Poissons

720 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées pour des prélèvements et 600 remises dans un circuit d'élevage. Après douze semaines de nutrition, ces alevins subissent un stress de confinement de dix minutes destiné à mesurer leur réponse physiologique, pour définir le ratio d'acides gras essentiels de leur aliment. Le porteur indique que le confinement fait monter le cortisol et la consommation d'oxygène, et affirme que le retour à de bonnes conditions limite les nuisances. Il conclut que l'étude porte sur le métabolisme et la résistance au stress et ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation, l'objectif affiché étant de remplacer la farine et l'huile de poisson dans les aliments d'aquaculture.

Objectifs

La composition optimale des acides gras alimentaires est une condition préalable à la réussite de l'élevage des alevins de poissons. Un apport adéquat d'acides gras essentiels au cours des premiers stades de développement des alevins de poisson est essentiel pour la progression normale de la neurogenèse (formation de neurones fonctionnels) et ainsi le développement du cerveau. Pour les alevins de poisson, la substitution de l'huile de poisson par des huiles végétales peut potentiellement entraîner des déficiences ou des déséquilibres en acides gras essentiels chez les alevins de poissons, qui ont été impliquées dans une variété de troubles, telles qu'une réponse retardée et accrue au stress, une réduction de l'activité phagocytaire contre les pathogènes, la réduction de la réactivité aux stimuli auditifs et de l'acuité visuelle, une altération du développement cérébral. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les besoins en acides gras essentiels des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour pouvoir établir les effets sur la physiologie métabolique du poisson ainsi que sur leur capacité de tolérance au stress pour à terme pouvoir remplacer, de la manière la plus adaptée aux besoins du poisson, la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles. Pour répondre à cela, un essai d’alimentation de 12 semaines comprenant 8 traitements sera conduit en triplicat sur des truites arc-en-ciel dès leur premier repas élevées dans des conditions optimales. Au total, 7200 poissons seront utilisés pour cet essai d'alimentation soit 900 poissons par traitement. Les 8 traitements correspondront à 8 aliments présentant des profils en acides gras différents. Les aliments sont formulés sur la base de la composition des aliments actuellement commercialisés chez la truite, de façon à couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels de l’animal. Après 12 semaines de nutrition, afin d’évaluer la capacité des alevins à tolérer un stress, en d'autres termes la robustesse des alevins, en fonction de l’aliment reçu, un sous-groupe de 720 poissons (n=90 par traitement) sera soumis à un stress de confinement pendant 10min puis remis dans de bonnes conditions. Le reste des poissons mis en élevage ne sera pas stressé.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acides gras essentiels dans l’aliment à destination des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour déterminer l’influence de différents apports en acides gras essentiels par la nutrition sur la sensibilité et la résilience à un stress chez la truite arc-en-ciel et donc des indications sur sa robustesse. Malgré le contrôle des conditions d’élevage, les poissons sont soumis à de multiples perturbations liées aux systèmes de production ou aux variations de leur milieu. Ces perturbations peuvent être à l’origine d’une augmentation de la fragilité des animaux et d’une dégradation de leur bien-être et de leur état de santé. Favoriser la robustesse des poissons est donc une solution pour lutter contre ces perturbations. L'expérimentation permettra d’établir chez la truite arc-en-ciel le lien entre la nutrition en acides gras (stockage, mobilisation et transfert des acides gras), et la réponse physiologique face à un stress (paramètres liés au bien-être, aux systèmes immunitaire et inflammatoire). Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possible aux besoins nutritionnels des alevins de truite dès leur premier repas afin de favoriser la robustesse du poisson.

Procédures

Un sous-groupe de poissons (720) sera soumis après 12 semaines d'élevage à un stress de confinement de 10 min suivi par un retour dans de bonnes conditions d'élevage.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Le stress de confinement (procédure expérimentale réalisée sur 720 poissons) a été réduit au temps minimal permettant de voir une réponse physiologique au stress. Il entrainera une hausse de l'hormone de stress (cortisol) qui entrainera une hausse de la consommation en oxygène. Le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress entrainera dans un premier temps une augmentation de l'activité de nage du poisson puis ensuite le poisson reviendra progressivement à son état physiologique avant stress (dans les 2h suivant le stress), cela permettra donc de limiter au maximum les nuisances chez le poissons.

