Poissons zèbres
Création de lignées poissons-zèbres génétiquement modifiées, évaluation et prise en charge des phénotypes dommageables.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2000 poissons zèbres vont être utilisés, gardés vivants pour produire des lots expérimentaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune intervention n'est pratiquée sur eux, l'évaluation reposant sur l'observation de l'aspect et du comportement d'animaux génétiquement modifiés pouvant développer des malformations cardiaques ou perdre leur capacité de régénération. Le projet crée et surveille ces lignées pour identifier des gènes du développement et de la régénération du cœur, en vue d'applications chez les mammifères. Le porteur affirme que l'évaluation du caractère dommageable d'un phénotype génétiquement modifié ne peut se faire par une méthode alternative.
Objectifs
Les affections cardiaques sont devenues l’une des causes les plus fréquentes de décès et d’invalidité, si ce n’est la cause première comme l’indiquent de nombreux pays européens. Parmi ces affections, les malformations cardiaques congénitales représentent une des causes majeures de morbidité infantile. Cependant, peu de facteurs génétiques responsables de ces malformations ont été identifiés à ce jour. Le développement cardiaque du poisson-zèbre étant rapide et très proche de celui observé chez l'homme, cet animal se présente comme un modèle de choix pour identifier les gènes potentiellement responsables de malformations cardiaques congénitales. De plus, alors que les mammifères adultes sont incapables de régénérer leur cœur après une lésion, le poisson zèbre est capable, suite à une amputation d’un maximum de 30% du ventricule, de totalement régénérer son cœur. Notre principal objectif est d’identifier les facteurs génétiques qui régulent le développement et la régénération du cœur chez le poisson zèbre pour ensuite les tester chez les mammifères. Pour déterminer les cibles appropriées, nous allons créer et/ou analyser des animaux génétiquement modifiés nous permettant d'étudier la fonction de ces facteurs au cours du développement et de la régénération. L'objectif de ce projet consiste à évaluer les conséquences de ces modifications génétiques sur la santé et le bien-être des poissons afin de gérer au mieux de l'élevage de ces animaux.
Bénéfices attendus
A court terme, l’évaluation et la prise en charge d’un phénotype dommageable permet de mieux comprendre la lignée transgénique étudiée. A long terme, la création et/ou l'étude de lignées génétiquement modifiées nous permettra de caractériser des gènes impliqués dans le développement, les pathologies et la régénération cardiaques et par conséquent de mieux appréhender les pathologies cardiaques chez l'homme.
Procédures
Aucune intervention ne sera effectuée sur les animaux. L'évaluation du phénotype se fait par observation de l'aspect et du comportement des animaux.
Impact sur les animaux
Nos études sont focalisées sur des gènes impliqués dans le développement et la régénération du cœur, les effets indésirables potentiellement attendus se traduiraient par différentes atteintes cardiaques : malformations, perte de la capacité de régénération.
Devenir
La procédure décrite dans ce projet consiste à évaluer les conséquences de modifications génétiques sur la santé et le bien-être des poissons afin de gérer au mieux de l'élevage de ces animaux. Ces derniers pourront être utilisés pour la production de lots expérimentaux.
Remplacement
Le projet répond aux exigences réglementaires de la directive 2013-118 : Art. R. 214-89.−Au sens de la présente section et des textes pris pour son application, on entend par « Procédure expérimentale » toute intervention destinée ou de nature à aboutir à la naissance ou à l’éclosion d’un animal ou à la création et à la conservation d’une lignée d’animaux génétiquement modifiés L’évaluation du caractère dommageable d’un phénotype d’un animal génétiquement altéré n’est donc pas envisageable par une méthode alternative.
Réduction
Cette procédure d’évaluation du phénotype dommageable se fait sur un nombre restreint d’individu et durant la période d’élevage ce qui permet d’avoir des paramètres zootechniques spécifiques qui aboutissent à une meilleure gestion de la production et donc une réduction au final du nombre d’individu nécessaire pour obtenir les lots expérimentaux.
Raffinement
L'évaluation du phénotype dommageable repose sur une méthode d'observation non invasive qui ne génère aucune douleur et aucun stress à l'animal. De plus, l'identification du phénotype dommageable permettra de définir des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant une prise en charge de la souffrance pour les lignées identifiées, à travers des actions ciblées (enrichissement adaptés, pris en en charge de la douleur, arrêt du maintien de la lignée).
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre est ici utilisé pour 2 raisons : 1- Le développement cardiaque du poisson- zèbre étant très proche de celui observé chez l'homme, cet animal se présente comme un modèle de choix pour identifier rapidement les gènes potentiellement responsables de malformations cardiaques congénitales. De plus, l'organe cardiaque se développe rapidement chez cette espèce, nous permettant d'effectuer nos analyses sur des spécimens de moins de 96 heures post-fertilisation. 2-Contrairement aux mammifères, le poisson- zèbre est capable de régénérer son tissu cardiaque à l'âge adulte. Les phénotypes seront monitorés aux stades suivants : 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 3 mois, et 6 mois post fécondation.
Bioaccumulation chez le poisson : exposition via le milieu aquatique et via la voie alimentaire
- Protection de l’environnement
Saumons : 2000
Autres poissons : 10000
15 000 poissons (poissons zèbres, saumons et autres espèces) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, la quasi-totalité tuée à l'issue et seuls quelques témoins survivants éventuellement replacés. Ils sont exposés jusqu'à 28 jours à des substances chimiques via l'eau ou l'alimentation, pour mesurer la bioaccumulation exigée par la réglementation avant mise sur le marché. Le porteur indique que les concentrations sont choisies sous le seuil de toxicité aiguë mais que des effets néfastes comportementaux ou létaux restent possibles, et qu'une mortalité de 10 % n'invalide pas le test. Il commande des lots de 400 à 600 poissons par essai pour tenir compte de la mortalité liée au transport.
Objectifs
L’évaluation de la bioaccumulation de certaines substances est obligatoire dans le cadre d’autorisation de mise sur le marché de nouvelles substances ou d’évaluation d’un risque sanitaire (rejet d’effluent etc…).Dans ce cadre, des essais sont menés sur différents organismes représentatifs des écosystèmes aquatiques dont les poissons. L'essai de bioconcentration chez le poisson se compose de deux phases : exposition (absorption) et post-exposition (élimination). Pendant la phase d’absorption, un groupe de poissons d’une même espèce est exposé à la substance d’essai à une ou deux concentrations (en fonction des propriétés de la substance). Pour la phase d’élimination, ils sont ensuite transférés dans un milieu exempt de la substance d'essai, ou nourris avec des aliments « propres », non-traités. Ces essais vont permettre de déterminer un facteur de bioconcentration ou bioamplification (FBC, FBA) d’une substance afin d’évaluer les risques sur l’écosystème aquatique et la chaine alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus sont utilisés dans le cadre de l'évaluation du risque des substances chimiques, produits formulés, médicaments ou autre afin de déterminer les concentrations maximales acceptables dans l'environnement et de réaliser les évaluations du risque.
Procédures
Les animaux sont exposés à des concentrations en substance chimiques via le milieu aquatique ou via l'alimentation. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales. La durée de la phase d'exposition est de 28 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les essais de bioaccumulation ne devraient pas entrainer de mortalité, les concentrations d'expositions étant choisies en dessous des niveaux de toxicité aiguë. Cependant, la durée de l'essai , plus longue qu'un essai de toxicité aiguë ainsi que les différences de sensibilité des organismes peut entrainer des effets néfastes sur les organismes. Les effets néfatses sont dépendant de la substance testée et peuvent être comportementaux ou létales.
Devenir
Les animaux des groupes exposés sont issus d'une procédure sévère, ils ne peuvent donc pas être réutilisés. De plus, les espèces de poissons utilisées ne sont pas toutes des espèces domestiques qui peuvent être replacés en aquarium ou par des associations. Si des solutions de replacement existent, les animaux issus des groupes contrôles, restant à la fin de la phase d'élimination, seront gardés en vie et replacés.
Remplacement
Ces essais sont exigés par les règlementations quand des read-across ne sont pas possibles, pas pertinent ou que les données issues de la littérature ne sont pas suffisantes. Il n’existe pas actuellement de modèle cellulaire permettant de représenter la bioaccumulation au sein des organismes.
Réduction
Dans un but de réduction du nombre d’animaux utilisés, la ligne directrice préconise l’utilisation de 3 groupes de concentration (témoin, forte concentration, faible concentration) et non d’une gamme de 5 concentrations. La réalisation d'un essai préliminaire avec un faible nombre d'individus permet d'affiner les durées des phases d'absorption et d'élimination et ainsi d'évaluer précisément le nombre d'individus nécessaire pour l'essai définitif. Le développement d'une méthode analytique de dosage de la substance dans le poisson la plus sensible possible permettra de réduire le nombre de poissons utilisés, chaque individu prélevé donnant un résultat et pas un pool d'individus pour une mesure.Pour l'essai préliminaire, il faut 20 poissons par concentration (3 concentrations) soit 60 poissons. Pour l'essai définitif, il faut 13 prélèvements au cours du temps avec 4 poissons à chaque temps soit 52 individus. 3 poissons supplémentaires au début du test, à la fin de la phase d'adsorption et à la fin de la phase d'élimination pour le dosage des lipides soit 9 poissons. Une tolérance de 10% de mortalité n'invalide pas le test. le nombre de poisson par concentration est donc de 52+9+7 soit 68 poissons par lot. 4 lots maximum par test soit 68*4 = 272. Soit 332 poissons pour essai préliminaire + essai définitif. Des lots de 400 poissons sont donc commandés pour chaque projet pour tenir compte de la mortalité potentielle liée au transport (10% max) ainsi que des poissons utilisés pour le développement de la méthode analytique (entre 20 et 30 individus). Pour les espèces les plus petites et en fonction des limites de quantification de la méthode analytique, il peut être nécessaire de pooler les individus par 3 ou 4 et donc d'augmenter le nombre d'individus par lot. C'est notamment le cas du Danio pour lequel des lots de 600 poissons sont nécessaires. Afin de réduire le nombre de poissons utilisés, si le choix de l'espèce incombe au laboratoire, une espèce de grande taille est privilégiée.
