Poissons

180 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec cinq aliments différents, la moitié reçoit ensuite une injection simulant une infection bactérienne qui déclenche une réponse inflammatoire et un comportement de fièvre. Huit heures plus tard, toutes sont anesthésiées puis tuées pour prélever foie, intestin, rate et sang. Le projet cherche à valider des aliments aquacoles entièrement végétaux, le porteur indiquant avoir réduit les conditions par des tests in vitro préalables mais jugeant l'étape sur poisson vivant nécessaire pour la filière.

Objectifs

Les farines et les huiles de poisson sont des ingrédients traditionnels utilisés dans les aliments aquacoles pour nourrir les espèces de poissons carnivores comme les salmonidés. Issus principalement de la pêche, les volumes de production de ces matières premières marines sont stables depuis les années 80 et la mise en place des quotas de pêche. Aussi, la disponibilité en farine et l’huile de poissons devient de plus en plus limitante vis-à-vis de la demande croissante émanant de l’aquaculture. Pour assurer le développement durable de l’aquaculture, la farine et l’huile de poissons doivent faire l’objet d’un remplacement par des sources végétales abordables, adaptées aux besoins nutritionnels des poissons et respectueuses de l’environnement. Cependant, l’utilisation de régimes à base de plantes dépourvus de farine et d’huile de poisson ne favorise pas une croissance optimale de la truite arc-en-ciel. En nutrition animale, les extraits de levures sont souvent utilisés pour améliorer la santé des animaux et leur croissance. Après avoir démontré les effets anti-inflammatoires de certains extraits de levures en utilisant des cultures de cellules d’intestin de truite, nous souhaitons maintenant confirmer ces effets chez de jeunes truites arc-en-ciel en tant que complément alimentaire. Des jeunes truites arc-en-ciel seront donc nourries avec des aliments 100% végétaux contenant des levures. Après 12 semaines d’alimentation, nous évaluerons si l’utilisation des levures dans l’alimentation favorise la croissance et augmente la résistance du poisson en cas d’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette expérience permettra d’améliorer l’efficience des aliments végétaux destinés aux jeunes truites arc-en-ciel. La filière pourra ainsi bénéficier d’aliments aquacoles 100% végétaux tout aussi performants que ceux contenant actuellement des huiles et farines de poissons et d’un moyen d’améliorer la robustesse des poissons.

Procédures

Dans cette expérimentation, 180 jeunes truites arc-en-ciel seront maintenues dans des conditions classiques d’élevage pendant 12 semaines et nourries avec 5 aliments différents répondant aux besoins alimentaires des poissons. A l’issue des 12 semaines, une moitié des poissons sera soumise à une injection de produit simulant une infection bactérienne (groupe traité) et l’autre moitié sera soumise à une injection de solution saline (groupe contrôle). La durée de l'injection dure en moyenne une dizaine de secondes. Huit heures après injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour observer une réponse inflammatoire. Les poissons seront également mesurés et pesés afin d’évaluer un potentiel effet des différents régimes alimentaires sur la croissance des poissons.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Les effets connus de l’injection que nous allons appliquer sont une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’un comportement de fièvre chez la truite arc-en-ciel. Ces injections ne sont pas létales mais nous ne sous-estimons pas l’impact de cette inflammation déclenchée chez le poisson. Ainsi nous avons sélectionné la plus petite dose ainsi que le temps le plus court possible afin d’observer une réponse inflammatoire. Afin de réduire le stress potentiel engendré par la manipulation puis l’injection, chaque poisson sera capturé avec une épuisette puis placé sous anesthésie générale afin de procéder à l’injection. Les manipulations des truites arc-en-ciel seront effectuées par des personnes expérimentées et familiarisées avec l'espèce.

Devenir

Huit heures après l’injection, la totalité des poissons seront anesthésiés puis euthanasiés afin de prélever des échantillons de foie, d’intestin, de rate et de sang.

