Poissons
Réponses physiologiques et comportementales de la sardine face à une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans chez la sardine Sardina pilchardus.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
360 sardines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 180 tuées pour prélever leurs tissus et 180 gardées vivantes pour observer une ponte. Chaque poisson subit douze biométries sous anesthésie et deux biopsies musculaires, puis des mesures de métabolisme et un test de fuite face à un prédateur, sous un régime pauvre en oméga-3 et une eau réchauffée. Le porteur étudie l'adaptation de l'espèce au changement climatique, en vue de modéliser l'état des stocks. Il affirme qu'il est "indispensable" d'expérimenter sur cette espèce, dont la physiologie serait mal connue.
Objectifs
L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales d’une espèce de petit poisson pélagique, la sardine Sardina pilchardus, s’ajustent face aux conditions environnementales. En particulier, l’objectif est d’étudier comment sont impactées les performances physiologiques de cette espèce de fort intérêt écologique et halieutique en termes de croissance, taux métaboliques, et comportement anti-prédateur, face à un scénario futur couplant une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans.
Bénéfices attendus
Les données physiologiques et comportementales obtenues permettront de mieux comprendre les réponses physiologiques et comportementales de la sardine, espèce dont la physiologie est mal connue, dans un contexte de changement climatique. Aussi, les données obtenues au niveau de l’individu seront utilisées par la suite dans notre projet pour modéliser les réponses au niveau de la population. Ceci permettra à terme de mieux comprendre la répartition des stocks, mais aussi la qualité des stocks en termes d’oméga 3, dans un contexte de changement climatique.
Procédures
- Tout au long du conditionnement, nous suivrons le taux de croissance individuel à travers des biométries bimensuelles. Chaque poisson (n=360) subira donc 12 biométries d’environ 2 minutes chacune. - Tout au long du conditionnement, nous suivrons également la composition en acides gras individuellement sur les 360 individus par (1) une première biopsie réalisée au T0 du conditionnement sur le flanc gauche, au-dessus de la ligne latérale, (2) une seconde biopsie musculaire réalisée 2 mois après le début du conditionnement, cette fois sur le flanc droit, au-dessus de la ligne latérale. Chaque poisson (n=360) subira donc 2 biopsies, qui dure chacune environ 5 minutes. - Entre 4 et 6 mois après le début du conditionnement, les performances physiologiques et comportementales des individus seront évaluées: • A l’issue de 4 mois de conditionnement, les taux métaboliques des 360 individus, c’est à dire la quantité d’oxygène consommée par unité de poids et de temps, seront mesurés par respirométrie 4 fois par bassin, sur 24h (durée totale estimée pour tester les 12 bassins : environ 2 semaines). • A l’issue de 5 mois de conditionnement, les performances de fuite seront mesurées sur 180 individus, à raison de 5 individus à la fois, par analyse vidéo sur 24h, (durée totale estimée pour tester les 180 individus : environ 1 mois). La réponse de fuite mesurée en tant que telle ne dure que quelques secondes, mais les animaux seront gardés 24h en tout dans le bassin test. • Un prélèvement sanguin, durant environ 3 minutes, sera effectué à la suite des mesures de réponses de fuite, c’est-à-dire environ 6 mois après le début du conditionnement, sur ces mêmes 180 individus. - Des mises à jeun de 24h seront effectuées avant chaque biométrie, biopsie, mesure de respirométrie et mesure de réponse de fuite
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent : (1) la biométrie qui nécessite une anesthésie puis une contention des animaux, et qui peut alors générer un stress léger durant environ 3 minutes par poisson, (2) les biopsies qui nécessitent une anesthésie, une contention, et une cicatrisation, et qui peuvent alors générer une douleur et un stress modéré pendant environ 5 minutes, (3) la respirométrie (mesure des taux métaboliques) peut générer un stress léger si le niveau d’oxygénation du bac descend en dessous du seuil de 75% d’oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Ce stress n’excèdera pas 15 minutes, qui est la durée durant laquelle la pompe permettant le renouvellement d’eau reste fermée pour permettre la mesure de consommation en oxygène des individus, (4) la réponse de fuite peut générer un stress modéré durant environ 5 minutes, lié au fait que nous stimulons les individus avec un stimulus expérimental mimant un prédateur, et cherchons à générer une réponse de fuite, (5) le prélèvement sanguin lié à l’anesthésie et à la contention peut générer un stress modéré et une douleur pendant environ 3 minutes, (6) le cumul des actes sur un même individu peut générer un stress sévère d’une dizaine de minutes, notamment du fait que les prises de sang seront effectuées juste après la mesure de réponse de fuite.
Devenir
A l’issue de la procédure, 180 animaux ayant subi le test de de fuite seront mis à mort pour prélever leurs différents tissus nécessaires à l'analyse des acides gras, à la mesure de l'expression de gènes (foie, muscle, cerveaux, yeux), ainsi qu'à la détermination de l’âge (otolithes). Les 180 autres seront gardés en vie et replacés dans un bassin commun pour voir si une ponte naturelle a lieu, puisque la période correspondra à une période de ponte en milieu naturel, et que des pontes spontanées ont déjà été obervées dans d'autres laboratoires à cette période.
Remplacement
Cette étude vise à caractériser les réponses physiologiques et comportementales de la sardine (croissance, synthèse des acides gras, taux métaboliques, évitement des prédateurs) face aux changements environnementaux. Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. En effet, les processus étudiés s’appliquent à l’organisme vivant, dans son intégrité et toute sa complexité.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte-tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. L’estimation a été faite à partir de données de variabilités (notamment de croissance, de données d’expression de gènes, et de mesures d’acides gras) obtenues dans des expériences préalables sur d’autres espèces moins grégaires (prise en compte de la puissance des tests statistiques). Pour permettre d’utiliser un minimum d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les mesures de respirométrie et de réponses de fuite. Pour tester l’effet du conditionnement sur les variables étudiées, nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes du type ANOVA à un facteur et ANOVA à mesures répétées.
Raffinement
Les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors des marquages, des biométries, des biopsies, et prises de sang, les poissons à jeun seront sédatés légèrement par injection directement dans leur bac d’origine d'un anesthésiant pour limiter leur stress et faciliter la pêche. Ils seront ensuite délicatement pêchés à l’aide d’un bécher opaque, pour limiter la manipulation des animaux et la perte des écailles (les sardines étant particulièrement sensibles aux manipulations), puis transvasés dans un seau d'anesthésiant. Ce bain d’anesthésiant contiendra également une solution à base d’aloé vera qui permet de former une petite pellicule sur la peau des poissons limitant ainsi la perte des écailles et les lésions dues à la manipulation. Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision superficielle de 5 mm de la peau au-dessus de la ligne latérale après asepsie permettra au punch à biopsie d’atteindre le muscle sans enlever de peau. A la suite de la biopsie, un antiseptique puis une goutte de colle chirurgicale recommandée par notre vétérinaire référent seront appliquées sur la zone incisée. Pour la mesure des taux métaboliques par respirométrie, l’ensemble du montage expérimental sera placé derrière un rideau, et le système mis en place directement dans les bassins permettra d’éviter aux individus le stress d’un transport, et de ressentir les modifications de changements cycliques du régime d’écoulement. Le niveau d’oxygénation du bassin sera contrôlé en permanence et ne descendra pas en dessous de 75% de saturation en oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Les animaux seront en surveillance permanente. Ils seront retirés de la procédure dès que le point limite sera atteint (les points limites sont décrits dans l’item prévu à cet effet). Pour le test de fuite, qui génère un stress qui est très souvent rencontré en milieu naturel, chaque individu ne sera testé qu'une seule fois. Le poisson sera complètement isolé de l’environnement extérieur, et son comportement sera observé en permanence par vidéo.
Choix des espèces
Le projet se focalise sur la sardine (Sardina pilchardus), petit poisson pélagique d'intérêt écologique et économique. L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales de cette espèce de petit pélagique s’ajustent face aux conditions environnementales. Il est donc indispensable d'expérimenter sur cette espèce. Stade adulte de première année (20 g et 14 cm environ). Il s’agit du stade qui permet le meilleur taux de survie après la pêche en milieu naturel. Grâce à leurs sonars, les pêcheurs sont capables, avant même de jeter le filet à l’eau d’avoir une idée de la taille des individus du banc et donc de savoir s’ils correspondent à ceux que l’on cherche. Aussi, la période de juin nous assure de trouver des individus d’un an environ. L’âge exact des individus ne pourra toutefois être confirmé qu’après sacrifice et prélèvement des otolithes, à l’issue de l’expérience.
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Autres poissons : 240
800 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée ou adoptée et environ 450 tués. Des poissons zèbres subissent un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire sous anesthésie, tandis que des carpes koï et poissons rouges sont manipulés par les stagiaires, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de futurs expérimentateurs. Le porteur décrit une formation réglementaire encadrée par un arrêté et censée améliorer le bien-être des animaux non-humains détenus. Il affirme que le remplacement des animaux par un modèle est "impossible" lors des travaux pratiques.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séances, les expériementateurs maitriseront les aspects élémentaire de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'élements permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les carpes koï/poissons-rouges et les poissons-zèbres seront soumis à une anesthésie. Les carpes koï ne seront pas soumises à des prélèvements. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes (sperme et ovocytes) de manière non-invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale. La durée des interventions ne devra pas excéder 2 minutes pour les femelles et 4 minutes pour les mâles. Dans le cas de poissons-zèbres gardés d'une session sur l'autre, nous veillerons à ce que le lot d'individus qui est déjà passé en procédure n'en subisse pas une deuxième et ne soient utilisés que pour la mise en reproduction.
Impact sur les animaux
L'ensemble des manipulations réalisées par les stagiaires est encadré par des professionnels et un vétérinaire spécialisés sur les espèces aquatiques. La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie. L'anesthésie peut être considérée comme une nuissance en tant que telle. Ainsi, celle-ci n'excédera pas 10 minutes au total. Le temps de recouvrement de l'anesthésie est en général rapide et le poisson reprend ses comportements natatoires rapidement. Les manipulations faites sous anesthésie, à savoir le fin-clip et le prélèvement de gamète, sont considérées aussi comme des nuisances. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette. Concernant la biopsie de la nageoire caudale (fin-clip) : Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, la nageoire caudale présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement.
