Poissons
L’IKEJIME : Etat des lieux et apports de cette méthode d’abattage pour l’acceptabilité de la mise à mort des poissons
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
60 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes mises à mort, réparties en quatre groupes de quinze selon la méthode d'abattage testée. Le projet compare l'asphyxie sur glace, la percussion crânienne, l'électronarcose et la méthode Ikejime, pour mesurer le stress et la qualité du filet. Le porteur indique que certains groupes seront tués par des méthodes qui ne respectent pas les recommandations de la directive 2010/63/UE, l'asphyxie sur glace durant plus de dix minutes avec un stress accru. L'objet déclaré porte en partie sur l'acceptabilité de la mise à mort et la qualité organoleptique de la chair.
Objectifs
L'objectif est d'évaluer le stress et la qualité du filet de poisson mis à mort par différentes méthodes chez la truite Arc en Ciel : l'asphyxie sur glace, méthode classiquement utilisée sur les bateaux de pêche, la percussion crânienne, méthode classiquement utilisée sur les parcours de pêche, l'électronarcose, méthode utilisée en élevage et la méthode Ikejime, méthode traditionnelle japonaise de plus en plus utilisée actuellement.
Bénéfices attendus
La méthode Ikejime est en développement actuellement chez certains pécheurs car elle est considérée comme préservant mieux les qualités organoleptiques du poisson car moins stressante et douloureuse au moment de l'abattage. Le projet permettra d'évaluer scientifiquement ces données et de comparer cette méthode de mise à mort aux autres méthodes beaucoup plus utilisées actuellement sur les bateaux de pêche (asphyxie sur glace et percussion de la boite cranienne) et en élevage (electronarcose).
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes méthodes d'euthanasie. Les procédures seront réalisées par des personnes expérimentées et durera de l'ordre de quelques minutes ainsi la percussion crabienne et la méthode ikejime sont d'une durée de la minute maximum, la technique electronarcose à une durée de 3 minutes. La méthode de mise a mort par asphyxie sur glace est la méthode la plus longue, 45 minutes, mais la glace ralentie la physiologie de l'animal. 15 poissons sont concernés par cette méthode.
Impact sur les animaux
Du fait des objectifs du projet, certains groupes de poissons seront mis à mort avec des méthodes qui ne respectent pas les recommandations de mise à mort (annexe IV) de la directive 2010/63/UE mais qui sont utilisés en pratique par les pécheurs. Les méthodes testées dans ce projet et non décrites dans la directice 2010/63/UE sont la mise à mort par asphyxie sur glace et la méthode Ikéjimé. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les poissons sont associés à la méthode de mise à mort par asphyxie sur glace. La durée de mise à mort sera plus longue que celle obtenue avec les autres méthodes, électronarcose de l’ordre de 3 minutes, percussion/commotion cérébrale et Ikejime de l’ordre de la minute tandis que pour l’asphyxie sur glace le temps estimé est plus de 10 minutes. Le stress induit sera plus important.
Devenir
Procédure sans réveil (mise a mort) pour tous les animaux
Remplacement
L'objectif du projet étant de comparer différentes méthodes de mises à mort chez le poisson, cela ne peut se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
En faisant l'hypothèse que la libération de cortisol est identique entre la méthode Ikejime et la percussion cranienne, et une liberation multipliée par 2 pour les méthodes asphyxie et électronarcose, le test de comparaison de 2 moyennes avec un risque alpha de 0.05 et une puissance à 0,9 ,15 poissons par lot sont nécessaires, ce qui correspond donc à 60 poissons au total (https://biostatgv.sentiweb.fr/), 15 par méthodes de mise a mort testées (asphyxie, percussion/commotion de la boîte cranienne, electronarcose et ikejime). Cette hypothèse est basée sur des premières données non publiées sur les méthodes de mise à mort de type électronarcose, commotion et surdosage d’anesthésique nous permettant d’avoir une idée des ordres des grandeur de niveau de cortisol attendu. Et surtout sur les différences de durée pour obtenir la mise à mort des animaux, très rapide et proche en durée pour la méthode percussion/commotion cérébrale et Ikejimé et plus longue pour les méthodes électronarcose et asphyxie sur glace.
Raffinement
Durant la période d'acclimation et d'élevage des animaux, les points limites sont les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 6 mg/ml) et ne peuvent pas être rectifiés, par exemple en raison d’une coupure de courant longue durée ou du défaut d’un appareil, l'expérimentation sera arrêtée. D'autre part, en cas de nage erratique, d'anorexie, les poissons seront euthanasiés. La densité sera de 16 kg/m3, ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher.
Choix des espèces
La Truite est l'espèce de poisson la plus élevée en France. Elle est de plus très utilisée dans les parcours de pêche. Ce n'est pas un modèle au niveau des poissons de pêche mais c'est également un modèle scientifique en expérimentation animale avec des publications sur le stress et la physiologie de l'espèce. La truite est donc un modèle intéressant car bien décrit scientifiquement et les résultats pourraient être comparer avec le milieu marin car la truite peut également s’élever en eau de mer. D’une façon générale, il n’y a pas de raison pour penser qu’une réponse en fonction de la méthode de mise à mort utilisée soit différente selon les espèces de poissons. Ce seront des truites adultes de type portion, vendue entière pour une personne, soit 250g environ. C'est une taille interessante pour appliquer les différentes méthodes de mise à mort.
Mécanismes contrôlant la perte de cellules souches neurales dans le cerveau adulte de Danio rerio
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
14 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur leur électropore des plasmides dans les cellules souches neurales sous anesthésie, les expose à des traitements dans l'eau et en irradie une partie aux rayons X pour provoquer de la mort cellulaire. Tous sont mis à mort pour prélever le télencéphale, le porteur reconnaissant un manque de données sur les analgésiques efficaces chez cette espèce. Il affirme que la culture cellulaire détruit l'organisation de la niche et que les cellules isolées montrent des comportements "aberrants" absents in vivo.
Objectifs
Notre but est de comprendre quels mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlent la perte des cellules souches neurales adultes dans le cerveau des vertébrés.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet permettra de caractériser les deux mécanismes principaux de perte de CSNs dans le cerveau adulte en conditions physiologiques : la division symétrique neurogénique, et la transdifférenciation. Ces mécanismes seront des candidats intéressants de dysfonction en conditions pathologiques de perte de CSNs, comme le vieillissement ou certains troubles du comportement.
Procédures
Procédures 2, 3, 4, 6 et 9 : les animaux seront soumis, une fois dans leurs vies et sous anesthésie, à une procédure d’electroporation de plasmides dans les cellules souches neurales. Cette manipulation prend environ 1 à 2 min par poisson. Procédures 5 et 7 : les animaux seront donc soumis à un traitement administré dans l’eau de nage. Cette manipulation prend moins d’une minute par lot de poisson car il s’agit ‘juste’ de les transférer d’un bac a un autre (dans lequel a déjà été dilué le traitement). Il y a ensuite la durée du traitement mais sans action car les poissons sont libres de nager dans leurs bacs. Procédure 10 : les animaux seront soumis à une relativement faible irradiation aux rayons X de 80Gy afin d’induire une légère augmentation des évènements de mort cellulaire. Cette manipulation se passe en plusieurs ‘étapes’ : le transfert des poissons dans des bacs isothermes (moins d’une minute pour transférer les poissons dans un aquarium avec 3cm de hauteur) et le traitement dans l’irradiateur des poissons (dans leur aquarium) qui dure un maximum de 57 min pour une dose de 80Gy.
Impact sur les animaux
Nous ne prévoyons aucun effet indésirable ou nuisance sur les animaux. Si un effet indésirable inattendu apparait nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.
Devenir
Tous les animaux doivent être mis à mort afin de prélever le télencéphale pour l’analyser.