Remplacement

Cette étude se propose d’étudier la robustesse de la truite arc-en-ciel nourrie avec des régimes 100% végétaux supplémentés avec des extraits de levures. En amont de cette expérience, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules d’intestin de truite afin de définir les doses d’extrait de levures potentiellement les plus efficaces pour induire une résistance à une inflammation cellulaire. Cette première étape in vitro nous a permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. Cependant, afin de valider les observations faites in vitro et envisager l’utilisation de ces produits en aquaculture, nous ne pouvons pas exclure cette étape d’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de poissons à utiliser pour cette expérience a été minimisé, en considérant les différences de réactions que chaque poisson peut avoir face à ce type d’injection. Pour ces calculs, nous avons utilisé un logiciel qui permet de s’assurer que le nombre de poissons sera tout de même suffisant pour que les résultats soient fiables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur les animaux utilisés au cours de l’expérience les différents points seront assurés : le volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, le rythme jour/nuit naturel, et le nombre de poissons par bassin pour exprimer un répertoire comportemental riche. Du début de l’élevage et jusqu’au grossissement des poissons la taille des bassins sera adaptée de façon à respecter une densité d’élevage appropriée à la truite arc-en-ciel. Tout au long de la croissance, le comportement et les mortalités seront contrôlés quotidiennement, lors de chaque repas. Ce suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Cette évaluation est basée sur deux grands critères : comportemental et physique. Dans les critères comportementaux, il sera évalué (scores allant de 1 à 3 suivant la sévérité) : la prostration et l’isolement prolongé de l’animal, la nage anormale, la prise alimentaire perturbée et la position inhabituelle dans la colonne d’eau. Concernant les critères physiques, il sera évalué le changement du volume anormal (ex : maigreur observé par la tête plus grosse que le corps), les lésions comportementales dues aux blessures ou maladies, l’apparition de malformations (scoliose, exophtalmie, tumeur) ainsi que l’aspect général de la peau et des nageoires. Si une note de 3, qui correspond au point limite ultime, est scorée sur un des points à évaluer, l’animal sera euthanasié aussitôt via les procédures réglementaires. La manipulation des truites-arc-en-ciel sera effectuée par des personnes expérimentées et familiarisées avec cette espèce. Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront qu’une dizaine de secondes par poisson. Le stress au réveil sera évalué selon les comportements décrits ci-dessus.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale. L’expérimentation sera réalisée sur des truites arc-en-ciel de 10 à 15g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons tissulaires dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.

120 poissons, des sandres et des tanches, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous maintenus en vie et remis dans leur bassin. Chaque mois pendant quatre mois, ils sont capturés et anesthésiés pour un contrôle de croissance, trois sandres par bassin subissant en plus une prise de sang. Le porteur indique avoir choisi des méthodes non létales pour éviter de tuer les animaux, les prises de sang restant une nuisance limitée par l'anesthésie. Il vise à améliorer les techniques d'élevage aquacole du sandre en circuit fermé, et précise qu'à la fin les poissons seront gardés au laboratoire ou donnés à des pisciculteurs.

Objectifs

L'objectif du projet est démontrer les effets de la tanche sur le bien-être du sandre et de la polyculture de poissons sur les communautés microbiennes des bassins d'élevage aquacole. Un travail préliminaire mené dans des conditions de production a montré que des communautés microbiennes différentes étaient présentes dans les systèmes d'élevage et que la diversité des communautés microbiennes semblait corrélée à la diversité des espèces de poisson présentes dans les compartiments aquacoles. Toutefois l'effet le plus important semblait être celui du système d'élevage lui-même, chaque système ayant des caractéristiques propres (volume d'eau, débit hydraulique, histoire ...). Le contrôle de l'environnement microbien est un enjeu majeur pour les élevages piscicoles en circuit fermé.

Bénéfices attendus

Il s'agira de démontrer qu'un pilotage de la diversité des espèces de poisson (polyculture) dans un système d'élevage jusqu'à ce jour uniquement utilisé en monoculture constitue une approche scientifique pertinente pour améliorer la durabilité des élevages en circuit fermé. De manière plus ciblée, cette étude permettra d'améliorer les techniques d'élevage du sandre et de sécuriser sa production en France et en Europe (estimée à 2000 tonnes actuellement). Pour la première fois, à notre connaissance, les relations entre les communautés de poisson et microbiennes dans ces systèmes seront étudiées, or le compartiment microbien joue un rôle majeur dans le fonctionnement de ces systèmes de production. A ce niveau une attention particulière sera portée sur les risques de pathologies bactériennes pour les poissons et d'antibiorésistance.

