Poissons zèbres

Former des étudiants de master aux métiers de l'environnement : 210 poissons zèbres vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue, y compris les individus témoins. Chaque année, 36 poissons sont exposés au mercure inorganique pendant sept, quatorze ou vingt et un jours, et dix-huit d'entre eux restent ensuite seuls dans leur aquarium pendant une semaine. La mise à mort est réalisée par l'enseignant, par balnéation dans la benzocaïne, et figure parmi les gestes que les étudiants doivent apprendre à décrire. Le porteur juge ces travaux pratiques "indispensables" parce que les étudiants iront travailler dans des cabinets d'études chargés de pratiquer des expérimentations animales de toxicologie.

Objectifs

Ce projet de formation s’inscrit dans le cadre du programme de Master de Biologie de notre université qui forme des étudiants aux métiers de l’Environnement dans le domaine professionnel des laboratoires, des institutions et des entreprises (suivi de la qualité des milieux, dépollution, recherche en écotoxicologie, etc.). Au cours de la 1ère année du Master, les étudiants suivent des enseignements théoriques, dirigés et pratiques leur permettant de comprendre les phénomènes de pollution et leurs répercussions sur les organismes vivant dans les milieux aquatiques et terrestres. Les travaux pratiques (TP) sont proposés afin de leur montrer de manière très appliquée comment concevoir et mettre en place une expérimentation mimant un problème de contamination dans un milieu aquatique et donc un problème d'altération de sa qualité de l'eau, puis d'utiliser les résultats d’analyse issus de l’expérimentation pour évaluer et mieux comprendre les mécanismes de contamination. Au cours de cette expérimentation, les étudiants suivront la contamination d’unités expérimentales (aquariums) contenant différents types d’organismes aquatiques appartenant à des espèces se situant à des niveaux différents de la chaine alimentaire : végétaux (plantes aquatiques flottantes et enracinées : lentilles d’eau, élodées) et animaux (bivalves : palourdes asiatiques Corbicula fluminea) et poissons zèbre : Danio rerio). La multiplicité des espèces testées permettra aux étudiants de différencier les réponses des espèces face à une contamination de l’eau. Elle permettra aussi aux poissons de se retrouver avec des espèces végétales et animales dans un environnement enrichi, où les conditions artificielles tendront à se rapprocher de conditions plus naturelles. La prise en compte de la température dans cette expérience fait aussi écho au problème de réchauffement climatique, et visera à les sensibiliser aux multiples effets de ce phénomène global sur la qualité de milieux notamment déjà pollués. A l’issue de l’expérience, les étudiants compareront les niveaux de contamination des différentes espèces et auront pris conscience de la nécessité absolue de veiller au bien-être des animaux en expérimentation.

Bénéfices attendus

Au cours de ce TP les étudiants sont sensibilisés et formés à la démarche scientifique et à l’éthique de l’expérimentation animale. L’objectif de ce TP est en effet d’apprendre aux étudiants à concevoir, planifier, mettre en place et suivre une expérimentation avec des animaux : mise en place des aquariums (sédiment, bulleurs, résistances chauffantes…), techniques de manipulation des animaux, suivi de la qualité de l’eau (étalonnage et utilisation de sondes oxygène et pH), suivi du bien-être des organismes (observation et suivi du comportement des organismes, points limites, aliment), suivi de l’exposition (ajout compensé de mercure), description des méthodes de mise à mort réglementaires (mise à mort réalisée par l’enseignant compétent), recueil d’échantillons, élaboration de graphiques et analyse statistique des résultats. En plus d’être formés à la manipulation, au maintien et au suivi du bien-être des poissons, les étudiants acquièrent ainsi les bases pour concevoir et mener à bien, et dans le respect de l’éthique animale (Règle de 3 R), une expérimentation avec des organismes vivants. A l'issue de leurs études supérieures, les étudiants aborderont leur activité professionnelle avec une formation et une expérience préalable à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Procédures