Remplacement
Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules peuvent être perdues dans le cerveau adulte. Le travail sur CSNs en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les CSNs isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode de division. Ce paramètre impacte de façon directe le maintien ou la déplétion des populations souches. Par ailleurs, à l’heure actuelle, la transdifférenciation, pourtant importante in vivo n’a pas été observée in vitro. Enfin, par imagerie intravitale, il a été démontré que les choix de destins des CSNs sont contrôlés à l’échelle de la population et impliquent une coordination spatio-temporelle entre cellules au sein de leur niche. Toute approche in vitro détruit cette niche et cette organisation spatiale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Concernant les procédures de traçage et d’électroporation, différents articles publiés ces dernières années montrent que le comptage d’environ 150 cellules sur un minimum de 10 animaux est suffisant pour rendre compte des choix effectués, de façon comparable à un comptage de la population globale. Ces valeurs suffisent à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test de Fischer) des choix de destin entre des CSNs contrôles et manipulées. Nous travaillerons donc dans chaque cas avec 10 animaux et uniquement si besoin certaines expériences seront répétées (maximum 3 répétitions). Concernant l’utilisation d’inhibiteur pharmacologique, nous travaillerons avec 10 animaux par condition ce qui suffit à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test exacte de Fisher) de CSNs activées versus non-activées entre des animaux contrôles et des conditions de blocage des voies de signalisation.
Raffinement
Les manipulations, invasives ou nécessitant une immobilisation temporaire seront conduites sur animaux anesthésiés. Les inductions (tamoxifène, doxycycline) seront administrées dans l’eau de nage. Les animaux sont toujours maintenus en groupe afin de garantir leurs bien-être. Nous suivrons quotidiennement les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une mise à mort. Chez Danio rerio, il y a un manque d’information sur les effets et la spécificité des produits « classiques » analgésiques. Cependant, une étude récente suggère l’utilisation de lidocaine 2-5 mg/ml dans le bain de réveil. Nous suivrons cette procédure aussi souvent que possible.
Choix des espèces
Nous avons choisi le poisson téléostéen Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de CSNs. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de CSN par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches in toto qui évitent de perdre des cellules comme lorsqu’un organe est analysé sur coupes. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les CSNs de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par la voie de signalisation Notch). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des CSNs adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des CSNs sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.
Etude comparative de la diversité génétique de lots de juvéniles de denti, Dentex dentex, et de corb, Sciaena umbra, produits en écloserie avec celle retrouvée dans les populations naturelles
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
250 poissons, dentis et corbs, vont être utilisés dans des procédures déclarées de gravité légère, gardés vivants et remis dans leurs bassins d'élevage à l'issue. Sous anesthésie et hors de l'eau pendant une trentaine de secondes, chacun subit un prélèvement d'un morceau de nageoire caudale pour comparer la diversité génétique des poissons d'écloserie à celle des populations sauvages. Le porteur reconnaît qu'une mauvaise réaction à l'anesthésiant peut conduire à euthanasier un individu. Il présente ces géniteurs et juvéniles comme "nécessaires" à la production de la station aquacole, à laquelle ils sont réintégrés.
Objectifs
Ce projet, vise à étudier la diversité génétique d’un lot de juvéniles de Dentex dentex et d’un lot de juvéniles de Sciaena umbra (deux poissons marins côtiers) produits en captivité et de comparer cette diversité génétique à la diversité génétique actuelle des populations sauvages de la zone. L'objectif est de s'assurer que les juvéniles produits en écloserie ont une diversité génétique peu ou pas différente statistiquement de celle retrouvée dans le milieu naturel. En effet, ce projet a pour objectif d'être un contrôle génétique afin d'envisager des relâchés de lots d'élevage dans un but de restauration de la biodiversité naturelle. Et un des points essentiels à vérifier au préalable de potentiels relâchés en vue de restauration, est de ne pas impacter la diversité génétique naturelle afin de conserver le potentiel évolutif des populations sauvages. L'étude de la diversité génétique des deux lots de géniteurs (issus du milieu naturel ; de corb et de denti) sera également effectuée afin de s’assurer que la diversité génétique de ces géniteurs reflète bien la diversité génétique retrouvée dans les populations du milieu naturel. Ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion des lots d’élevage étudiés pour un potentiel objectif futur de restauration de population. Ce projet s’inscrit au sein d’un programme à plus grande échelle, comprenant également en parallèle deux autres projets ayant pour but de tester l’efficacité de relâché d’individus produits en écloserie via leur capacité d’adaptation au milieu naturel et l’estimation de leur taux de survie mesurés in situ ainsi que via l’estimation de leurs performances comportementales mesurées en bassin afin de soutenir les populations naturelles de corb et de denti. En résumé, ce projet-ci (décrit ici), correspond au contrôle génétique nécessaire à prendre en compte afin de pouvoir envisager des relâchés de lots d’élevage dans un but de restauration. Il est bien évident que ces résultats seront mis en parallèle avec de futurs contrôles sanitaires (c'est-à-dire une vérification de l’absence de pathogènes et virus des lots relâchés dans ces relâchés expérimentaux sera également effectuée par un vétérinaire spécialisé).
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de conclure quant à la faisabilité de l’utilisation des lots de juvéniles issus de nos géniteurs dans un but de restauration de population. Ainsi, ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion de nos lots d’élevage afin de ne pas impacter la diversité génétique naturelle pour un potentiel objectif futur de restauration de population.
Procédures
Les 25 géniteurs de Sciaena umbra et les 25 géniteurs de Dentex dentex seront soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. De plus, 200 juvéniles au total (100 juvéniles de Sciaena umbra et 100 juvéniles de Dentex dentex) seront également utilisés dans ce projet en étant également soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. Chaque prélèvement génétique s’effectuera individuellement et ne durera pas plus de 30 secondes où l’animal sera hors de l’eau. Puis il sera immédiatement transféré dans un bac de réveil fortement oxygéné.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n’est attendue sur les animaux. Cependant, une mauvaise réaction à l’anesthésiant lors de la session de prélèvement de tissu (respiration très lente et discontinue) n’est jamais à exclure ni à négliger. Ce type de réaction entraînera l’arrêt complet de l’intervention et une aide à la ventilation (mouvements lents favorisant la circulation de l’eau sur les branchies) sera pratiquée dans une eau claire sans anesthésiant. Les réponses post-traumatiques étant maximales de 60 à 90 minutes après le traumatisme, un non-retour à un état considéré comme normal entraînera une euthanasie par balnéation (anesthésie puis transfert pour euthanasie dans une solution de Benzocaïne à 1000 ppm). La mort de l’animal sera confirmée en lien avec l’absence de mouvements operculaires.
Devenir
A l’issue de la procédure unique, les individus seront gardés en vie et retrouveront leurs bassins d’élevage au cœur de la station de production aquacole. Les géniteurs sont en effet nécessaires à la production de la station aquacole et les juvéniles seront réintégrés dans le circuit d’élevage de la plateforme à des fins de production aquacole (qui est le cœur de la station aquacole, permettant un partage de technologies à des aquaculteurs locaux). Tous les individus repartiront ainsi dans leurs bassins d’élevage dans les mêmes conditions que précédemment (température, photopériode, salinité, densité, volume d’eau, etc.)
Remplacement
Il est impossible dans le cadre de ce protocole de remplacer ces espèces par un autre modèle, l’intérêt du projet étant justement d’étudier la génétique de ces deux espèces.
Réduction
L’effectif d’individus prélevés pour la mesure de la diversité génétique sur les juvéniles (soit n=100 juvéniles par espèce) a été calculé à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance statistique de détections suffisante avec des tests statistiques adaptés. Les deux lots de géniteurs (pour rappel, issus du milieu naturel) sont tous prélevés pour comparer la diversité génétique des lots de géniteurs avec celle des populations sauvages et ainsi voir si leur diversité génétique reflète bien la diversité génétique naturelle. Ainsi pour ces analyses-ci, 100 juvéniles par espèce ainsi que les 25 géniteurs denti et les 25 géniteurs de corbs (soit 250 individus au total) semble être un effectif nécessaire et suffisant pour l’exploitation de données concernant la diversité génétique des lots d’élevage.