Procédures

Mensuellement sur une durée de 4 mois, des animaux seront capturés, anesthésiés et soumis à un contrôle de croissance individuel. Aux mêmes dates, juste avant les contrôles de croissance, 3 sandres par bassin (uniquement dans les bassins où des sandres seront présents) seront captutés et anesthésiés, puis feront l'objet d'un prélèvement de sang.

Impact sur les animaux

Les manipulations lors des contrôles de croissance des poissons et les prélèvements biologiques constituent des nuisances pour les animaux. Pour réduire leur impact, nous pratiquerons des anesthésies pour éviter la douleur. Pour limiter les risques d'infection, nous utiliserons des petits matériels stériles ou désinfectés. Nous aurons une attention particulière (observation des poissons) les jours qui suivront ces opérations.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie, y compris ceux qui feront l'objet d'un prélèvement sanguin, et remis dans leur bassin d'origine. A l'issue de l'étude, les animaux seront soit gardés au laboratoire pour d'autres études soit donnés à des pisciculteurs locaux partenaires du laboratoire, après avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer cette expérimentation car aucune étude de ce genre n'existe dans la litérature scientifique. Notre approche est innovante et en rupture avec les pratiques d'élevage actuelles des élevages aquacoles en circuit fermé.

Réduction

Pour que notre étude soit crédible et les résultats transférables aux professionnels de l'aquaculture, il nous faut mener une telle étude avec des densités et effectifs d'élevage qui s'approchent le plus des conditions d'élevage rencontrées dans les systèmes de production, une charge initiale de 20 kg de poisson par bassin restant une charge faible.

Raffinement

Pour limiter les nuisances aux animaux, nous avons volontairement recherché des méthodologies non létales pour ne pas avoir à euthanasier des animaux. Une recherche bibliographique fouillée a été menée en amont dans le but d'identifier les méthodologies adaptées. Puis nous avons réduit au maximum le nombre de poissons qui feront l'objet de prélèvements biologiques (uniquement 3 poissons par bac par temps). Les poissons seront anesthésiés pour les prélèvements biologiques, puis mis dans un bain de reveil pour récupérer progressivement de leur anesthésie.

Choix des espèces

Le choix du sandre est directement dicté par le fait qu'il s'agit de l'espèce cible dont on veut améliorer les performances d'élevage et le bien-être en condition d'élevage, c'est une espèce d'intérêt aquacole majeur pour les élevages en circuit fermé en Europe. La tanche est une espèce compatible avec l'élevage du sandre, elle fréquente les mêmes habitats en milieu naturel et en conséquence a les mêmes préférendum écologiques. Toutefois, l'intérêt pour la tanche réside principalement dans le fait qu'elle produit un mucus abondant avec des propriétés antibactériennes avérées et qu'elle occupe préférentiellement un autre partie de la colonne d'eau , le fond. La tanche est de longue date considérée comme un poisson "docteur", les anciens ouvrages de pisciculture d'Europe de l'Est mentionnent sa consommation d'ectoparasites et les pouvoirs de son mucus. A un poids moyen de 130-150 g, les sandres et les tanches seront au stage juvénile. Un des objectifs étant d'évaluer les effets sur la croissance, l'utilisation d'animaux au stade juvénile est judicieux puisque les animaux auront un potentiel de croissance élevé non affecté par l'acquisition de la maturité sexuelle.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.

160 anguilles européennes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est capturé, anesthésié, puis équipé par chirurgie d'un émetteur acoustique et d'une marque RFID implantés sous la peau avec un à trois points de suture, pour suivre en télémétrie la migration de dévalaison en lagune. Le porteur indique que le stress de la capture et du marquage peut retarder la migration, et écarte les individus déjà blessés ou en mauvais état sanitaire. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier des anguilles sauvages capturées dans le milieu, l'espèce étant présentée comme menacée d'extinction.

Objectifs

Ce projet a pour objectif (i) de mieux connaître la dynamique de dévalaison à l'intérieur d'un système lagunaire, (ii) d'étudier la diversité des comportements migratoires et (iii) d'évaluer le succès de deux projets de restauration de la continuité hydrobiologique.