Raffinement
Les poissons sont maintenus dans un environnement permettant une croissance optimale en termes de qualité d’eau et d’alimentation. Suivi journalier des conditions d’essai (pH, Oxygène dissous). Les poissons sont surveillés quotidiennement et scorés selon une grille de points limites permettant l'évaluation pgysique et comportementale des individus. En fonction du score obtenu, une surveillance 2 fois par jour pourra être réalisée. Dès l'atteinte des points limites, les animaux sont retirés de la procédure et euthanisiés.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées par les normes et les règlementations. Les poissons utilisés seront adultes ou juvénile en fonction de l'espèce (taille et poids des organismes).
SNSC – Importance du système neurosécréteur caudal dans l’homéostasie des téléostéens.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
5 940 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sert à créer des lignées génétiquement modifiées, l'autre subit des variations rapides de température, de salinité, de pH ou d'oxygène, ou la destruction de neurones par un antibiotique. Le porteur indique que ces modifications peuvent altérer la croissance ou la reproduction, et que les reproducteurs sont tués à deux ans quand leurs capacités déclinent. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier un "organisme entier", ce système caudal n'ayant selon lui pas d'équivalent chez les mammifères.
Objectifs
Notre projet est d’étudier les fonctions d’un organe neuroendocrinien situé dans la queue du poisson et appelé système neurosécréteur caudal. Ce système est formé de neurones situés à l’extrémité caudale de la moelle épinière des poissons. Ces cellules produisent différentes hormones qui sont libérées dans la circulation sanguine. Sans doute parce que ce système ne semble pas avoir d’équivalent chez les mammifères, ses fonctions restent très peu connues. Les quelques études disponibles suggèrent une implication dans l’adaptation des poissons aux variations de certains paramètres de leur environnement (température de l’eau, salinité, pH, niveau d’oxygène dissous). Pour notre projet, nous allons utiliser l’organisme modèle poisson-zèbre (Danio rerio). Nos objectifs sont de : 1) Décrire précisément comment ce système est organisé et se met en place au cours du développement du poisson. 2) Déterminer précisément les fonctions de ce système. En particulier, nous allons chercher à identifier quelles hormones sont produites par ce système lorsque le poisson fait face à des variations de son environnement. Puis, nous testerons l’importance de ces hormones dans la réponse physiologique du poisson à ces variations de l’environnement.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le développement et les fonctions du système neurosécréteur caudal, un organe peu connu des poissons. Les quelques données disponibles suggèrent que cet organe est impliqué dans l’adaptation physiologique des poissons aux variations de leur environnement. Les poissons représentent non seulement une part importante de la diversité des vertébrés mais aussi un élément essentiel pour la biodiversité des écosystèmes aquatiques ainsi qu’une source de nourriture importante pour l’humanité. Les changements climatiques liés à l’activité humaine vont impacter particulièrement les environnements aquatiques en affectant notamment la salinité, le pH, l’oxygène et la température et vont impacter l’ensemble des composantes de ces écosystèmes, en particulier les poissons. Nous pensons que mieux comprendre la physiologie de ces animaux, notamment leurs mécanismes d’adaptation à des variations environnementales, sera utile pour comprendre et anticiper l’influence de ces bouleversements climatiques sur ces animaux. Ceci devrait avoir des implications pour définir les stratégies pour la préservation de ces animaux et de ces écosystèmes ainsi que pour l’élevage et l’aquaculture.
Procédures
Quatre types d’interventions sont utilisés dans ce projet : 1. Création de lignée d’animaux génétiquement modifiés. Des œufs sont obtenus par accouplement naturel de poisson-zèbre reproducteurs élevés et maintenus au laboratoire dans une animalerie confinée et agrémentée. Ces œufs sont injectés à l’aide d’une micro-aiguille contenant les éléments permettant l’ajout d’un gène ou l’introduction d’une mutation inactivant un gène). Les animaux issus de ces œufs sont élevés et utilisés comme reproducteurs. 2. Production d’animaux dépourvus de certaines hormones ou du récepteur à ces hormones. Des reproducteurs génétiquement modifiés sont utilisés pour produire des poisson-zèbre dont le gène permettant la production d’une hormone d’intérêt, ou son récepteur, est inactivé et qui sont donc incapables de les produire. 3. Des expériences consistant à faire subir à des poissons des variations d’un paramètre de l’eau (température, salinité, pH ou niveau d’oxygène dissous). Ces variations sont contenues dans des gammes que l’animal peut rencontrer dans son environnement naturel et durent de quelques heures à quelques jours. 4. Suppressions neurones du système neurosécréteur caudal. Des poissons génétiquement modifiés, dont les neurones du système neurosécréteur caudal sont sensibles à un antibiotique, sont traités avec cet antibiotique ce qui entraîne la mort de ces cellules.
Impact sur les animaux
- La création de lignée OGM est généralement sans effet car les modifications du génomes obtenues sont maintenu à l’état hétérozygote (un seul des deux chromosomes parentaux est affecté). Néanmoins, elle est susceptible d’entraîner des malformations congénitales non souhaitées. De telles malformations sont détectées dès les stades embryonnaires et seuls des animaux ne présentant pas de malformation sont mis en élevage. - Les expériences de variations rapides des paramètres de l’eau sont susceptibles d’entraîner un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel, les stress induits devraient être modérés. - L’inactivation des gènes codant pour les hormones produites par les neurones du système neurosécréteur caudal ou de leurs récepteurs, et la suppression de ces cellules, pourraient entraîner des modifications de la physiologie des animaux engendrant une modification de leur croissance ou de leur capacité à se reproduire. Cela devrait également impacter leurs capacités à s’adapter à des variations des paramètres de l’eau, et pourrait entraîner des stress plus forts ou prolongés lors des challenges.
Devenir
Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Ces animaux sont euthanasiés à 2 ans, car à cet âge les capacités de reproduction diminuent fortement. Dans le cadre des challenges et de la production d’animaux dépourvus de SNSC ou de certaines hormones et récepteurs, les animaux sont euthanasiés à l’issu du challenge pour pouvoir prélever les différents tissus qui feront l’objet d’analyses histologique et moléculaire.
Remplacement
Les processus développementaux et physiologiques tel que ceux étudiés dans ce projet sont complexes et impliquent des interactions entre différents organes et parties du corps. Pour étudier ces processus, il est nécessaire de recourir à des organismes entiers. Des alternatives ont été envisagées, notamment la culture in vitro des neurones du système neurosécréteur caudal étudiés. Néanmoins, l’objectif de ce projet et de pouvoir étudier les fonctions des hormones produites par ces neurones sur l’organisme ce qui n’est pas possible avec les alternatives envisagées.
Réduction
Une partie des animaux utilisés dans ce projet permettra la création de lignées génétiquement modifiées et l’autre partie subira des challenges (variations rapides des paramètres de l’eau) afin de déterminer le rôle du système neurosécréteur caudal et des hormones qu’il produit. Le nombre d’animaux envisagé pour la création des lignées génétiquement modifiées est basé sur notre expérience de ce type d’approche. L’optimisation des protocoles nous permet d’utiliser le moins d’animaux possible. En particulier l’utilisation d’un marqueur visible nous permet de sélectionner les œufs porteurs d’un transgène d’intérêt. Pour notre projet, 16 lignées génétiquement modifiés seront nécessaires. Pour chacune, 50 animaux seront utilisés. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour garantir l’obtention des lignées souhaitées. Pour les expériences de variations des paramètres de l’eau, 10 animaux seront utilisés pour chaque paramètre de l’eau étudié (4 paramètres en tout), à 3 valeurs différentes, pendant 3 durées différentes et à 3 stades différents. Ces expériences seront réalisées sur des animaux sauvages (non génétiquement modifiés) et des animaux génétiquement modifiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les tissus d’intérêt afin de réaliser des analyses moléculaire ou histologique. Notre expérience de ce type d’analyse montre qu’un nombre de 10 animaux par condition est nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats qui soient statistiquement significatifs. Pour chaque expérience de variations des paramètres de l’eau, des contrôles adaptés ont été prévus et les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, pour chaque animal euthanasié, différents tissus seront prélevés et les échantillons seront conservés afin de pouvoir être utilisés pour différentes analyses sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. D’une façon générale, ce projet a été conçu et organisé de façon à pouvoir, à chaque étape, sélectionner rigoureusement les lignées à produire et les expériences à mettre en œuvre afin de répondre à nos objectifs. Le nombre de lignées et d’expériences prévus, et donc le nombre d’animaux, ont été optimisés afin de répondre au mieux aux objectifs de ce projet, notamment en termes de tests statistiques.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans une animalerie confinée et agrémentée, dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée, y compris pendant les expériences de variations des paramètres de l’eau, afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées la sélection des embryons concernés se fait sans avoir recours à des biopsies. De plus, l’observation attentive de ces embryons permet de n’élever que des animaux dépourvus de malformation. Dans le cadre des expériences de variations des paramètres de l’eau et de la production d’animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones, les animaux font l’objet d’un suivi particulier (horaire ou quotidien) par du personnel formé afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental. Des points limites, définis à l’avance, permettent d’interrompre l’expérience de variations des paramètres de l’eau si nécessaire.