Raffinement
Plusieurs procédures d'anesthésie générale, d’asepsie et de prélèvements optimales ont été mises en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Avec, notamment, un dosage anesthésique fin permettant la minimisation du stress chez tous les individus et un réveil rapide, des prélèvements dans la partie la plus fine de la nageoire caudale et une désinfection systématique entre chaque individu. La totalité des prélèvements de tissu seront effectués sous anesthésie générale. Ce prélèvement s’effectuera hors de l’eau mais ne sera pas plus long que 30 secondes. Entre chaque prélèvement, le matériel de prélèvement (ciseaux chirurgicaux) sera désinfecté (Ethanol 96% NORMAPUR) afin d’éviter toute contamination (par exemple, bactérienne) de la zone incisée de l’animal (bientraitance) et afin d’éviter toute contamination biologique (ADN) entre les différents échantillons (concernant les résultats expérimentaux).
Choix des espèces
Ces deux espèces sont des espèces emblématiques de Méditerranée et sont également considérées comme des espèces trophées, induisant une diminution de leurs stocks naturels à cause d’une surexploitation par la pêche et d’une dégradation de leurs habitats. De meilleures connaissances concernant leur génétique liée à l’élevage pourraient être utilisées dans une optique de restauration dans un but de sauvegarde de ces espèces pour la biodiversité. Les individus produits en écloserie de Dentex dentex et de Sciaena umbra sur lesquels nous ferons les prélèvements (de nageoire caudale) sont des individus au stade juvénile. Il faut savoir que les génotypes individuels ne sont en aucun cas influencés par la taille ou le stade de développement des individus. Il sera donc préférable de prélever les échantillons biologiques sur des individus au stade juvénile plutôt que sur des larves. En effet, l’anesthésie de larves est trop complexe et incertaine : cela risquerait d’engendrer un fort taux de mortalité. Le stage juvénile est, lui, un stade pour lequel les individus sont bien plus robustes à l’anesthésie. De plus, grâce à une connaissance de plus en plus conséquente de ces deux espèces par l’équipe en charge de ce futur projet, les dosages anesthésiques pour ces deux espèces et pour des petites tailles de juvéniles sont maîtrisées et n’induisent aucune mortalité. Egalement, l’analyse de la diversité génétique du lot de géniteurs de Dentex dentex et de Sciaena umbra (individus issus du milieu naturel) permettra de vérifier que ces lots de géniteurs ont une diversité génétique représentative de la diversité génétique retrouvé dans le milieu naturel pour les deux espèces. Ainsi des prélèvements génétiques seront effectués sur les 2 lots de géniteurs : des individus adultes et matures sexuellement.
Effets des fluctuations thermiques sur la croissance, la morphologie et le comportement de l’omble chevalier
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
900 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs œufs sont placés sous différents régimes de fluctuations thermiques jusqu'à l'éclosion, ce qui peut réduire leur survie, puis les larves sont filmées et anesthésiées pour des photographies morphologiques. Le porteur justifie le nombre par une mortalité anticipée pouvant atteindre 50 %. Il conclut que l'espèce n'est ni remplaçable ni substituable pour évaluer l'adaptation des salmonidés au réchauffement climatique.
Objectifs
Les salmonidés lacustres sont emblématiques de l'Amérique du Nord et de l'Europe. Ce sont des espèces qui ont une forte importance économique (pêche professionelle et amateure), patrimoniale et un fort interêt écologique de part leur position dans le réseau trophique. Néanmoins, les densités de populations ne sont pas stables. Le réchauffement climatique est l’une des principales causes pouvant expliquer ce déclin. L’objectif général de ce projet sera de quantifier les effets d'extrêmes de température apparaissant lors des premiers stades de vie. Spécifiquement, nous testerons si des extrêmes de température de courte durée (24h) et répétés influencent le développement et le phénotype des individus. L’objectif ici est de comprendre comment des fluctuations de température modifie la croissance et la mortalité larvaire, et si des modifications morphologiques et comportementales peuvent être observées. En effet, la température influence directement la physiologie, le développement et le comportement des individus, et certaines études suggèrent que certains organismes peuvent mettre en place des stratégies évolutives et plastiques afin d’y faire face. Ces analyses nous permettront d'évaluer le potentiel d'adaptation des salmonidés face au changement climatique. De façon plus spécifique, nous répondrons à ces objectifs en plaçant des oeufs de salmonidés à différents régimes de fluctuations de température chroniques (3 conditions : 4,5°C stable, augmentation à 8,5°C et 9,5°C) jusqu'à l'éclosion. Un suivi temporel sera réalisé à quatre pas de temps (750, 900, 1200 1500 degrés jour) sur le développement larvaire (croissance et mortalité) et le phénotype (morphologie et comportement).
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face aux fluctuations thermiques. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle d'individus ayant différentes histoires évolutives. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la gestion des salmonidés.
Procédures
Les animaux seront mis dans un petit aquarium afin d'être filmés (mesure comportementale, 10min). Ensuite, ils seront anésthésiés afin d'être placés sous un objectif photo et d'être pris en photo. Enfin, ils seront replacés dans leur aquarium. En outre, les fluctuations de températures auront lieu une fois par semaine de la fécondation à la naissance, cela peut induire une survie inférieure et un développement différent.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet (prise de photo pour mesurer la morphologie et vidéo pour le comportement) n'impliquent qu'un leger stress du à la manipulation des animaux. Nous nous attendons à ce que ce stress se dissipe rapidement après avoir remis les individus dans leur aquarium. Enfin, les fluctuations de température mise en place lors du développement embryonnaire peuvent modifer leur développement, notamment morphologique et comportementale.
Devenir
Pour pallier au stress et souffrances potentiels dû à l’expérimentation, les individus sont mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre les diminutions de densité dans les populations de salmonidés. L'objectif est d'évaluer les effets d’une augmentation de la variabilité thermique en milieu sauvage dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température et dont les effets sont problématiques d’un point de vue économique et écologique. En effet, cette étude permettra de comprendre la sensibilité au changement climatique d'une espèce avec une forte importance économique (pêche professionelle et amateur) et également écologique (prédateur). Le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il répond a une problématique spécifique. De plus, chaque espèce répond différemment aux variations environnementales, ainsi il n’est pas remplaçable ni substituable.
Réduction
Cette expérimentation prévoit 3 traitements de température (2 régimes fluctuant et 1 témoin stable). L’effectif de 100 individus par répétition permet d’avoir un effectif de qualité pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, et les 50 individus suivis dans chaque traitement permettent prendre en compte la répétabilité de la variabilité interindividuelle dans chaque traitement ainsi que la variabilité entre les séries, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort gràce à un suivi temporel des mêmes individus (Règle des 3 R : Réduction). Au total 900 individus seront utilisés et mis à mort à la fin de l’étude : (3 traitements * 100 individus + 3 traitements *50 poissons individualisés) = 450 individus. 450*2 (50% de mortalité maximale anticipée) = 900 individus.
Raffinement
Tout au long de l’expérimentation, les structures et conditions expérimentales évolueront avec la croissance des animaux (litrage, nourriture, lumière). Les aquariums disposeront d’un couvercle afin de limiter le stress dû à la lumière. Les animaux seront visités 3 à 4 fois par jours, y compris le week-end. Avant les mesures morphologiques, les individus seront anesthésiés afin de limiter le stress due à la manipulation. Lors des mesures comportementales, une cachette sera disposée dans l'aquarium de test afin de limiter le stress. Enfin, aucune intervention chirurgicale n’est prévue, ainsi les mesures comportementales et morphologiques ne seront pas invasives pour les animaux.
Choix des espèces
Les salmonidés sont en déclin depuis plusieurs décennies, ayant des conséquences économiques, sans que les raisons de ces pertes d’effectifs ne soient complètement comprises. Bien que le réchauffement climatique soit l’une des causes de ce déclin, l’un des facteurs largement sous considéré est l’apparition de phénomène bref et intense de température. Ce projet apportera des connaissances essentielles quant au potentiel d’adaptation des salmonidés face aux fluctuations thermiques. Les résultats de ce projet détermineront la pertinence d’étudier à plus large échelle l’adaptation potentielle des organismes avec différentes origines. Ces connaissances pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer une aide stratégique pour la conservation des salmonidés. Nous utiliserons des poissons au stade embryonnaire, larvaire et jusqu’au stade juvénile. Ces premiers stades de vie devraient présenter des phénotypes différents selon les traitements des fluctuations de température subit durant le développement embryonnaire.