Devenir
carpe koï/poisson-rouge : En fin de procédure les animaux seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet. Poisson-zèbre : en cas de sessions rapprochées, les animaux seront maintenus en vie et réutilisés pour la mise en reproduction. Si les sessions sont trop éloignés, les poissons-zèbres seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (un animal par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard (animaux dit de réforme) dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques.
Raffinement
S’agissant d’une formation réglementaire soulignant les bonnes pratiques zootechniques, un soin particulier sera apporté à l’enrichissement de l’environnement (ajout d’éléments de décors, pondoirs avec une plage etc.), des éléments d’enrichissement alimentaire (zooplanctons) seront également apportés (1 fois par jour si possible). Une grille de score pour la détection des points limites sera utilisée, que ce soit lors des procédures mais aussi lors de l'observation quotidienne des animaux. La grille de score regroupe différents paramètres à observer chez le poisson (apparence physique, respiration, comportements alimentaire, social et natatoire) et donne un score aux problèmes observés. En fonction du score obtenu, l'animal va soit être monitoré très attentivement, soit soigné, soit euthanasié. Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anethésie.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est la principale espèce utilisée à des fins scientifiques. La facilité d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font un modèle de choix pour la recherche. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (facilité de reproduction, nombres d'œufs, température, etc.) de cette espèce permettent de présenter de manière optimale l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. La carpe koï est un poisson téléostéen d’eau froide, présentant des caractéristiques complémentaires au poisson-zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie. Il en va de même pour le poisson rouge. Poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures. Carpes koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés. Poissons-rouges : les animaux seront des adultes de réforme.
Evaluation du potentiel d’adaptation rapide des ombles chevaliers au changement climatique
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
720 ombles chevaliers vont être utilisés dans des procédures classées en gravité légère, 660 tués à l'issue et 60 géniteurs remis en liberté. Les géniteurs sont anesthésiés pour prélever gamètes et un fragment de nageoire, et la descendance subit des mesures de respirométrie avec un jeûne de 44 heures et un isolement temporaire. Le porteur justifie la mise à mort par le stress et la souffrance potentiels de l'expérimentation elle-même. L'objectif déclaré est d'évaluer le potentiel d'adaptation de l'espèce à une hausse de la température de l'eau.
Objectifs
Les salmonidés lacustres sont emblématiques de l'Amérique du Nord et de l'Europe. Ce sont des espèces qui ont une forte importance économique (pêche professionelle et amateur), patrimoniale et un fort interêt écologique de part leur position dans le réseau trophique. Néanmoins, les populations connaissent de nombreuses fluctuations. Les données relatives aux captures de pêche montrent des variations interannuelles fortes et irrégulière, due à plusieurs facteurs telles que la température ou l’eutrophisation. Le réchauffement climatique est l’une des principales causes pouvant expliquer ce déclin. En effet, la température influence directement la physiologie, le développement et le comportement des individus. L’objectif de ce projet sera de quantifier l’adaptation phénotypique de populations face au réchauffement climatique lors des premiers stades de vie des salmonidés. En effet, les effets de la température peuvent notamment être dépendent de l’origine des poissons, certaines populations présentant une sensibilité plus faible à une augmentation de la température, laissant apparaitre une possible adaptation. Ainsi, les études sur le réchauffement climatique suggèrent que certains organismes peuvent mettre en place des stratégies évolutives et plastiques afin d’y faire face. Spécifiquement, ce projet testera si la population d’origine et la température d’incubation (4° et 9°) influencent le phénotype des individus. Les observations seront réalisées à deux pas de temps (180 jours et 300 jours après la fécondation) sur le développement (croissance) et le phénotype (morphologie, comportement et physiologie). Ces analyses permettront d'évaluer le potentiel d'adaptation des salmonidés.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au mécanismes d’adaptation des salmonidés face aux réchauffement climatique. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes ayant différentes histoires évolutives. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la gestion du repeuplement de salmonidés.
Procédures
Les géniteurs seront anesthésiés avant le prélèvement des gamètes et de tissus (nageoire) afin de réduire le stress et empêché toute sensation de douleur. Les nageoires des poissons peuvent repousser et c’est ainsi un prélèvement non invasif. Pour la descendance, les animaux seront mis dans deux bacs (2 x 5L) connéctés afin d'être filmés (mesure comportementale). Ensuite, des mesures respirométriques seront effectué dans un récipient hermétique (200ml) pendant 20h environ ce qui limiteras sensiblement leur mouvement (la petite taille des poissons aux stades de développement étudiés, la contrainte physique due à la taille des chambre respirométrique sera limitée). Ces mesures impliqueront un jeun de 44h (mis à jeun pendant 24h avant la mesure + 20h de mesure) qui ne devrait pas impacter le développement des poissons. Un léger stress pourra être ressenti dû à l’isolement des poissons. L’eau y sera renouvelée toutes les 10min pour s’assurer que la qualité de l’eau reste bonne durant le test. Enfin, ils seront anesthésiés afin d'être placés sous un objectif photo et d'être pris en photo. Après leur réveil, ils seront ensuite replacés dans leur aquarium.
Impact sur les animaux
Durant les actes expérimentaux, le stripping sur les géniteurs induira un leger stress physique. Le prélèvement d’une petite section de nageoire sera effectué entrainant une légère lésion physique. Sur la descendance, la prise de photo pour mesurer la morphologie et vidéo pour le comportement n’impliquent qu'une légere peur dû à la manipulation physique (à l’aide d’une épuisette) des animaux pour les placér sous l’objectif photo. Les mesures métaboliques impliqueront un jeun court (léger stress alimentaire 24h de jeun + 20h de mesure), une faible contrainte de déplacement et un isolement temporaire des congénères.
Devenir
Pour pallier au stress et souffrances potentiels dû à l’expérimentation, les individus sont mis à mort à la fin de la procédure. Les géniteurs qui auront pu être manipulés sur le terrain sans être ramenés au laboratoire seront remis en liberté.
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre la diminution des effectifs dans les populations de salmonidés. L'objectif est d'évaluer les effets d’une augmentation de la température en milieu sauvage dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température. Ces effets sont, de plus, problématiques d’un point de vue économique et écologique. En effet, cette étude permettra de comprendre la sensibilité au changement climatique d'une espèce avec une forte importance économique (pêche professionelle et amateur) et également écologique (prédateur). Le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il répond a une problématique spécifique. De plus, chaque espèce répond différemment aux variations environnementales, ainsi il n’est pas remplaçable ni substituable.
Réduction
Cette expérimentation prévoit 2 traitements de température (4 et 9°C) chez 3 populations avec 10 familles chacune. 20 géniteurs issus de chacun des 3 lacs ( = 3 populations) seront nécessaires pour obtenir les gamètes. Les analyses statistiques envisagées seront notamment des analyses de variances (ANOVA) et des modèles linéaires à effets mixtes (GLM). L’effectif de 10 individus par famille permet d’avoir un effectif de qualité pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses et évaluer la plasticité des traits, et les 100 individus (10ind * 10 familles) suivis dans chaque populations permettent prendre en compte la répétabilité de la variabilité interindividuelle dans chaque traitement ainsi que la variabilité entre les séries (facteur aléatoire), tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). Au total 720 individus seront utilisés à la fin de l’étude : (2 traitements * 3 populations * 10 familles * 10 individus) = 600. 600*0.1(mortalité anticipée) + (20 géniteurs * 3 populations) = 720 individus.
Raffinement
Tout au long de l’expérimentation, les structures et conditions expérimentales évolueront avec la croissance des animaux (litrage, nourriture, lumière). Les aquariums disposeront d’un couvercle afin de limiter le stress dû à la lumière. Les animaux seront visités 3 fois par jour en semaine et 1 fois par jour le week-end. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (pH, oxygène) seront vérifiés quotidiennement. Avant les mesures morphologiques, les individus seront anesthésiés afin de limiter le stress due à la manipulation. Lors des mesures comportementales, une cachette sera disposée dans l'aquarium de test afin de limiter le stress. Les géniteurs seront anesthésiés avant le stripping et le prélèvement de tissus (1/5 de la nageoire pelvienne) afin de réduire le stress et prévenir toute sensation de douleur. Les nageoires des poissons peuvent repousser et c’est ainsi un prélèvement non invasif.
Choix des espèces
Les salmonidés sont en déclin depuis plusieurs décennies, ayant des conséquences économiques, sans que les raisons de ces pertes d’effectifs ne soient complètement comprises. Bien que le réchauffement climatique soit l’une des causes de ce déclin, certaines populations se maintiennent, suggerant que certains individus puissent s’adapter. Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face au réchauffement climatique. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes avec différentes origines. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la conservation des salmonidés. Pou obtenir des gamètes des animaux au stade adulte sont nécessaires, puis des poissons au stade larvaire et stade juvénile pour les mesures de morphologie, comportement et métabolisme. Ces premiers stades de vie devraient présenter des phénotypes différents selon les traitements des fluctuations de température subit durant le développement embryonnaire.
Devenir et effet de contaminants chimiques émergents en condition de réchauffement climatique chez le bar européen
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
7 300 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux stades post-larvaires, ils sont exposés pendant 45 jours à un mélange de polluants PFAS dans leur alimentation et à une hausse de la température de l'eau de 5 °C, puis pêchés et tués à douze points de prélèvement. Le porteur décrit un stress léger cumulé qu'il juge modéré, et vise à comprendre les effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination chimique. Les bénéfices annoncés restent une référence pour de futures études en écotoxicologie marine.