Devenir

120 poissons stressés seront euthanasiés 40 minutes après le stress de confinement pour des prélèvements biologiques en vue d'analyses biologiques. Le confinement est généralement considéré comme un défi stressant pour les poissons, mais, contrairement aux facteurs de stress tels que les changements de température, la disponibilité de l'oxygène ou les infections parasitaires, le confinement ne remet pas directement en cause l'état de santé du poisson donc n'impactera la future vie du poisson. Ainsi, les 600 poissons restants stressés par confinement non utilisés pour les prélèvements biologiques seront remis dans un circuit classique d'élevage mais ne serviront plus à des expérimentations animales.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'un régime alimentaire sur le métabolisme et la résistance au stress des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une biomasse d’élevage minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). Une faible densité d’élevage altère la survie, la croissance et l'efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel avec une altération de ses réponses physiologiques. Afin de réduire au maximum le nombre de poisson mis en élevage tout en maintenant une densité d’élevage optimale, les poissons seront élevés lors des premiers jours dans des petits paniers (20x20cm) placés dans des bassins avec un renouvellement d’eau important. Ensuite, les poissons, lorsqu’ils auront atteint la taille de 0.5 gramme, seront transférés dans des cages plus grandes (60 x 60 cm) toujours dans une optique de préserver une biomasse d’élevage optimale. Les effectifs ont donc été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour maintenir des densités d’élevage optimales qui ne modifient pas le comportement des poissons ainsi que ses réponses physiologiques. Le nombre d’individus à utiliser a ainsi été réduit le plus possible (en adaptant la taille des paniers à celle des poissons) mais calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, des études antérieures sur la nutrition des alevins de la truite arc-en-ciel nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La croissance, ainsi que le métabolisme des alevins de truite arc-en-ciel, est sujette à une très forte variabilité. Ainsi, le nombre d'animaux utilisés a été calculé au plus juste pour permettre de détecter des différences pour les paramètres physiologiques, biochimiques et moléculaire étudiés. Pour la mise en place du stress par confinement, nous avons prévu un nombre d'animaux minimal en réalisant le stress dans une petite épuisette permettant de réaliser le stress de confinement dans les meilleures conditions possibles

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux : volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, rythme jour/nuit naturel, et de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche. Au début de l'élevage, les jeunes alevins seront élevés dans des paniers pour pouvoir obtenir une densité d'élevage suffisante au démarrage au vu de la petite taille des animaux. Le panier sera directement plongé dans le courant d’eau. La cuve sera nettoyée tous les jours avec un tuyau siphonnant. Dès que les poissons auront atteint une densité correcte, ils seront relâchés dans un bac d’élevage plus grand. Le stress de confinement a été réduit au temps minimal (10min) permettant de voir une réponse physiologique au stress, le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress permettra de limiter au maximum les nuisances chez le poissons. Les animaliers en charge des élevages contrôleront le comportement et les mortalités des animaux au cours du stress mais aussi de l'élevage. En cas de dépassement des points limites, les animaux concernés seront anesthésiés puis euthanasiés par surdose d'anesthésiant.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). L'essai démarrera avec des alevins de truite dès le 1er repas.

240 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées en fin d'étude et les autres réutilisées, dont 80 gardées un mois avant d'être tuées pour des travaux pratiques de dissection. Chaque poisson reçoit l'antibiotique par voie intraveineuse, orale et par gavage sous sédation, puis subit trois séries de prélèvements sanguins. L'étude vise à réévaluer le dosage de l'oxytétracycline en pisciculture pour lutter contre la furonculose. Le porteur affirme que la pharmacocinétique ne peut s'étudier que sur animal vivant, tout en indiquant qu'un modèle in silico permettra ensuite de s'en affranchir.

Objectifs

Le projet FEAMP Medic’EAU vise à évaluer et optimiser les pratiques vaccinales et thérapeutiques appliquées par les pisciculteurs afin de contrôler la furonculose, une maladie causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp Salmonicida (ASS). Pour la partie thérapeutique qui fait l’objet de la présente demande, l’objectif est de proposer une méthodologie qui permette de réévaluer le schéma posologique des antibiotiques, afin d’améliorer leur efficacité thérapeutique, de réduire la mortalité associée à la furonculose, mais également de limiter l’impact de l’antibiothérapie sur la sélection et dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques. Une compréhension fine de la pharmacocinétique (= interaction entre l’antibiotique et l’organisme de l’animal) de l’antibiotique (oxytetracycline) chez la truite Arc-en-ciel est indispensable pour s’assurer d’une exposition suffisante d’Aeromonas chez l’animal infecté, et optimiser ainsi le schéma posologique. Une méta-analyse des données pharmacocinétiques déjà existantes dans la littérature nous a permis d’évaluer les lacunes et d’identifier les covariables d’intérêt (c’est-à-dire les éléments qui peuvent modifier de manière importante le comportement de l’antibiotique chez la truite Arc-en-ciel : poids, température de l’eau, voie d’administration, forme galénique, ploidie. Ce projet va donc nous permettre de réaliser une étude pharmacocinétique de l’oxytétracycline chez la truite Arc-en-ciel, en station expérimentale, par une approche en cross-over. Cette approche classique chez les mammifères est rarement conduite chez le poisson, car elle nécessite plusieurs prélèvements, et donc des poissons d’une taille suffisante. Ainsi, chaque poisson recevra le médicament par voie intraveineuse et par voie orale, ce qui permettra de mieux caractériser la variabilité de la pharmacocinétique dans cette espèce, notamment la variabilité interindividuelle, et de quantifier plus finement l’influence des différentes covariables d’intérêt. Ces données seront intégrées dans un modèle pharmacocinétique dit « de population » qui permettra par la suite de prédire le comportement de l’oxytétracycline chez la truite. Une optimisation du schéma posologique pourra alors être proposée, pour un usage plus vertueux des antibiotiques, garantissant une efficacité optimale tout en limitant le risque de sélection de dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