Choix des espèces
L’étude dynamique des processus développementaux et physiologiques n’a de sens qu’à l’échelle d’un organisme entier. Ces processus ne peuvent être reproduits totalement in vitro et nécessitent de recourir à des organismes modèles animaux. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude génétique. Sa relative facilitée d’élevage, son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Les études physiologiques sur les animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones seront réalisées sur de jeunes larves (2 semaines), des juvéniles (8-10 semaines) et des adultes (4-6 mois) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux.
Effets d’extraits de plantes sur les désordres métaboliques chez la larve de poisson zèbre soumise à un régime riche en graisses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
585 larves de poisson zèbre vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Âgées de sept jours, elles sont surnourries par un bain enrichi en graisses et exposées à onze extraits de plantes, puis tuées pour mesurer l'accumulation de lipides et l'inflammation, afin d'évaluer ces extraits contre les désordres métaboliques. Le porteur indique que les procédures ne comportent aucun geste invasif, la seule contrainte tenant à la dégradation possible des solutions. Il affirme que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie le recours au poisson vivant.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer les propriétés de 11 extraits de plantes issues de la biodiversité de La Réunion sur les pertubations métaboliques chez le poisson-zèbre au stade larvaire, suite à un régime enrichi. Dans le cas de maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète, différents processus sont dérégulés. Les données de la littérature décrivent la mise en place d'une inflammation chronique, d'un stress oxydant, d'une dyslipidémie ou d'une insulino-résistance pouvant entrainer des effets délétères sur l'ensemble des systèmes de l'organisme tels que le foie, le coeur, les reins ou le système nerveux. Dans le cadre de notre projet, les larves sont surnourries avec un régime riche en lipides et traitées avec les extraits de plantes aux concentrations maximales non toxiques afin d'évaluer leurs effets sur différents paramètres métaboliques, notamment l'accumulation lipidique, le stress oxydant et l'inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet participera au développement d'approches thérapeutiques innovantes reposant sur la biodiversité végétale, permettant d'évaluer leurs impacts dans un contexte de pathologies métaboliques et des complications associées (dyslipidémie).
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucun intervention invasive. Ils seront incubés pendant 5 jours (avec renouvellement des solutions toutes les 24h) dans une solution à base de nourriture sèche (Contrôle) pour 45 larves, une solution à base de jaunes d'oeuf (HFD) pour 45 larves et des solutions à base de jaune d'oeuf + extrait de plante (HFD traités) pour 495 larves.
Impact sur les animaux
La qualité des solutions à base de jaunes d'oeuf et extraits de plantes (à des concentrations non toxiques déterminées au préalable) dans lesquelles les larves sont incubées (balnéation) peut se dégrader au cours du temps et induire un stress aux animaux. Les solutions seront donc re-préparées, renouvelées toutes les 24h et les animaux seront examinées chaque jour de l'expérimentation.
Devenir
A la fin de l’expérimentation, après mise à mort des animaux, l'accumulation lipidique sera analysée par coloration Oil Red O. Des larves seront conservées et d'autres analyses au niveau de l'expression génique ou protéique pourront être effectuées afin d’évaluer les effets sur l’inflammation ou le stress oxydant, par exemple.
Remplacement
Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place à la suite d'un régime riche en graisses. Seul le modèle animal permet de prendre en considération une telle complexité et de réellement tester l'impact de ces extraits sur l'ensemble des processus métaboliques.
Réduction
Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible. 3 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de permettre la réalisation d'études statistiques. Les expériences seront réalisées en triplicat : 3 x 15 larves pour chaque condition.
Raffinement
Les larves seront placées dans des conditions optimales (température : 26.5°C ; oxygénation ; pH). Notre protocole a été développé afin que les larves bénificient d'un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. Chaque solution sera fraichement préparée et renouvelée toutes les 24h. Les larves seront nourries suffisamment avec de la nourriture spécialisée et adaptée. Les larves seront examinées chaque jour de l'expérimentation et tout signe de souffrance selon des points limites adaptés sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de l'obésité et du diabète puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre. Les animaux utilisés seront des larves âgées de 7 jours. A ce stade de développement, les larves sont capables de se nourrir de manière autonome et disposent déjà d'un tractus gastroinstestinal fonctionnel.
Validation d’un nouveau modèle expérimental d’onco-immunologie chez le poisson-zèbre immunodéprimé
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
2720 poissons zèbres immunodéprimés vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 80 d'entre eux et modéré pour 2640, la quasi-totalité étant tuée et quelques individus réutilisés pour l'élevage. Chaque poisson reçoit jusqu'à cinq injections, d'abord un tissu humain puis des cellules tumorales humaines et des traitements, pour mettre au point un modèle de cancer greffé dans un microenvironnement humain. Le porteur décrit des lésions des nageoires, des pertes d'équilibre et des poissons prostrés au fond de l'aquarium parmi les effets attendus. Il situe la finalité, des études précliniques sur deux cancers, comme une perspective, ce projet visant d'abord à valider le modèle lui-même.
Objectifs
Le poisson-zèbre est un modèle animal vertébré plus éloigné de l’Homme que les modèles mammifères murins mais il connait aujourd’hui de nombreuses améliorations qui permettent de l’utiliser pour des projets expérimentaux. Tout d’abord, il est maintenant possible d’élever des poissons-zèbres à 37°C, température des mammifères qui permet des conditions optimales pour l’étude du développement des cellules cancéreuses humaine au sein de cet organisme. De plus, les lignées de poissons-zèbres existantes lui permettent d’être immunodéprimé et transparent. Il est ainsi possible de réaliser des cinétiques in-vivo via une observation facilitée en microscopie de la croissance et de la prolifération des cellules greffées. Ce projet vise à recréer la complexité des situations naturelles chez l’homme. A ce jour, la très grande majorité des projets étudient des cellules tumorales humaines dans les tissus de l’animal modèle (murins, poissons….). Dans ce projet, il s’agit d’étudier le développement des cellules tumorales humaines dans un tissu humain chez le poisson. Il s’agit dans un premier temps d’implanter un tissu humain obtenu à partir de cellules humaines, puis dans un second temps, d’y injecter les cellules tumorales. Ce projet a pour objectif d’étudier le comportement de cellules tumorales dans un microenvironnement humain chez le modèle poisson-zèbre. Les paramètres étudiés seront la croissance et la prolifération des cellules tumorales dans l’organisme, la taille de la tumeur et sa vascularisation, et ce pour différents cancers. Nous proposons dans un premier temps d’implanter des tissus humains chez le poisson-zèbre, puis dans un second temps, d’y injecter les cellules tumorales. S’ils s’avèrent concluants, ces travaux permettront à l’avenir d’utiliser le modèle du poisson-zèbre immunodéprimé greffé pour la comparaison d’approches thérapeutiques in-vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter à la communauté scientifique un protocole performant pour réaliser des implantations de tissu exogène humain chez le poisson-zèbre. De plus il permettrait de comparer l’évolution des cellules tumorales dans un tissu humain ou non humain ce qui sera un atout pour réaliser de futures recherches oncologiques en se rapprochant toujours plus des conditions retrouvées chez l’Homme. La finalité ultime de ce projet est de pouvoir réaliser des études pré-cliniques d’efficacité de traitements pour 2 types de cancers : urologique et glioblastome.
Procédures
Les animaux seront soumis à un maximum de 5 injections espacées chacune d’une semaine au minimum (mise en place du tissu hôte, injection des cellules tumorales et 3 injections maximum du traitement). Chaque procédure d’injection étant réalisée sous une anesthésie et une analgésie des poissons-zèbres et ne durant pas plus de 10 minutes entre le début de l’anesthésie et le réveil.
Impact sur les animaux
Suite à l’injection de cellules, différents effets indésirables peuvent apparaitre et être caractérisés chez le poisson-zèbre. Le premier point concerne la taille de la tumeur et la potentielle apparition de métastases. Les cellules tumorales étant fluorescentes, il sera possible de les observer au microscope et de détecter l’apparition des métastases. Il peut y avoir des lésions au niveau du site d’injection, des pétéchies abondantes au niveau des ouïes ou encore des changements anatomiques importants (lésion des nageoires, flexion du corps). Au niveau comportemental, la présence d’effets indésirables peut être caractérisée par une perte importante de l’équilibre, une prise d’air à la surface permanente, l’animal peut être prostré au fond de l’aquarium, une agressivité envers les autres poissons ou encore une nage anormale (en cercle par exemple). Les traitements testés peuvent eux aussi induire des effets indésirables pour les animaux. La toxicité et les effets indésirables associés à chaque molécule sera étudiée et les concentrations adaptées seront évaluées avant d’être administrée.