Objectifs
Le projet vise à acquérir des connaissances sur les effets interactifs des contaminants chimiques et de l'augmentation de la température sur le bar européen. On s'attend à ce que les écosystèmes marins soient affectés par le réchauffement dû au changement climatique et par le nombre croissant de contaminants chimiques bioaccumulés dans l’environnement, tels que les substances per- et polyfluoroalkyles (PFAS). Ces composés désignent un groupe de produits chimiques manufacturés (composés organofluorés) qui sont utilisés dans l’industrie et les produits de consommation en raison de leurs propriétés antiadhésives, résistances aux fortes chaleurs et imperméabilisantes. Ils sont présents dans une grande variété de biens de consommation, tels que les mousses anti-incendie, les ustensiles de cuisine antiadhésifs, les cosmétiques, les emballages alimentaires et les matériaux comme les moquettes, les tissus antitaches et les vêtements hydrofuges. Compte tenu de leurs utilisations, persistance et omniprésence, ces composés sont identifiés dans tous les compartiments de notre environnement (eau, sol, air) et représentent une menace pour l’environnement marin. Ensemble, ces facteurs de stress (tempérarture et contamination chimique) constituent un défi pour les organismes marins et peuvent nuire à leur croissance et à leur développement. Le projet ambitionne d'étudier simultanément la manière dont l'augmentation de la température pourrait influencer la cinétique d’accumulation de ces contaminants, et la manière dont ces facteurs de stress combinés impactent les fonctions physiologiques d'un poisson de climat tempéré. Une exposition en laboratoire des premiers stades de vie du bar (post-larves) dans le cadre d'une élévation de température de l’eau de +5°C seront mises en oeuvre, avec une contamination alimentaire d'un mélange de contaminant. Ce projet se décline en 3 objectifs : i) étudier la façon dont les contaminants sont assimilés par les poissons à 2 températures différentes ; ii) étudier l’influence de la température sur les voies d’élimination des contaminants et iii) étudier l'impact de l’augmentation de la température de l’eau et de la contamination chimique sur la mise en place de l’axe de la reproduction et du développement des bars.
Bénéfices attendus
Cette expérimentation fournira des connaissances et des outils pour une meilleure anticipation et compréhension des changements globaux à venir, et servira de référence pour les études futures en écotoxicologie marine. En particulier, sur la façon dont l'histoire environnementale précoce des poissons peut affecter les fonctions physiologiques des stades ultérieurs dans leur capacité à faire face à l'environnement pollué et au changement climatique.
Procédures
Les poissons seront soumis à une contamination de composés organofluorés dans l’aliment pendant une période de 45 jours. Pendant cette période, 8 points de prélèvements seront réalisés à 0, 4, 8, 14, 21, 28, 35 et 45 jours pour suivre les cinétiques de contamination. Cette exposition sera suivie d'une phase d'épuration pendant 2,5 mois avec également 4 points de prélèvements à 48, 53, 75 et 120 jours. Ces prélèvements nécessiteront la mise à mort des poissons.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue correspond à un stress léger pendant les 45 jours de contamination dans les 4 groupes expérimentaux de poissons. Un stress léger supplémentaire (moins d’une minute) sera également généré lors des pêches nécessaires pour la réalisation des prélèvements. Compte tenu de ces deux stress cumulés, les nuisances attendues sont modérées.
Devenir
Mise à mort nécessaire pour réaliser les prélèvements.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier 1/ les cinétiques d’accumulation de contaminants sur des stades précoces (post-larves) dans un contexte de réchauffement climatique ; 2/ paramétrer les effets potentiels de ce multi-stress sur les stades précoces pour appréhender l’impact sur les stades ultérieurs.
Réduction
Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance ont été réalisés. Le nombre d’animaux est estimé afin 1/ d’optimiser les quantités nécessaires pour les différents types d’analyses (chimiques, biochimique et biomoléculaires) ; 2/ de permettre des analyses statistiques fiables malgré la variabilité de la réponse physiologique entre les individus. 3/ le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).
Raffinement
• Un jeûne (minimum 12 heures) sera réalisé avant les manipulations afin d’éviter la régurgitation et le malaise des poissons. • La pêche des poissons se fera à l’aide d’un Becher pour les stades post-larves, puis à l’aide d’une épuisette appropriée à la taille des bacs et des juvéniles. • Au préalable à l’exposition aux contaminants par voie trophique, qui nécessite l’utilisation d’une solution de solvant (méthanol), un test d’appétence a été réalisé sur les recommandations de la cellule SBEA (Structure Bien-Etre Animale) du laboratoire. Aux concentrations utilisées, le méthanol n’altère ni l’appétence de l’aliment, ni la croissance des poissons.
Choix des espèces
Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination par des composés poly et perfluoroalkylés (PFAS) sur la physiologie de cette espèce. Le stade post-larves du bar sera ciblé en particulier puisqu’il est démontré que l’exposition à des changements environnementaux aux stades précoces induit des effets à long terme sur les stades ultérieurs. Par ailleurs, ce stade de vie (fin de développement larvaire) correspond au retour des individus à la côte, où une exposition aux contaminants chimiques est plus importante, particulièrement en zone estuarienne.
Impact de la proportion de muscle rouge sur la capacité de nage chez la truite automnale
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque poisson subit deux tests de nage forcée à contre-courant, jusqu'à trois heures, la répétition sur les mêmes individus justifiant la gravité sévère déclarée. Le porteur indique que l'objectif premier relève d'un "enjeu agronomique et économique", diminuer par sélection génomique le muscle rouge qui gêne la vente de truite fumée, et présente comme bénéfice annexe la vérification que cette baisse ne nuit pas à la capacité de nage. Il conclut que la question impose des tests sur animaux vivants.
Objectifs
La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes . Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres , alors qu’une autre n’observe aucun effet . Un des objectifs du projet est de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Plus spécifiquement, l'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la mesure de capacité de nage est répétable entre 2 tests et s'il y a une relation entre capacité de nage et proportion de muscle rouge au sein de la même base génétique. Ce projet comporte une seule procédure expérimentale de test de nage classée sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Par ailleurs, il s'agira de déterminer si la capacité de nage d'un poisson est comparable entre 2 tests séparés de 3 semaines pour permettre une récupération complète. De plus, il s'agira de déterminer s'il existe une relation entre les capacités de nage et la proportion de muscle rouge ou la morphologie au sein d'une même base génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental. Le débit sera progressivement augmenté par paliers de 10-20min pour atteindre 90cm/s. Le test doit durer 160 minutes. Au cas où un animal n’aurait pas décroché, le test de nage sera arrêté au bout de 3 heures. Le test sera répété 2ème fois sur les mêmes animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les poissons utilisés dans ce projet sont celles générés par un test de nage répété 2 fois (phase 1 et 2) sur les mêmes individus et qui va durer au maximum 3h. Cette nuisance est sévère car répétée 2 fois sur les mêmes individus. Ces tests de nage nécessitent également une émersion des animaux pour les transférer de leur bassin d’élevage jusqu’au dispositif de test de nage qui ne durera pas plus de 5 secondes. Cette émersion des animaux génère un stress de courte durée est considéré comme léger. Enfin, les animaux seront exposés à des phases d’habituation à un environnement nouveau lié au regroupement 3 à 4 semaines avant les tests, et au changement de bassin lorsqu’ils seront transférés du bassin d’élevage au bassin de test induisant un stress modéré. Les animaux seront également mis à jeun la veille du test. Ces mises à jeun, bien supportées par l’espèce, sont léger.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
En prenant en compte la variabilité de la réponse au test de nage et de la proportion de muscle rouge, nous avons pu diminuer le nombre d'animaux utilisés à 180 truites. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante et de mettre en évidence une relation entre la proportion du muscle rouge et les performances de nage.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèces (photopériode, qualité d'eau, densité, nourriture). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués en même temps que le marquage par pit-tag entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test afin de limiter au minimum le stress du transfert. Pour cela, les poissons seront pêchés dans leur bassin d’élevage avec une épuisette, puis disposés dans un bac d’anesthésie avec de la tricaïne MS-222 + bicarbonate de soude pour tamponner le milieu et éviter un stress d’acidité. Lors du marquage, les poissons seront déposés sur une serpillère humide pour éviter la déperdition de mucus. Le corps et les yeux des poissons seront recouvert de cette serpillière pour les isoler de l’environnement ambiant. Après injection de la marque, les poissons sont mis dans un bac de réveil, avant d’être regroupés pour constituer les lots destinés aux tests de nage. Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le temps d’émersion des animaux qui ne durera pas plus de 10 secondes. Ils seront également mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin qui sera disposé dans une pièce isolée et ne servant qu’aux tests de nage afin de limiter le stress. Pendant la procédure, la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Cette surveillance du comportement des poissons se fait en continu dès lors que les poissons sont pêchés dans leur bassin d’élevage pour être introduit dans le dispositif de test de nage. Une à deux personnes seront en permanence prêtes à intervenir dès l’atteinte des points limites pendant le test, Notre expérience, nous indique que les poissons bien épuisés récupèrent tous après un test de nage. Par ailleurs, à l'issue de la phase 2, les poissons sont mis à mort dès qu'ils ne sont plus en capacité de nager (cf § 4.2 Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.
Choix des espèces
L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.
Evaluation de l’effet dose-réponse d’un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss).
- Recherche appliquée
- Maladies animales
630 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Vaccinées par immersion puis infectées par injection avec une souche virulente de Flavobacterium psychrophilum, elles servent à mesurer une dose létale 50 et l'efficacité du vaccin, le critère retenu étant la survie ou la mort. Le porteur indique que les poissons atteignant le point limite, défini par une détresse terminale (nage erratique, nécrose, animal ne répondant plus aux stimuli), sont mis à mort. L'objectif affiché est commercial, la mise sur le marché d'un vaccin pour la pisciculture de la truite.
