Poissons zèbres

230 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures classées en souffrance modérée, pour un enseignement de biologie du développement. Le porteur indique que les adultes ne subissent aucun traitement et servent uniquement à la reproduction, seuls leurs embryons de moins de cinq jours étant observés, puis qu'ils sont réutilisés à des fins pédagogiques. Il décrit un génotypage présenté comme non invasif, par simple repérage d'un marqueur fluorescent. Il justifie le maintien de lignées vivantes par l'intérêt de montrer aux étudiants un vertébré à embryons transparents.

Objectifs

Ce projet consiste à présenter un organisme modèle vertébré, le poisson zèbre, pour renforcer et illustrer les cours et travaux dirigés de la Biologie / Génétique du Développement. Les concepts de base de la Biologie du Développement animal visent à faire comprendre la mise en place des structures précoces, les phénomènes d'induction tissulaire, la morphogenèse et l’organogenèse dans un organisme vertébré. Nous présenterons des embryons sauvages et mutants, fixés et vivants, à des stades de développement précoces. Nous utiliserons des lignées mutantes, inductibles par la chaleur, des traitements chimiques et l'injection transitoire d'ARN guide (CRISPR/CAS9) pour induire des phénotypes précoces facilement observables à 3 jours de développement pour les étudiant.es.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra de présenter un organisme modèle vertébré aux étudiant.es de Biologie du Développement et de les faire observer en parallèle des embryons vivants et fixés pour avoir une vision dynamique et réaliste de nos enseignements.

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour expérimentation et observation à 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours et 5 jours. Ils sont ensuite fixés à 3, 4 et 5 jours pour analyse moléculaire et phénotypique.

Impact sur les animaux

Dans ce projet pédagogique nos adultes ne sont soumis à aucun traitement et servent uniquement à la reproduction pour générer des embryons pour nos observations phénotypiques.

Devenir

A l'issue de la procèdure les animaux seront réutilisés à des fins reproductives pédagogiques.

Remplacement

Notre projet utilise des embryons et des larves plutôt que des poissons adultes.

Réduction

Les travaux pratiques concernent uniquement des processus embryonnaires ou larvaires avant 5 jours de développement. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à nos observations. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que d’obtenir nos embryons. De plus, le génotypage dans ce projet est dit non invasif (sélection des lignées grâce à la présence d'un rapporteur fluorescent) ce qui n'induit pas de douleur chez l'animal.

Choix des espèces

Nos enseignements visent à transmettre les connaissances sur le développement des organismes modèles vertébrés. Ils portent sur la mise en place des axes et territoires embryonnaires. Une approche éducative incluant un animal vertébré permet une meilleure appréhension des phénomènes contrôlant ces processus. Le poisson zèbre est un modèle qui présente de nombreux avantages dont la possibilité d'observer les événements embryonnaires précoces « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non- invasive, le recourt à l'utilisation d'approches chimiques, de lignées transgéniques inductible par la chaleur et de mutagénèse dirigée transitoire pour obtenir des phénotypes facilement observables et quantifiables précocement afin de comprendre les processus moléculaires et génétiques étudiés. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ces embryons facilement pour observer le développement précoce. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.

7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.

Objectifs

Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.

Procédures

Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.

Devenir

l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure

Remplacement

Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.

Réduction

Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.

1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.

Procédures

Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

10 924 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une dose d'irradiation aux rayons X puis une transplantation de cellules de mélanome, avec un suivi sous anesthésie pouvant durer six mois, pour identifier des gènes régulant les métastases. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer troubles de la nage, œdèmes et léthargie, et prévoit une mise à mort quand ces signes n'évoluent pas sous douze heures. Il affirme que la culture cellulaire, y compris en 3D, ne reproduit pas la complexité d'un "organisme vivant".

Objectifs

La formation de métastases est la première cause de mortalité chez les patients atteints de cancers solides. La compréhension du processus menant à la dissémination des cellules tumorales représente donc un enjeu majeur de santé publique. Si ces mécanismes commencent à être caractérisés dans les tumeurs épithéliales telles que le poumon ou le sein, ils demeurent mal connus dans les tumeurs non-épithéliales comme le mélanome. En particulier, le rôle d’interactions potentielles entre signaux extérieurs et adhérence des cellules tumorales dans la dissémination du mélanome n’a pas été élucidé. L’objectif de ce projet est de découvrir de nouvelles molécules exprimées à la surface des cellules de mélanome et qui régulent la formation de métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de découvrir de nouveaux gènes régulateurs de la capacité de dissémination des cellules de mélanome. La compréhension du mécanisme d’action de ces gènes pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques contre les cancers métastatiques.