Devenir
Les animaux entrant dans l’une des procédures expérimentales (hormis les poissons destinés à l’élevage et au maintien de la lignée) seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales. Les tumeurs et les métastases (si présence), sont prélevés pour être analysés par des analyses biochimiques et histologiques. Seuls les animaux utilisés dans la procédure d’élevage seront réutilisés pour maintenir les lignées dans notre animalerie.
Remplacement
Pour l’étude des cancers ou d’implantation de tissus exogènes, le modèle animal est requis afin d’évaluer la croissance tumorale ou du tissu dans un environnement adéquat. En effet, ces cellules ont besoin de multiples signaux pour croitre correctement, d’une interaction avec les différents tissus et en particulier avec le système vasculaire de l’hôte, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Pour évaluer toutes ces interactions avec les différents tissus et/ou types cellulaires, nous avons besoin d’utiliser un modèle animal. De plus ce projet privilégie le modèle poisson-zèbre qui est un modèle vertébré plus éloigné de l’Homme que les modèles mammifères murins mais qui connait aujourd’hui de nombreuses améliorations permettant de baser des projets expérimentaux sur ce modèle.
Réduction
L’étude des cancers est aujourd’hui majoritairement effectuée chez la souris via l’injection de cellules tumorales et l’analyse de tumeurs ex-vivo. Il est très difficile de réaliser des cinétiques sur le développement de des tumeurs. Les cinétiques sont possibles seulement soit avec un grand nombre d’animaux, soit avec des procédures lourdes pour l’animal. Nous cherchons donc à développer un nouveau modèle qui permettra de réaliser des cinétiques au cours de la croissance tumorale in-vivo, ce qui conduira de fait à une réduction du nombre d’animaux. Le développement de nouvelles lignées de poissons-zèbres immunodéprimés et transparents a ouvert ces nouvelles perspectives : elles permettent de suivre in-vivo différents paramètres comme la croissance tumorale ainsi que des tissus spécifiques via l’expression de protéines fluorescentes. Dans la littérature scientifique, les tailles des tumeurs présentent un coefficient de variation important. En considérant cette variation et en recherchant un effet bénéfique de traitements des groupes de 10 animaux nous permettront d’obtenir des données statistiquement significatives (dans les conditions classiques de risque). Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la significativité des résultats obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe, dans un environnement approprié à leur statut immunodéficitaire à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 14h / 10h. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens ou les expérimentateurs, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. Avant chaque injection, les poissons seront anesthésiés pour limiter leurs stress. Une grille de scores sera utilisée dès la première expérimentation réalisée sur ces poissons
Choix des espèces
Le modèle poisson est en plein essor dans de nombreux domaines d’études et notamment depuis peu en cancérologie. Il est maintenant possible de maintenir les poissons-zèbres à 37°C, ce qui est la température optimale pour les cellules de mammifères qui seront utilisées. Les poissons-zèbres immunodéficients permettent le maintien des tumeurs dans l’organisme puisqu’ils ont un système immunitaire absent (ou déficient). De plus, les lignées utilisées sont transparentes, ce qui permet de réaliser des cinétiques pour la croissance de la tumeur in-vivo avec la microscopie. Enfin, elles pourront aussi être croisées avec d’autres lignées transgéniques pour obtenir des poissons immunodéficients et exprimant des gènes rapporteurs dans des types cellulaires spécifiques. Ceci permettra de visualiser des cinétiques in-vivo, via des acquisitions microscopiques, des processus cellulaires comme la vascularisation de la tumeur. Ce modèle permettra donc en plus d’une approche quantitative et qualitative, une approche temporelle in-vivo qui sera très innovante, notamment lors de tests de molécules à visée thérapeutique. La lignée utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable lié à son immunodéficience. Elle est de ce fait sensible aux différents types d’infections. L’eau utilisée pour le maintien ou les expérimentations sera stérilisée à l’autoclave et supplémentée en antibiotiques pour fournir un environnement adéquat à ces poissons. De jeunes adultes (12 – 16 semaines), dont tous les systèmes tissulaires et cellulaires sont opérationnels, seront utilisés pour mener à bien ces expérimentations.
Role de l’environnement des nerfs périphériques dans leur développement et régénération chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 900 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les adultes sont génotypés jusqu'à deux fois par prélèvement d'un morceau de nageoire sous anesthésie, et des alevins subissent une ablation d'un nerf moteur au laser suivie d'une observation par fluorescence, pour étudier la régénération nerveuse. Les adultes sont tués par surdose d'anesthésiant une fois la génération suivante obtenue, les alevins par anesthésie puis commotion cérébrale pour l'histologie. Le porteur affirme à plusieurs reprises que la douleur est "minimisée", en s'appuyant sur le stade précoce des alevins et la rapidité de régénération de l'espèce.
Objectifs
Les motoneurones qui résident dans la moelle épinière constituent le relai final entre le système nerveux central et le muscle squelettique, responsable du mouvement. Au cours de leur différenciation, les motoneurones émettent des axones qui sortent de la moelle épinière pour suivre une trajectoire stéréotypée pour atteindre leur cible musculaire. Ce processus est orchestré par tout un répertoire de molécules présentes dans l’environnement des axones. Après lésion des nerfs moteurs, l’environnement va à nouveau servir pour le guidage des nerfs afin qu’ils puissent retourner vers leur cible musculaire initiale. L'importance de l'environnement au cours de la régénération des nerfs moteurs sera étudié chez des jeunes alevins de poissons zèbres dont deux gènes de molécules de guidage ont été mutés. Les mutations ne devraientt pas induire de phénotype dommageable permettant l’élevage des poissons. Afin de visualiser les nerfs moteurs et les cellules impliquées dans le processus de régénération, ces poissons auront préalablement été croisés avec 5 lignées transgéniques fluorescentes. Les nerfs sont lésés par ablation laser chez les jeunes alevinsde 4 jours post-fécondation (stade non couvert par la loi sur l'expérimentation animale). Le processus de régénération sera ensuite suivi in vivo par fluorescence, de manière non invasive pendant 2 jours.
Bénéfices attendus
Depuis plus de 40 ans, le poisson zèbre a été un modèle très utilisé pour comprendre la fonction des gènes. Il a même permis de corréler entre un locus donné et une pathologie humaine. Notre étude permettra de comprendre l’importance des deux protéines de l'environnement dans le développement et la régénération des nerfs moteurs et pourra apporter des arguments supplémentaires sur leur implication potentielle dans les maladies neuro-musculaires. En effet ll'une d'entre elle a déjà été mentionné comme candidat potentiel pour des neuropathies bien qu’aucune maladie humaine n’ait été associée avec une mutation dans ce gène pour l’instant. Chez l'homme, les nerfs périphériques sont aisément lésés et leur régénération est lente et souvent incomplète. En fait, moins de la moitié des patients qui subissent une réparation après lésion récupèrent de bonnes fonctions motrices et sensorielles. L’amélioration des connaissances fondamentales dans les molécules impliquées dans la régénération des nerfs moteurs est donc essentielle et ces données auront une application dans la médecine régénérative
Procédures
Les poissons seront génotypés au maximum 2 fois durant leur vie à partir de 3 mois (âge adulte) par prélevement d'un petit échantillon de la nageoire caudale afin de déterminer les poissons homozygotes à l'aide de ciseaux stérilisés à l'alcool 70% puis rincés à l'eau stérile. Le prélèvement se fait sous anesthésie et la procédure totale dure trois minutes. L'animal est immédiatement transféré dans le bac de réveil dont l'eau est correctement aérée jusqu'à la reprise totale de ses capacités soit 1 à 2 min. La nageoire régénère naturellement en 10 jours sans que cela n'impacte sur la nage du poisson.
Impact sur les animaux
Compte tenu des données obtenues chez les souris invalidées pour les deux gènes et du fait de leur faible fonction chez l'organisme adulte, les poissons adultes homozygotes ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. En revanche, les poissons doublement mutants pourraient être plus sensibles aux conditions d'élevage avec un vieillissement plus précoce consistant en une baisse de la reproduction et des animaux amaigris. Concernant les alevins subissant une ablation du nerf moteur, la douleur devrait être minime compte tenu du stade auquel l'expérimentation est effectué : 4 jour post-fécondation alors que le poisson est hors cadre de la législation. A ce stade, le système nerveux central n'est pas encore mature et les comportements complèxes ne sont pas encore présents. De plus la lésion d'un seul nerf moteur dans le tronc correspond à 1,7% des nerfs totaux. Des études ont aussi montré que chez des alevins de 5 jours post-fécondation (stade couvert par la législation), les marqueurs de la douleur revenaient rapidement à la normale en 24 h suivant le stimulus nociceptif. Aussi, les alevins agés de 5 jours-post fécondation ne devraient pas non plus ressentir de douleur puisque cela correspond à 24 h suivant l'ablation. Enfin, le poisson zèbre est un modèle animal qui a une forte capacité de régénération de nombreux organes comme le coeur et le cerveau. Une complète régénération du nerf moteur est observé 48 h après ablation chez le jeune alevin wt.
Devenir
Les animaux d’environ 1 an et 4 mois sont mis à mort par surdose d'anesthésiant quand ceux de la génération suivante atteignent la maturité sexuelle et sont capables de se reproduire afin de donner de nouveaux embryons, et donc alevins qui serviront à l’étude de la régénération. Tous les alevins pour l’étude de la régénération seront mis à mort par anesthésie suivie d'une commotion cérébrale afin de pouvoir réaliser des études histologiques.
