Poissons zèbres
Impact de l’insuline sur la neurogenèse chez le poisson-zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
20 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on perce l'os du crâne avec une aiguille pour injecter de l'insuline dans les ventricules cérébraux, puis les cerveaux sont prélevés 24 heures plus tard, afin d'étudier la neurogenèse chez l'adulte. Le porteur décrit une procédure invasive mais rapide et affirme n'avoir jamais observé de troubles après ce type d'injection. Il conclut que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie ainsi le recours à l'animal.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer l'impact de l'injection intracérébroventriculaire d'insuline sur la neurogenèse chez le poisson-zèbre adulte. Bien que la neurogenèse soit un phénomène se produisant principalement au cours du développement du système nerveux, de nombreuses études ont démontré que ce processus pouvait se produire au niveau de certaines régions particulières du cerveau adulte. Les données de la littérature ont montré que la neurogenèse chez l'adulte pouvait être impactée tout au long de la vie par différents facteurs tels que le stress et les dommages cérébraux (accidents vasculaires cérébraux, traumatismes crâniens et maladies neurodégénératives). Dans le cadre de ce projet, nous nous intéressons à la prolifération des cellules souches neurales à la suite d'une injection intracérébroventriculaire d'insuline, en évaluant l'activité proliférative au niveau des niches neurogéniques des poissons zèbres adultes. Notre objectif est de comprendre si la stimulation des voies de l'insuline pourrait permettre d'augmenter la neurogenèse afin de contrecarrer l'effet de certaines maladies impactant négativement la neurogenèse (maladies neurodégératives, diabète, obésité).
Bénéfices attendus
Ce projet participera à une meilleure compréhension du rôle de l'insuline ainsi que des mécanismes au niveau moléculaire qui se mettent en place dans le processus de neurogenèse chez l'adulte. Il pourra permettre d'envisager à termes certaines solutions thérapeutiques visant à maintenir un certain niveau de neurogenèse indispensable à la mémorisation et à l'homéostasie cérébrale.
Procédures
Tous les animaux (n=20) seront soumis à une seule injection (véhicule ou insuline) au niveau des ventricules cérébraux. Il s'agit d'une procédure invasive mais rapide et réalisée sous anesthésie générale. Pour cela, le poisson est anesthésié sous tricaïne (0.02 %), un orifice au niveau de l'os du crâne à la jonction télencéphale/rhombencéphale est réalisé avec une aiguille 30G ½ et une injection intracérébroventriculaire d'insuline (1 à 2 μL) est effectuée au niveau de cet orifice via un micro injecteur. L’ensemble de la procédure dure environ 2 min.
Impact sur les animaux
L'injection, si mal réalisée, peut entrainer des troubles locomoteurs du poisson. Cependant, cette procédure sera réalisée par une personne qualifiée et expérimentée. Lorsque les poissons sont replacés dans de l’eau propre, la récupération est rapide (moins de 30 secondes). Un stress post-anesthésique peut être observé pendant cette période (
Devenir
A la fin de l'expérimentation (24h post-injection), les animaux sont mis à mort et les cerveaux sont prélevés afin de permettre l'étude de la prolifération des cellules souches neurales au niveau des niches neurogéniques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place. Le modèle animal permet de considérer l'ensemble des processus tels que l'activation de différentes voies de signalisation ainsi que l'activation de différents types cellulaires qui se mettent en place à la suite d'une injection d'insuline au niveau du ventricule.
Réduction
L'expérimentation a été conçue afin d'utiliser le moins d'animaux possible. Les expérimentations seront réalisées sur un nombre total de 20 poissons (10 animaux/groupe). Les données de précédentes études chez le poisson-zèbre au sein du laboratoire ont montré qu’un nombre minimal d’environ 10 poissons/groupe était suffisant afin de s’affranchir de la variabilité inter-individuelle et d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
A la suite de l'injection intracérébroventriculaire, les animaux sont regroupés dans un aquarium avec un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront appliqués et tout signe de souffrance sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de la plasticité cérébrale puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre.
Analyse fonctionnelle des gènes codant pour les récepteurs aux hormones corticostéroïdes chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Une partie subit des tests de performance comportementale, une autre une exposition de 48 heures à une eau appauvrie en sel qui provoque un déséquilibre osmotique, avant prélèvement des tissus. Le projet utilise des lignées dont les récepteurs au cortisol, l'hormone de stress, sont inactivés, pour comprendre leur rôle. Le porteur relie ces travaux au bien-être des animaux non-humains en élevage et à l'amélioration des méthodes d'aquaculture, bénéfices renvoyés au développement futur d'indicateurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de chaque récepteur au cortisol (hormone de stress) dans la régulation de l’homéostasie ionique et hydrique ainsi que dans des activités comportementales du poisson. L’exposition du poisson à une situation stressante active l’axe corticotrope et conduit très rapidement à la libération de cortisol dans le sang. Ce cortisol va modifier différents processus comportementaux et métaboliques, dont le métabolisme hydrominéral, via des voies de signalisation mettant en jeu les 2 récepteurs au cortisol. Concernant l’homéostasie ionique et hydrique (métabolisme hydrominéral), plusieurs études ont montré le rôle déterminant du cortisol dans la régulation des échanges ioniques et la perméabilité de la branchie, principal organe impliqué dans la régulation de la balances hydrominérale. Par contre, pour des raisons techniques, le rôle des récepteurs au cortisol dans le maintien de l’homéostasie ionique et hydrique est controversé. Plusieurs travaux ont aussi étudié les rôles de ces 2 récepteurs sur le comportement des poissons. Tout comme pour le maintien de l’homéostasie, des résultats contradictoires sont mesurés sur le rôle des récepteurs. Plusieurs travaux suggèrent une notion de complémentarité fonctionnelle des 2 récepteurs et l'hypothèse d'une réponse compensatrice, quand l'un des 2 récepteurs est muté. Mais pour l’instant, rien n’a été clairement démontré. Dans ce contexte, afin de caractériser les rôles respectifs des 2 récepteurs au cortisol dans la régulation des fonctions branchiales (organe-clé de l’homéostasie chez le zebrafish) et des activités comportementales, nous proposons d'utiliser des lignées de zébrafish pour lesquels les gènes codant pour les récepteurs au cortisol sont inactivés et non fonctionnels. Les rôles de ces récepteurs seront étudiés en condition contrôle et lors de stress.