A très court terme, à l’issu de ce projet, nous disposerons d’une modélisation décrivant le comportement de l’oxytétracycline chez la truite Arc-en-ciel. Ce modèle nous permettra également de prédire la pharmacocinétique de cet antibiotique dans différentes situations sans devoir recourir à de nouvelles expérimentations animales. A court terme (d’ici 1 an), dans le cadre du projet MEDIC’EAU, nous réévaluerons le schéma posologique de l’oxytétracycline pour le traitement de la furonculose chez la truite Arc-en-ciel, afin de s’assurer d’une meilleure efficacité dans la lutte contre la furonculose tout en limitant le risque de sélection de gènes de résistance aux antibiotiques. A moyen/long terme, l’ambition est que cette méthodologie soit aisément duplicable pour réévaluer par la suite d’autres antibiotiques couramment utilisés en fermes piscicoles, et dont les schémas posologiques posent question

Procédures

L’oxytétracycline sera administrée aux 240 truites avant chaque séquence de prélèvement : - Par voie IV, par injection dans le sinus veineux caudal, sous anesthésie générale - Par prise spontanée par voie orale : un aliment médicamenteux sera distribué aux animaux, sans manipulation particulière, après 24h de mise à jeûn - Par gavage oral : l’aliment médicamenteux sera administré aux animaux sous sédation, après 24h de mise à jeûn. Après le gavage, le poisson sera transféré dans un réservoir individuel pendant quelques minutes pour surveiller le réveil et la régurgitation. Trois séquences de prélèvement sanguin sont prévues, espacées d’au moins 4 semaines de washout, principalement pour s’assurer d’une récupération complète de l’hématocrite des animaux. Durant chaque séquence, 3 prélèvements de sang seront réalisés sur chaque truite. Chaque prélèvement représente un volume sanguin de 0,4 mL (seringue à insuline), soit un prélèvement total de 1,2 mL de sang maximum par poisson par séquence, ce qui représente moins de 15% du volume sanguin circulant de la truite Arc-en-ciel. Les prélèvements seront répartis sur 15 jours pour une même séquence.

Impact sur les animaux

La réalisation de pharmacocinétiques longitudinales permet à la fois de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, d’évaluer la variabilité inter-individuelle ainsi que de mieux caractériser l’influence des différents cofacteurs. Cette approche est permise par le choix de travailler avec des animaux plus gros, qui tolèrent plusieurs prises de sang, et sont plus représentatifs de la population de truite cible (la furonculose en élevage touche des animaux plus âgés que les classes d’âge habituellement choisies en expérimentation animale). Le protocole expérimental peut entraîner de la nuissance chez les poissons, liée à la ponction de sang dans le sinus veineux et au gavage. Une anesthésie est donc systématiquement mise en œuvre pour chaque manipulation, l’anesthésie se fait par balnéation à l’aide de tricaïne (80 mg/L).

Devenir

120 poissons seront euthansiés à la fin de la procédure. 80 animaux seront gardés en vie 1 mois pour ensuite être euthanasiés dans le but d'être utilisés pour les TPs dissection/démarche nécropsique réalisés sur poissons fraichement tués à l'école vétérinaire de Maisons Alfort. 40 animaux pourront être gardé en vie pour permettre la mise en place d'essai pour un projet sur le bien-être animal, DAP sera déposée fin d'année 2022.

Remplacement

L’objectif étant d’évaluer la pharmacocinétique de l’oxytétracycline chez la Truite Arc-en-ciel, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. Toutefois, l’utilisation d’outils de modélisation moderne permet de mieux valoriser les données récoltées, en quantifiant la variabilité de chaque covariable d’intérêt plutôt que de travailler en valeurs moyennes comme historiquement. De plus, dans un second temps, le modèle créé in silico permettra de s’affranchir de l’expérimentation animal pour définir le schéma posologique optimum, sans devoir réaliser des essais de dose/titration nécessitant un grand nombre d’animaux de laboratoire.