Remplacement
Le processus de régénération des nerfs intervient dans un environnement complexe qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Nous utiliserons le poisson zèbre plutôt que le modèle de la souris déjà établi car il permet de visualiser in vivo le processus de régénération par fluorescence de manière non invasive.
Réduction
La capacité de fécondation externe du poisson zèbre permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre de poissons a été réduit au minimum de deux lots de 20 pour chaque lignée. Ce nombre est nécessaire à la fois pour assurer la pérénité de chaque lignée et pour permettre aux poissons de se développer correctement et d'avoir correctement accès à la nourriture. Contrairement à la souris, chez le poisson zèbre il est nécessaire d'effectuer un brassage génétique en utilisant suffisamment de couples pour obtenir une nouvelle génération. De plus, il n'y a pas de chromosome sexuel, aussi il est difficile de contrôler le ratio mâles/femelles. Enfin ce nombre de 20 poissons par bac est important pour le bien être de l'animal puisque le poisson zèbre est un animal grégaire il est nécessaire de l'élever en un nombre suffisamment important pour permettre les interactions sociales.
Raffinement
Des points limites adaptées à la procédure et suffisament prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être de l'animal. Au cours de l'élevage, le bien être des poissons sera vérifié de manière hebdomadaire tout au long de la vie des animaux. Les animaux qui présentent des phénotypes tels que animaux ne se nourrissant pas, animaux amaigris, animaux présentant des défauts musculo-squelettique (scoliose, lordose, ...), animaux présentant un comportement indicatif d'un stress chronique (animaux isolés au fond d'un bac, décolorés, ...) seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance. Après ablation d’un nerf moteur, le réveil des alevins sera surveillé. Un retour à l'activité motrice en absence d'anesthésiant apparait en quelques minutes. Puis l’état des alevins sera suivi quotidiennement sous stéréoscope (soit à 5 et 6 jours post-fécondation). Tout alevin présentant un défaut de flotabilité, restant au fond du puit dans la boîte 12 puits sera mis à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un bon modèle pour l'étude du développement des nerfs moteurs. Le développement du système nerveux périphérique moteur est relativement simple. Concernant l’étude de la régénération des nerfs périphériques, grâce à l'utilisation de lignées transgéniques fluorescentes la régénération des nerfs peut être suivie in vivo en temps réel par fluorescence donc de manière non invasive chez les alevins. Les embryons sont obtenus sans souffrance après accouplement naturel de poissons adultes puisque la fécondation se fait ex utero. De plus chez les alevins de type sauvage, les nerfs régénèrent rapidement, en 48 h après ablation. Enfin, lorsque le nerf est sectionné par ablation laser, l'alevin est âgé de 4 jours post-fécondation, il peut encore se nourrir à partir de son sac vitellin et est ainsi indépendant. Il ne devient sous la dépendance de la loi qu’à partir de 5 jours post-fécondation alors que le phénomène de régénération a déjà commencé, ce qui signifie que la condition de souffrance est minimisé Des poissons adultes de 4 à 16 mois homozygotes et hétérozygotes adultes seront utilisés pour obtenir des embryons homozygotes ou hétérozygotes par accouplement naturel puisqu'à ce stade, ils sont pleinement fertiles. Des alevins de 4 à 6 jours post-fécondation seront utilisés pour étudier le processus de régénération. Tandis que les organes se développent rapidement chez les embryons et alevins de poisson zèbre; le système nerveux central reste encore primitif jusqu'à 5 jours post-fécondation. De plus il a déjà été montré que la régénération s'effectuait de manière rapide : en 2 jours il y a régénération complète ce qui signifie que la douleur ressentie est minimisée.
Étude de la réponse immunitaire innée induite par des bactéries pathogènes chez le vertébré Danio rerio (zebrafish).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
70 610 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 64 410 d'entre eux, la plupart tués en fin d'expérience et quelques adultes gardés vivants pour la reproduction. Aux stades embryonnaire et larvaire, ils sont infectés par des bactéries pathogènes et observés par transparence, puis mis à mort par surdose d'anesthésiant. Le porteur présente le recours au poisson zèbre comme relevant lui-même du "Remplacement" des mammifères, tout en déclarant plus de 64 000 individus en souffrance sévère. Il affirme que l'usage d'animaux reste "incontournable", une cellule ne pouvant reproduire un organisme entier.
Objectifs
Les maladies infectieuses affectent les personnes et les animaux avec un impact considérable sur les économies mondiales et la santé publique. La résistance aux antimicrobiens est responsable des échecs de traitement entraînant une estimation de 700.000 décès humains chaque année dans le monde (OMS, 2018). Il donc est urgent de résoudre ce problème croissant en développant des thérapies alternatives. Comprendre comment les infections affectent les organismes vivants est une étape importante pour le développement de ces thérapies . Cependant, elle nécessite de travailler avec des modèles animaux. Afin d’adopter la stratégie 3R (Remplacement, Raffinement et Réduction) pour ses travaux, ce projet implique l’utilisation du zebrafish (Danio rerio) (Remplacement). Le zebrafish a été choisi car l’étude de son embryon offre de nombreux avantages pour l’étude de certaines maladies infectieuses. En effet, du fait de sa transparence, nous pouvons l’observer directement sous un microscope pour suivre sa réponse immunitaire aux infections à différents temps sans avoir à l’euthanasier. Ceci permet de Réduire de façon substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour mener convenablement les études. De surcroit, de très nombreux outils expérimentaux sont disponibles, comme par exemple, des lignées de zebrafish où l’on peut observer directement les cellules qui luttent contre les infections avec un microscope. Ces outils permettent de Raffiner les expériences et donc d’obtenir des résultats beaucoup plus robustes et statistiquement plus significatifs. Le but du présent projet est de : -comprendre le developpement d’une infection induites par des microbes impliqués dans des maladies humaines - étudier et comparer la nocivité des différentes bactéries, c’est-à-dire comprendre comment ces bactéries infectent les organismes vivants (animaux), survivent et se développent dans ces organismes, -identifier les facteurs microbiens impliqués dans ces processus -identifier les gènes de l’hôtes impliqués dans la défense contre les bactéries -identifier des médicaments ou therapies permettant lutter contre les infections bactériennes.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est d’apporter des solutions thérapeutiques à des problèmes clefs du domaine des infections bactériennes. A couts terme, le projet fournira des connaissances fondamentales sur le développement des maladies infectieuses. Ces connaissances seront plubliées dans des revues scientifiques spécialisées permettant la diffusion de la science. Les différents microbes que nous étudierons ont en commun la capacité de survivre dans l’organisme qu’ils infectent, leur permettant ainsi de persister à long terme, conduisant à des infections chroniques. Ce projet permettra de comprendre comment les microbes échappent aux défenses immunitaires de de l’organisme hôte et nous identifierons les molécules produites par l’agent infectieux qui sont importantes pour la persistance du microbe dans l’organisme hôte. Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet permettront à moyen terme d’identifier des molécules pouvant être ciblée par de futurs traitements anti-microbiens. A plus long terme de nouveaux medicaments anti-bactériens seront developpés pour traiter des patients atteints d’ infections chroniques.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux de plus de 5 jours de développement sont les suivants : - Immobilisation sous anesthésie générale dans de l’eau à 28°C dans une boite avec un fond en verre pour l’observation avec un microscope, au stade 6 à 17 jours de développement sur une durée courte inferieur à 1h ou sur une longue durée (entre 1 et 15 heures au cours de la nuit). Cette intervention lorsqu’elle est courte (inférieur à 1 h) pourra être répétée une fois chaque jour jusqu’à 17 jours (n total= 46 800 embryons et larves).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont les suivantes : -Pour les embryons ayant subies une infection, les microbes présents dans l’organisme peuvent induire une infection aigue ou chronique. Du fait de l’infection, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement. - Pour les embryons traités avec des médicaments, si la dose n’est pas adaptée, elle peut induire des effets secondaires sur l’organisme. Si tel est le cas, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement La surveillance régulière des embryons par simple observation permettra de détecter ces changements dès leur apparition, la prise de nourriture et les mouvements de nage seront surveillés.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort, soit en fin d’expérience, soit en cours d’expérimentation pour tout animal qui, présente un état prédictif d’une grande douleur ou d’une mort prochaine. Pour la mise à mort, les animaux seront traités tout d’abord avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée pour atteindre une dose léthale et induire la mort. Les animaux morts seront ensuite traités avec de l’eau de javel (lorsque l’animale est infecté par un microbe), puis ils seront ensuite congelés à -20°C et éliminés comme des déchets biologiques et incinérés. Pour l’étude des gènes importants dans la défense contre les bactéries, seuls les animaux porteurs des modifications génétiques permettant l’inactivation du gène d’intérêt, seront maintenus dans notre animalerie pour constituer le stock d’animaux reproducteurs, c’est-à-dire qui seront uniquement utilisés pour des accouplements afin d’obtenir des embryons. Ces animaux seront gardés sous observation quotidienne jusqu’au stade adulte et pendant les deux premières années afin de déceler toute anomalie et détecter tout signe de maladie afin de prévenir une soufrance ou une mort éventuelle par une mise à mort.
