Poissons zèbres

Créer une lignée de poissons zèbres mutants pour un gène de la reproduction, tel est l'objet de ce projet qui utilise 1 050 poissons zèbres dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage passe par la section d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et les femelles peuvent voir leurs pontes se bloquer, ce qui conduit alors à leur mise à mort. Après deux générations, les animaux sont tués pour l'analyse de leurs ovaires, et 100 poissons hétérozygotes sont réutilisés pour maintenir la lignée. Le projet vise à vérifier si l'effet d'un microARN sur la reproduction, déjà observé chez le médaka, se retrouve chez le poisson zèbre.

Objectifs

Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans l’ovaire, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez la femelle médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins d’œufs produits et moins bien fécondés. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse du nombre d’œufs a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les femelles mutantes pondent elles aussi moins d’œufs, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les microARN sont très bien conservés au cours de l'évolution, et on considère généralement que leurs cibles le sont aussi. Pourtant, aucun modèle expérimental n'a encore démontré cette conservation évolutive des cibles de microARN, ni celle des phénotypes associés à leur régulation. Notre microARN d'intérêt ayant un impact similaire sur les phénotypes reproducteurs chez le médaka et le zebrafish, démontrer une conservation évolutive de ces phénotypes et de leurs gènes cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir de nouvelles voies pour étudier les défauts de fertilité humaine.

Procédures

Ce projet concerne la création d'une lignées mutante. Pour l'établissement de cette lignée, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisée sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthésie du poisson compris. La récolte des oeufs est faite dans l'aquarium, une fois qu'ils sont tombés dans le fond après que le mâle a fécondé les oeufs expulsés par la femelle (il n'y a donc pas manipulation directement sur l'animal pour cette récolte).

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car nos gènes d’intérêts sont principalement exprimés dans les gamètes. Le gène sera modifié pour empêcher la fixation de son inhibiteur dessus et donc empêcher sa régulation. Nous nous attendons principalement à une réduction du nombre d’œufs pondus. Cependant, chez le médaka, il peut arriver un blocage des pontes lorsque les poissons sont mis en couple (arrêt des pontes par la femelle), caractérisé par une absence d’œufs dans le bassin et un gonflement anormal du ventre de la femelle. Si cet événement venait à se produire chez le zébrafish, un autre male serait d’abord ajouté en première instance, afin de stimuler la femelle. Et si cela ne débloque pas la femelle, et que des modifications de la nage ou de comportement alimentaire venant à apparaitre, une euthanasie sera effectuée. Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. Les anesthésies pratiquées pour les prélèvements (fragment de nageoire) peuvent entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 100 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet à venir ensuite).

Remplacement

L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre miR‑202 et le gène tead3b sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule sans recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour miR‑202, et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.

Réduction

In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur 6x4 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en F2) et 6x4 individus de génotype sauvage (WT), soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus F0 porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en F1 lorsque les F0 sont croisés avec des animaux WT. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la génération F1 produira une génération F2 homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de la génération F2). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse de l’ovaire des 48 animaux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Son ovaire est accessible à l'analyse histologique et transcriptomique Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 mois âge de maturité et 6 mois), l’analyse moléculaire, transcriptomique et histologique des ovaires permettant une étude a deux stades de maturité de développement de l’organe.

Sectionnés d'un fragment de nageoire caudale pour le génotypage puis soumis à un prélèvement de sperme, 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. La lignée mutante créée sert à vérifier si l'inactivation d'un site de fixation d'un microARN réduit la fertilité, comme observé chez le médaka. La plupart sont tués après deux générations pour l'analyse des organes, 75 individus hétérozygotes étant réutilisés pour entretenir la lignée dans un autre projet. Le porteur reconnaît qu'une lignée déjà présente au laboratoire, où ce microARN est désactivé, ne montre aucun effet délétère, ce qui interroge l'ampleur des atteintes attendues ici.