Objectifs
Flavobacterium psychrophilum est une bactérie et l'agent responsable de la flavobactériose d’eau froide aussi connue comme syndrome de l'alevin de la truite arc-en-ciel qui revêt une importance économique notable . Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne dans la production aquacole en eau douce de la truite arc-en-ciel. Aucun vaccin commercialisé contre cet agent pathogène et ses manifestations cliniques n'est actuellement disponible. Le partenaire de ce projet a l'intention de commercialiser un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum afin de contribuer à la prévention de la flavobactériose chez la truite arc-en-ciel. La souche vaccinale a conféré une protection significative à la truite arc-en-ciel lors d’épreuves d’infection réalisées avec la souche mère virulente isolée aux Etats-Unis. Plusieurs essais de vaccination de truites arc-en-ciel par immersion ont été réalisés à l'Université de l'Idaho. L'utilisation du vaccin a permis d'obtenir une protection significative par rapport au groupe ayant reçu le contrôle. Avant une mise sur le marché, il est nécessaire de valider l’efficacité du vaccin sur des souches responsables d’épisodes infectieux en Europe. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet vise à évaluer l’effet dose-réponse du vaccin vivant atténué contre l’infection par une souche virulente de la bactérie pathogène Flavobacterium psychrophilum isolée en France. Les poissons après avoir été vaccinés par immersion seront infectés dans des conditions contrôlées afin d’évaluer leur résistance et l'efficacité du vaccin.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point le protocole d’administration d’un vaccin (dose et temps de contact) et d’évaluer le potentiel protecteur de ce vaccin. Si les résultats sont positifs, le partenaire poursuivra les essais dans le but de mettre sur le marché et de commercialiser ce vaccin.
Procédures
Les deux étapes de vaccination (primo et rappel) sont réalisées par immersion pour répondre aux contraintes de la filière (praticité d’administration à l’échelle industrielle). Les infections expérimentales sont réalisées par injection. Elles sont réalisées sous anesthésie (par bain) et une seule injection par poisson est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 48 heures avant l’infection. Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations.
Impact sur les animaux
Le critère utilisé pour évaluer l’efficacité du vaccin est la résistance au pathogène suite à un challenge infectieux. La réponse est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. L’inocuité de la souche vaccinale a été démontrée lors d’expériences précédentes sur la truite arc-en-ciel menées par le partenaire du projet, aucun effet indésirable de l’étape de vaccination n’est attendu. Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert) et à injection lors du challenge sont compensés par anesthésie par bain (tricaïne à 100 mg/l).
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour évaluer l’efficacité du vaccin de soumettre les poissons à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance.
Réduction
La mesure de la dose létale 50 (DL50) est un protocole de référence en expérimentation animale nécessitant 6 doses avec 10 poissons par condition. La mise en évidence de différences significatives entre les conditions de vaccination (dose et durée d’immersion dans le vaccin) nécessite 30 poissons par aquarium. Des effets dépendants du bac d’élevage étant classiquement observés lors des épreuves infectieuses, il est indispensable de dupliquer les groupes infectés. Les effectifs proposés sont ceux utilisés récemment pour les analyses statistiques lors de l’évaluation de vaccins contre F. psychrophilum. Dans un but de réduction, la mesure de la DL50 sera mutualisée dans d’autres projets employant le même lot d’animaux et les mêmes conditions du challenge infectieux (même souche, mode d’infection).
Raffinement
Les animaux sont observés au moins deux fois par jour afin de surveiller l'apparition du point limite qui sera suivi par une grille de scoring et défini par une détresse terminale par l’observation cumulée de 2 signes cliniques minimum correspondant à : une nage erratique, hyper ou sous ventilation, nécrose au point d’injection pouvant conduire à un choc osmotique (dérégulation des pressions), caudale rongée, animal ne répondant plus aux stimuli (épuisette). Une anesthésie par bain de tricaïne (100 mg/L) est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau (T°C = 10°C, O2>7 mg/l, pH = 8, NO2
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine l’evaluation de la protection du vaccin. Pour l'évaluation de la résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (5 g) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale. De plus, c’est à ce stade que les animaux sont le plus sensibles à cette pathologie dans les élevages. L’objectif commercial est donc de vacciner les animaux sur ces stades précoces (1 g).
Description d’un protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque chez les poissons téléostéens pour l’étude de cellules souches du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 poissons de plusieurs espèces vont être utilisés, mis à mort sous anesthésie profonde par la perfusion d'un fixateur chimique dans le cœur. La procédure est finale et ne vise pas à produire des connaissances biologiques nouvelles mais à mettre au point et publier un protocole de fixation adapté aux petits poissons. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet d'étudier un tissu par immuno-histologie ou microscopie électronique, et que la qualité de fixation obtenue réduira à terme le nombre d'individus utilisés. Les espèces concernées sont des poissons zèbres, médakas, astyanax et cichlidés, étudiés à trois stades de développement.
Objectifs
La qualité de la fixation est cruciale pour le succès des protocoles histologiques. L’efficacité de la fixation par immersion dans le fixateur est limitée par la taille de l’échantillon considéré ; de par la lente diffusion de la molécule fixative au centre du tissu. De plus, la fixation-perfusion cardiaque permet une perfusion immédiate du fixateur à travers la circulation sanguine. Actuellement, dans les études chez les tétrapodes, la fixation-perfusion cardiaque est la technique standard dans les études histologiques. Enfin, l’avantage de la perfusion cardiaque est impérative lorsque l’homogénéité de fixation est cruciale comme pour les études d’épitopes labiles en immunohistologie ou dans les expériences de microscopie électronique. Alors qu’il existe de nombreuses publications décrivant la perfusion cardiaque pour les tétrapodes, aucune n’est adaptée aux poissons. Ce protocole permet de réaliser la dissection et la perfusion-fixation cardiaque chez les poissons téléostéens, les poissons zèbres, les médakas et les cichlidés.
Bénéfices attendus
Tout d’abord ce projet concerne l’étude des régions des cellules souches du toit optique chez les téléostéens. D’autre part, la présente demande d’autorisation de projet permettra de publier un protocole de perfusion-fixation adapté au petits poissons téléostéens qui manque actuellement à la communauté scientifique. De plus, la très bonne fixation que permet la perfusion permettra de réduire grandement le nombre d’individus utilisé pour les expériences d’immuno-histologie et de microscopie électronique. En effet comme tous les tissus sont parfaitement fixés en plus du cerveau, ceux-ci peuvent être tous étudiés dans d’excellentes conditions éventuellement par différentes équipes et pour différents projets.
Procédures
Les poissons ne seront soumis qu’à l’unique procédure décrite dans cette demande d’autorisation de projet. Cette procédure est finale et comporte la mise à mort sous anesthésie profonde par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde). La procédure doit être réalisée en 3 à 5 minutes comptées après que le poisson est sorti du mélange anesthésique.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernant un lot de poissons avant la mise à mort par perfusion-fixation peuvent être dues à : 1- Leur déplacement de l’animalerie vers le laboratoire de perfusion ; 2- Les poissons étant perfusés un par un, la pêche au filet du poisson dans son aquarium pour le mettre dans l’aquarium d’anesthésie peu stresser le poisson concerné et brièvement ses congénères, cet opération est réalisée environ en une minute ; 3- Le pincement la queue du poisson pour tester du niveau de profondeur de l’anesthésie, puis lorsque on teste une seconde fois l’anesthésie en positionnant les aiguilles de contention. Passé ce dernier stade et après la dissection du cœur, le poisson est mis à mort par la procédure de perfusion-fixation.
Devenir
L’ensemble des poissons de ce projet seront soumis à une anesthésie profonde suivie par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde. Cette procédure est finale.
Remplacement
Il n’y a aucune alternative non animale pour étudier un tissu biologique par immuno-histologie ou par microscopie électronique. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces proches phylogénétiquement et dans le cadre de notre projet d’étude comparée, ces espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre de poisson prévu a été calculé dans le but le réduire au minimum. Ce type d’étude histologique et de microscopie électronique ne nécessite pas en elle-même un nombre statistique d’individus étudiés. De plus, l’établissement du protocole de perfusion-fixation aboutira à une réduction du nombre d’individus utilisé de fait de la qualité de la fixation obtenue dans la communauté des chercheurs travaillant sur les petits téléostéens.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être des poissons sera assuré par les zootechniciens compétents de l’institut. Pour les poissons élevés à l’institut (zébrafish, médakas, astyanax), les individus resteront dans l’animalerie jusqu’à ce que l’ensemble des équipements nécessaires soient en place. Comme indiqué ci-dessus, les individus prévus pour une journée de perfusion, seront amenés dans une zone de stabulation proche mais suffisamment éloigné de la zone de perfusion pour que les bruits ne génèrent pas de stress. Puis les poissons seront prélevés un par un puis déplacé près de la zone de perfusion et anesthésiés loin de la zone de stabulation. Pour les cichlidés qui ne sont pas encore élevés au laboratoire mais qui sont achetés en animalerie, les jours de perfusion seront adaptés à leurs livraisons, c’est-à-dire qu’ils seront perfusés le jour de leur arrivée au laboratoire afin que leur stress du voyage ne se poursuive pas inutilement.
Choix des espèces
D’une part, les espèces zébrafish, médakas et astyanax sont reconnus par un grand nombre de publications comme des poissons modèles pour les analyses neuro-anatomiques étudiant les structures cérébrales de téléostéens à petits cerveaux. D’autre part, des espèces moins connues de cichlidés présentent des comportements complexes (émotions, motivation, apprentissage) et présentent de plus grand cerveaux (Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra). Notre projet vise à réaliser une étude comparative phylogénétique entre toutes ces espèces du point de vue neuro-anatomique, immuno-histologique et comportemental. L’avantage du choix de ces espèces est que certaines sont relativement proche phylogénétiquement mais qu’elles présentent a la fois des différences importantes entre leurs structures cérébrales. Pour ces études nous aurons donc besoin de procéder à ces comparaisons à la fois comportementales, anatomiques et immuno-histologiques. Pour toutes ces espèces nous avons donc besoin de valider le protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque. Pour les espèces de zébrafish, médakas et d’astyanax nous étudions trois stades de développement (3 semaines, 1 mois et 3 mois) car nous cherchons à connaître le rôle des niches de cellules souches dans le développement du toit optique une structure du cerveau des téléostéens. Les cichlidés nous intéressent pour leurs capacités comportementales de haut niveau et seul le stade adulte nous intéresse pour cette étude.
Alimentation du bar commun par un nouveau produit à base de plancton congelé
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
1908 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent un stress de confinement d'une heure et un marquage par puce RFID sous anesthésie, pour tester un aliment à base de plancton congelé destiné à l'élevage larvaire. Le porteur présente ce projet comme visant à améliorer la pisciculture et affirme qu'il n'est pas possible d'éviter l'expérimentation zootechnique. Les 1908 poissons sont tués, dont 1800 à l'âge d'un an, le sexe ne pouvant être déterminé que par observation des gonades après mise à mort.