Remplacement
Une cellule ne pouvant reproduire la complexité d’un organisme entier, pour l’instant, l’utilisation des animaux reste incontournable. Aujourd’hui, aucun des modèles animaux disponibles pour l’étude de l’inflammation et des infections faisant l’objet de ce projet ne permet de combiner à la fois : 1) l’induction d’une véritable infection induisant le développement d’une maladie proche de celle observée chez l’homme 2) la possibilité d’une évaluation rapide de l'efficacité des médicaments en visualisant leur effet sans mettre à mort l'animal grâce notamment aux techniques d’imagerie des organismes vivants par transparence. Le développement du modèle animal zebrafish reste donc un choix incontournable. Il offre ainsi une alternative tres intéressante aux modèles mammifères permettant ainsi le Remplacement. En effets les infections ainsi qu’une grande partie des observations faites sur l’animal seront realisées avant le stade de 5 jours de développement.
Réduction
La transparence intrinsèque des embryons et des larves de zebrafish permet de décrire et de suivre les infections en temps réel par transparence, à differents temps sans avoir à euthanasier l’animal et donc de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, les adultes assurant uniquement la production d’œufs. Pour des raisons de reproductibilité, chaque expérience est reproduite 3 fois de façon indépendante, avec un nombre minimal d’individus à utiliser pour chaque expérience. Les tests statistiques et le nombre de poissons pour chaque experience ont été determinés grâce aux données bibliographiques. Par la suite, le nombre d’animaux sera réajusté au cours du projet grâce à des logiciels de statistique permettant d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tous nos poissons font l’objet d’une surveillance quotidienne (y compris les week-ends et jours fériés) par du personnel qualifié et avec roulement d’astreinte. Pour les larves de zebrafish, la surveillance est basée sur l’observation par transparence de plusieurs paramètres physiologiques comme la presence d’une bonne circulation sanguine, la mesure du rythme respiratoire ou autre symptômes anormaux. Pour les adultes, la surveillance est basée sur l’observation de changements du rythme respiratoire, de leur comportement, et d’une réponse de stress, ainsi que l’observation des signes externes de maladies. Les individus présentant des caracteristiques anormales seront automatiquement mis à mort avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée jusqu’à une dose léthale pour induire la mort. Tout au long des expériences, les embryons et les larves de zebrafish sont maintenus à la température optimale de 28°C avec un cycle jour/nuit. La qualité de l’eau est surveillée afin de presenter en permanence les paramètres en sel et de pH optimaux. Nous contrôlons qu'ils ne soient pas maintenus en trop forte densité et que les individus ayant des caractéristiques anormales soient mis à mort systématiquement. Les larves maintenues au dela de 5 jours auront un milieu enrichi en micro-organismes. Tout geste technique sera réalisé avant 5 jours de développement et sous anesthésie générale. Des réunions concernant l’animalerie et la surveillance des poissons sont organisées régulièrement et permettent de faire évoluer le système de suveillance des animaux et de raffinement.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le zebrafish (Danio rerio). Les nouvelles techniques rendent le zebrafish pertinent pour le Remplacement des mammifères pour l’étude de l’inflammation et des maladies infectieuses notamment grâce à sa transparence et à l’utilisation d’imagerie en temps réel qui permettent de Réduire le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement bons. De plus, l’existance de nombreux outils expérimentaux permettant de suivre facilement les cellules immunitaires marquées par transparence permettent de Raffiner les études. Par rapport au modèle souris, le zebrafish répond donc parfaitement aux besoins de Remplacer, de Réduire et de Raffiner. Par sa taille, le zebrafish se révèle attractif pour la découverte de nouveaux médicaments . Pour les expériences de test de médicaments et d’infections, nous utilisons des embryons et des larves de zebrafish. Tous les gestes techniques sont effectués avant le stade 5 jours. Une partie des analyses se font sur des embryons et larves dont les stades ne dépassent pas 5 dpf et qui ne nécessitent donc pas de répondre à un protocole soumis au comité d’éthique. Seules certaines larves font l’objet d’un suivi plus long, notamment pour l’étude des infections persistentes au-delà de 5 jours. Aucune infection n’ est réalisée sur le stade adulte. Donc en fonction de l’analyse realisée, nous utiliserons des larves de différents stades de developement : du stade 1-cellule (0 jour de développement) à 17 jours de développement. Seules certaines larves etudiées en microscopie seront maintenues en vie jusqu’à 1 mois. Pour l’obtention d’animaux portant une modification génétique permettant l’étude des gènes importants pour la réponse immunitaires, les animaux sont elevés jusqu’à l’age adulte mais ne subissent aucune infection. S’ils portent la modification génétique d’intérêt, ils seront maintenus dans l’animalerie pour assurer la reproduction et pour produire des œufs.
Etude dans un modèle de larve de poisson-zèbre du rôle des vésicules extracellulaires dans les dommages hépatiques et cérébraux associés à la progression de la maladie du foie gras induite par des contaminants environnementaux
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
7 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pendant huit jours puis une exposition à des polluants, benzo[a]pyrène ou pyrène, pendant sept jours, pour reproduire une maladie du foie gras et ses atteintes cérébrales. Le porteur décrit une nage plus faible ou anarchique comme effet attendu et renvoie au conditionnel un éventuel intérêt chez l'Homme. Il présente le poisson zèbre comme une alternative au modèle rongeur tout en jugeant l'expérimentation animale "indispensable".
Objectifs
Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (25% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie et qui peut avoir des répercussions au niveau du cerveau avec le développement d'encéphalopathies. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux polluants environnementaux comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) est identifiée comme un facteur de risque. L’un de mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication crucial participant aux échanges entre le foie et le cerveau et favorisant la progression de ces maladies et l’apparition de dommages aux niveaux de ces organes. Il apparait donc important d’évaluer le rôle de ces vésicules dans ce contexte de NAFLD et d’exposition aux HAPs et en particulier sur les dommages hépatiques et cérébraux. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes, dont le foie et le cerveau, et différents types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous mettrons en place une approche expérimentale sur un modèle de poisson-zèbre afin de comprendre le rôle des vésicules extracellulaires dans la progression des NAFLD induite par une exposition aux HAPs.
Bénéfices attendus
Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le rôle des vésicules extracellulaires dans les effets néfastes d'une exposition à un polluant de l'environnement (benzo[a]pyrène ou pyrène) dans les maladies du foie et les dommages cérébraux associés. En outre, l'étude des potentiels effets protecteurs de molécules capables de réduire la production ou la capture de ces vésicules dans le cadre de ces pathologies pourra être une preuve de concept pertinente et permettre d'envisager d'autres études pour une éventuelle utilisation chez l'Homme.
Procédures
Alimentation avec un régime enrichi en graisse (8 jours) Exposition à des polluants de l'environnement (7 jours)
Impact sur les animaux
L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques avec des complications au niveau du cerveau. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons : développement d'une steatohépatite et peut-être le développement des premiers signes d'une encéphalopathie hépatique. Cependant cet impact restera modèré puisque qu'à ce stade de maladie, aucun signe de souffrance ne devrait se manifester mais il se pourrait que le comportempent des poissons soit légèrement altéré (nage plus faible ou anarchique; recherche alimenataire plus lente).
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement) puisqu’il s’agit d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires, un moyen de communication entre cellules et organes et qui circulent dans le sang. En particulier, l’un des objectifs de ce projet est d’évaluer si des vésicules émises par le foie peuvent induire des dommages au niveau du cerveau. Dans ce contexte, seul l’utilisation de modèles animaux permet d’appréhender la complexité de ces relations entre cellules et organes. Toutefois, l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.
Réduction
Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. En effet, de par l’expérience que nous avons de ce modèle et des expériences que nous voulons réaliser, nous avons pu déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles malgré la variabilité liée à l’expérimentation animale.
Raffinement
Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale (suivi d’une grille d’évaluation de la souffrance adaptée au modèle). Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux (qualité de l’eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poisson par bac…). Si une souffrance excessive venait à être détectée, quelle qu’en soit la cause (hébergement, manipulation, impact des traitements), les expérimentations concernées seront arrêtées et les procédures seront révisées (modifications des conditions d’hébergement, réduction des doses d’exposition aux agents toxiques…). Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux.
Choix des espèces
Ce projet vise à évaluer l’impact des HAP sur l’appartion et la progression des NAFLD (maladies du foie allant de la stéatose vers un état pathologique, la stéatohépatite et qui peut se traduire également par complication au niveau cérébral). Le modèle de poisson zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et ainsi à l’avenir limiter l’utilisation de ces modèles mammifères. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude physio-pathologique avec l’Homme notamment concernant le foie et les NAFLD (types cellulaires et métabolisme) mais également au niveau de la neurotoxicité ; une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 4 et 12 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des NAFLD (induite par l’alimentation notamment) mais également pour évaluer la neurotoxicité de différents traitements.
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents
- Protection de l’environnement
Saumons : 2500
Loups de mer : 1000
Autres poissons : 3000
9 000 poissons, poissons zèbres, saumons, loups de mer et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la quasi-totalité tuée et 70 poissons zèbres conservés pour l'élevage. Ils sont exposés dans l'eau à des concentrations de substances chimiques, effluents, biocides ou produits phytosanitaires, dans des essais où la mort d'un certain nombre d'individus est le résultat recherché. Le porteur indique que ces essais réglementaires servent à évaluer la toxicité pour l'environnement. Les poissons issus de ces procédures sévères ne peuvent être ni réutilisés ni relâchés.