Objectifs

Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans les testicules, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez le male médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins de spermatozoïdes et moins fécondant. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse de la capacité de reproduction du male a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les males mutants ont aussi une baisse la qualité et de la quantité spermatique, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les miARN, dont celui de l'étude, sont très bien conservés au cours de l’évolution, et il est généralement admis que leurs cibles le sont également. Pourtant, à ce jour, aucun modèle expérimental n’a permis de démontrer clairement une conservation évolutive des cibles de ces microARN, ni une conservation des phénotypes associés à la régulation d’un miARN sur un gène cible. Dans notre cas, le miARN travaillé, chez le médaka et le zebrafish, un impact similaire sur les phénotypes de reproduction, la mise en évidence d’une conservation évolutive des phénotypes et de leurs cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’étude des défauts de fertilité humaine.

Procédures

Ce projet concerne la création d'une lignée mutante. Pour valider une lignée mutante un génotypage par fin clip (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Cette procédure est très rapide : moins de 2 minutes par animal, anesthésie et récupération incluses. Les animaux de première génération seront isolés jusqu’à 8 jours maximum, le temps de recevoir les résultats de séquençage du prestataire. Afin d'identifier les poissons, ceux-ci resteront dans des bacs individuels à paroi transparente, permettant un contact visuel avec leurs congénères. Les animaux mutants et sauvages de troisième génération subiront un prélèvement de sperme sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car ce microARN est surtout exprimé dans les gonades. Le gène cible sera modifié pour empêcher la fixation du microARN et donc sa régulation. Nous anticipons principalement une diminution de la fertilité. Dans une lignée déjà présente au laboratoire où le microARN est désactivé, aucun phénotype délétère n’a été observé, nous ne nous attendons donc pas à des effets graves. Cependant, chez le médaka, un blocage des pontes peut survenir (arrêt de ponte par manque de stimulation mâle), caractérisé par l’absence d’œufs et un gonflement abdominal de la femelle, d’où un suivi spécifique des femelles zébrafish. Le génotypage est invasif (petit fragment de nageoire) mais réalisé sous anesthésie pour minimiser les nuisances, pouvant causer une réduction temporaire de l’activité locomotrice. La récolte de sperme est bien maîtrisée et n’entraîne pas d’inconfort notable. Les anesthésies pour prélèvements peuvent modifier temporairement le comportement alimentaire le jour même.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 75 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet).

Remplacement

L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre un micro ARN et un gène sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour le microARN et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.

Réduction

In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur au moins 12 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en 2ème génération) et au moins 12 individus de génotype sauvage (non mutés) soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus fondateurs porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en 1ère génération lorsque les individus fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype sauvage. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la 1ère génération produira une 2ème génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de cette 2ème génération ). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse des testis d’au moins 24 animaux.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau,densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Le génotypage ainsi que la récolte de sperme se feront sous anesthésie. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Le testicule est accessible à l'analyse histologique et l’analyse de l’expression des gènes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, les testicules permettant une étude au stade de maturité de développement de l’organe.

Tués à douze mois pour éviter, selon le porteur, l'apparition de signes de vieillissement, 7 200 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir des lignées où douze gènes liés à l'habituation sont remplacés par une protéine fluorescente. Aucune intervention n'est déclarée sur les poissons de plus de cinq jours, la surveillance se limitant à cinq jours sur sept, avec pour points limites la scoliose, une nage anormale ou des femelles remplies d'œufs. Le tri des embryons de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire, réduit selon lui le nombre d'individus élevés, sans que le RNT indique combien sont écartés à ce stade.

Objectifs

Chez les patients atteints de schizophrénie ou d'autisme, le processus d'habituation, un type de mémoire, est impacté. Nous avons reproduit ce mécanisme d'habituation chez le poisson zèbre. Quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, le poisson zèbre réagit en changeant de direction. Lorsqu'il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant l’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes ciblés seront remplacés par de la fluorescence ce qui nous permettra d'étudier les effets des protéines invalidées sur l'habituation en évitant le génotypage par prélèvement de la nageoire.

Bénéfices attendus

Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'homme nous montrent l'importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines, d'étudier leur rôle tout en évitant un génotypage par biopsie de la nageoire caudale.

Procédures

Aucune intervention ne sera réalisée sur les poissons âgès de plus de 5 jours.