Etude des mécanismes d’apparition de la scoliose chez le poisson-zèbre Danio rerio, en particulier du rôle des cils du système nerveux dans ce processus.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
2500 poissons zèbres vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés ou menées sous anesthésie sans réveil. Des lignées mutantes développent une scoliose progressive pouvant réduire leur capacité à nager et à accéder à la nourriture, et des larves reçoivent des injections de colorant dans le cerveau sous anesthésie terminale. Un morceau de nageoire est prélevé pour le génotypage et vingt individus seulement sont gardés vivants pour reproduction. Le porteur indique utiliser des modèles cellulaires mais affirme que l'étude de la colonne vertébrale sur un vertébré reste essentielle.
Objectifs
Ce projet vise à identifier les mécanismes d'apparition de scolioses chez le poisson zèbre en lien avec les anomalies du fonctionnement des cils du système nerveux. Nous étudions des gènes qui causent des ciliopathies, des maladies humaines rares liées à des défauts de formation ou de fonction des cils, des organites cellulaires sensoriels et motiles présents sur la majorité des cellules. Le poisson zèbre a des intérêts scientifiques et techniques uniques pour l'étude des processus développementaux: transparence des embryons, développement externe, possibilité de produire et d'étudier des lignées mutantes. De plus, c'est un modèle reconnu de la scoliose idiopathique, une maladie très répandue (qui affecte 3% des adolescents dans le monde) dont l'étiologie est très mal comprise. Notre projet se subdivise en 3 objectifs: 1) Identifier les mécanismes d'apparition de la scoliose due à une dysfonction ciliaire, en prenant pour modèle un mutant de poisson-zèbre. Ce mutant ne présente pas de létalité embryonnaire à l'état homozygote et développe une scoliose progressive chez le poisson juvénile. 2) Tester les interactions fonctionnelles entre différents protéines ciliaires et avec des acteurs de la signalisation des neuropeptides en étudiants des doubles mutants. 3) Tenter de diminuer ou de retarder la scoliose par des traitements par des drogues. Pour l'ensemble du projet, nous utiliserons 2500 animaux sur 5 ans. Les animaux utilisés pour des expériences avant la fin du stade embryonnaire (5 jours) ne sont pas inclus dans ce décompte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à court et moyen terme, de mieux comprendre les événements qui conduisent à la scoliose chez le poisson-zèbre, en espérant à plus long terme que les mécanismes pathologiques identifiés pourront au moins en partie être validés chez l’homme. La scoliose idiopathique est une maladie d’origine inconnue qui touche environ 3% des adolescents dans le monde. Ceci est particulièrement important car il n’existe à ce jour pas de traitement médicamenteux pour la scoliose. Les seules interventions possibles sont le port d’un corset, traitement préventif, qui ne corrige pas la scoliose déjà existante, ou l’arthrodèse, une chirurgie lourde qui consiste à fixer les vertèbres les unes aux autres.
Procédures
Des animaux mutants ou double-mutants à phénotype dommageable de scoliose seront produits. La scoliose apparait entre 4 et 5 semaines après la ponte. Dans le cas où les animaux sont produits pour observation de l’évolution de la scoliose, les animaux seront maintenus jusqu’à l’âge de 6 mois. La durée de cette procédure est donc de 6 mois. Dans le cas où les animaux sont euthanasiés pour prélèvements, l’euthanasie interviendra à 3 stades différents : 5-21 jours, 3-9 semaines (2 stades différents) et 3-4 mois. Dans ces deux cas, entre 1 à 2 mois, un petit morceau de nageoire caudale sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant. L’anesthésie pour prélèvement de nageoire dure moins d'une minute. Une à deux semaines après le prélèvement, la nageoire caudale a complètement régénéré. Pour la procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central, les larves anesthésiées seront soumises à des injections sous loupe binoculaire de Dye fluorescent ou billes dans le ventricule cérébral ou canal: 90 larves âgées de 5 jours et 90 larves âgées de 15 jours seront injectées puis la diffusion du Dye sera observée sous microscope pendant 2h dans une atmosphère thermostatée et sous anesthésie. Les larves seront euthanasiées à la fin de l'expérience, donc au bout de 2 heures. Pour la procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose, un test de drogues sera réalisé sur 600 alevins âgés de 7 jours à 8 semaines. Observation de l'apparition de la scoliose pendant ces 7 semaines d'expériences. Vers 1-2 mois, un petit morceau de leurs nageoires caudales sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue vient de l’utilisation de lignées mutantes de poissons qui développent une scoliose à l’état homozygote chez l’adulte. Cette scoliose (torsion tridimensionnelle de la colonne vertébrale en absence de malformations vertébrales ou de fractures) peut, dans les cas les plus graves, induire une difficulté de nage donc une mobilité réduite et une compétition avec des poissons sains pour l’accès à la nourriture.
Devenir
La production de lignées double-mutantes pour l’observation de l’apparition de la scoliose est procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (adultes de 6 mois environ), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. 20 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. La production de lignées mutantes pour analyse phénotypique sur animaux euthanasiés est une procédure de sévérité modérée. Dans cette procédure les animaux seront euthanasiés eà différents stades larvaires, juvéniles et adultes pour prélever les organes et réaliser des analyses. La seule raison pour les euthanasier en dehors de ce protocole serait les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. La procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central est une procédure sans réveil. Toutes les larves seront sous anesthésie pendant toute la durée de la procédure et euthanasiées à la fin. En effet, l’injection d’un colorant fluorescent dans les ventricules du cerveau et l’observation de la larve vivante sous microscope pendant plusieurs heures compromettent la viabilité de l’animal et génèreraient potentiellement des souffrances en cas de réveil. La procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose est une procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (8 semaines ou 12 semaines en fonction du génotype), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring.
Remplacement
Dès que possible nous utilisons des modèles cellulaires pour remplacer l’expérimentation animale. Nous avons ainsi développé dans les dernières années des modèles de cellules souches embryonnaires de souris et de cellules pluripotentes induites humaines que nous différencions en différents types neuronaux, en deux dimensions et en culture de type organoïdes. Ceci nous permet de comprendre par exemple le rôle des cils dans la formation des neurones. Néanmoins, l’expérimentation sur le poisson reste essentielle, en complément des modèles cellulaires, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus de développement aussi complexes que la morphogenèse du système nerveux central ou de la colonne vertébrale.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans aucun dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Nous réutilisons aussi les animaux adultes produits dans certaines expériences (par exemple des animaux hétérozygotes pour certaines mutations) pour réaliser d’autres expériences. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des poissons dès l’âge de 1 mois (au lieu de 2 mois habituellement). Le nombre total d’animaux impliqués est de 2500.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28°C, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2-3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de transgenèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson-zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse. Nous analysons également l’impact d’un défaut des cils sur l’apparence de scoliose, pathologie pour laquelle le poisson-zèbre est un modèle de choix du fait des contraintes mécaniques subies par la colonne vertébrale pendant la nage. Ce modèle permet d’étudier les étapes précoces de la maladie, avant la survenue de la courbure, ce qui est difficile chez l’homme. Le poisson-zèbre permet également de tester des molécules chimiques pour retarder ou réduire l’apparition des scolioses. Les nageoires caudales sont coupées pour le génotypage sur des animaux âgés de plus de 2 mois. Pour certaines expériences, nous pourrons génotyper les poissons à un stade plus précoce (1 mois) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Afin d’étudier le développement de la scoliose, (phénotype dommageable modéré) nous réalisons des expériences sur des larves (5 jpf-21 jpf), des juvéniles (21 jpf-3 mois), et des adultes (> 3 mois).
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents dans un contexte réglementaire
- Protection de l’environnement
Saumons : 752
Loups de mer : 1242
3374 poissons, poissons zèbres, truites et bars, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, la plupart tués à l'issue. Ils sont exposés en continu à une eau contaminée par des substances chimiques et des effluents industriels, de 96 heures à 30 jours, pour des tests réglementaires d'écotoxicologie. Les reproducteurs de poissons zèbres non exposés sont proposés à l'adoption et une partie des témoins réutilisée, mais les individus exposés sont tués en fin d'essai. Le porteur indique que les espèces et les méthodes sont imposées par les normes REACH et que les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités.