Chaque année, les poissons seront exposés à un contaminant : pendant 7 jours pour 12 poissons ; 14 jours pour 12 poissons supplémentaires et 21 jours pour 12 poissons également. Ces 12 poissons exposés au contaminant jusqu'à 21 jours, auxquels s'ajoutent 6 poissons contrôle, resteront seuls dans leur aquarium respectif pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Vie en milieu contraint, variation de température, exposition au mercure inorganique. Les données expérimentales montrent que le Danio peut vivre dans une gamme de température allant de 6,7 à 41,7°C. In situ, les poissons zèbres sont retrouvés dans des eaux dont la température s’échelonne entre 16,5 et 33°C. A priori une température d’hébergement entre 20°C et 26°C n’induit pas de stress chez le poisson zèbre, en particulier au stade adulte. Concernant l’exposition au mercure, et comme précisé dans le déroulé du projet, la concentration maximale testée (30 μg/L) est inférieure à la LC50 -96h (140 μg de mercure inorganique/L), les concentrations analysées dans l'eau de rivières étant proches de 10 μg/L dans des milieux pollués. Ce travail pratique est effectué depuis plus de 20 ans et aucun signe clinique lié à l’exposition au mercure n’a jamais été observé. Cependant, durant toute la durée de présence des poissons dans le laboratoire (de leur arrivée à la fin de l’expérience), des observations seront faites quotidiennement par les personnes qualifiées et compétentes (conformément à l’article 33). Elles seront attentives à des modifications comportementales (nage anormale, individu stationnaire, individu isolé, déplacement à la surface de l’eau, position anormale dans la colonne d’eau, hyperventilation, baisse de la prise de nourriture.

Devenir

Les poissons en mauvaise santé ainsi que tous les individus ayant suivi la procédure expérimentale seront euthanasiés.

Remplacement

Ces Travaux pratiques s’avèrent indispensables pour les étudiants afin de comprendre les méthodes qu’ils utiliseront dans leur carrière professionnelle. Un tel projet ne peut s'effectuer sur des modèles in vitro. Ces étudiants se destinent aux métiers de l'environnement (pratique d'élevage, échantillonnage de tissus, dosage, comparaison lots témoins/expérimentaux) notamment dans des cabinets d’études chargés de pratiquer des expérimentations animales de toxicologie. Le poisson Danio étant un modèle expérimental classiquement utilisé en recherche et en toxicologie, son utilisation par les étudiants en travaux pratiques s’avère être un prérequis qui leur sera indispensable pour leur futur professionnel. A l'issue de leurs études supérieures, ils aborderont leur activité professionnelle avec une expérience préalable de la manipulation des poissons en ayant déjà pris conscience de la nécessité absolue de veiller à leur bien-être.

Réduction

Le nombre de poissons a été optimisé afin de mettre à mort le moins d’organismes possibles tout en permettant une analyse statistique des résultats. Ce nombre de poissons nécessaires (3 poissons/aquarium) a été soigneusement évalué pour les analyses chimiques de bioaccumulation en se basant sur des tests préalables réalisés au cours d’expérimentations antérieures du laboratoire. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi réduit au seuil de pertinence statistique. Ainsi un total de 54 poissons/an (dont 42 poissons faisant l'objet d'une procédure) pour les 18 aquariums et pour toute la durée de l’expérimentation seront nécessaires (soit 210 poissons dans cette demande de saisine pour toute la durée du projet de 5 ans).

Raffinement

Des conditions optimisées au maximum seront offertes aux poissons pendant leur accueil au laboratoire et en expérimentation: faible densité (