Réduction

Réaliser une étude pharmacocinétique en cross over, avec plusieurs prélèvements par poisson, permet de réduire significativement le nombre de poissons, chaque poisson étant son propre témoin. Le nombre de poissons nécessaire à cette expérimentation a été déterminée en considérant les objectifs scientifiques mais également en posant plusieurs postulats qui ont permis de réduire le nombre de modalités à tester, et donc d’animaux nécessaires. Ainsi, toutes les modalités d’intérêt identifiées seront testées sur les truites triploïdes (ce qui nécessite le recours à 180 poissons), alors que ces modalités seront réduites sur les diploïdes (soit 60 poissons uniquement).

Raffinement

Les animaux sont observés deux fois par jour durant toute la durée du protocole (4 mois + temps d’acclimatation) Les points limites sont : (1) d’une part les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. Si les point critiques sont atteints (oxygène 20°C) et ne peuvent être rectifiés, l’expérimentation sera arrêtée. La qualité de l’eau (pH, teneurs en nitrites et en nitrates) est vérifiée chaque semaine. (2) d’autre part la santé des poissons. Les poissons moribonds (nage erratique sur le dos, apathie, anorexie) seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique. La densité sera de 15 kg/m3 (en début d’expérimentation) à maximum 30 kg/m3 (en fin d’expérimentation, en raison de la croissance des animaux), ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3). Les bacs sont de plus enrichis de tubes permanents permettant aux poissons de se cacher. Pour nous assurer d’un minimum incompressible de 3 prises de sang par poisson par séquence de prélèvement, nous avons choisi de travailler avec des poissons de grande taille, de minimum 300g, ce qui reflètera également plus fidèlement la biologie des animaux qui seront traités en élevage. Nous pourrons ainsi prélever 1,2 mL de sang par séquence de prélèvement, à raison de 0,4 mL par prise de sang sur une période d’environ 15 jours (soit 0,4% du poids vif total). L’approche populationnelle retenue permet également d’espacer les prélèvements sur chaque poisson. Enfin, une période de wash out d’au moins 4 semaines sera appliquée entre chaque séquence de prélèvement, pour s’assurer que les poissons ont retrouvé un hématocrite normal.

Choix des espèces

La truite Arc-en-ciel est un hôte naturel d’Aeromonas salmonicida subsp salmonicida. C’est de plus l’espèce de poisson la plus élevée en France. C’est enfin l’espèce sur laquelle nous voulons optimiser l’utilisation de l’oxytétracycline dans un contexte « one health ». Les truites utilisées pèseront minimum 300g. La furonculose est une maladie que l’on observe à différents stades d’élevage (alevins, truites portions = 200/250 g, grosse truite = >1 kg). Du fait des contraintes de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible de loger des truites Arc-en-ciel de poids trop important en nombre suffisant pour permettre l’acquisition de résultats interprétables. L’étude sur des poissons de 300g est un compromis entre le poids total des poissons pouvant entrer dans la station, une taille suffisante pour permettre des prélèvements de sang répétés, et la volonté d’un modèle qui soit le plus proche possible de la population de truite à évaluer. A ce poids (300g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proches des animaux d’un poids plus élevé (hors période de gamétogenèse).

Capturés dans un cours d'eau salmonicole, 800 truites communes et 400 chabots, soit 1 200 poissons sauvages, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque poisson est mesuré, pesé, puis incisé sur le ventre pour l'implantation d'un transpondeur, et reste entre 30 secondes et une minute hors de l'eau. Tous sont remis à l'eau vivants, pour vérifier si les ouvrages aménagés sur la rivière, dont une passe à poissons, leur permettent de circuler. Le porteur compte jusqu'à 5 à 10 % de truites qui perdent leur transpondeur dans les semaines suivantes et jusqu'à 20 % de femelles qui l'expulsent lors de la fraie, et affirme que "Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale".

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

300 truites sauvages vont être capturées et relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, chaque poisson reçoit un transpondeur implanté par incision ventrale, avec un maintien hors de l'eau de trente secondes à une minute, pour évaluer le franchissement d'une passe à poissons récemment aménagée. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et décrit une cicatrisation qu'il juge généralement bonne. Il affirme que cette étude comportementale ne peut se faire que sur des individus vivants relâchés dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité par les poissons d’un ouvrage de franchissement (passe à poissons) récemment réalisé pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau jurassien. Un seuil constituait un obstacle à la montaison des truites au niveau de la tête du bassin versant, connu pour proposer historiquement des habitats piscicoles de qualité. Le gestionnaire local a décidé d’équiper ce seuil d’une passe à ralentisseurs plans afin de rétablir la montaison des truites et autres espèces accompagnatrices. En 2022, cette passe a été réalisée et doit maintenant faire l’objet d’une étude de franchissabilité piscicole par RFID.