Impact sur les animaux

Lors de la génération et l'élevage des individus mutant, aucun effet indésirable n'est attendu considérant nos résultats précédents avec des lignées similaires mais non fluorescentes. Toutefois, la création de ces lignées avec insertion d'une protéine fluorescente à la place du gène n'étant pas un simple knock-out, une surveillance 5 jours sur 7 sera réalisée par du personnel qualifié et l'expérimentateur avec pour points limites l’observation d’anomalies physiques du poisson (couleur de la peau anormale, hyperventilation, déformation morphologique du poisson, scoliose, siphose, blessure, femelles remplies d'oeufs), d’anomalies de son comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité), prostration au fond du bac à l'abri de la lumière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l'apparition de signes de vieillissement et donc d'impacter le bien-être des animaux.

Remplacement

L'étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique obligatoirement l'utilisation de modèles animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre les adaptions du cerveau des vertébrés face à des stimuli extérieurs. De plus, le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités avec celui de l'Homme.

Réduction

Afin de minimiser le nombre de poissons à élever, un tri des embryons âgés de moins de 5 jours et présentant une fluorescence appropriée sera réalisé (non soumis à une DAP). Ceci permettra de réduire drastiquement le nombre d'individus élevés et de garder après 5 jours de développement uniquement les poissons pour le maintien de la lignée et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement. Pour le maintien des lignées, nous faisons une nouvelle génération tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Pour surveiller le bien-être animal, nous observerons les poissons qui seront utilisés ensuite pour créer les générations suivantes.

Raffinement

Les poissons-zèbres générés et conservés devraient tous être sans phénotype dommageable d'après notre expérience précédente. Tous les individus sont regroupés dans des bacs de 3.5l pour être au minimum 8 par bac et au maximum 20 par bac. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.

Choix des espèces

Les gènes de l'Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fertilisation externe, avec des pontes de plus de 100 oeufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d'autres modèles tels que la souris et ainsi obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux, ce qui nous permettra de relier les événements dans les neurones avec le comportement d'apprentissage de l'animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettrons de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement (hors cadre). Ainsi, ces reproducteurs seront gardés jusqu'à 12 mois; avant l'apparition de signes de vieillesse.

Les poissons zèbres utilisés portent une modification génétique qui rend fluorescent un gène du métabolisme intestinal, ce qui permet de lire à l'œil ce qu'une substance fait dans leur intestin. 700 d'entre eux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des perturbateurs endocriniens entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent ensuite cinq séances d'imagerie sans anesthésie jusqu'à l'âge de trois mois, chacune d'une dizaine de secondes. Ils sont tués pour prélever leurs intestins et mesurer l'expression du gène, et le porteur présente la lignée transgénique comme un moyen de réduire le nombre de poissons employés dans les tests réglementaires.

Objectifs

Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.

Bénéfices attendus

L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.

Procédures

Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.

Remplacement

L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.

Réduction

L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).

Raffinement

Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.

Sortis de l'eau à l'épuisette puis amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, 36 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet veut établir si une analgésie doit compléter l'anesthésie lors de ce prélèvement de génotypage, ce qui suppose qu'un tiers des poissons le subisse sans analgésique. Après l'acte, ils passent moins de vingt-quatre heures seuls dans un bac sans circulation d'eau ni nourriture, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress, et leur locomotion est filmée dix minutes. Ils sont ensuite gardés vivants et réutilisés pour la reproduction, puis tués au bout de dix-huit mois.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN en faisant un prélèvement. Ce geste consiste à faire une biopsie de petite taille de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. L’objectif de ce projet sera de statuer sur la nécessité de mettre en place une analgésie péri-opératoire en plus de l’anesthésie générale lors de ce prélèvement. Ceci sera appuyé par une étude comportementale et une évaluation du bien-être des poissons à l’aide d’une grille de score en post-intervention sur la période de récupération. Une recommandation pourra alors être rédigée à l’issue de cette étude.

Bénéfices attendus

Le prélèvement de nageoire est une pratique très courante et est aujourd’hui la méthode de référence pour connaître le patrimoine génétique d’un poisson zèbre. Cette étude permettra d’apporter à la communauté scientifique les connaissances aujourd’hui manquantes de l’intérêt ou non de l’utilisation d’un analgésique lors d’un prélèvement de nageoire caudale chez le poisson zèbre. Ce projet pourrait permettre de partager par le biais d’une publication scientifique un protocole de prélèvement chez le poisson zèbre qui réponde aux exigences réglementaires, environnementales, de bien-être animal tout en étant prouvé dans sa mise en œuvre grâce à ce travail pour l’expérimentateur.