Choix des espèces

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est une espèce modèle très utilisée en recherche et notamment en écotoxicologie. Les étudiants seront très probablement amenés à l’étudier dans des conditions similaires dans leur vie professionnelle. Ce poisson supporte très bien la stabulation en laboratoire, particulièrement à l’âge adulte. Il mesure à l’âge adulte entre 2 et 3 cm, sa durée de vie est relativement courte (3 ans). Sa taille permet de le prélever au cours de l’expérimentation sans perturber l’écosystème simplifié que représente l’aquarium avec les autres espèces et le fond sablo-vaseux. En expérimentation, il supporte très bien l’environnement de l’unité expérimentale (aquarium) d’un volume de 10 L d’eau douce, à raison de 3 poissons par unité expérimentale. Rappelons ici que notre étude ne concerne pas une exposition à un polluant par une toxicité aigüe entraînant la mort de l’animal mais à une toxicité chronique à doses modérées. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est une espèce modèle très utilisée en recherche et notamment en écotoxicologie. Les étudiants seront très probablement amenés à l’étudier dans des conditions similaires dans leur vie professionnelle. Ce poisson supporte très bien la stabulation en laboratoire, particulièrement à l’âge adulte. Il mesure à l’âge adulte entre 2 et 3 cm, sa durée de vie est relativement courte (3 ans). Sa taille permet de le prélever au cours de l’expérimentation sans perturber l’écosystème simplifié que représente l’aquarium avec les autres espèces et le fond sablo-vaseux. En expérimentation, il supporte très bien l’environnement de l’unité expérimentale (aquarium) d’un volume de 10 L d’eau douce, à raison de 3 poissons par unité expérimentale. Rappelons ici que notre étude ne concerne pas une exposition à un polluant par une toxicité aigüe entraînant la mort de l’animal mais à une toxicité chronique à doses modérées.

Gardés comme reproducteurs puis tués au bout de dix-huit mois, 12 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit, une fois, sous anesthésie générale, le prélèvement d'un fragment de moins de 2 mm2 de sa nageoire caudale destiné au génotypage, la moitié des poissons recevant en plus un analgésique une demi-heure avant et après, l'autre moitié servant de comparaison sans analgésie. Après l'intervention, ils passent dix minutes en test de locomotion, puis restent moins de vingt-quatre heures seuls, sans alimentation et dans un aquarium coupé de la circulation d'eau. Le porteur reconnaît que l'interaction entre les deux anesthésiques employés n'est pas documentée et que des effets indésirables peuvent survenir, et justifie la mise à mort à dix-huit mois par le risque sanitaire et les anomalies du vieillissement.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 2 mm2 de la nageoire des poissons. L’objectif de ce projet est de statuer sur la nécessité de mettre en place une analgésie péri-opératoire en plus de l’anesthésie générale lors de ce prélèvement. Nous vérifierons également que l’analgesiant utilisé n’entraine pas d’effet secondaire néfastes pour les poissons car elle contient des conservateurs. L’étude s’appuie sur un test comportemental et une évaluation du bien-être des poissons à l’aide d’une grille de score en post-intervention sur la période de récupération.

Bénéfices attendus

Le génotypage par prélèvement de nageoire est une pratique très courante et est aujourd’hui la méthode de référence pour connaitre le patrimoine génétique d’un poisson zèbre. Cette étude permettra d’apporter à la communauté scientifique les connaissances aujourd’hui manquantes de l’intérêt ou non de l’utilisation d’un analgésique lors d’un prélèvement de nageoire caudale inférieur à 2 mm2 chez le poisson zèbre. Ce projet pourrait permettre de partager par le biais d’une publication scientifique un protocole de génotypage chez le poisson zèbre qui réponde aux exigences réglementaires, environnementales, de bien-être animal tout en étant éprouvé dans sa mise en œuvre grâce à ce travail pour l’expérimentateur.

Procédures

Suivant le groupe auquel appartient l’animal, il est soumis ou non à un analgésique durant 30 minutes avant et après le prélèvement. Ce prélèvement est effectué sous anesthésie générale et ce une seule fois par animal. Le test comportemental effectué nous permet d’évaluer la locomotion du poisson ainsi que l’utilisation de la colonne d’eau durant 10 minutes. Au bout de 18 mois, les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les poissons sont pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 2 mm2 est faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme pouvant générer un inconfort et une gêne de courte durée pour l’animal. Le risque lié à l’anesthésie, comme l’arrêt respiratoire, est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue (environ 2-3 minutes). Après le prélèvement de nageoire pour génotypage, les aquariums ne sont pas remis en circulation et les poissons ne sont pas alimentés et ce durant moins de 24h. Restant seuls durant ce laps de temps, ils peuvent montrer des signes de stress. Les dommages causés par une intéraction entre la lidocaine et la benzocaine n'étant pas documentés, des effets indésirables peuvent survenir.