Objectifs
Le projet a pour objectif de tester un nouveau type d'aliment pour l'élevage larvaire du bar, le plancton congelé. Il consiste en des larves de crustacés cirripèdes conservées dans l'azote liquide qui après décongélation retrouvent leur mobilité et sont utilisables comme nourriture vivante pour la phase très délicate de l'élevage larvaire des poissons marins. Le plancton congelé présente une meilleure qualité nutritionnelle que les Artemia normalement utilisées pour cette phase d'élevage, et est utilisé avec succès dans l'élevage de morue, vieille et lompe. Nous souhaitons évaluer l'efficacité de cet aliment vivant novateur chez le bar, et étudier son effet sur la croissance, la survie et la robustesse des larves et des jeunes poissons.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet de montrer de meilleures survie, croissance et robustesse du bar lors de l'élevage larvaire avec l'utilisation de plancton congelé, du fait de sa valeur nutritionnelle très supérieure à celle des nauplii d'Artemia classiquement utilisées à ce stade: en particulier, le plancton congelé est beaucoup plus riche que les Artemia en acides gras oméga3 à chaîne longue, qui sont essentiels au stade larvaire. On attend aussi des effets potentiels sur le sex-ratio, qui se fixe pendant l'élevage larvaire chez le bar et dont on sait qu'il peut être influencé par les conditions d'élevage. D'une manière générale, la qualité de l'alimentation larvaire est capitale pour la qualité des juvéniles et des élevages aquacoles subséquents.
Procédures
Les animaux seront soumis à un stress de confinement, représentatif de procédures d'élevage classiques (pêche), d'une durée de 1 heure. Ils seront marqués par transpondeur RFID (30 secondes , sous anesthésie) pour pouvoir suivre leur développement jusqu'à l'âge de 1 an. Pendant cette période, ils seont mesurés 2 fois hors de l'eau (sous anesthésie, une minute à chaque fois).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n'est attendu pendant la phase larvaire, le protocole testé étant supposé mieux satisfaire les besoins du poisson que le protocole classique. Pour la phase de test de tolérance au stress/robustesse, les poissons subiront un test de confinement, qui mime des conditions couramment rencontrées en élevage, et dont l'effet sur les paramètres physiologiques (cortisol en particulier) ne dure pas plus de quelques heures. Pour le suivi de la croissance de 150 jours à 1 an, pour lequel il n'est pas possible techniquement de maintenir une structure de 9 réplicats, les poissons seront marqués avec des puces RFID afin de pouvoir regrouper les lots. Ceci sera fait sous anesthésie pour minimiser stress et douleur, et là aussi une récupération totale est attendue après 24 à 48 heures.
Devenir
Les 1908 animaux seront euthanasiés, dont 108 à l'issue de la phase d'évaluation du stress, afin de collecter les organes nécessaires ausx analyses. Les 1800 animaux restants seront euthanasiés à l'age de 1 an pour déterminer leur sexe (seule l'observation des gonades permet de déterminer le sexe chez cette espèce)
Remplacement
Dans l'étude de l'effet d'un régime alimentaire de type proies vivantes, il n'est pas possible d'éviter l'expérimentation zootechnique.
Réduction
Les nombres d'animaux marqués par bassin (200, soit 600 par traitement) sont évalués pour permettre de mettre en évidence des différences de taux de malformations ou de sex-ratio de 5% entre traitements, ce niveau de différence étant très significatif sur le plan économique Les effectifs prélevés pour l'étude de l'expression de gènes et du cortisol plasmatique (6 animaux par bassin et temps de prèlèvement) correspond aux bonnes pratiques expérimentales pour ce type de prélèvements
Raffinement
Pendant le marquage et les biométries lors des mesures de croissance, nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce: pré-anesthésie dans les bassins pour calmer les poissons et permettre un pêche non stressante, puis anesthésie plus profonde pour toutes les manipulations hors de l'eau (qui dureront moins d'une minute pour chaque poisson)
Choix des espèces
Dicentrarchus labrax (bar en Atlantique, loup en Méditerranée) est une espèce de poisson marin côtier, importante pour la pêche et la pisciculture. Le but de l'expérimentation est d'améliorer la phase d'élevage larvaire de cette espèce en pisciculture. Les animaux seront étudiés du stade juvénile à l'âge de 1 an, où l'observation visuelle des gonades sur poissons euthanasiés permet un sexage sans erreur, et où il est possible de dégager par filetage la colonne vertébrale pour qualifier finement les malformations de celle-ci.
Etude de l’effet d’une alimentation à base d’extrait d’algue sur le stress et l’immunité de juvéniles de bars (Dicentrarchus labrax)
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
320 bars juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont pêchés à l'épuisette à plusieurs reprises, soumis pour 80 d'entre eux à un test de stress par pourchasse puis confinement à forte densité, avant une prise de sang sous anesthésie suivie de la mise à mort. Le projet évalue si un extrait de micro-algue ajouté à l'aliment réduit le stress et renforce l'immunité en élevage. Le porteur situe le bénéfice, une recette d'aliment pour pisciculture, sur le long terme et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour ce type d'approche.
Objectifs
Depuis des décennies, de nombreuses orientations scientifiques ont concouru à diminuer la part des matières premières d’origine marine dans les aliments pour l’aquaculture. En effet, les ressources de la pêche mondiale stagnent voire régressent, et ne peuvent plus être utilisées avec la même intensité pour nourrir les productions aquacoles, dont les tonnages augmentent rapidement. Les micro-algues font partie des meilleurs candidats pour assurer des substitutions devenues obligatoires, notamment pour remplacer une utilisation trop importante des huiles et farines de poissons issues de la pêche. Elles renferment des teneurs en protéines élevées, intéressantes pour les poissons, ainsi que des lipides, des vitamines et des pigments pouvant à la fois améliorer la santé des poissons en élevage, ainsi que leur qualité nutritionnelle. Dans le cas de l’algue rouge Galdieria sulphuraria, ses capacités d’adaptations importantes associées à sa composition en glucides d’intérêt dans la régulation de certains stress, ont soulevé l’intérêt des industriels afin d’étudier son effet dans l’alimentation animale, et notamment en pisciculture. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’impact d’une supplémentation algale en Galdieria sulphuraria dans l’alimentation d’un poisson d’élevage marin, le bar commun Dicentrarchus labrax, en s’intéressant notamment à divers paramètres sanguins, impliqués dans l’immunité et la gestion du stress.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu du projet est de mettre en évidence que la micro-algue testée pourra être intégrée dans le futur à des recettes d’aliments pour poissons parce qu’elle contribue à une amélioration de certains paramètres immunitaires, susceptibles de conférer aux poissons une meilleure résistance vis-à-vis de pathogènes pouvant être rencontrés en élevage. Le deuxième bénéfice attendu porte sur la réduction de manière générale du stress du bar consommant cette micro-algue. Etant donné que la procédure d’induction du stress appliquée dans cette étude, vise à reproduire des évènements stressants ayant lieu occasionnellement en élevage, on peut espérer que les bénéfices attendus de l’incorporation de cet extrait algale dans l’aliment, confèrent une meilleure résistance des poissons à des stress de différentes natures, liés à leur élevage. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à long terme, puisqu’il resterait à déterminer (à minima) la dose optimale d’extrait de cette micro-algue à utiliser pour avoir un effet satisfaisant, puis à obtenir les autorisations permettant la mise sur le marché de ce produit. Du point de vue de la recherche scientifique, si des bénéfices étaient avérés, la recherche des composés impliqués dans l’amélioration de la physiologie du bar serait également réalisée sur le long terme.
Procédures
La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 160 poissons (prise de sang), 2 fois sur 80 poissons (changement de bac, puis prise de sang), ou 3 fois sur 80 poissons (changement de bac, test de stress, puis prise de sang). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 80 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement). La procédure ‘prise de sang’ sera réalisée une fois sur l’ensemble des animaux du projet, soit 320 bars. Elle consistera en une anesthésie, suivi d’une prise de sang, puis d’une mise à mort. L’anesthésie durera au moins 5 minutes pour assurer une anesthésie efficace, et le prélèvement sanguin durera normalement moins d’1 minute, et maximum 2 minutes.
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue est le stress généré par les pêches de poissons, réalisées pour le prélèvement sanguin à l’issu de la phase d’imprégnation (10 poissons/bac, soit 160 poissons pêchés 1 fois), pour la préparation du test de stress (10 poissons/bac), sa réalisation (20 poissons/aliment), et le prélèvement sanguin final (40 poissons/aliment, soit 80 poissons pêchés 2 fois, et 80 poissons pêchés 3 fois). Les nuisances et effets indésirables attendus sont un stress généré par une réaction de fuite, puis par l’émersion et la compression dans l’épuisette qui en suivra. Cette nuisance est considérée comme légère car elle sera à chaque fois de courte durée (durée de pêche et d’exondation du poisson de l’ordre de la minute), et réalisée à l’épuisette sur de petits groupes (10 animaux). La seconde nuisance attendue est le stress généré par le changement de bac des poissons utilisés pour étudier les niveaux en cortisol, lactate et glucose sanguin des 4 régimes alimentaires. Cette nuisance est également considérée comme légère car ce transfert sera fait dans des bacs identiques à ceux d’où proviennent les poissons. Une nuisance faisant l’objet de cette demande d’autorisation est le prélèvement sanguin sur l’ensemble des poissons inclus dans cette demande, soit 320. Il s’agit de prélever du sang des bars alimentés différemment au cours de la phase d’imprégnation, afin de réaliser par la suite différents dosages. Cette nuisance est considérée comme modérée car ces prélèvements seront réalisés sur des bars préalablement anesthésiés. La nuisance provoquée par la piqûre d’aiguille ne sera donc pas ressentie par le poisson. Le prélèvement sanguin sera d’une durée inférieure à la minute, réalisé une fois par poisson, et suivi immédiatement par la mise à mort de l’animal. La seconde nuisance faisant l’objet de cette demande d’autorisation de projet est la réalisation d’un test de stress sur 80 poissons. En effet, lors de ce test, les poissons seront pourchassés à l’épuisette pendant 1 min et par groupe de 20, ce qui engendrera un stress par une réaction de fuite, avant d’être confinés pendant 5 min à une densité élevée d’environ 60 kg/m3. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison des courtes durées d’application de ces stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements sanguins
Remplacement
Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet extrait spécifique de micro-algue, Galdieria sulphuraria. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit amène des atouts supérieurs en terme de stress et d’immunité par rapport à d’autres micro-algues et en particulier à la spiruline, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.