Bénéfices attendus

L'analyse des détections enregistrées par les stations d'écoute fixes et mobiles permettront de : i) S'assurer du bon déroulé de l'opération de marquage et de la survie des individus, -ii) Etudier le comportement des individus relâchés après l'opération de marquage : sont-ils immédiatement mobiles ou non ? - iii) Etudier comportements migratoires des individus : est-ce qu'ils dévalent tous ou certains remontent-ils au contraire le cours d'eau ? -iv) Connaître à quel moment les individus prennent la direction de la mer -v) Evaluer combien d'individus parmi ceux qui ont été détectés partis des bassins amont parviennent jusqu'aux portes de la mer - vi) Estimer la durée nécessaire pour les individus de parcourir la distance entre l'embouchure des bassins et les portes de la mer -vii) Evaluer si les voies de connexion restaurées sont utilisées par les anguilles pour rejoindre la mer -ix) Mieux connaître la diversité des comportements de dévalaison. Les résultats obtenus pourront éventuellement permettre de formuler des préconisations pour la gestion des ouvrages de connexion, afin d'optimiser le retour en mer des anguilles.

Procédures

Capture dans un vereux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15 min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide de 1 à 3 points de suture : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h

Impact sur les animaux

Le stress de la capture et du marquage est susceptible de retarder la migration des individus.

Devenir

L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.

Remplacement

L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.

Réduction

Le milieu étudié présentant des densités d'anguilles élevées, il est nécessaire de suivre un maximum d'individus afin de pouvoir obtenir des résultats robustes et représentatifs de l'ensemble des deux sous-populations ciblées. De plus, au niveau des embouchures des bassins ciblés, des individus peuvent se faire éventuellement prédater par des silures. Et entre l'embouchure des bassins ciblés et les portes de la mer, les anguilles peuvent être prélevées par les pêcheurs professionnels ou la prédation aviaire. Par conséquent, un nombre suffisamment élevé d'individus doivent être marqués pour optimiser les probabilités d'avoir suffisamment d'individus qui parviennent jusqu'aux sorties de l'hydrosystème du Vaccarès. Dans le cadre de cette étude pilote, un total de 40 individus par bassin et par saison de dévalaison (octobre à mai), soit un total de 80 pour une année de suivi, et 160 si deux années de suivi sont réalisées, seront marqués. Le choix de ce nombre est un compromis entre avoir suffisamment d'individus pour obtenir des résultats robustes (n>>30 par bassin et par saison de suivi) et avoir suffisamment de moyens financiers pour y parvenir (coût des marques acoustiques relativement élevées >400€). Si les retours d'expérience sont favorables, un déploiement à plus grande échelle sera éventuellement envisagé.

Raffinement

Un individu qui présente des marques externes de blessures prononcées (souvent d'origine de prédateurs aviaires) ou d'autres signes d'état sanitaire dégradé (kystes, parasites, opacité des yeux, etc.) ne sera pas utilisé dans le cadre de cette procédure. Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie et analgésie pour limiter au maximum la douleur. Un individu qui présente un comportement anormal lors de son anesthésie: des signaux d'hyperventilation ou de tremblements sera immédiatement placé dans le bac de réveil et ne sera donc pas traité. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 40kg/L. Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser le brassage et l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à plusieurs points de passage, aux points de sorties des bassins ciblées ainsi qu'aux portes de la mer, de manière continue. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements et en particulier de mettre en place des dispositions pour optimiser son retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Dans le cadre de cette étude, uniquement des anguilles femelles argentées de plus de 50 cm, ayant un poids suffisamment important (>400g) pour supporter l’implantation de transpondeurs sans affecter leurs constantes vitales, seront utilisées. L'implantation de transpondeurs correspond à un lestage total de 5.1g dans l'air, avec une marque RFID de 23 mm de long qui pèse 0.6 g et un émetteur acoustique de 9mm de diamètre qui pèse 4.5g dans l'air (et 2.7g dans l'eau). L’impact des implants est négligeable lorsque leur masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.

700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.

Procédures

Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.

Impact sur les animaux

La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.

Remplacement

Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.

Réduction

Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).

Raffinement

Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.

268 bars européens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyse et l'autre gardée vivante pour produire des gamètes. Au stade larvaire, ils reçoivent une injection de cellules souches germinales d'anguille européenne et, pour certains, une puce d'identification sous anesthésie, afin de tester le bar comme parent de substitution de l'anguille. Le porteur indique que les larves ne récupérant pas une nage normale dans les cinq minutes sont tuées par surdose d'anesthésique. Il présente l'anguille comme un "produit à haute valeur ajoutée" et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale, le bar étant lui-même le sujet de l'étude.