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

2 000 poissons sauvages, truites, chabots et blageons, vont être capturés et relâchés après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après anesthésie, 1 950 individus reçoivent un transpondeur implanté par incision ventrale et 50 truites une seconde incision de deux centimètres pour un émetteur radio suturé, afin d'évaluer le franchissement de deux passes à poissons. Le porteur indique que la capture et le marquage induisent un stress et évoque une mortalité post-opératoire qu'il estime très faible. Il affirme que l'étude comportementale in situ ne peut se faire que sur des individus vivants dans leur milieu naturel.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce aux technologies RFID (Radio Frequency IDentification) et radiotélémétrie, la franchissabilité de 2 aménagements réalisés au niveau de 2 seuils infranchissables (ponts routiers) pour rétablir la continuité écologique un grand cours d'eau alpin. Sur ce cours d'eau, de nombreuses améliorations ont été réalisées ces dernières années, notamment sur la continuité écologique : les deux seuils visés ont été aménagés pour le franchissement piscicole il y a 9 ans. Ces aménagements permettent une circulation (montaison et dévalaison) a priori facilitée qu’il convient de vérifier en combinant deux technologies au regard du gabarit du cours d’eau : la RFID et la radiotélémétrie. La radiotélémétrie est utilisée en complément de la RFID car cette technologie permet d'envoyer un signal à longue portée (100-200m), permettant de travailler dans des grands milieux et de caractériser des comportements / franchissements au niveau de voies de passages qu'on ne peut pas équiper par RFID.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » des deux seuils éuipés de passes à poissons à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'950 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. Pour 50 individus, un double-marquage sera réalisé et un émetteur radio sera implanté manuellement en plus du PIT tag, impliquant une incision ventrale de 2 cm, qui sera suturée. La procédure durera au total 2 à 3 minutes, pendant lesquelles les individus seront maintenus sous sédation dans un bain d’anesthésiant

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux.

Devenir

Remise à l'eau après marquage

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le chabot et le blageon. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité des ouvrages. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Pour la RFID : Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Pour la radiotélémétrie : après anesthésie, les poissons seront placés dans un bac rectangulaire de 10L contenant une concentration plus légère de benzocaïne (30 mg/L) pour maintenir les conditions d’anesthésie sur toute la durée de l’opération. Seule la tête sera maintenue dans l’eau et une canule introduite dans la bouche et reliée à une pompe d’aquarium pour assurer une irrigation permanente des branchies. Un champ stérile sera placé sur l’animal, la zone d’incision sera nettoyée à la vétidine, et un scalpel stérile sera utilisé. L’opérateur portera des gants stériles. Tout le matériel chirurgical sera désinfecté au steranios, ainsi que l’émetteur, puis rincés à l’eau purifiée. La taille de l’émetteur F1170 sera adapté et toujours < 2% du poids de l’animal (Annexe 1). Pour la suture, une aiguille pointe ronde diamant, 3/8 cercle 26mm, sera utilisée avec un fil monofilament résorbable Monosyn en glyconate. La pommade iodée sera ensuite appliquée. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, le blageon (Telestes souffia), petit cyprinidé rhéophile, sera étudié car jugé caractéristiques du secteur d’étude. Enfin, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage et de migration. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. 50 truites adultes de plus de 200g, soit environ 25 cm, seront également marquées à l’aide d’un émetteur radio (double marquage). Pour les blageons et chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

150 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 femelles tuées pour prélever leurs gonades, les autres gardées vivantes après cannulation ou stimulation manuelle de la ponte. Sur dix mois, elles sont anesthésiées pour un sexage par échographie, une puce leur est injectée, et huit prélèvements sont réalisés. Le projet cherche à savoir si la méthylation de l'ADN existe pendant l'ovogenèse de cette espèce, préalable annoncé à de futures études. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation par des cellules en culture.

Objectifs

La reprogrammation de la méthylation de l’ADN pendant l’ovogenèse permet des réorganisations chromosomiques qui peuvent influencer l’expression des gènes dans la génération suivante. Ces modifications, souvent irréversibles, peuvent induire des modifications physiologiques, morphologiques ou biologiques et potentiellement conférer des avantages aux descendants qui deviennent alors des caractères héréditaires. Il est donc admis que ce mécanisme est un moteur de l’évolution. Chez les poissons, certaines espèces déclenchent cette reprogrammation et d’autres non. Dans ce dernier cas, les mécanismes adaptatifs ne sont pas encore compris mais semblent impliquer d’autres voies qui intégreraient à chaque génération les modifications épigénétiques et leurs conséquences sur l’expression génique. La compréhension des liens entre des modifications environnementales et les mécanismes évolutifs des espèces représente un enjeu important de nos connaissances, particulièrement pour des espèces très sensibles aux variations de leur environnement tels que les poissons. Les résultats obtenus à l’aide de diverses méthodes de biologie moléculaire nous permettront de mieux comprendre les mécanismes qui sont déclenchés dans des ovocytes à chaque étape de l’ovogenèse. Ainsi il nous sera possible de répondre à l’objectif principal de ce projet qui est de déterminer si la reprogrammation de la méthylation de l’ADN existe chez la perche commune et s’il existe un lien avec la dynamique d’expression des gènes pendant l’ovogenèse. Ce travail représente un préalable nécessaire à des études plus précises sur l’effet de variations de certains paramètres environnementaux sur le succès de reproduction chez la perche commune.

