches antérieures, la télémétrie est la méthode de suivi la plus appropriée pour mieux comprendre les routes de migration et les zones d'alimentation et de croissance des espèces en milieu naturel. En ce qui concerne l'animal, on veillera lors de l'implantation chirurgicale de l'émetteur à ce que les poissons aient des poids (ou tailles) minimales afin de respecter le ratio convenu des 2% pour limiter au mieux les problèmes de flottabilité, les biais de comportement et les risques de surmortalités. Le protocole a été établi sur la base des rapports de la littérature et de l'expérience pratique, et garantit que le risque d'altération du bien-être de l’animal dû à l'émetteur implanté est minime. Afin de limiter le stress chez les animaux et de favoriser leur récupération physiologique, les animaux seront marqués à la station d'élevage en France. Avant l'insertion de la marque, les animaux seront placés en phase d'anesthésie profonde (dose chirurgicale). Les animaux seront ensuite observés quotidiennement durant 4 semaines pendant leur récupération.
Choix des espèces
Il s'agit d'une étude d'évaluation de faisabilité pour la réintroduction de l'esturgeon européen dans le delta et estuaire des rivières concernées. C'est pourquoi cette étude est dédiée à cette espèce. Les animaux impliqués dans le projet seront des juvéniles âgés de 6 à 12 mois, issus de reproductions assistées en bassin. L'âge exact des individus sera défini en fonction de leur taux de croissance sur le site d'élevage. Il faudra qu'ils fassent a minima 100g pour pouvoir être marqués avec les marquées définies. A ce stade, les esturgeons européens se déplacent normalement en eau douce et en eau saumâtre ; pourtant, d'autres individus de cet âge sont déjà tolérants au sel et se déplaceront vers la mer. Les questions de recherche tiennent compte des déplacements de ces poissons dans la zone d’étude : a) La disponibilité de zones d'eau saumâtre dans le port, pour l'acclimatation des poissons. b) La disponibilité des aires d'alimentation dans la zone d'étude