Procédures

A partir de l’apparition de la première tumeur, les poissons sujets au développement de tumeurs seront soumis à une observation hebdomadaire et individuelle. Le suivi sera réalisé sur une durée de 6 mois, après quoi tous les poissons seront mis à mort, qu’ils aient ou non développé une tumeur. Des poissons adultes de la lignée casper recevront une dose sub-létale d’irradiation aux rayons X de l’ordre de 30 Gy (déterminée par la procédure 1) répartie sur deux jours (15 Gy par exposition). Ils seront ensuite transplantés avec des cellules de mélanome 24 heures après la seconde irradiation. Pour suivre l’évolution des tumeurs, une documentation photographique sera réalisée sous anesthésie une fois par semaine. Ce suivi sera réalisé sur une durée maximale de 6 semaines après transplantation, après quoi tous les poissons seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent présenter des signes de stress ou de maladie dus au développement de tumeurs primaires. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Le hérissement des écailles, la présence d’œdèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites plus rarement observés et plus graves nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, les animaux susceptibles de développer des tumeurs ne peuvent être replacés ou adoptés.

Remplacement

Les modèles de migration et d’invasion cellulaires seront utilisés à chaque fois que cela est possible, notamment pour les analyses mécanistiques du rôle des gènes impliqués dans la formation de métastases et identifiés au cours de ce projet. Cependant, les lignées cellulaires de cancers humains rendent mal compte de la complexité des comportements des cellules dans leur milieu naturel, notamment dans un cadre de migration, et souffrent de limites importantes pour la modélisation des étapes de progression métastatique puisque la plupart des lignées cellulaires de mélanome humain proviennent de métastases et se sont adaptées à leurs conditions de culture in vitro. Les méthodes alternatives telles que la culture en 3D seront aussi envisagées mais ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.

Réduction

Le recours à des expériences pilotes permettront d’optimiser les protocoles sur un petit nombre de poissons adultes. De plus, une stratégie visant à tester tous les gènes candidats en même temps réduira considérablement le nombre total d’animaux utilisés par rapport à une stratégie qui s’intéresserait à chaque gène candidat séparément. Enfin, des analyses statistiques a priori basées sur notre expérience du type de manipulations proposées ont permis d’établir les tailles d’échantillons nécessaires pour observer des différences significatives, réduisant ainsi au minimum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet.

Raffinement

Le développement de tumeurs présente un risque de souffrance animale modérée. Cependant, cette souffrance éventuelle peut être prévenue par une surveillance attentive des animaux et l’application de critères d’arrêt définis. Afin de réduire le stress des animaux et de prévenir toute souffrance, les poissons sujets au développement de tumeurs seront observés au moins deux fois par semaine à la recherche de signes ou de changements de comportement précoces et prédictifs de la maladie. Ceux-ci comprendront principalement (par ordre de fréquence) des modifications de la nage, une respiration accélérée prolongée, une léthargie (immobilité prolongée au fond de l’aquarium) ou une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau. Des cas plus rares peuvent présenter un hérissement des écailles, la présence d’œdèmes ou une incapacité à se nourrir. Les poissons malades seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 12h. En absence d’amélioration des signes de stress ou de maladie listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. Dans un souci de raffinement, les poissons seront maintenus à une densité optimale de 5-8 poissons par litre d’eau pour favoriser leurs interactions sociales, en accord avec les recommandations de l’AAALAC. Les poissons seront également nourris une fois par jour avec des artémias pour préserver leurs instincts prédateurs et enrichir leur milieu.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté à l'étude de la fonction de gènes d’intérêt dans le cancer. Des modèles très fiables de mélanome ont été établis et des outils performants sont disponibles pour modifier des gènes spécifiquement dans ces tumeurs afin d’en examiner le rôle, en particulier sur le comportement des cellules cancéreuses. De plus, l’environnement des cellules est très bien conservé entre l’homme et le poisson puisque la plupart des organes ont des programmes de développement et des structures semblables. D'autres espèces pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique. Les microinjections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade une-cellule, ce qui permet l’intégration dans le génome et la production d’animaux transgéniques mosaïques. Les tumeurs primaires surviennent au stade adulte entre 8 et 30 semaines après fécondation. Les transplantations sous-cutanées nécessitent l’utilisation de poissons adultes âgés de 12 à 26 semaines car les poissons âgés de moins de 3 mois sont trop petits pour permettre l’observation de la migration spatiale des cellules tumorales et les poissons âgés de plus de 6 mois présentent une variabilité plus importante de la réponse à l’irradiation.

3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.

Objectifs

Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.

Bénéfices attendus

L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).

Devenir

Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.

Remplacement

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.