Objectifs
La qualité des écosystèmes et leur préservation est en lien directe avec la santé. Dans ce cadre, il est important d’établir des diagnostics de l’état de ces écosystèmes et également de prédire l’impact potentiel des activités anthropiques sur ces écosystèmes. La toxicité des effluents, des produits chimiques, des phytosanitaires et biocides ou des substances sur les écosystèmes aquatiques est évaluée en utilisant différents modèles biologiques comme des bactéries, des végétaux, des invertébrés et des poissons. Les effets recherchés peuvent être aigus (mort) ou chroniques (croissance, développement larvaire). Ces essais rentrent dans le cadre de nombreuses règlementations (CLP, REACH, directive biocide, directive phytosanitaire) et permettent d’évaluer les risques pour l’environnement. Cette étude correspond à l’évaluation de la toxicité aiguë sur les poissons en suivant la ligne directrice OCDE 203 ou une méthode équivalente. L'objectif du projet est de déterminer les concentrations en élément d'essai entrainant des effets sur la survie des poissons. Les valeurs à déterminer sont la concentration n'entrainant pas d'effet (NOEC) et si nécessaire la concentration entrainant 10% ou 50% d'effet sur la survie des poissons.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettent l'étiquetage des substances et la réalisation de l'évaluation des risques des substances introduites dans l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à des concentrations en substance chimiques via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Cet essai visant à déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis des poissons, il est probable qu'un certain nombre d'individus meurent au cours de la procédure.
Devenir
Les animaux sont issus d'une procédure sévère, ils ne peuvent donc pas être réutilisés. De plus, les espèces de poissons utilisées ne sont pas toutes des espèces domestiques qui peuvent être replacés en aquarium ou par des associations.
Remplacement
Dans le cas où des méthodes alternatives, des essais sur lignées cellulaires ou des essais sur les embryons de poissons n'ont pas permis de dériver des données fiables, les autorités peuvent exiger un essai de toxicité aiguë sur poisson.
Réduction
Les données issues d'essai sur les oeufs de poissons peuvent être utilisées à la place de l'essai préliminaire. Dans le cas où les essais poissons sont réalisés en même temps que d’autres essais (par exemples daphnies et algues), ces essais sont réalisés au préalable et un essai limite avec 7 poissons par condition est réalisé sur les poissons à la concentration entrainant 50% d'effet la plus basse des autres tests conformément à la monographie n°126 de l’OCDE. Utilisation de 14 poissons par test limite au lieu de 42 poissons pour un test complet. Si plusieurs essais sont réalisés en même temps, les témoins sont mutualisés.
Raffinement
Une charge maximale de 0.8 g de poids frais/L est utilisée au cours des tests. la concentration en oxygène dissout doit être maintenu au dessus de 60%. Les perturbations (vibrations ou bruit excessifs, par exemple) qui pourraient modifier le comportement des poissons doivent être évitées ou réduites autant que possible. Les poissons témoins pourront être en fonction des demandes placés à la fin du test. Une observation journalière des organismes est réalisée a minima et 2 fois par jour si apparition de symptômes évocateurs de souffrances.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les poissons utilisés seront au stade juvénile ou adulte conformément aux normes utilisées.
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents sur les premiers stades de la vie de poissons
- Protection de l’environnement
Saumons : 5000
Autres poissons : 10000
27500 poissons vont être utilisés, aux premiers stades de vie de l'œuf au juvénile, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Poissons zèbres, salmonidés et autres poissons sont exposés à des substances chimiques et des effluents pour des essais écotoxicologiques réglementaires. Le porteur indique que ces essais peuvent provoquer des malformations pouvant conduire à la mort. Le résumé affirme que tous les poissons sont tués en fin de test, alors que le champ structuré déclare 2000 poissons zèbres adoptés.
Objectifs
La qualité des écosystèmes et leur préservation est en lien directe avec la santé. Dans ce cadre, il est important d’établir des diagnostics de l’état de ces écosystèmes et également de prédire l’impact potentiel des activités anthropiques sur ces écosystèmes. La toxicité des effluents, des produits chimiques, des phytosanitaires et biocides ou des substances sur les écosystèmes aquatiques est évaluée en utilisant différents modèles biologiques comme des bactéries, des végétaux, des invertébrés et des poissons. Les effets recherchés peuvent être aigus (mort) ou chroniques (croissance, développement larvaire). Ces essais rentrent dans le cadre de nombreuses règlementations (CLP, REACH, directive biocide, directive phytosanitaire) et permettent d’évaluer les risques pour l’environnement. Ces essais vont permettre de déterminer les valeurs de toxicité chronique (CEx = concentration entrainant X% de malformations sur les poissons ou CSEO = concentration sans effet observé) de substances ou de matrices environnementales en adéquation avec les règlementations des différents pays afin d’évaluer les risques pour l’écosystème aquatique.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus seront utilisés dans le cadre de l'évaluation du risque des substances chimiques, produits formulés, médicaments ou autre afin de déterminer les concentrations maximales acceptables dans l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à des concentrations en substances chimiques via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Ces essais peuvent entrainer des malformations plus ou moins sévères pouvant conduire à la mort des organismes.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du test afin de réaliser les mesures biologiques nécessaires (poids, taille).
Remplacement
Ces essais sont exigées par les règlementations quand des équivalence avec d'autres substances ne sont pas possibles, pas pertinent ou que les données issues de la littérature ne sont pas suffisantes.
Réduction
Les données issues d'essais aiguës ou de la littérature sont utilisées pour définir la gamme de concentration à réaliser dans l'essai définitif. Si ces données n'existe pas, un essai sur les oeufs sera réalisé pour définir la gamme.
Raffinement
Les poissons seront maintenus dans un environnement permettant une croissance optimale en termes de qualité d’eau et d’alimentation.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées par les normes et les règlementations. Les poissons utilisés seront au stade œuf jusqu’au stade juvénile conformément aux normes utilisées.
Mécanismes contrôlant la perte de cellules souches neurales dans le cerveau adulte de Danio rerio
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
14 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur leur électropore des plasmides dans les cellules souches neurales sous anesthésie, les expose à des traitements dans l'eau et en irradie une partie aux rayons X pour provoquer de la mort cellulaire. Tous sont mis à mort pour prélever le télencéphale, le porteur reconnaissant un manque de données sur les analgésiques efficaces chez cette espèce. Il affirme que la culture cellulaire détruit l'organisation de la niche et que les cellules isolées montrent des comportements "aberrants" absents in vivo.
Objectifs
Notre but est de comprendre quels mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlent la perte des cellules souches neurales adultes dans le cerveau des vertébrés.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet permettra de caractériser les deux mécanismes principaux de perte de CSNs dans le cerveau adulte en conditions physiologiques : la division symétrique neurogénique, et la transdifférenciation. Ces mécanismes seront des candidats intéressants de dysfonction en conditions pathologiques de perte de CSNs, comme le vieillissement ou certains troubles du comportement.
Procédures
Procédures 2, 3, 4, 6 et 9 : les animaux seront soumis, une fois dans leurs vies et sous anesthésie, à une procédure d’electroporation de plasmides dans les cellules souches neurales. Cette manipulation prend environ 1 à 2 min par poisson. Procédures 5 et 7 : les animaux seront donc soumis à un traitement administré dans l’eau de nage. Cette manipulation prend moins d’une minute par lot de poisson car il s’agit ‘juste’ de les transférer d’un bac a un autre (dans lequel a déjà été dilué le traitement). Il y a ensuite la durée du traitement mais sans action car les poissons sont libres de nager dans leurs bacs. Procédure 10 : les animaux seront soumis à une relativement faible irradiation aux rayons X de 80Gy afin d’induire une légère augmentation des évènements de mort cellulaire. Cette manipulation se passe en plusieurs ‘étapes’ : le transfert des poissons dans des bacs isothermes (moins d’une minute pour transférer les poissons dans un aquarium avec 3cm de hauteur) et le traitement dans l’irradiateur des poissons (dans leur aquarium) qui dure un maximum de 57 min pour une dose de 80Gy.
Impact sur les animaux
Nous ne prévoyons aucun effet indésirable ou nuisance sur les animaux. Si un effet indésirable inattendu apparait nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.
Devenir
Tous les animaux doivent être mis à mort afin de prélever le télencéphale pour l’analyser.
Remplacement
Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules peuvent être perdues dans le cerveau adulte. Le travail sur CSNs en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les CSNs isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode de division. Ce paramètre impacte de façon directe le maintien ou la déplétion des populations souches. Par ailleurs, à l’heure actuelle, la transdifférenciation, pourtant importante in vivo n’a pas été observée in vitro. Enfin, par imagerie intravitale, il a été démontré que les choix de destins des CSNs sont contrôlés à l’échelle de la population et impliquent une coordination spatio-temporelle entre cellules au sein de leur niche. Toute approche in vitro détruit cette niche et cette organisation spatiale.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Concernant les procédures de traçage et d’électroporation, différents articles publiés ces dernières années montrent que le comptage d’environ 150 cellules sur un minimum de 10 animaux est suffisant pour rendre compte des choix effectués, de façon comparable à un comptage de la population globale. Ces valeurs suffisent à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test de Fischer) des choix de destin entre des CSNs contrôles et manipulées. Nous travaillerons donc dans chaque cas avec 10 animaux et uniquement si besoin certaines expériences seront répétées (maximum 3 répétitions). Concernant l’utilisation d’inhibiteur pharmacologique, nous travaillerons avec 10 animaux par condition ce qui suffit à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test exacte de Fisher) de CSNs activées versus non-activées entre des animaux contrôles et des conditions de blocage des voies de signalisation.