Réduction
Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 réplicas d’analyse par régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. En fonction du type d’analyses, du volume de sang prélevable par poisson, et de la puissance statistique souhaitée, il a été déterminer qu’il nous fallait 10 poissons par prélèvement pour les analyses immunitaires (soit 40 poissons par régime alimentaire et 160 poissons au total), et 5 poissons par prélèvement pour les analyses liées au stress (soit 40 poissons par régime alimentaire et 160 poissons au total). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte de la densité d’élevage des poissons pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, sans nuire aux besoins analytiques. Les données issues de cette étude seront analysées statistiquement.
Raffinement
La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Par exemple, les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes sans parties contondantes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les 160 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Les poissons pêchés afin de subir une prise de sang seront immédiatement sédatés pour diminuer le stress et l’inconfort de l’animal. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.
Choix des espèces
Le bar commun est une espèce de poisson marin carnivore dont l’aquaculture est bien développée en France et en Europe (3ème espèce de poisson marin produite), mais pour laquelle des voies d’amélioration restent à trouver, notamment vis-à-vis de l’immunité et du stress. Concernant l’immunité, malgré le fait que des vaccins existent, certains phénomènes de mortalité massive (ex : vibrioses) ont toujours lieu dans les élevages dans certaines conditions, et des solutions restent à trouver, qu’il s’agisse des conditions environnementales ou du statut immunitaire du poisson. En ce qui concerne le stress, plusieurs études scientifiques ont mis en évidence que le bar y est particulièrement réceptif (en terme d’augmentation du cortisol et du lactate sanguin), ce qui en fait un bon candidat pour notre étude. D’un point de vue économique, une diminution de cette sensibilité au stress pourrait améliorer les performances de ce poisson en élevage. Il s’agit d’animaux juvéniles d’environ 15 g au moment de la réalisation des procédures. Il s’agit d’un poids standardisé pour les essais zootechniques menées au sein de notre structure. Cette taille permet de réaliser des prélèvements sanguins d’un volume suffisant pour la réalisation des analyses prévues dans cette étude.
Domestication et programme de sélection artificielle chez le poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 648 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 2 340 en gravité sévère. Ils subissent un marquage par aiguille sous sédation, des mesures de cortisol et d'agressivité par isolement, un test de résistance à un choc thermique poussé jusqu'à la perte d'équilibre et, pour 2 340 larves, un test de résistance virale suivi sur 72 heures. L'objectif est de concevoir un programme de sélection artificielle pour améliorer le "potentiel aquacole" de l'espèce sur plusieurs générations, soit une finalité de production. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation portant sur l'"organisme entier".
Objectifs
L'objectif de ce projet est double. Il vise : (i) A suivre les conséquences d'un processus de domestication chez les poissons sur plusieurs générations (ii) A concevoir un programme de sélection artificielle multi-fonctions et de comparer son impact sur l'évolution du potentiel aquacole au fil des générations à celui des programmes de sélections artificielles traditionnellement appliqués en pisciculture (mono-fonction). Pour ce faire, il sera pris en compte des réponses portant sur la croissance, le comportement, le bien-être et la reproduction des poissons. Plus en détail, la méthode in vivo utilisée sera fondée sur l'étude de traits fonctionnels morphlogiques, physiologiques, comportementaux, moléculaires, génomiques et génétiques. Nos hypothèses de travail sont les suivantes : (i) a. En raison de la relaxation de la sélection naturelle et des pressions de sélection du nouvel environnement, nous émettons l'hypothèse que plusieurs changements apparaitrons dans la population de poissons zèbre sauvages au fil des générations, comme cela a été démontré chez d'autres espèces de vertébrés. (i) b. Puisque le syndrome de domestication semble être robuste entre les différents programmes de sélections (chez les mammifères et oiseaux), la deuxième hypothèse est que si ces changements sont dus à la domestication elle-même (et non pas au programme de sélection), les animaux devraient évoluer de manière similaire entre les populations qui subiront des programmes de sélections artificielles différents. Le syndrome de domestication est ici définit comme regroupant un ensemble de caractéristiques comportementales et physiologiques convergentes chez plusieurs espèces ayant subit des programmes de sélection différents. (ii) Nous émettons également l'hypothèse qu'un programme de sélection artificielle multi-fonctions peut conduire à une amélioration du potentiel aquacole, ainsi qu'à une plus grande robustesse de ce potentiel, par rapport à un programme de sélection mono-fonction. Nous définissons ici le potentiel aquacole comme étant la quantité mesurable d'expression de traits/fonctions souhaitables, favorable à la domestication et ultérieurement, à la production.
Bénéfices attendus
La domestication reste un processus difficile. Il échoue souvent (i) en raison de limitations zootechniques, de contraintes socio-économiques, d’erreurs de conception ou de caractéristiques intrinsèques des espèces/populations, (ii) conduit à un problème de bien-être animal, ou (iii) entraîne des productions peu durables avec un faible potentiel d’adaptation pour faire face aux changements dans les attentes humaines et aux changements globaux. Cela soulève la nécessité d’améliorer les approches de domestication pour façonner la production d’espèces de demain. Récemment, les programmes de domestication ont récolté les avantages des progrès de la génétique, de la génomique et de la physiologie pour concevoir des programmes de sélection artificielle (PSA). Ces PSA visent à modifier intentionnellement traits/fonctions biologiques des populations contrôlées par l’homme afin d’améliorer les performances des organismes d’élevage. La plupart des PSA se concentrent sur peu de fonctions biologiques particulières mais sans tenir compte de l’évolution d’autres au cours des générations domestiquées. Pourtant, une domestication réussie nécessite l’expression favorable de plusieurs traits impliqués dans diverses fonctions biologiques ainsi que le maintien du potentiel d’adaptation des populations domestiquées. De plus, la PSA monofonction peut entraîner la co-sélection d’expressions de traits délétères, ce qui peut condamner la production animale. L’élaboration de PSA qui tiennent compte de toutes les fonctions biologiques importantes (c.-à-d. un PSA multifonction) pourrait surmonter les pièges des PSA monofonction et améliorer la production. Cependant, le développement de PSA multifonctions est difficile car ils nécessitent (i) d’effectuer une évaluation intégrative de divers traits (du gène aux phénotypes de toutes les fonctions biologiques), (ii) de définir les expressions optimales recherchées des caractères qui peuvent varier en fonction des objectifs de domestication, et (iii) de parvenir à un consensus entre des résultats parfois discordants obtenus pour différentes fonctions. Pour favoriser une aquaculture plus efficace et durable. Notre projet vise à proposer une approche d’un PSA multifonction pour faciliter les futurs développements aquacoles et avoir compréhension de l’évolution de cette espèce sous différents processus de domestication.
Procédures
6336 individus seront soumis à des contrôles de croissance réguliers sous anesthésie (moins de 5 min/individu, répétés 7 fois à 20 jours d'intervalles). Parmis ces 6336 individus, 3696 seront soumis à une indentification par VIE sous sédation (introduction d'une aiguille, moins de 5 min/individu). Suite à cette identification, 2640 individus seront aléatoirement sélectionnés pour évaluer le niveau de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l'eau et seront par conséquent isolés (1h). Ils seront ensuite soumis à une évaluation des paramètres de reproduction impliquant une anesthésie et un massage des paroies abdominales pour évacuer le sperme (pour les mâles, 1 fois, moins de 2 min/individu) puis à un test d'aggressivité impliquant un isolement (18h d'acclimatation + 1h de test). Toujours parmis ces 6336 individus, suite aux contrôles de croissance, 1584 individus seront soumis à une évaluation du potentiel adaptatif (plusieurs semaines) puis à la même évaluation des paramètres de reproduction que décrits précédemment ; et 1056 individus seront soumis à un test de résistance à un choc thermique (1h). 2340 nouveaux individus seront soumis à un test de résistance virale impliquant une infection par balnéation des larves et un suivi des mortalités sur 72h.
Impact sur les animaux
La technique d’identification utilisée implique l’introduction d’une aiguille chez l’animal. Elle pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Les tests de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l’eau et comportemental implique d’isoler les individus. Or le poisson zèbre est une espèce grégaire. Ces expérimentations peuvent donc induire un stress chez les individus. Nous nous attendons à ce que les tests de résistance thermique et de résistance virale est un impact très négatif sur les individus. En effet, l’objectif de ces tests est de connaitre la résistance maximale des individus. Cela entrainera donc un stress ainsi qu’une probable souffrance pour les individus.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort soit afin de limiter la douleur (test de résistance virale, resistance thermique) soit afin d'être utilisés pour des prélèvemens de tissus biologiques.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence l’efficacité d’un programme de sélection artificielle et ses conséquences au niveau de l’organisme entier, sur plusieurs générations.