Devenir

Les poissons étant utilisé pour l’élevage, ils seront mis à mort au bout de 18 mois afin de limiter le risque sanitaire et le développement d’anomalies liées au vieillissement.

Remplacement

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 % de gènes similaires aux gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Son élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.

Raffinement

Les poissons sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les biopies sont réalisées sur animaux anesthésiés. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont définis.

Choix des espèces

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui se rapproche le plus possible du génome humain. Le poisson zèbre possède 71 % de gènes similaires aux gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en fait un très bon candidat. Il présente l’avantage d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. Il est également possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. L’élevage et le maintien de lignées transgéniques (nécessitant une biopsie) sont donc indispensables pour de nombreux projets scientifiques. L’objectif de notre projet étant de récolter des données pour la mise en place de meilleures conditions de prise en charge lors de la réalisation d'un biopsie il est donc pertinent de travailler directement sur cette espèce. Les animaux seront prélevés entre 3 et 6 mois de vie. Cet âge assure une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes et assure une meilleure récupération. Cela permet aussi d’avoir un pourcentage de prélèvement de tissu suffisamment faible par rapport à la taille totale du poisson.

Modifiés génétiquement, mais sans phénotype dommageable déclaré, des poissons zèbres sont triés pour constituer des groupes reproducteurs. 18 000 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit, sous anesthésie et analgésie, le prélèvement de 10 % de sa nageoire caudale, geste qui lèse des terminaisons nerveuses et dont le porteur attend un retour à une nage normale en cinq minutes. 16 200 poissons resteront en vie comme reproducteurs et 1 800 seront tués faute de porter les caractéristiques génétiques recherchées, leurs embryons étant ensuite étudiés avant cinq jours de développement, stade auquel la réglementation sur l'expérimentation animale ne s'applique pas.

Objectifs

Ce projet vise à identifier certains poissons zèbre porteurs de caractéristiques génétiques spécifiques, sans qu’ils présentent de phénotypes dommageables. L’objectif est de former des groupes de poissons reproducteurs, capables de produire régulièrement des embryons, en fonction des besoins des chercheurs. Les études porteront ensuite sur les toutes premières étapes du développement des embryons (avant 5 jours). À ce stade, la loi ne considère pas ces recherches comme de l’expérimentation animale. Pour maintenir les lignées de poissons utiles à ces recherches, il est indispensable de prélever fragment de leur nageoire caudale, qui nous permettra de repérer les animaux d’intérêts.

Bénéfices attendus

Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d’optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement altérés qui seront utilisées comme reproducteurs pour la production d’embryons dont l’étude (réalisée avant 5 jours de développement) ne relève pas de la législation de l’expérimentation animale. La méthode de génotypage utilisée dans la présente procédure présente deux bénéfices majeurs : Premièrement elle est parfaitement fiable, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux et le nombre de manipulations de ceux-ci. Deuxièmement, elle est sans incidence sur le bien-être de l’animal, celui-ci reprenant un comportement de nage parfaitement normal dès les premières minutes suivant le réveil d’anesthésie.

Procédures

Un prélèvement par animal de 10% (~2 mm2) de la nageoire caudale sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié. L’ensemble de la procédure de prélèvement dure environ 5 minutes (2 min endormissement, 1 min prélèvement, 2 min réveil) et 5 minutes après le réveil les animaux présentent à nouveau un comportement de nage normal.