Raffinement
Les manipulations, invasives ou nécessitant une immobilisation temporaire seront conduites sur animaux anesthésiés. Les inductions (tamoxifène, doxycycline) seront administrées dans l’eau de nage. Les animaux sont toujours maintenus en groupe afin de garantir leurs bien-être. Nous suivrons quotidiennement les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une mise à mort. Chez Danio rerio, il y a un manque d’information sur les effets et la spécificité des produits « classiques » analgésiques. Cependant, une étude récente suggère l’utilisation de lidocaine 2-5 mg/ml dans le bain de réveil. Nous suivrons cette procédure aussi souvent que possible.
Choix des espèces
Nous avons choisi le poisson téléostéen Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de CSNs. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de CSN par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches in toto qui évitent de perdre des cellules comme lorsqu’un organe est analysé sur coupes. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les CSNs de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par la voie de signalisation Notch). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des CSNs adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des CSNs sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.
Etude des mécanismes d’apparition de la scoliose chez le poisson-zèbre Danio rerio, en particulier du rôle des cils du système nerveux dans ce processus.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
2500 poissons zèbres vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés ou menées sous anesthésie sans réveil. Des lignées mutantes développent une scoliose progressive pouvant réduire leur capacité à nager et à accéder à la nourriture, et des larves reçoivent des injections de colorant dans le cerveau sous anesthésie terminale. Un morceau de nageoire est prélevé pour le génotypage et vingt individus seulement sont gardés vivants pour reproduction. Le porteur indique utiliser des modèles cellulaires mais affirme que l'étude de la colonne vertébrale sur un vertébré reste essentielle.
Objectifs
Ce projet vise à identifier les mécanismes d'apparition de scolioses chez le poisson zèbre en lien avec les anomalies du fonctionnement des cils du système nerveux. Nous étudions des gènes qui causent des ciliopathies, des maladies humaines rares liées à des défauts de formation ou de fonction des cils, des organites cellulaires sensoriels et motiles présents sur la majorité des cellules. Le poisson zèbre a des intérêts scientifiques et techniques uniques pour l'étude des processus développementaux: transparence des embryons, développement externe, possibilité de produire et d'étudier des lignées mutantes. De plus, c'est un modèle reconnu de la scoliose idiopathique, une maladie très répandue (qui affecte 3% des adolescents dans le monde) dont l'étiologie est très mal comprise. Notre projet se subdivise en 3 objectifs: 1) Identifier les mécanismes d'apparition de la scoliose due à une dysfonction ciliaire, en prenant pour modèle un mutant de poisson-zèbre. Ce mutant ne présente pas de létalité embryonnaire à l'état homozygote et développe une scoliose progressive chez le poisson juvénile. 2) Tester les interactions fonctionnelles entre différents protéines ciliaires et avec des acteurs de la signalisation des neuropeptides en étudiants des doubles mutants. 3) Tenter de diminuer ou de retarder la scoliose par des traitements par des drogues. Pour l'ensemble du projet, nous utiliserons 2500 animaux sur 5 ans. Les animaux utilisés pour des expériences avant la fin du stade embryonnaire (5 jours) ne sont pas inclus dans ce décompte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à court et moyen terme, de mieux comprendre les événements qui conduisent à la scoliose chez le poisson-zèbre, en espérant à plus long terme que les mécanismes pathologiques identifiés pourront au moins en partie être validés chez l’homme. La scoliose idiopathique est une maladie d’origine inconnue qui touche environ 3% des adolescents dans le monde. Ceci est particulièrement important car il n’existe à ce jour pas de traitement médicamenteux pour la scoliose. Les seules interventions possibles sont le port d’un corset, traitement préventif, qui ne corrige pas la scoliose déjà existante, ou l’arthrodèse, une chirurgie lourde qui consiste à fixer les vertèbres les unes aux autres.
Procédures
Des animaux mutants ou double-mutants à phénotype dommageable de scoliose seront produits. La scoliose apparait entre 4 et 5 semaines après la ponte. Dans le cas où les animaux sont produits pour observation de l’évolution de la scoliose, les animaux seront maintenus jusqu’à l’âge de 6 mois. La durée de cette procédure est donc de 6 mois. Dans le cas où les animaux sont euthanasiés pour prélèvements, l’euthanasie interviendra à 3 stades différents : 5-21 jours, 3-9 semaines (2 stades différents) et 3-4 mois. Dans ces deux cas, entre 1 à 2 mois, un petit morceau de nageoire caudale sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant. L’anesthésie pour prélèvement de nageoire dure moins d'une minute. Une à deux semaines après le prélèvement, la nageoire caudale a complètement régénéré. Pour la procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central, les larves anesthésiées seront soumises à des injections sous loupe binoculaire de Dye fluorescent ou billes dans le ventricule cérébral ou canal: 90 larves âgées de 5 jours et 90 larves âgées de 15 jours seront injectées puis la diffusion du Dye sera observée sous microscope pendant 2h dans une atmosphère thermostatée et sous anesthésie. Les larves seront euthanasiées à la fin de l'expérience, donc au bout de 2 heures. Pour la procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose, un test de drogues sera réalisé sur 600 alevins âgés de 7 jours à 8 semaines. Observation de l'apparition de la scoliose pendant ces 7 semaines d'expériences. Vers 1-2 mois, un petit morceau de leurs nageoires caudales sera prélevé sur l'alevin anesthésié pour l'identification afin de conserver les alevins au génotype intéressant.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue vient de l’utilisation de lignées mutantes de poissons qui développent une scoliose à l’état homozygote chez l’adulte. Cette scoliose (torsion tridimensionnelle de la colonne vertébrale en absence de malformations vertébrales ou de fractures) peut, dans les cas les plus graves, induire une difficulté de nage donc une mobilité réduite et une compétition avec des poissons sains pour l’accès à la nourriture.
Devenir
La production de lignées double-mutantes pour l’observation de l’apparition de la scoliose est procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (adultes de 6 mois environ), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. 20 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. La production de lignées mutantes pour analyse phénotypique sur animaux euthanasiés est une procédure de sévérité modérée. Dans cette procédure les animaux seront euthanasiés eà différents stades larvaires, juvéniles et adultes pour prélever les organes et réaliser des analyses. La seule raison pour les euthanasier en dehors de ce protocole serait les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring. La procédure d’injection de billes ou dye fluorescent dans le ventricule cérébral ou canal central est une procédure sans réveil. Toutes les larves seront sous anesthésie pendant toute la durée de la procédure et euthanasiées à la fin. En effet, l’injection d’un colorant fluorescent dans les ventricules du cerveau et l’observation de la larve vivante sous microscope pendant plusieurs heures compromettent la viabilité de l’animal et génèreraient potentiellement des souffrances en cas de réveil. La procédure de test de drogues pour diminuer ou retarder la scoliose est une procédure de sévérité modérée. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience (8 semaines ou 12 semaines en fonction du génotype), sauf dans les cas où ils doivent être euthanasiés plus tôt car ils ont atteint les points limites selon notre grille de scoring.
Remplacement
Dès que possible nous utilisons des modèles cellulaires pour remplacer l’expérimentation animale. Nous avons ainsi développé dans les dernières années des modèles de cellules souches embryonnaires de souris et de cellules pluripotentes induites humaines que nous différencions en différents types neuronaux, en deux dimensions et en culture de type organoïdes. Ceci nous permet de comprendre par exemple le rôle des cils dans la formation des neurones. Néanmoins, l’expérimentation sur le poisson reste essentielle, en complément des modèles cellulaires, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus de développement aussi complexes que la morphogenèse du système nerveux central ou de la colonne vertébrale.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans aucun dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Nous réutilisons aussi les animaux adultes produits dans certaines expériences (par exemple des animaux hétérozygotes pour certaines mutations) pour réaliser d’autres expériences. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des poissons dès l’âge de 1 mois (au lieu de 2 mois habituellement). Le nombre total d’animaux impliqués est de 2500.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28°C, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2-3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de transgenèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson-zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse. Nous analysons également l’impact d’un défaut des cils sur l’apparence de scoliose, pathologie pour laquelle le poisson-zèbre est un modèle de choix du fait des contraintes mécaniques subies par la colonne vertébrale pendant la nage. Ce modèle permet d’étudier les étapes précoces de la maladie, avant la survenue de la courbure, ce qui est difficile chez l’homme. Le poisson-zèbre permet également de tester des molécules chimiques pour retarder ou réduire l’apparition des scolioses. Les nageoires caudales sont coupées pour le génotypage sur des animaux âgés de plus de 2 mois. Pour certaines expériences, nous pourrons génotyper les poissons à un stade plus précoce (1 mois) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Afin d’étudier le développement de la scoliose, (phénotype dommageable modéré) nous réalisons des expériences sur des larves (5 jpf-21 jpf), des juvéniles (21 jpf-3 mois), et des adultes (> 3 mois).