Objectifs
Les évaluations des risques environnementaux sont basées sur l'étude de l'impact des composés anthropiques sur la survie et le développement de différents taxons représentatifs des écosystèmes. Pour être représentatives et exploitables ces évaluations des risques doivent inclure des organismes à différents niveaux d'organisation. Ainsi des études son classiquement menées sur des algues des crustacés et des poissons. Les tests réalisés au sein de ce projet sont des tests règlementaires qui suivent des normes d’essai nationales et internationales. Le but de ces essais est de générer des données qui entreront dans les dossiers d'évaluations des risques environnementaux, dans des dossiers d’homologation de produit ou dans des suivis industriels règlementaires. Les données générées par ces essais entreront dans des dossiers tels que demandés par la directive REACH, le CLP (étiquetage de produits), règlement phytosanitaires (dir. 91/414/EEC), la convention OSPAR (HOCNF), ainsi que les suivis industriels dans le cadre de la loi sur l'eau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la génération de données utilisées dans les évaluations des risques environnementaux. Ces évaluations des risques permettent de mieux gérer et utiliser les composés testés au regard de leur impact potentiel sur l'environnement.
Procédures
Les animaux (poissons) seront soumis à une exposition continue à un environnement contaminé via l'eau des aquariums sur des périodes de 96h à 30 jours. Les interventions réalisées sur animaux vivants seront du type observation.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux peuvent être une inhibition de la croissance, un mauvais développement larvaire, et des signes de stress et / ou de mauvais état de santé décrits dans l'annexe 1 "points limites".
Devenir
Procédure 1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio : les animaux reproducteurs sont gardés en vie car ils n'ont pas été exposés à des produits toxiques et qu'ils ont été maintenus dans de très bonnes conditions favorisant la reproduction. Les individus non productifs sont écartés des reproducteurs dans un bac dit de "retraite" et sont ensuite proposés à l'adoption après approbation du vétérinaire référent. Procédures 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) réalisés sur poissons juvéniles : les individus exposés aux produits testés sont euthanasiés en fin de procédure pour éviter toute souffrance à long terme. Les individus témoins (non exposés) sont réintroduits dans les bacs de réserve et réutilisés lors d'essais ultérieurs. Le nombre de poissons réutilisés dans ce cadre représente en moyenne 14% du contingent. Procédures 3 relative au test de toxicité chronique d'ihibition de la croissance des poissons juvéniles et procédure 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio : les individus témoins ne pouvant être réutilisés en raison des temps de tests l'ensemble des poissons utilisés dans ces procédures sont euthanasiés en fin d'essai.
Remplacement
Le modèle poisson fait partie intégrante des évaluations des risques et des demandes d’autorisation de mise sur le marché / étiquetage. Les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. Cependant les essais de mortalité sur œufs de poissons sont proposés en remplacement des essais sur poissons adultes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (œuf) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques sont réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ce procédé permet de vérifier que les modèle poissons n'est sont pas plus sensibles que les autres organismes testés sur la matrice (crustacés, végétaux…). Cette façon de procéder permet de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Ils sont maintenus dans des salles dédiées et uniquement fréquentées par le personnel habilité. Des enrichissements des milieux tels qu'un apport de nourriture vivante, des caches ou des systèmes de remous permettent également d'améliorer les conditions de stabulation.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les procédures N° 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) et 3 relative au test de toxicité chronique d'inhibition de la croissance des poissons sont réalisées sur truite et bars. Le stade requis pour ces tests est le stade juvénile. Les individus doivent mesurer entre 2 et 4 cm d’après les exigences des normes suivies (OCDE 203 et 215). Pour la procédure n°1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio, le stade requis est les stade adulte (mature et reproductif) les individus commandés sont âgés de 4 mois. Pour la procédure n° 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio le stade d’exposition est les stade œuf.
Le poisson zèbre un organisme modèle en enseignement
- Enseignement supérieur
230 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures classées en souffrance modérée, pour un enseignement de biologie du développement. Le porteur indique que les adultes ne subissent aucun traitement et servent uniquement à la reproduction, seuls leurs embryons de moins de cinq jours étant observés, puis qu'ils sont réutilisés à des fins pédagogiques. Il décrit un génotypage présenté comme non invasif, par simple repérage d'un marqueur fluorescent. Il justifie le maintien de lignées vivantes par l'intérêt de montrer aux étudiants un vertébré à embryons transparents.
Objectifs
Ce projet consiste à présenter un organisme modèle vertébré, le poisson zèbre, pour renforcer et illustrer les cours et travaux dirigés de la Biologie / Génétique du Développement. Les concepts de base de la Biologie du Développement animal visent à faire comprendre la mise en place des structures précoces, les phénomènes d'induction tissulaire, la morphogenèse et l’organogenèse dans un organisme vertébré. Nous présenterons des embryons sauvages et mutants, fixés et vivants, à des stades de développement précoces. Nous utiliserons des lignées mutantes, inductibles par la chaleur, des traitements chimiques et l'injection transitoire d'ARN guide (CRISPR/CAS9) pour induire des phénotypes précoces facilement observables à 3 jours de développement pour les étudiant.es.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra de présenter un organisme modèle vertébré aux étudiant.es de Biologie du Développement et de les faire observer en parallèle des embryons vivants et fixés pour avoir une vision dynamique et réaliste de nos enseignements.
Procédures
Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour expérimentation et observation à 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours et 5 jours. Ils sont ensuite fixés à 3, 4 et 5 jours pour analyse moléculaire et phénotypique.
Impact sur les animaux
Dans ce projet pédagogique nos adultes ne sont soumis à aucun traitement et servent uniquement à la reproduction pour générer des embryons pour nos observations phénotypiques.
Devenir
A l'issue de la procèdure les animaux seront réutilisés à des fins reproductives pédagogiques.
Remplacement
Notre projet utilise des embryons et des larves plutôt que des poissons adultes.
Réduction
Les travaux pratiques concernent uniquement des processus embryonnaires ou larvaires avant 5 jours de développement. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à nos observations. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que d’obtenir nos embryons. De plus, le génotypage dans ce projet est dit non invasif (sélection des lignées grâce à la présence d'un rapporteur fluorescent) ce qui n'induit pas de douleur chez l'animal.
Choix des espèces
Nos enseignements visent à transmettre les connaissances sur le développement des organismes modèles vertébrés. Ils portent sur la mise en place des axes et territoires embryonnaires. Une approche éducative incluant un animal vertébré permet une meilleure appréhension des phénomènes contrôlant ces processus. Le poisson zèbre est un modèle qui présente de nombreux avantages dont la possibilité d'observer les événements embryonnaires précoces « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non- invasive, le recourt à l'utilisation d'approches chimiques, de lignées transgéniques inductible par la chaleur et de mutagénèse dirigée transitoire pour obtenir des phénotypes facilement observables et quantifiables précocement afin de comprendre les processus moléculaires et génétiques étudiés. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ces embryons facilement pour observer le développement précoce. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.
Expérimentations de marquage pour mieux comprendre le cycle de vie du thon rouge Thunnus thynnus
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
234 poissons, thons rouges et listaos, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour poser des marques électroniques et suivre leurs migrations. Le porteur indique que 222 seront relâchés en mer après capture, sortie de l'eau et pose de marque, et que 12 seront tués pour récupérer les capteurs. Il décrit un protocole de capture rapide, moins de deux minutes hors de l'eau, avec intubation et double ancrage de la marque pour limiter les blessures. Une partie des tests met au point des marques internes de fréquence cardiaque, essayées au préalable sur des thons morts.