Impact sur les animaux

La biopsie entraîne la lésion de terminaisons nerveuses au niveau de la nageoire caudale. Les poissons ayant subi un prélèvement de nageoire doivent se réveiller rapidement (2 minutes) après la sortie de l’anesthésie et reprendre un comportement de nage normal au bout de 5 minutes. Dans le cas (extrêmement rare) d’un individu pour lequel la surveillance post-prélèvement indique un problème de réveil ou des altérations de la nage qui perdurent plus que 15 minutes, l’animal sera mis à mort par surdose d’anesthésique.

Devenir

Animaux gardés en vie pour l'utilisation continue en tant que reproducteurs (16200). Les animaux présentant des caractéristiques génétiques sans intérêt pour le travail expérimental ou le maintien des lignées seront mis à mort (1800).

Remplacement

Une alternative au génotypage par biopsie de nageoire adulte est le prélèvement de fragments de nageoire sur embryons. Celui-ci est réalisé entre 3 et 5 jours de développement et ne relève donc pas de la législation sur l’expérimentation animale. Cette approche de remplacement sera utilisée tant que possible, mais son utilisation reste limitée au vu de la petite quantité de matériel biologique et du temps limité (moins de 48h) disponible pour l’analyse.

Réduction

Les identifications seront adaptés et réduit aux mieux afin de répondre aux stricts besoins des projets de recherche sans surproduction. La procédure réalisée devra permettre l’identification de populations d’adultes reproducteurs permettant de i) répondre au besoin grégaire des animaux, ii) être sûr que chaque population compte aussi bien des mâles que des femelles, iii) avoir un nombre de reproducteurs suffisant pour la réalisation des expériences tout en permettant d’assurer des périodes de repos régulières aux reproducteurs.

Raffinement

Plusieurs mesures seront prises pour minimiser l’impact du prélèvement sur le bien-être des animaux : i) Les prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés, afin d’éviter tout stress associé à la manipulation. ii) L’anesthésie sera de courte durée pour assurer un réveil rapide (

Choix des espèces

Plus de 80% des gènes associés à des pathologies humaines sont retrouvés chez le poisson zèbre. Son utilisation est pertinente pour deux raisons : Premièrement, la transparence de ses embryons, qui permet par exemple de visualiser des altérations du système cardiovasculaire sur l’animal vivant. Cette transparence permet de réaliser des études sur un organisme vertébré proche de l’homme sans que celles-ci relèvent de la législation sur l’expérimentation animale tant qu’elles sont réalisées au cours des 5 premiers jours de développement. La fécondation du poisson zèbre a lieu de manière externe ce qui veut dire que les embryons peuvent être produits par simple accouplement naturel d’adultes reproducteurs dont l’identification est l’objet de la présente demande. Le second avantage du poisson zèbre est la possibilité de réaliser des études génétiques. Ces études nécessitent de réaliser des prélèvements de fragments de nageoire sur animal adulte (>3 mois) pour d’identifier les animaux d’intérêt. Les animaux seront génotypés à l’état adulte (>3 mois) vu que i) l’objectif de la procédure est d’identifier des adultes reproducteurs et que ii) la nageoire adulte est suffisamment grande pour pouvoir effectuer un prélèvement qui est à la fois suffisant pour le génotypage est assez petit pour être sans incidence sur le bien-être du poisson.

Isolement d'une nuit, anesthésie générale de deux à trois minutes, une minute hors de l'eau, prélèvement de un à deux microlitres de sperme jusqu'à trois fois par individu à une semaine d'intervalle : 7 650 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le champ structuré les déclare tous réutilisés, et le porteur ajoute que les animaux dont les lignées ne seront pas maintenues en élevage sont tués par surdose d'anesthésique. L'objectif est de constituer une banque de sperme pour sécuriser des lignées génétiques uniques créées par les équipes et indisponibles dans le commerce, ce que le porteur présente aussi comme un moyen de réduire le nombre de poissons surnuméraires. L'isolement d'une nuit est reconnu comme anxiogène chez une espèce qui vit en groupe, et rien n'est précisé sur la répartition entre mâles et femelles parmi les 7 650 individus, ni sur le nombre de lignées abandonnées.