Réduction
La petite taille des Danio rerio ne nous permet pas de réaliser un nombre conséquent d’analyse sur un même individu. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum nécessaire pour évaluer chacun des paramètres utiles pour répondre à notre objectif. De plus, nous avons réduit au minimum le nombre de famille afin de nous permettre la production des 5 générations nécessaire au projet sans consanguinité. En effet, nous effectuerons des croisements interfamiliaux, en croisant des reproducteurs sélectionnés entre les familles. La méthode de croisement est basée sur la "duplication" du nombre d'ancêtres pour la progéniture à chaque génération. Ainsi, chaque poisson à la F1, aura 2 ancêtres, à la F2, 4 ancêtres, et ainsi de suite jusqu'à la F5 où chaque poisson aura 32 ancêtres. Hormis la méthode de croisement basé sur la duplication du nombre d'ancêtre, aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Les procédures d’identification, contrôle de croissance et de collection du sperme peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau et/ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (identification). De ce fait, les animaux seront préalablement sédatés ou anesthésiés avant la manipulation. De plus, lors de l’identification, un analgésique sera utilisé en complément de la sédation. Le test de résistance virale peut induire un stress et/ou des infections et conduire à la mort de l’animal. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (72h) afin de limiter le stress et la douleur. De plus, les animaux ayant subi cette procédure seront immédiatement mis à mort à la fin de la manipulation. L’isolement provoqué par les tests de cortisol et le test comportemental peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (30 minutes pour le cortisol et 19h pour le test comportemental – 18h d’acclimatation + 60 min de test filmé) afin de limiter le stress et la douleur. Le test de résistance thermique, peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. Nous utiliserons donc la perte d’équilibre comme point limite pour retirer l’animal de l’expérimentation et le mettre à mort. De plus, nos structures expérimentales d’hébergement sont équipées d’un enrichissement intégré de l’environnement. Il s’agit d’un fond imprimé de gravier qui fournit une sensation de profondeur dans le réservoir. La conception est basée sur le fait démontré que le poisson zèbre à une préférence pour le visuel gravier dans le fond du réservoir. Pour chaque procédure, les points limites portent sur la surveillance du comportement des poissons et l'apparition d'éventuelles blessures au niveau cutané. De telles observations nous amènent à retirer l'animal de l'expérimentation et à le mettre à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un poisson avec un cycle de vie court ce qui nous permettra d’obtenir rapidement plusieurs générations. De plus, c’est un poisson facile à élever et de nombreuses données sont disponible. Les animaux seront utilisés à tous les stades de développement, du stade embryon à l’âge adulte. Le projet visant à comprendre comment les animaux évoluent sous l’impact de la domestication, cela inclut d’étudier des paramètres liés à chaque stade développement. De plus, le projet visant à produire plusieurs générations, cela inclut de réaliser un cycle de vie complet de l’individu. Plus précisément, les contrôles de croissance débuteront au stade larvaire et se poursuivront jusqu'à l'âge adulte, le test de résistance virale se fera sur des larves âgées de 3 jours post-fécondation et l'ensemble des autres expérimentations se feront à l'âge adulte.
Evaluation du potentiel effet perturbateur endocrinien de substances et d’effluents sur des poissons sexuellement matures
- Protection de l’environnement
Autres poissons : 8320
11 880 poissons, poissons zèbres et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus vingt et un jours dans une eau contenant des substances chimiques ou des effluents, avec des effets que le porteur décrit comme irréversibles, changement de sexe, baisse de la fécondité et modification du comportement. Les poissons exposés sont tués à la fin de l'essai, ceux des groupes témoins pouvant être réutilisés. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'absence de test alternatif validé par l'OCDE et par la conformité réglementaire de son activité.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’impact des substances chimiques sur le système endocrinien des groupes de poisson exposés, composés de mâles et de femelles sexuellement mâtures, sur une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours).
Bénéfices attendus
Le projet visant à évaluer l’effet néfaste des substances et effluents testés sur la santé des organismes aquatiques, il participe activement à la protection et la préservation de l’environnement.
Procédures
Pas de prélèvements prévus sur animaux vigiles. L'exposition se fait via le milieu d'essai, les animaux baignants dans des concentrations en substance maintenues constantes durant 21 jours tout au long des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : - Changement de sexe des organismes exposés (par exemple : les femelles peuvent développer des caractères sexuels masculins, les mâles peuvent produire de la vitéllogénine,…) ; - Diminution du nombre d’œufs pondu par la femelle et/ou diminution de la qualité du sperme chez le mâle ; - Diminution du taux de fécondité ; - Changement du comportement pouvant impacter l’ensemble des activités métaboliques des poissons exposés (par exemple : diminution de l’appétit, aggresivité,…) ; L’ensemble de ces nuisances seraient irréverssibles, même si les poissons ne sont plus exposés.
Devenir
Les poissons issus du contrôle et du contrôle solvant pourront être réutilisés. Les poissons exposés à des substances chimiques seront mis à mort à la fin de la procédure. Lorsque des prélèvements terminaux sont réalisés sur les organismes, tous les organismes sont mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives non animales comprennent : les méthodes in sillico (références croisées, modèle mathématique prédictif tel que le modèle « Quantitative Structure-Activity Relationship ») ; les méthodes in vitro (comprenant les tests sur lignées cellulaires ou sur organoïdes) ; et les recherches bibliographiques (partage de données entre industriels, Fiches de Données de Sécurité). Malheureusement les méthodes ci-dessus ne peuvent être appliquées pour plusieurs raisons : Premièrement, l’insuffisance de données disponibles pour les molécules testées. Les méthodes in sillico ont une forte dépendance aux bases de données disponibles concernant la substance d’essai (notamment aux fiches de données de sécurité). Néanmoins dans le cadre de notre activité, ces données sont absentes ou insuffisantes pour permettre d’établir des modèles robustes. De plus certains processus, comme les effets sur le comportement ou les effets à long termes, sont difficiles à paramétrer dans ces modèles. Deuxièmement, le manque de concordance entre les lignées cellulaires seules et les organismes complets. Les méthodes in vitro ne peuvent prendre en compte l’ensemble des interactions complexes tissus-organes ce qui empêche de connaitre l’effet global d’une molécule sur un organisme. Troisièmement : les limites expérimentales. Dans le cas d’utilisation de culture cellulaire, le milieu de culture peut en lui-même constituer un biais. En effet, il peut potentiellement interagir avec les xénobiotiques et empêcher, ou aggraver, leur toxicité ce qui ne permet pas de statuer sur son danger réel en cas de rejet dans l’environnement. Dernièrement, la validité réglementaire des méthodes alternatives. La mise sur le marché européen des produits de consommations s’appuie sur des règlements adoptés au sein des pays membres de l’Union Européenne. Malheureusement à ce jour, aucun test alternatif n’a été standardisé et intégré aux normes de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique) concernant les perturbateurs endocriniens. L’activité de l’établissement s’appuyant sur les normes de l’OCDE, et les Bonnes Pratiques de Laboratoires, l’utilisation de méthodes alternatives non standardisés peut conduire à une invalidité des études auprès des instances réglementaires. Par conséquent, pour les raisons citées, il n’est pas encore possible de remplacer l’expérimentation animale au sein de notre établissement.
Réduction
Comme cité plus haut, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en garantissant la robustesse des tests statistiques. Concernant la partie statistique, celle-ci est détaillée dans deux documents : 1) la norme relatif au projet (par exemple, pour le présent projet, il s’agit de l’annexe 8 de la norme OCDE 229 montré en Figure 1), et 2) le guide « Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OCDE Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54 ». De plus, avant de démarrer l’essai préliminaire, une veille bibliographique est réalisée. Si cette veille permet de déterminer la Concentration Maximale Tolérée, et donc la gamme de concentration de l’essai définitif, alors l’essai préliminaire n’est pas réalisé. Dans le cas contraire, les organismes témoins de l’essai préliminaire peuvent être réutilisés dans l’essai définitif.
Raffinement
Les mesures visant à réduire les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure sont les suivantes : 1) Les organismes sont acclimatés pendant deux semaines avant le début de la procédure afin de réduire le stress lié au changement de conditions de maintien (passage des conditions d’élevage aux conditions expérimentales) ; 2) Les conditions environnementales (température, luminosité, paramètres physico-chimiques de l’eau) sont réglées de manière optimales. Elles sont strictement maintenues et sont contrôlées régulièrement afin d’éviter toutes variations environnementales pouvant impacter le bien-être des organismes ; 3) Une ronde quotidienne est mise en place et permet d’observer quotidiennement les organismes afin d’évaluer leur état de santé ; 4) Une feuille de points limites a été établie afin de détecter le plus précocement possible d’éventuels signes de souffrance. Si l’organisme dépasse un certain seuil, ce dernier est retiré du test et mis à mort .
Choix des espèces
Danio rerio, Oryzias latipes et Pimephales promelas sont des espèces recommandées par l’OCDE. En effet, elles sont reconnues comme étant des espèces modèles en biologie, c’est-à-dire qu’elles possèdent des qualités importantes pour la recherche dont : 1) une biologie bien connue (dimorphisme sexuel bien documenté, génétique maîtrisée) ; 2) elles sont faciles à maintenir en élevage et à faire se reproduire (descendance nombreuse, développement rapide) ; 3) elles sont économiquement accessibles et faciles à manipuler en expérimentation (petite taille) ; 4) elles sont robustes (résistance à la consanguinité, aux maladies et aux stress environmentaux) ; et 5) les résultats expérimentaux obtenus avec ces espèces sont transposables à d’autres poissons d’eau douce. L’ensemble de ces critères montre que ces espèces sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisant compte tenu de l’activité de l’établissement utilisateur. Des poissons adultes, sexuellement mâtures et identifiables doivent être utilisés pour la procédure. En effet la procédure vise a étudier la reproduction et le développement de caractères sexuels secondaires.