Objectifs
Le thon rouge Thunnus thynnus est une espèce qui a historiquement subi une surexploitation, ce qui a mené à un plan de reconstitution initié en 2007. Depuis, la situation du stock Est-Méditerranée s’est substantiellement améliorée. Il reste néanmoins de grandes étapes à franchir pour la gestion et la conservation de ce stock, ainsi que des espèces de grands pélagiques en général. En particulier, la compréhension des liens entre l’environnement physique (e.g. le climat) et les processus biologiques (migrations, reproduction, nutrition) sont aujourd’hui mal connus pour ces espèces à très larges aires de répartition. Ce projet a pour objectif général de mieux comprendre le cycle de vie du thon rouge, et les expérimentations ont deux volets principaux. Le premier sera le marquage d’animaux sauvages en haute mer, avec des marques archives électroniques externes de type 'pop-up' qui enregistrent des informations environnementales (température, lumière, pression), à transmission satellite pour pouvoir retracer les parcours de migration. Les marquages auront lieu sur des bateaux de pêche commerciale. Le deuxième volet sera des expériences pour le développement de marques 'pop-up' innovantes et pour la mise au point de méthodes de marquage avec des capteurs internes. Ces expériences seront toujours des marquages en bateau, sur des thons listao Katsuwonus pelamis (île de La Réunion, en palangrier) et des juvéniles de thon rouge (Golfe du Lion en palangrier). Contrairement au thon rouge, le thon listao est plus abondant, plus facilement accessible à la pêche et de moindre importance commerciale. Le listao est un modèle idéal pour faire des tests de dispositifs électroniques innovants qui seront utilisés in fine sur les thons rouges. Des marquages sur des juvéniles de thon rouge serviront pour la mise au point de déploiements de capteurs internes qui enregistrent des données physiologiques, notamment l’impédance des tissus et la fréquence cardiaque. À long terme, l’ensemble des expériences vont servir au développement des marques archives à transmission satellite qui enregistrent des données physiologiques, à utiliser pour comprendre les liens entre environnement et physiologie pendant le cycle de vie des animaux sauvages.
Bénéfices attendus
Les expériences de marquage ‘pop-up des thons rouges représenteront une avancée majeure dans notre compréhension de la biologie de cette espèce. Le projet permettra aussi des avancements importants vers le développement de tags externes archives qui enregistrent plusieurs variables physiologiques chez les espèces des grands pélagiques marines. Les expériences sur les thons listaos (masse 3 - 6 kg), permettront de tester des marques pop-up qui sont des alternatives aux marques actuellement en commerce, moins chères mais plus performants. En particulier, avec un ancrage dans le muscle axial qui sera équipée d’un système d’électrodes pour un capteur de taux de gras, par mesure de l’impédance des tissus. Les mesures de taux de gras indiquent l’état nutritionnel du poisson et pourront fournir des aperçus sur les zones de nourrissage des thons le long de leur trajet migratoire. Les expériences avec les marques physiologiques sur les juvéniles de thon rouge dans le Golfe Lion permettront de maîtriser les protocoles de déploiement des marques externes qui mesure l’impédance, mais aussi des marques internes qui enregistrent la fréquence cardiaque. L’observation de la fréquence cardiaque est la meilleure façon d’estimer l’activité métabolique des animaux en liberté. Il existe des marques en commerce qui enregistrent l’électrocardiogramme (ECG) pour pouvoir calculer la fréquence cardiaque mais, étant des systèmes archive interne, le tag doit être récupéré pour obtenir les données. Une approche issue de la chirurgie humaine, la laparoscopie, a été utilisée sur des thons morts pour établir le placement optimal des marques ECG en proximité du cœur.
Procédures
Le présent projet envisage le marquage de 110 thons rouges avec des marques archives électroniques externes de type 'pop-up'. Les individus seront pêchés à la canne sur des palangriers commerciaux ou depuis des senneurs sur les sites de reproduction. Le protocole de capture limite au maximum la souffrance et le stress des animaux grâce à des temps de pêche réduits (
Impact sur les animaux
Pour le marquage avec les tags externes 'pop-up', les nuisances et les effets indésirables seront très limités, grace au méthode de capture et marquage rapide. Un système de trocart sera utilisé pour implanter les marques internes de la façon la plus rapide et le moins nuisible possible, soit dans la cavité péritonéale, soit intramusculaire dans la mâchoire. Le fait de minimiser l’invasivité de l’intervention maximisera les chances de survie de l’animal, et évitera les effets sur son comportement et son bien-être. Certains des thons marqués avec des tag physiologiques (n = 6) seront relâchés équipés avec des ‘survival tags’, pour confirmer que le marquage n’a pas d’impact sur leur survie, en comparaison avec des thons capturés mais non-marqués (n = 6). Pour n = 12 de ces thons rouges, la marque sera placée puis les animaux seront remis à l'eau attachés avec un hameçon, pour enregistrer leur fréquence cardiaque et évaluer la qualité du signal ECG obtenu. Ces dernières expériences serviront pour la mise en œuvre du marquage de thons adultes en cage.
Devenir
222 thons seront relâchés dans leur milieu naturel et 12 seront mis à mort pour récupérer les marques électroniques.
Remplacement
Ces études doivent être réalisées sur le thon rouge car l’objectif est d’améliorer les connaissances sur l’écologie de cette espèce dans son environnement naturel. On remplacera cependant celui-ci par des poissons morts ou par le thon listao quand cela sera possible, notamment pour les tests de mise au point méthodologique ou pour des développements électroniques.
Réduction
Le nombre d’individus utilisés est optimisé afin de permettre de réaliser des tests statistiques appropriés aux différents objectifs du projet et tenant compte de la grande valeur économique des thons rouges adultes. Le nombre a été déterminé pour permettre de capturer plusieurs réplicats de séries temporelles générées par les capteurs des marques électroniques permettant de renseigner fréquence cardiaque, profondeur, température ambiente, lumière, accélération. Les expérimentations ne relèvent pas de la comparaison de population, mais de la collecte de données en milieu naturel sur des processus que nous cherchons à caractériser (e.g. migrations). Il n’est donc pas possible de calculer le nombre nécessaire d’individus a priori et nous avons choisi un chiffre permettant d’obtenir suffisamment d’information exploitable en tenant compte des aspects logistiques complexes de ces opérations, de la probabilité que la marque ne fonctionne pas correctement ainsi que de la valeur commerciale des individus. Pour le marquage des thons rouges avec marques archives en bateau, chaque année pendant 5 ans, 5 individus juvéniles seront marqués dans le Golfe du Lion et sur la côte Atlantique, et 12 individus adultes matures sur les sites de reproduction. Pour les thons listao, chaque année pendant 5 ans, 20 individus seront marqués avec différents prototypes de marques archives électroniques. Pour la mise au point des méthodes de déploiements de capteurs internes, des études préliminaires seront achevées sur 24 thons juvéniles pour évaluer la méthode la plus rapide et moins stressante de placement des deux types de marque.
Raffinement
Le protocole de marquage des thons rouges et listaos sur bateau avec des marques externes a déjà été mis au point. Notamment, le protocole limite au maximum la souffrance et le stress des animaux grâce à des temps de pêche réduits (
Choix des espèces
Le thon rouge est le modèle principal du projet. C’est une espèce exploitée emblématique, notamment en Méditerranée. De nombreuses questions scientifiques importantes tant au point de vue fondamental (e.g. déterminisme des migrations et des routes migratoires en relation avec l’environnement) qu’appliqué (e.g. zones de pontes, temps de résidence, structuration de la population) doivent cependant être résolues pour gérer de façon durable cette espèce. Les outils développés dans le cadre du présent projet visent précisément à aborder ces questions. Le thon listao est une espèce abondante dans l'Océan Indien, son utilisation permet de réduire le nombre de thons rouges utilisés pour achever les tests de différentes modèles nouveaux de marques archives. Les individus seront une combinaison de juvéniles (pas sexuellement matures) et adultes (stade reproductif). Les expériences avec les marques physiologiques sur les juvéniles de thon rouge permettront de maîtriser les protocoles de déploiement des marques externes qui mesure l’impédance, mais aussi des marques internes qui enregistrent la fréquence cardiaque. Le marquage de 110 thons rouges adultes avec des marques archives 'pop-up' permettra de mieux connaitre les zones de reproductions, les migrations transatlantiques et les zones de nourricerie de cette espèce. Les marquages de 100 thons listaos en Océan Indien permettront de tester des marques pop-up qui sont des alternatives aux marques actuellement commercialisées, moins chères et plus performants.