Objectifs

Les équipes de recherche des instituts utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez le poisson zèbre, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations de cryoconservation et de fécondation in vitro des lignées génétiques impliquées vise à préserver des modèles uniques créés par les équipes de recherches et indisponibles dans le commerce.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à constituer une banque de sperme de poisson zèbre permettant de sécuriser les lignées uniques développées par les chercheurs utilisant l'animalerie. Cela permettra à la fois de diminuer le nombre d'animaux surnuméraires générés en maintenant des lignées non utilisées en procédures expérimentales mais aussi de limiter les dérives génétiques résultant de croisement à répétition en repartant sur un stock de sperme congélé en utilisant la technique de fécondation in vitro.

Procédures

Un prélèvement de sperme (1-2 µl) sera réalisé une fois par individu. Dans le cas où le nombre soit insuffisant, jusqu'à 3 prélèvements de sperme pourront être réalisés par individu en respectant un délais d'une semaine entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La récolte des oeufs sera réalisé une fois par individu.

Impact sur les animaux

Les mâles sont hébergés en situation d'isolement pendant une nuit avant le prélèvement de sperme pour éviter les stimulations avec les autres congénères. L'isolement peut générer de l'anxiété, le poisson étant un animal vivant en groupes sociaux. L'anesthésie générale (environ 2-3minutes) et le temps passé en dehors de l'eau (environ 1minute), nécessaires pour réaliser le prélèvement peut également induire un stress pour l'animal.

Devenir

Les animaux pour lesquels les lignées ne seront pas maintenues en elevage seront mis à mort par surdosage anesthésique.

Remplacement

Il n'y a pas de remplacement possible, la cryoconservation est la seule méthode possible pour garantir le stockage à long terme de lignées uniques. Elle sera limitée aux lignées originales pour lesquels ces lignées ne sont pas disponibles auprés d'un centre de ressouces

Réduction

Le nombre d'animaux a été évalué pour garantir la bonne réalisation de la cryoconservation. La procédure permettra de réduire le nombre d'animaux en élevage.

Raffinement

Les poissons sont élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7,5 avec des cycles jour/nuit de 14h/10h. Nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante (artémias) et à maintenir un enrichissement social. Lors des prélèvements, les bacs d'anesthésie et de reveil seront maintenus à 28°C par l'utilisation de tapis chauffant. Une anesthésie générale sera réalisée. Des points limites strictes et spécifiques seront appliqués.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude des maladies génétiques. Le poisson zèbre présente de nombreuses similitudes avec l’Homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires. Les poissons seront utilisés à partir de 3 mois. Il est necessaire que les poissons aient atteint la maturité sexuelle et qu'ils soient en capacité de se reproduire.

5 260 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les mâles sont anesthésiés pour qu'on aspire leur sperme à la papille génitale, jusqu'à trois fois chacun, les femelles pour qu'une pression sur l'abdomen libère une centaine d'œufs, une fois par mois pendant six mois. L'opération consiste à congeler des lignées qui ne sont plus activement utilisées, puis à réduire les effectifs vivants : les poissons de la première procédure sont tués à l'issue, seuls les individus témoins étant gardés vivants. Le porteur classe ce tri parmi les gains pour le bien-être des animaux non-humains, au motif qu'il libère de l'espace d'hébergement pour ceux qui restent.

Objectifs

Au cours des dix dernières années, l'utilisation du poisson zèbre en tant qu'organisme modèle a considérablement augmenté. Avec plus de 20 000 lignées mutantes, transgéniques et de type sauvage, le poisson-zèbre est devenu le deuxième en Europe. Cependant, il est encore possible d'améliorer la maintenance de la lignée et le processus de reproduction en appliquant la cryoconservation. L’objectif de ce projet est d’assurer la conservation de lignées de poissons-zèbres qui représentent un grand intérêt pour la recherche ou qui ne sont plus activement utilisées et ce de façon indéfinie, par cryoconservation.