Bénéfices attendus

Les poissons sont très sensibles aux variations de leur environnement et ces dernières contrôlent plusieurs fonctions biologiques parmi lesquelles la reproduction. Ainsi, l’ovogenèse de la perche est contrôlée par des variations saisonnières de température et photopériode. D’autres paramètres environnementaux peuvent moduler la progression de ce processus. Par conséquent, il existe un lien avéré entre l’environnement et la reproduction ce qui pourrait, théoriquement, modifier les processus moléculaires impliqués dans l’adaptation des espèces aux variations de leur milieu de vie. Parmi ces processus, la méthylation de l’ADN est connue chez les mammifères mais ne semble pas exister chez toutes les espèces de poisson. Il s’agit ici de déterminer si ce processus existe pendant l’ovogenèse de la perche. Cela nous permettra, à l’avenir, d’étudier comment certains paramètres environnementaux ciblés influencent ces processus évolutifs. Cette étude constitue donc un préalable scientifique indispensable pour ouvrir ce nouveau champ d’investigation.

Procédures

Il y aura 5 expérimentations effectuées or de l’eau mises en place dans ce travail. Au début du cycle de reproduction, l’ensemble des 150 animaux seront anesthésiés avant d’être sexés par échographie (procédure 1, 2 et 3) car il n’y a pas de signe distinctif extérieur chez cette espèce (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Puis une puce électronique leur sera injectée pour nous permettre d’avoir un suivi personnalisé (procédures 1, 2 et 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Ils seront alors répartis de manière homogène dans 2 bassins. L’ovogenèse sera induite en contrôlant les variations de température et de photopériode dans chaque bassin. Huit prélèvements réguliers seront effectués pendant les 10 mois d’ovogenèse. Au cours de chaque prélèvements 6 femelles (48 femelles en tout) seront anesthésiées pour effectuer une prise de sang (procédure 1) pour analyser des taux hormonaux (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson). Elles seront mises à mort pour effectuer une analyse approfondie des gonades par échographie et des prélèvements de gonades pour un suivi histologique classique. Un mois avant le début de la saison de ponte, toutes les femelles restantes (52 femelles) seront anesthésiées avant d’introduire une canule dans l’orifice urogénital (procédure 2) (Durée la capture et le retour dans le bassin de réveil : 10 min/poisson) pour prélever quelques ovocytes. Ces derniers seront observés pour évaluer leur progression dans les phases finales de maturation. Ceci nous permettra de trier les femelles en fonction de cet avancement. Les femelles au même stade pondront en même temps, nous permettant de réduire le stress des animaux lors de la saison de ponte. Enfin, à cette dernière étape, les femelles prêtes à pondre (reconnaissable par l’observation d’une cloque sur l’orifice uro-génitale) seront stimulées manuellement pour déclencher la ponte (procédure 2) (Durée de l’intervention entre le moment de la capture et le retour dans le bassin de réveil : moins de 5 minutes par poisson). De la même manière, les mâles spermiants seront stimulés par pression abdominale pour collecter le sperme (procédure 3) (Durée entre la capture et le retour dans le bassin de réveil :

Impact sur les animaux

Trois manipulations (injection d’une puce électronique (procédure 1, 2, et 3), prise de sang (procédure 1) et cannulation (procédure 2)) impliquent l’injection d’une aiguille ou d’une canule chez l’animal. Elles pourraient induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Pour y pallier, les animaux seront systématiquement anesthésiés pour éviter la douleur. Concernant les risques d’infection, le matériel utilisé est stérile ou désinfecté et une observation renforcée des animaux sera effectuée pendant la semaine qui suit les expérimentations. Si nécessaire un protocole de traitement sera mis en place.

Devenir

Seule la procédure 1 (prise de sang) sera suivie d’une mise à mort des animaux car les gonades devront être prélevées pour effectuer des analyses moléculaires et histologiques. Concernant les 2 autres procédures, les animaux seront gardés en vie après chaque expérience pour nous permettre de continuer la progression de l’étude

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence des régulations moléculaires dans des ovocytes au cours de l’ovogenèse. Ces régulations si elles existent, dépendent certainement des variations de signaux moléculaires et/ou cellulaires (hormones, signaux nerveux etc…) jusqu’ici inconnus. Il n’est donc pas possible d’effectuer ce travail dans des cellules en culture qui ne permettraient pas de reproduire l’ensemble de ces signaux extracellulaires.