Elaboration d’un protocole pilote pour alimenter et mesurer le stress de l’exposition nocturne à la lumière artificielle chez le mulet-porc
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
100 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Capturés en milieu naturel, ils sont exposés sur trois nuits à une lumière artificielle nocturne, puis tués par surdose d'anesthésique pour prélèvement de sang, de muscle et de foie, afin de calibrer un protocole de mesure du stress lié à la pollution lumineuse. Le porteur décrit un stress à la capture et au transport et une perte de poids légère pendant l'acclimatation, sans autre manipulation directe. Il présente l'étude comme pilote, préalable à un dispositif de plus longue durée qui fera l'objet de futures demandes d'autorisation.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote destinée à concevoir un protocole d’alimentation et de mesure indirecte du stress chez le mulet-porc, dans le cadre du développement d’un projet expérimental sur un plus long terme. Celui-ci visera à analyser l'effet sur la biodiversité aquatique, d'une forme de stress spécifique aux milieux urbains, à savoir la pollution lumineuse nocturne. Nous avons choisi de réaliser cette étude sur des mulets-porcs juvéniles car il s’agit d’une espèce commune, largement répandue dans les milieux aquatiques urbanisés européens et connue pour se nourrir exclusivement de biofilms (couches de micro-organismes qui se forment sur des surfaces en contact avec l'eau) lorsqu’ils sont juvéniles. Ce comportement alimentaire est recherché car le projet global cherchera à analyser les effets du stress lumineux sur une fonction essentielle au fonctionnement des écosystèmes aquatiques : l’interaction alimentaire plante-poissons. Les poissons seront capturés en milieu naturel par nos soins grâce à des filets spécifiques à la pêche aux civelles donc sans risque de blessure des animaux et transportés dans nos installations. Nous mettrons ensuite à leur disposition des biofilms produits naturellement sur place, et ferons évoluer la lumière de telle façon à simuler les modes d'éclairage urbain les plus répandus. Nous verrons ainsi les effets de cette pollution lumineuse à la fois sur l’alimentation des poissons (quantités ingérées, fréquences des repas) et sur leur niveau de stress. Pour la quantification de celui-ci, de l'eau des aquariums sera régulièrement prélevée et analysée, avant qu'une fois les poissons euthanasiés, on réalise des mesures sur leur sang, muscles et foie. C'est ensuite la recherche de la présence de cortisol dans l'eau et/ou dans le sang qui nous permettra d'évaluer le niveau de stress des poissons exposés aux effets de la lumière. Des prélèvements d’organes et tissus renseigneront en parallèle sur l’évolution de la composition en lipides en fonction du mode d’alimentation, et ce afin d’évaluer l’effet sur l’interaction alimentaire biofilm-poisson.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude pilote à court terme sont de tester la faisabilité et les paramètres d’un protocole de mesure indirecte du stress du poisson en réponse à un stress lumineux. A moyen terme, l’étude pilote permettra de concevoir un dispositif expérimental réaliste pour étudier les réponses comportementales (en particulier alimentaires) et le stress induit par la pollution lumineuse nocturne chez le mulet-porc. Cette espèce de poisson a été choisie puisqu’elle représente un maillon essentiel au bon fonctionnement des écosystèmes aquatiques soumis à pression urbaine. A long terme, la démarche expérimentale permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique fondamentale robustes sur la réponse de la biodiversité aquatique, et plus généralement du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, à divers facteurs de stress urbain. Ils alimenteront des recommandations de gestion des espaces publics urbains, notamment pour ce qui concerne la réduction, la mitigation ou la gestion des effets des éclairages publics sur l'environnement.
Procédures
Les poissons seront capturés en milieu naturel avec des techniques de pêche au filet. Toutes les précautions seront prises pour éviter des blessures aux animaux au cours de cette étape. Ils seront ensuite transportés pendant deux heures dans des sacs de transport adaptés. Les poissons, d’une espèce capable de vivre aussi bien dans l’eau douce que dans l’eau salée, seront ensuite acclimatés à l’eau de l’aquarium, d’une salinité plus basse que celle des milieux de capture, par le respect de seuils d’acclimatation progressifs accompagnés d’observations comportementales continues. Ils resteront ensuite en quarantaine sanitaire pendant 21 jours. Puis, ils seront alimentés avec un aliment naturel, le biofilm (la couche de micro-organismes qui se forme sur des surfaces en contact avec l'eau), dont l’appétence en condition de captivité sera testée. Si ce biofilm venait à être négligé, des granulés commerciaux le remplaceront. Certains poissons seront ensuite soumis à un stress lumineux nocturne d’une durée au total courte (3*12 h maximum d’exposition nocturne). L’ensemble des poissons destinés à l’expérimentation sera euthanasié à diverses étapes pour les besoins des prélèvements indispensables à l’interprétation des résultats : prises de sang pour y mesurer le cortisol qui sera comparé aux mesures réalisées dans l’eau, extraction de muscles et de foie pour analyse des profils en lipides. Ces profils illustrent pertinemment le rôle des plantes dans le fonctionnement des réseaux alimentaires de l’écosystème.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à un stress lors de leur capture et pendant leur transport, qui durera environ deux heures, ainsi que lors du transfert dans l’aquarium. Au cours de la procédure visant à habituer les poissons à se nourrir en captivité de biofilms, une perte de poids des animaux, légère mais sans conséquences sur leur bien-être, est possible. Ensuite, au cours de la procédure destinée à tester un protocole de mesure indirecte du stress, certains individus seront exposés aux effets d'une lumière nocturne, d’intensité légère, pendant 3 nuits, c'est à dire durant 36 heures non consécutives. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne, qui est recherché. Les effets attendus sont d’ordre comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire, stress modéré), et d’ordre physiologique (accumulation de cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau du milieu). En dehors de ces nuisances légères, aucune manipulation directe n’est prévue sur les animaux. Tous seront néanmoins euthanasiés (selon le mode réglementaire, c’est-à-dire qu’une fois que les poissons auront été anesthésiés par balnéation, une augmentation de la quantité du produit anesthésique dans l’eau produira leur euthanasie) en fin d’expérimentation pour les besoins de prélèvements de sang, muscle et foie nécessaires à l’interprétation des résultats.
Devenir
Les 100 poissons impliqués sont euthanasiés. 10 le sont dès le début du projet, servant ainsi de « témoins », 20 à 30 autres le sont à la fin de la période d’alimentation par le biofilm ou les granulés, ceci pour la détermination du profil lipidique. Enfin, 60 seront euthanasiés après l’exposition à la lumière. Ces euthanasies sont justifiées par le besoins de prélèvements destinés à recueillir les paramètres indispensables aux résultats de l’étude pilote déployée dans le cadre de l‘élaboration d’un dispositif multiannuel. Celui-ci fera l’objet de futurs dépôts de demandes d’autorisation d’expérimenter au fur et à mesure de l’avancée du projet.
Remplacement
Les finalités de l’expérimentation pilote sont de juger de la faisabilité et du calibrage d'un protocole d’alimentation et de mesure du cortisol excrété par des animaux vivants dans l’eau du milieu suite à une exposition à un stress léger. L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle.
Réduction
Le nombre d’animaux intégrés à l’étude pilote est limité au strict minimum requis pour une analyse statistique fiable de l’effet de l’exposition lumineuse sur le comportement alimentaire des animaux. L’expérimentation est constituée de 3 procédures qui s’enchainent sur tout ou partie des mêmes animaux afin d’optimiser leur usage. Ce nombre de 100 inclut un total de 10 surnuméraires capturés pour pallier une mortalité potentielle pendant la capture, le transport et l’acclimatation aux conditions d’hébergement (soit une mortalité estimée à environ 10%).
Raffinement
En dehors des étapes de capture, transport et transfert, les poissons ne seront jamais manipulés. Une fois pêchés, les poissons seront placés dans des viviers de dimensions adaptées à leur nombre et à leur taille, puis placés délicatement dans des sacs de transport gonflés aux 2/3 à l'oxygène pur et hermétiquement fermés. Ces sacs seront déposés dans un contenant assurant leur stabilité pendant le transport jusqu'au site expérimental. Une fois les poissons sur place, des seuils progressifs d'acclimatation leur permettront de s'habituer à l'eau de leur aquarium. Par ailleurs, le seul transfert qui sera réalisé ensuite sera celui du lot de 60 poissons destinés à l’exposition lumineuse ; il sera effectué à l'aide d'épuisettes à mailles fines, entre le bac de quarantaine où auront été accueillis les poissons dès leur arrivée sur site, vers les aquariums où se dérouleront les expositions lumineuses. Les poissons seront nourris pendant l'expérimentation. La qualité, la quantité et la fréquence de l’alimentation seront ajustées en fonction des observations réalisées in situ. Au moins une fois par jour, des animaliers formés de longue date viendront contrôler visuellement l’état des poissons. Des mesures continues des différents paramètres de l’eau (température, pH, …) ainsi que des mesures ponctuelles des produits azotés, garantes de la qualité de l'eau, permettront de maintenir des conditions environnementales optimales tout au long de l’expérimentation. Les bassins seront dimensionnés pour offrir un espace de mobilité confortable aux animaux (bassins de 30 L pour des individus de 8±2 cm de longueur totale). Les poissons ne seront jamais isolés mais placés en groupes de minimum 5 à maximum 100 individus selon les étapes. Toutes les étapes expérimentales auront lieu dans une même salle dédiée afin que les poissons s’habituent à un environnement visuel et sonore unique et constant. Enfin, les aquariums seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires qu'il mène sur le fond. La présence d’une cache pourrait par ailleurs nuire à l’interprétation des résultats. Cependant, une des parois de chaque aquarium sera munie d’un décor mimant un décor de rivière afin potentiellement d’améliorer le confort des animaux.
Choix des espèces
Le mulet-porc est une des rares espèces de poissons connues pour se nourrir de biofilms au stade juvénile, ce comportement alimentaire spécifique étant essentiel pour atteindre les objectifs de long terme envisagés dans le projet global supportant l’étude pilote. Ces objectifs viseront au développement d’une démarche expérimentale multiannuelle intégrant différents représentants de la biodiversité aquatique (poissons et plantes d’espèces diverses). De plus, la capture de mulets-porcs en milieu saumâtre puis leur placement en milieu dulcicole pour l’expérimentation sont possibles puisqu’il s’agit d’une espèce dont le cycle de vie se déroule à la fois en eau salée et en eau douce. Le mulet-porc est par ailleurs largement répandu dans les milieux aquatiques urbanisés mondiaux dont l’étude est ciblée par le projet global, ce qui permettra d’optimiser la portée des résultats dans un contexte international. C’est aussi l’espèce la plus abondante dans les zones où les captures sont envisagées : ainsi, l’impact de celles-ci sur les ressources naturelles sera minimisé. Les poissons impliqués seront des juvéniles de 8±2 cm de longueur totale. Cette taille est en effet celle à laquelle les mulets-porcs sont décrits comme consommateurs exclusifs de biofilms en milieu naturel. Le fait de choisir des juvéniles limitera aussi les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Enfin, des poissons de petite taille sont recherchés afin d’optimiser le compromis entre confort des animaux et conditions optimales pour la fiabilité des mesures du cortisol dans l'eau.