Bénéfices attendus

La mise en place de cette technique permet de rationaliser considérablement l'espace d’hébergement disponible et les ressources nécessaires aux soins zootechniques, permettant une meilleure gestion des lignées utilisées activement pour la recherche et une meilleure gestion du bien-être animal. Cela permet également d’assurer la pérennité des lignées dans le temps en prévenant les problèmes de reproduction, l’apparition de mutations indésirables liées à la dérive génétique, réduit les contaminations microbiennes et libère de l’espace pour les animaux présents dans les structures contribuant ainsi à améliorer le bien-être animal. Enfin, elle facilite le partage au sein de la communauté scientifique grâce à une revitalisation rapide par fécondation in vitro ne nécessitant pas de quarantaine.

Procédures

Concernant les mâles, le sperme sera collecté sous anesthésie manuellement par aspiration au niveau de la papille génitale au maximum 3 fois par individu. Chez les femelles, les prélèvements d’ovocytes seront réalisés sous anesthésie, par légère pression abdominale. Environ une centaine d’œufs sera prélevée une fois par mois, pendant une durée de six mois.

Impact sur les animaux

Le prélèvement des gamètes, bien que non invasif, peut induire un stress lié à l’anesthésie ainsi qu’une légère douleur liée à la contention manuelle de l’animal.

Devenir

La première procédure a deux objectifs : 1 - Conserver des lignées de poisson-zèbre et réduire les effectifs des lignées non utilisées, 2 - Tester la qualité du sperme. Ainsi, pour le premier point, l’ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure. Pour le deuxième point les animaux seront gardés en vie en fin de procédure car il s’agit d’animaux contrôles. La seconde procédure a pour but de : 1- Tester la qualité du sperme cryopréservé, 2- Revitaliser des lignées. Cette procédure utilise des individus contrôles, ainsi, l’ensemble des animaux pourront être gardés en vie en fin de procédure.

Remplacement

Cette procédure ne peut être remplacée par aucune autre méthode, les gamètes doivent être collectées sur des animaux vivants.

Réduction

Afin d’éviter des prélèvements superflus et ainsi réduire le nombre de poissons en procédure, les lignées cryopréservées seront limitées aux lignées non utilisées et non disponibles auprès d’autres laboratoires ou conservatoires. Le nombre de poissons zèbre utilisés par lot est limité au minimum nécessaire pour obtenir des échantillons de bonne qualité et en quantité suffisante pour revitaliser un lot.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés pendant toute la durée de la procédure. Les prélèvements s’effectueront sur champs opératoires humides jetables et remplacés après prélèvement d’un lot afin de limiter les contaminations bactériennes. Des points limites prédictifs et des dispositifs sont mis en place et appliqués dès que leur seuil est atteint afin d’éviter toute forme de douleur/souffrance.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est aujourd’hui un modèle majeur en biologie et biomédecine et ce projet répond à une demande spécifique des utilisateurs zebrafish. Le poisson-zèbre présente de nombreux atouts en tant qu’organisme modèle. Son génome, entièrement séquencé depuis 2013 et régulièrement mis à jour, partage environ 70 % d’homologie avec celui de l’homme, dont 86 % des gènes associés à des maladies humaines. Son développement rapide en fait un système d’étude particulièrement efficace avec des poissons fertiles en 3 mois. La fécondation, le développement ex utero et la transparence des embryons permettent une observation directe et continue des différentes étapes du développement. De plus, l’imagerie en temps réel, notamment par fluorescence, offre une résolution allant du niveau macroscopique au cellulaire. Associées à la disponibilité d’outils de manipulation génétique, ces caractéristiques expliquent l’intérêt croissant porté au poisson-zèbre comme modèle pour l’étude de nombreux processus biologiques et de diverses pathologies. Les animaux utilisés seront uniquement des individus sexuellement matures, donc des adultes, un état qui survient entre 3 et 6 mois. Au-delà de 15 mois, la fertilité diminuant, il serait alors nécessaire de multiplier les prélèvements. C'est pourquoi, afin de prélever un sperme et des œufs de bonne qualité issus de poisson-zèbre fertiles, il est nécessaire d’utiliser des mâles et des femelles âgés d’au minimum 6 mois et au maximum 15 mois.

Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis quelques jours d'isolement : c'est ce que subit une partie des 3 550 poissons zèbres de ce projet, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les individus porteurs des mutations recherchées sont gardés vivants pour entretenir les lignées, alors que le champ officiel sur le devenir des animaux reste vide. Ces lignées reproduisent des maladies rares du cervelet, et le porteur annonce que les poissons mutants pourraient avoir du mal à nager, donc à s'alimenter. Il justifie l'effectif de 3 550 poissons par un nombre "rigoureusement calculé" d'après des expériences antérieures, sans donner aucun élément de ce calcul.

Objectifs

Ce projet a pour but de créer et maintenir des lignées de poisson zèbre, utilisés comme modèles de maladies rares du cervelet, une partie du cerveau essentielle pour coordonner les mouvements. Ces pathologies congénitales sont liées à des mutations dans des gènes spécifiques, dont les effets restent à préciser. Pour cela, ce projet vise à l’utilisation du modèle poisson-zèbre, un poisson souvent utilisé en recherche car il partage des similarités avec les humains au niveau des gènes et du développement. Ces recherches pourraient aider à mieux diagnostiquer ces maladies et à trouver de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la fonction de gènes dont les mutations sont à l’origine de maladies rares du développement du cervelet. En avançant dans l’identification des gènes impliqués et des mécanismes pathologiques en aval, il permettra d’améliorer le diagnostique génétique, et d’identifier de potentielles approches thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Un prélèvement d'un petit bout de nageoire sera réalisé sur certains poissons, sous anesthésie courte (1 minute) et sous analgésie, une seule fois au cours de la vie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les poissons subiront un stress lié à l’anesthésie de courte durée pour le prélèvement de nageoire caudale pour le génotypage, et à l’isolement nécessaire de quelques jours qui s’en suit. Les poissons exprimant les mutations pourraient présenter des difficultés dans la nage qui pourraient perturber la capacité des poissons à s’alimenter.

Devenir

Les poissons porteurs des modifications génétiques seront gardés en vie pour le maintien des lignées.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment le cervelet se forme pendant le développement embryonnaire, aussi bien dans des conditions normales que lorsqu’il est touché par des maladies génétiques rares. Ce processus est très complexe et dépend de nombreux facteurs, comme les interactions avec d’autres parties du cerveau et les influences de l’environnement. À ce jour, il n’est pas encore possible de reproduire complètement ce développement in vitro en laboratoire, car il s’agit d’un phénomène délicat et interconnecté. Étudier des organismes vivants reste essentiel pour avancer dans la compréhension de ces maladies et imaginer de nouveaux traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour ce projet a été rigoureusement calculé selon les expériences antérieures, afin de limiter leur utilisation tout en garantissant la réalisation du projet.

Raffinement

Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Les poissons bénéficient d’un apport en nourriture vivante (Paramécies et Artémias), et d’un enrichissement social par le maintien d’un nombre de poissons suffisant par aquarium et des accouplements réguliers. Dans le cadre de ce projet, un suivi génétique des poissons est nécessaire. Cela implique un prélèvement d’un petit fragment de nageoire. Celui-ci est réalisé sous anesthésie d’une durée très courte et avec une analgésie pour éviter toute douleur. Les poissons bénéficient d’une surveillance quotidienne pour détecter rapidement tout signe de stress ou de difficulté, comme des problèmes d’alimentation ou des comportements inhabituels. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet permet d’éviter toute souffrance chez les animaux.

Choix des espèces

Le développement du cervelet chez le poisson-zèbre est très similaire à celui de l’Homme, notamment en ce qui concerne les gènes impliqués, la formation des neurones et leur organisation. Cette espèce présente plusieurs avantages pour la recherche : elle est très prolifique, se développe rapidement et permet d’étudier le développement du cerveau sur les embryons en utilisant peu d’animaux adultes reproducteurs. Les prélèvements pour suivi génétique des animaux seront réalisés chez les adultes.