Analyse vidéo de l’efficacité alimentaire individuelle en condition de groupe et de reconnaissance individuelle chez le bar
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
20 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent un marquage externe et un accéléromètre implanté, puis sont élevés et mesurés pour tester une méthode vidéo d'évaluation de l'efficacité alimentaire en aquaculture. Le porteur qualifie les nuisances de limitées et maîtrisées, et indique tuer tous les poissons en fin d'essai pour ne pas les garder inutilement. Il juge le remplacement impossible, la mesure devant être faite in vivo sur l'espèce d'élevage.
Objectifs
L’efficacité alimentaire est le premier critère à améliorer en termes d’efficacité économique et environnementale dans tous les élevages et notamment en pisciculture. Ce caractère est cependant impossible à évaluer chez les poissons au niveau individuel car il nécessite de connaitre la ration ingérée par chaque poisson nourrit au sein d’un groupe de nombreux individus. Le projet vise à développer une méthode de quantification de l’ingéré individuel pour des poissons élevés en groupe en condition classique d’élevage, utilisant la reconnaissance d’individus par analyse vidéo et l’analyse de l’activité par accéléromètres. Dans le projet la procédure en expérimentation animale mise en oeuvre sur 20 poissons comprend: un marquage externe (marque individuelle colorée) et interne (accéléromètre), un élevage en condition normal durant 3 périodes de 2 semaines avec des mesures biométriques à intervalle régulier.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’une part la possibilité d’évaluer la prise alimentaire des poissons en condition de groupe pour calculer l’efficacité alimentaire individuelle, d’autre part la possibilité d’effectuer de la reconnaissance individuelle des poissons. La reconnaissance par intelligence artificielle permettra peut-être à terme d’enregistrer le comportement alimentaire des poissons sans avoir besoin de les marquer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure incluant: un marquage intramusculaire, un marquage externe par et intrapéritonéal (avec une marque acoustique), suivis de 4 mesures biométriques.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables sont a priori limités. La procédure mise en oeuvre est d'une sévérité légère et est maîtrisée par notre équipe sur cette espèce. Les conditions d'élevage en captivité ont été optimisées pour cette espèce.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure 1, afin de ne pas garder inutilement ces animaux expérimentaux
Remplacement
Le remplacement est impossible pour ces recherches qui impliquent la mesure in-vivo de l’efficacité alimentaire chez l’espèce d’intérêt aquacole Dicentrarchus labrax.
Réduction
Pour constituer une preuve de concept de la mesure de l’efficacité alimentaire par analyse vidéo le nombre de 20 individus a été choisi pour plusieurs raisons. Ce nombre est nécessaire afin d’obtenir des interactions sociales entre les individus (le bar est un animal grégaire) et suffisant pour avoir un échantillon représentatif des comportements alimentaires variés. Davantage d’individus compromettrait la capacité à évaluer l’ingéré par l’oeil humain. Moins d’individus ne permettrait pas d’effectuer des tests statistiques significatifs de corrélation entre l’ingéré estimé pour chaque poisson par les différentes méthodes.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pendant le marquage et les biométries nous utiliserons une procédure d'anesthésie optimisée pour cette espèce. Durant les phases d’élevage, les poissons seront en condition optimale d’alimentation (ad libitum alimentaire). L’alimentation sera effectuée en 4 points du bassin, créant ainsi de la variation dans l’environnement. La luminosité du bassin sera réglée afin d’optimiser l’apaisement des poissons avec l’utilisation d’un cycle correspondant à un ensoleillement avec 14 heures de jour et 10 heures de nuit comprenant une phase d’aube et de crépuscule.
Choix des espèces
Dicentrarchus larbax (bar) est une espèce importante pour la pisciculture. Explorer des moyens d'améliorer l'efficacité alimentaire de cette espèce est un enjeu majeur de développement durable de la filière. Le stade de développement des animaux utilisés est le stade adulte (350g).
Formations réglementaires à l’expérimentation animale « Espèces aquacoles » Niveaux concepteurs (Niveau 1) et applicateurs (Niveau 2)
- Formation professionnelle
16 daurades royales vont être utilisées, manipulées puis tuées sans réveil, dans le cadre d'une formation réglementaire à l'expérimentation animale. Chaque stagiaire s'exerce sur un poisson aux gestes de base, préhension à l'épuisette, anesthésie, marquage, prélèvement de sang et mise à mort. Le porteur justifie la mise à mort par la nécessité d'une autopsie et l'absence d'usage ultérieur, non par un objectif de connaissance. Il qualifie d'"indispensable" le recours à l'animal vivant pour reproduire les conditions de terrain.
Objectifs
Les formations règlementaires à l’expérimentation animale « Espèces aquacoles » (pour les chercheurs et pour les techniciens de laboratoire) sont approuvées par le Ministère de l’Agriculture (agrément obtenu pour 5 ans par l’établissement organisateur). Ces formations ont comme objectif d’assurer la formation spéciale complémentaire obligatoire à tout personnel réalisant des études utilisant l’animal de laboratoire vivant. Ces formations suivent un programme règlementaire validé par la Commission Nationale de la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques avec des conférences (CM), des travaux dirigés (TD) et des travaux pratiques (TP).
Bénéfices attendus
L’objectif de ces formations est d’améliorer la pratique quotidienne des stagiaires afin qu’ils puissent appliquer les principes du raffinement dans leurs expérimentations (meilleur choix des modèles animaux et des procédures expérimentales, meilleure prise en charge du bien-être animal), et ainsi obtenir une meilleure efficacité notamment une meilleure reproductibilité dans les résultats ce qui aboutit à une réduction du nombre d’animaux utilisés pour atteindre les objectifs scientifiques.
Procédures
Les poissons (Daurade royale - Sparus aurata) sont utilisés pour réaliser l'apprentissage de gestes expérimentaux de base, tels que : - la préhension douce avec une épuisette. La capture à l’épuisette est effectuée avant l’anesthésie, et après l’anesthésie. Elle permet dans tous les cas une préhension douce de l’animal dans son milieu. - l'anesthésie dans un aquarium - la contention et la manipulation de l'animal anesthésié avec une épuisette puis sur la table d'expérimentation - le marquage avec une marque externe. Le marquage est effectué, après désinfection du site, avec un pistolet qui effectue un agrafage d’une marque externe. Le poisson est sorti de l’eau et placé sur un linge humide - le prélèvement de sang se fait au niveau de la veine caudale, avec une aiguille bleue 23G préconisée pour une utilisation "intramusculaire enfant" et "intraveineuse", en se positionnant en direction de la veine caudale (position présentée pendant la séance d’anatomie sur animal mort). Le geste du prélèvement de sang est supervisé par un encadrant avant toute action invasive sur l’animal. - l'euthanasie par immersion dans un bain avec surdosage de produit anesthésiant (benzocaine).
Impact sur les animaux
Animaux euthanasiés.
Devenir
Le choix d’euthanasier les animaux est lié à plusieurs aspects : - Nécessité de réaliser une autopsie pour identifier les éventuelles lésions provoquées par les actes expérimentaux effectués pendant la formation - Nécessité de pratiquer une procédure d'euthanasie conforme - Réalisation de divers prélèvements d’organes, une fois l’animal euthanasié, afin de montrer la démarche de laboratoire pour ces prélèvements - Absence de justification d’utilisation ultérieure de ces animaux par le laboratoire.
Remplacement
Le recours aux animaux vivants s'effectue après un premier apprentissage sur mannequin ou matériel inerte. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour se placer dans les mêmes conditions que les conditions de terrain en phase expérimentale, afin d'appréhender au mieux le déplacement du poisson lors de sa préhension, d'exercer l'anesthésie, le marquage, le prélèvement et l'euthanasie.
Réduction
En matière de réduction, le nombre d’animaux utilisés est restreint au minimum, à savoir un poisson par stagiaire (soit 16 au total), pour que chaque stagiaire ait effectué à minima un ensemble de manipulation. D'un point de vue pédagogique, les stagiaires fonctionnent en binômes, chacun étant donc une fois manipulateur et une fois observateur et assiste/participe ainsi à deux ensembles complets de manipulations.