Réduction

Nous avons décidé de faire plusieurs expériences indépendantes (étude de la reprogrammation de la méthylation de l’ADN et analyse de la progression de l’ovogenèse par échographie) car ces dernières nécessitent les mêmes contrôles (histologie, taux hormonaux…) mais n’interfèrent pas en termes de prélèvement d’organes. Nous avons donc regroupé 2 expériences pour réduire le nombre d’animaux utilisé. D’autre part, la mise en point récente d’une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet maintenant de focaliser nos études avec un nombre de femelles et mâles plus adapté à nos besoins au départ. En effet, par le passé nous devions équilibrer le sexe-ratio pour nous assurer d’avoir le bon nombre de femelles pour toute l’expérience. Grâce au système d’identification par puce et au sexage préalable par échographie, nous pouvons réduire le nombre de mâles utilisés et donc réduire le nombre total d’animaux étudiés. En effet, cette opération permet de réduire le nombre de mâles utilisés de moitié par rapport à nos expérimentations précédentes.

Raffinement

Les étapes de puçage, de sexage, de cannulation ou de prise de sang peuvent engendrer soit un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (cannulation ou sexage) ou d’une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage et prise de sang). De ce fait les animaux seront préalablement anesthésiés pour éviter le stress des animaux. Les étapes de prélèvement de sperme ou de stripping (stimulation des pontes ou de la collecte du sperme) sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulés seront stimulés. Cette stimulation correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Une fois enclenchés ces processus ne nécessitent pas de pression abdominale prolongée et la récolte se fait rapidement. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale un mois avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin à quelques jours (4-5 j/par bassin) ce qui diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en nous permettant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés. Chaque mâle sera stimulé au maximum 3 jours de suite puis isolés du groupe pour récupérer et éviter le stress répété.

Choix des espèces

La perche commune est une espèce groupe synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément, il sera plus facile de déterminer si cette synchronicité existe également à l’échelle moléculaire. D’autre part, cette espèce pond ses œufs enrobés dans une gangue. Cette caractéristique présente l’avantage de nous permettre de déterminer si les éventuelles variations des régulations étudiées peuvent être en lien avec la localisation des ovocytes dans l’ovaire jusqu’à la ponte. En d’autres termes nous voulons savoir si le microenvironnement des cellules influence ces régulations dans un ovocyte donné. La ponte d’un ruban d’œufs nous permet en fin de cycle de déterminer la localisation antéro-postérieure des ovules dans la gonade et donc pouvoir suivre cette évolution tout au long du cycle de reproduction. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares. Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondus pourraient provenir de lots différents. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus épigénétique étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

135 flets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés en estuaire par pêche électrique, ils sont exposés un mois à un cocktail de pesticides par balnéation, puis tués pour prélever leur foie. Le projet vise à valider des biomarqueurs de la qualité des eaux estuariennes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des poissons vivants et qu'il n'a "pas d'autre alternative".

Objectifs

Le projet présenté vise à évaluer l’impact d’un mélange de pesticides sur le flet un poisson plat communément trouvé dans les estuaires. Le poisson sera exposé pendant un mois à des doses sublétales de pesticides reflétant les concentrations classiquement retrouvées dans un estuaire dont le bassin-versant est soumis à une forte pression agricole. La procédure expérimentale développée, incluant deux niveaux d’exposition et un groupe témoin non exposé, permettra d’isoler les effets des pesticides des différents stress naturellement subis par le poisson dans la nature. L’objectif est d’identifier les modifications métaboliques du flet en réponse à cette exposition aux pesticides. Les résultats obtenus permettront de valider des biomarqueurs dont la dérégulation, chez des poissons prélevés dans la nature, est le signe de la présence de pesticides. Ce projet permettra donc, à terme, d’améliorer les procédures d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes.

Bénéfices attendus

La procédure expérimentale proposée permettra de décrypter les mécanismes moléculaires de la réponse, et les réorientations métaboliques mises en place par les poissons face à une contamination à des pesticides, à des concentrations classiquement observées dans des estuaires présentant des bassins versants dominés par les activités agricoles. La connaissance fine de ces mécanismes permettra de mieux comprendre les impacts des pesticides sur les espèces vivant en estuaire, mais également de développer de nouveaux biomarqueurs qui, caractérisés dans des poissons prélevés in natura, permettront d'augmenter l'efficacité des procédures d’évaluation environnementales applicables à ces écosystèmes qui revêtent une importance sociétale, écologique et économique considérable.