Objectifs

Ce projet étudie la possibilité d'utiliser des bars européens comme parent de substitution d'anguilles européenne afin de pallier à l'infertilité des anguilles maintenues en captivité.

Bénéfices attendus

L'anguille européenne est considérée comme un produit à haute valeur ajoutée sur les marchés européens et asiatiques, ce qui en fait une cible pour la pêche et l'aquaculture. Cependant, elle ne peut pas atteindre la maturité sexuelle normalement en captivité, et sa production est basée sur la capture de juvéniles (civelles) et leur engraissement ultérieur. La population d'anguilles européennes étant en grave déclin, la reproduction en captivité semble être la seule alternative réaliste pour réduire la pression sur les populations naturelles. Le développement de la technologie des géniteurs de substitution par la transplantation de celulles souches germinales permettra de produire les gamètes d'anguille nécessaires au développement de l'aquaculture de l'anguille et à la diminution des captures de juvéniles dans le milieu naturel.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection au stade larvaire pour injecter les cellules souches germinales. L'injection de cellules souches germinales ne dure pas plus de 20 secondes. Une partie de ces animaux sera marquée avec une puce électronique intramusculaire pour une identification individuelle. Ce marquage qui ne prend que quelques secondes, est réalisé sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L'injection des larves est équivalente à une piqûre. Le marquage des poissons est équivalent à une piqûre. Pour chacun de ces gestes, l'anesthésie ne durera pas plus de 5 min.

Devenir

Une partie des animaux seront euthanasiés pour réaliser le suivi de la colonisation des cellules souches d'anguilles. Le reste sera gardés en vie pour produire des gamètes.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives non animales disponibles pour cette expérimentation. Le bar est le sujet de l’étude. Il s'agit dans cette étude de tester le bar européen comme receveur de cellules souches germinales d'anguilles.

Réduction

Comme nous connaissons le taux de survie des bars après micro-injection, le nombre d'animaux utilisés sera le minimum possible afin d’assurer une puissance nécessaire des résultats des échantillonnages. Pour cette expérimentation, 2 lots de 134 poissons (soit 268 poissons) seront injectés afin d'obtenir entre 15 et 20 poissons greffés par lots. La survie à l'élevage larvaire peut être estimée à 85% et le taux de réussite de greffe est de 15% donc 134 poissons injectés x 0.85 de survie x 0.15 de succès de greffe = 17 poissons réellement greffés. Aux 268 poissons injectés, il faut ajouter 132 poissons-témoins ne subissant aucune procédure. Le total des poissons utilisés est 268 poissons injectés +132 poissons-témoins. Il s'agit d'une recherche descriptive du phénomène de colonisation des gonades du receveur par les cellules souches du poisson-donneur. Il ne sera donc pas réalisé de test statistique sur cette expérimentation. Le nombre de 15 poissons greffés a été choisi en accord avec le nombre d'invididus généralement étudiés pour ce type de recherche dans la littérature.

Raffinement

Pour favoriser le rétablissement des larves micro-injectées, celles-ci sont maintenues dans de l’eau iso-osmotique stérile et gardées sous une surveillance accrue pendant les 4 heures suivant l’injection. En dehors des procédures, les animaux seront maintenus dans des conditions d’élevage optimales pour leur espèce. Les poissons sont manipulés sous anesthésie pendant moins de 5 minutes. Suite à cette anesthésie, les poissons sont réveillés dans de l'eau de mer. Le point limite suivant sera observé après les phases d'injection des cellules souches germinales et de marquage: tous les animaux ne récupérant pas une nage normale dans les 5 minutes après ces actes seront euthanasiés par une surdose d'anesthésie précédée d'une anesthésie.

Choix des espèces

Le bar est une espèce dont l'élevage est maitrisé, et pour laquelle la technique de transplantation des cellules souches germinales a été mise au point. Les larves de bars utilisées seront âgées de 60 jours. Les larves âgées de 60 jours pèsent 15 mg, poids requis pour permettre leur manipulation. Leur jeune âge permet d'avoir 15% de succès de greffe, car leur système immunitaire n'est pas complètement mis en place ce qui évite le rejet de la greffe.