Raffinement
En matière de raffinement, les protocoles d’anesthésie-analgésie (benzocaine) sont adaptés de manière à éviter toute douleur ou souffrance aux animaux lors de leur manipulation. Les dosages d'anesthésiant sont proportionnés en fonction de l'espèce et du poids des individus. La concentration en oxygène dissous dans les bassins d'accueil est contrôlée, et si besoin, maintenue à un niveau suffisant pour ne pas générer de stress. Par ailleurs, les bassins utilisés lors des manipulations sont à fond noir, afin maintenir les poissons dans un environnement non stressant. Les individus sont contrôlés de façon continue pendant toute la durée de la formation afin d'identifier précocement tous signes de stress.
Choix des espèces
Les stagiaires concernés par les espèces aquacoles travaillent principalement sur des poissons de bassin ou de pleine mer. Deux espèces cibles sont maintenues sur le site et sont les sujets quotidiens des activités des stagiaires : Denti (Dentex dentex) et Corb (Sciaena umbra). La daurade royale (Sparus aurata) sélectionnée pour la réalisation de cette formation est une espèce animale de taille moyenne qui se rapproche assez des poissons utilisés en routine dans le laboratoire demandeur ; par ailleurs, la daurade bénéficie d'une disponibilité aisée en élevage. C'est aussi une espèce qui facilite les premières étapes de l’apprentissage et dont l’approvisionnement et l’hébergement ne sont pas trop contraignants dans la région concernée. Animaux jeunes adultes d'un poids suffisant pour permettre les actes expérimentaux de base et faciliter les manipulations, de l'ordre de 200 à 300 g de poids corporel.
FLAVOCONTROL : Phénotypage de la résistance à la flavobactériose de populations de truites commerciales pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
5 200 truites et saumons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par la bactérie Flavobacterium psychrophilum, par bain ou par injection, pour mesurer la résistance de populations commerciales en vue d'une sélection génétique. Le porteur indique que la bactérie peut tuer rapidement les poissons et qu'il est difficile de pratiquer une mise à mort entre l'apparition de signes cliniques et la mort. Il qualifie d'"indispensables" ces infections en milieu contrôlé et les rattache à l'amélioration des programmes de sélection des entreprises aquacoles françaises.
Objectifs
Ce projet a pour objectif le développement d’un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales en milieu contrôlé avec la bactérie pathogène des salmonidés Flavobacterium psychrophilum ainsi que le transfert d’innovation pour améliorer le contrôle de la flavobactériose pour les entreprises aquacoles françaises. Flavobacterium psychrophilum est un agent pathogène majeur des salmonidés (truites et saumons). On le retrouve aujourd’hui dans toutes les régions pratiquant la salmoniculture (Europe, Amérique, Asie du Nord-Est et Océanie). La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), principale espèce d’élevage en France, est très sensible à cette bactérie, aujourd’hui identifiée par les éleveurs comme la première source de nuisance d’origine pathologique dans les élevages. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet a comme objectif principal de développer un dispositif permettant de réaliser des infections expérimentales avec F. psychrophilum en milieu contrôlé. Ce dispositif expérimental permettra d’évaluer la résistance intrinsèque de quatre populations commerciales de truites et d’entreprendre pour 2 d’entre-elles une épreuve d’infection expérimentale à vocation de sélection pour identifier des marqueurs de résistance génétique par génotypage haut-débit. Ces expériences en milieu contrôlé sont indispensables pour contribuer à l'obtention d'un gain génétique maitrisé et permettre d'améliorer à long terme les programmes de sélection génomique sur la résistance à cette pathologie.
Bénéfices attendus
En France, la truite arc-en-ciel est la principale espèce produite. Quatre entreprises françaises ont développé des programmes de sélection et exportent du matériel génétique amélioré dans le monde entier. Ainsi, les progrès faits par les sélectionneurs français pourront potentiellement bénéficier à l’ensemble de la salmoniculture. Afin d’introduire le caractère de résistance à la flavobactériose dans les programmes de sélection des entreprises françaises, il est nécessaire de mesurer la résistance à l’infection de populations de manière maitrisée, en s’assurant notamment qu’il n’y a pas de co-infection par d’autres agents pathogènes. Ce projet s’intéresse au développement d’installations expérimentales permettant la réalisation d’épreuves infectieuses en conditions contrôlées à vocation, entre autres, de sélection génétique. Le génotypage des individus testés et celui de leurs parents donneront lieu ensuite à des analyses génétiques dans le but d’estimer l’héritabilité de la résistance à la flavobactériose, d’identifier des déterminants génétiques de la résistance et d’évaluer l’efficacité potentielle de la sélection génomique. Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments.
Procédures
Les infections expérimentales sont réalisées soit par balnéation (une balnéation par poisson) soit par injection. Dans le cas des injections, elles sont réalisées sous anesthésie (tricaïne par bain) et une seule injection par poisson est réalisé par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection (suivant le mode d'infection: 48h pour la balnéation et 24h pour l'injection) . Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations et limite l’excrétion de matières azotées lors de la balnéation durant 24h, contribuant donc à une meilleure qualité de l’eau.
Impact sur les animaux
Il est complexe de définir des points limites pour ce type d’expérimentation : le critère utilisé pour évaluer la résistance au pathogène de la population est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. La bactérie utilisée peut tuer rapidement les poissons contaminés sans qu’il soit possible de pratiquer une euthanasie entre l’apparition de signes cliniques (parfois peu évidents) et la mort. De plus, l’apparition de signes cliniques ne condamne pas forcément les poissons car certains sont capables de «récupérer». Néanmoins, des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus génétiquement liés conservés dans le noyau de sélection. L’étude des caractères génétiques impliqués dans la résistance aux maladies infectieuses chez le poisson nécessite d’établir des liens entre génotype et phénotype (ie résistance/sensibilité). Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour identifier des géniteurs portant des marqueurs de résistance, de soumettre les descendants à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance. Il n’existe aujourd'hui aucune alternative in vitro à l’évaluation de la susceptibilité des poissons à l’infection étudiée.
Réduction
Les résultats des expérimentations sont traités selon la méthodologie du BLUP (Best Linear Unbiaised Predictor) modèle animal. Cette méthodologie prend en compte les performances des individus testés pour estimer les valeurs génétiques de leurs collatéraux (les frères et sœurs des animaux soumis aux épreuves de sélection ) et permettre de les classer entre eux. Pour que ces estimations soient suffisamment précises, elles nécessitent un grand nombre de données et donc d’individus testés. Toutefois, le nombre d’animaux est réduit au seuil de la pertinence statistique et scientifique pour les approches utilisées. Les individus challengés dans ce projet seront issus d’un croisement de 100 mères et 100 pères. De ce fait, l’effectif total par croisement compte au minimum 20 individus par père, soit 2000 individus pour avoir des estimations de valeurs génétiques suffisamment précises. Ce nombre a été défini comme suffisant dans différentes études de simulations génétiques. En complément du nombre nécessaire à l’objectif de sélection génétique visé, une partie des poissons sera utilisée pour la réalisation de pré-tests (procédures 1 et 2) sur les différents lots à challenger afin d’évaluer la sensibilité des animaux et déterminer les conditions expérimentales optimales (doses, ...).
Raffinement
Une anesthésie par bain de tricaïne est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire afin de limiter le stress des poissons. Tout au long de l'expérience, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 à 4 fois par jour (distribution, ration, Indices de conversion contrôlés=Quantité d'aliment distribué/Gain de biomasse). Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées (loin des standards de la production). La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Des points limites sont definis dans ce projet pour limiter la souffrance des individus.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants issus des partenaires privés afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus. Pour l'évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (env 1 gr pour les challenges par bain et 5 à 10g pour les challenges par injection) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale.
Implication d’un récepteur à activité tyrosine kinase dans la formation du squelette craniofaciale chez le poisson zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.
Objectifs
Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.
Procédures
Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.
Impact sur les animaux
Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.
Devenir
l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure
Remplacement
Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.
Réduction
Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.
Raffinement
Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.
Choix des espèces
Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.