Procédures

Les nuisances prévues au cours de cette procédure expérimentale sont : - une session de pêche électrique (narcose légère) de 2-3 heures pour capturer les poissons en milieu naturel, - le transport jusqu’au laboratoire (1h30 maximum) dans des bacs de 150L, - les biométries effectuées en début d’expérience sur les individus sédatés et anesthésiés (1h en tout), - l’exposition par balnéation d’un mois à 2 concentrations de mélange de pesticides, une faible et une forte. Les poissons seront placés dans des bacs de 20L d’eau de mer, avec un renouvèlement de l’eau et des pesticides tous les 2 jours pour la moitié du volume d’eau, soit 10L.

Impact sur les animaux

Les juvéniles de flets subiront un choc électrique afin de permettre leur capture en milieu naturel. Il s’agit d’une narcose légère, de faible intensité pendant une dizaine de seconde, qui permet d’attraper les poissons avec un haveneau sans causer de stress majeur chez les individus. De plus, les poissons subiront un léger stress lors de leur transport jusqu'au site expérimental, mais cela ne durera qu’au maximum 1h30. Enfin, les poissons seront soumis à un léger stress pendant 1 mois, dû à la contamination aux pesticides.

Devenir

A la fin de l’exposition aux pesticides, l’ensemble des poissons de la procédure (contaminés et témoins) seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires aux analyses pour mener à bien la présente étude.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’étudier les dérégulations métaboliques des poissons exposés à un mélange de pesticides qui s’approche des conditions naturelles. L’organe ciblé pour approfondir les réponses moléculaires du poisson par une approche de protéomique est le foie. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux vivants, les poissons ne pouvant être remplacés par un modèle informatique, des invertébrés ou un tissu isolé. Par ailleurs cette procédure expérimentale au laboratoire sur poissons doit nous permettre d'affiner nos interprétations sur la réponse du poisson in natura aux stress environnementaux; nous n'avons donc pas d'autre alternative.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux prévu pour ce projet, le nombre de poissons utilisés et mis à mort pour cette procédure expérimentale est de 15 poissons par bacs, pour 9 bacs de 20L, soit 135 individus. Ainsi, la densité de poissons par bassin d’élevage sera inférieure à 10kg/m3 ce qui n’est pas considéré comme une densité génératrice de stress. De plus, cela correspond au minimum nécessaire à la robustesse des tests statistiques qui seront utilisés pour comparer les différentes conditions expérimentales et pour limiter la variabilité individuelle. En outre, le prélèvement en milieu naturel de 135 poissons constitue un nombre relativement faible d’individus, ce qui n’aura aucun impact sur la démographie de la population naturelle de flets de l’estuaire où seront échantillonnés les poissons.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les flets seront maintenus une semaine dans des grands bacs de 300L pour acclimatation et traitements antibiotiques, si nécessaire. Les poissons seront ensuite placés dans les bacs expérimentaux de 20L, par lot de 15, pendant 1 semaine avant de lancer la procédure dans lesdits bacs. Ces bacs sont partiellement opaques et sont oxygénés en continu grâce à des pompes à air. Les poissons seront par la suite exposés aux pesticides par balnéation en introduisant directement les pesticides dans les bacs, à partir d’une solution mère liquide. Une surveillance quotidienne de l’état de santé sera également mise en place lors de l’expérience. Elle aura lieu le matin, lors du nourrissage des poissons, et en fin de journée. Les flets présentent des marqueurs de stress tels que le changement de couleur ou une altération du comportement pour la prise de nourriture, pouvant être utilisés comme points limites. Ainsi, si un individu présente de couleur sombre et des difficultés de nage, reste plaqué au fond du bac et ne s’alimente pas pendant 3 jours consécutifs, il sera considéré en état de souffrance, et de facto sorti du protocole expérimental et mis à mort. Cette décision sera prise en concertation avec le responsable du projet et la responsable(s) du bien-être des animaux. Une feuille de suivi des poissons sera complétée quotidiennement tout au long de la procédure. Cette fiche comportera un suivi des paramètres physico-chimiques (température, concentration en oxygène, pH, salinité) ainsi que l’état des poissons (problèmes de nage, position dans la colonne d’eau, prise alimentaire, changement de couleur, perte d’écaille, état des nageoires, lésions cutanées et parasites). Le nombre de poissons morts, moribonds, prélevés et restant dans les bacs d’exposition sera également relevé. Enfin, afin de limiter le plus possible le stress des poissons lors des manipulations, ils seront sédatés et anesthésiés un bac opaque avec couvercle prévu à cet effet et manipulés sur un linge humide pour protéger les écailles et la peau.

Choix des espèces

Le flet a été choisi pour cette procédure expérimentale car cette démarche s’intègre au sein d’un projet visant à optimiser des méthodes d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes Le flet est une espèce sentinelle de la qualité des eaux estuariennes, particulièrement étudiée à l’échelle de l’Europe ; cette espèce est présente en abondance dans les estuaires de la côte Atlantique. Le flet est considéré comme un très bon enregistreur de son environnement, en milieu naturel comme au laboratoire.