Procédures

Suivant le groupe auquel appartient l’animal, il est soumis ou non à un analgésique durant 30 minutes avant et après le prélèvement. Ce prélèvement est effectué sous anesthésie générale et ce une seule fois par animal. L’étude comportementale effectuée nous permet d’évaluer la locomotion du poisson ainsi que l’utilisation de la colonne d’eau durant 10 minutes. Au bout de 18 mois, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les poissons sont sortis de l'eau avec une épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Un prélèvement cutané de petite taille est fait au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme pouvant générer un inconfort et une gêne de courte durée pour l’animal. Le risque lié à l’anesthésie, comme l’arrêt respiratoire, est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Après le prélèvement, les aquariums ne sont pas remis en circulation et les poissons ne sont pas alimentés et ce durant moins de 24 heures. Restant seuls durant ce laps de temps, ils peuvent montrer des signes de stress.

Devenir

A l’issue de la procédure les poissons sont gardés en vie pour une éventuelle réutilisation comme de la reproduction.

Remplacement

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes semblables aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il présente l’avantage d’être facile à élever et d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. De plus, il est possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. Ainsi, inutile de procéder à une dissection ou à des méthodes invasives destinées à observer des effets dans le corps du poisson. Son élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques. Il nous faut donc connaître leur patrimoine génétique. Notre objectif portant sur la méthode de prélèvement pour connaître le patrimoine génétique des poissons et sur la prise en charge de la douleur associée, il n’est pas possible d’envisager un remplacement.

Réduction

Pour cette étude notre effectif a été défini à l’aide d’un test statistique. Nous testons un anesthésique avec ou sans 2 analgésiques, ce qui donne 3 groupes. 12 animaux sont testés par groupe, c’est pourquoi nous utilisons 36 animaux au total. Nous étudions la locomotion et l’occupation de la colonne d’eau grâce à des vidéos ainsi que la cicatrisation de la nageoire caudale grâce à des photos. Chaque expérience est faite une seule fois par poisson. Les résultats sont analysés avec un test statistique.

Raffinement

Les poissons sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les poissons sont mis à jeun le matin de l’expérience afin de préserver la qualité de l’eau. Durant l’expérience, ils sont transférés délicatement à l’aide d’une épuisette entre chaque bac. Ils sont mis en acclimatation individuellement afin de limiter leur stress. Pour les groupes traités, on ajoute au goutte à goutte de l’analgésique de la manière la plus homogène possible sur la totalité de la surface de l’aquarium pour permettre au poisson de s’habituer. Le bain contenant l’anesthésiant est tamponné pour limiter le comportement anxiogène du poisson. Ce dernier est sorti de l’eau à l’aide d’une cuillère en plastique percée atraumatique et déposé sur une surface plane en plastique afin de réaliser le prélèvement. La taille de celui-ci est réduite au maximum. Tout au long de l’expérience des vidéos sont réalisées pour observer le poisson sans le perturber et minimiser son stress. Le poisson reste moins de 24 heures dans le bain sans circulation d’eau ni nourrissage sur une étagère sans lumière directe. Un suivi est effectué avec une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Cela nous permet d’attribuer un score et de mener les actions nécessaires afin de réduire le stress ou la douleur après prélèvement. Suivant le score attribué au poisson, il sera euthanasié. Nous formons à la suite de l’isolement des couples mâle – femelle qui vont nous permettre d’identifier chaque individu et de poursuivre le suivi. Ces couples sont transférés dans des aquariums puis remis en circulation.

Choix des espèces

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui se rapproche le plus possible du génome humain. Le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes semblables aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en fait un très bon candidat. Il présente l’avantage d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. Il est également possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. L’élevage et le maintien de lignées mutées sont donc indispensables pour de nombreux projets scientifiques. L’objectif de notre projet étant de récolter des données pour la mise en place de meilleures conditions de prise en charge lors de la réalisation du prélèvement, il est donc pertinent de travailler directement sur cette espèce. Les animaux seront prélevés entre 3 et 6 mois de vie. Cet âge assure une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes et assure une meilleure récupération. Cela permet aussi d’avoir un pourcentage de prélèvement de tissu suffisamment faible par rapport à la taille totale du poisson.