Bénéfices attendus
Des stress en relation avec la qualité d'eau et/ou conditions d'élevage ont clairement des effets néfastes sur l’homéostasie et le comportement du poisson qui peuvent se traduire par une baisse de la productivité et l’établissement de situations de mal-être alors que le bien-être des animaux en élevage est un objectif important pour la profession en réponse à la demande sociétale. Une meilleure connaissance des réponses au stress, que l'on peut obtenir dans cette étude, devrait permettre le développement d’indicateurs biologiques d’état ou d’indicateurs prédictifs de bien-être chez les poissons et le cas échéant de problèmes de santé potentiels. Ces indicateurs seront utiles pour l’amélioration des méthodes d’élevage en aquaculture, pour le choix d'espèces à domestiquer et comme critères phénotypiques dans la sélection pour des caractères d’adaptation à l’environnement.
Procédures
Un nombre de 180 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère une seule fois de 30s pour la plus courte, à 9 minutes pour la plus longue. Un autre nombre de 90 individus seront exposés à une eau appauvrie en sels pendant 48 heures une seule fois. La diminution de la quantité en sels de l’eau se fera progressivement sur 24heures.
Impact sur les animaux
Afin de mesurer les capacités à maintenir leur homéostasie ionique et hydrique, les poissons seront exposés à un stress osmotique: exposition à une eau appauvrie en sel. Ce stress va induire un déséquilibre de la teneur en sels du poisson.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthaniés puis prélevés pour différentes analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n'est pas possible d'étudier in vitro les fonctions des récepteurs sur - 1. le maitien de l'homéostasie ionique et hydrique des poissons, car nous ne disposons pas de lignées cellulaires pour les différents organes et type cellulaires impliqués dans cette fonction - 2. le comportement, parce que les analyses comportementales complexes que nous envisageons ne peuvent être réalisées que sur animal et qui plus est seulement caractérisables chez l'adulte.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre une évaluation statistique de la variabilité individuelle des réponses.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pour la fonction en relation avec le maintien de l'homéostasie ionique et hydrique, le challenge osmotique aura lieu progressivement et ne durera que 48h, à des concentrations en sels déjà utilisés dans plusieurs autres études publiées récemment. De plus l'eau sera supplémentée en oxygène via un bullage d'air. Pour la partie comportement, un seul test comportemental sera réalisé par jour. En dehors des procédures les poissons seront élevés en groupe dans des structures d'élevage adaptées à l'espèce.
Choix des espèces
Les lignées de zebrafish avec inactivation des récepteurs au cortisol sont appropriées pour notre étude visant à étudier le rôle de chaque récepteur dans le maintien de l'homéostaise ionique et le comportement des poissons. De plus, les mécanismes impliqués dans le maintien de la balance hydrominérale ainsi que les différents traits de comportement sont bien caractérisés chez cette espèce. L'étude sera réalisée au stade adulte afin de mesurer les réponses des 2 sexes.
Création et maintien de lignées transgéniques de poissons zèbres
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
170 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur prélève un morceau de nageoire caudale sous anesthésie pour génotypage, puis on les isole jusqu'à trois jours, dans le but de créer des lignées génétiquement modifiées rendant fluorescentes des vésicules extracellulaires. Le porteur indique que les poissons sont réutilisés pour maintenir la lignée et gardés en vie jusqu'à leur an et demi, avant d'être mis à mort. Il conclut qu'aucune méthode de remplacement in vitro n'est possible parce que le projet repose sur la modification du génome d'un organisme vivant.
Objectifs
Les vésicules extracellulaires sont des petites particules qui sont sécrétées naturellement pas les cellules de l’organisme. Bien que ces vésicules semblent intervenir dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques, leur caractérisation dans des organismes vivants est encore très limitée, notamment du fait de leur petite taille, ce qui entrave leur utilisation en tant que marqueur ou véhicule thérapeutique. Pour permettre cette caractérisation, l’utilisation du poisson zèbre apparait comme un modèle prometteur du fait de son développement rapide et en dehors de leur mère, mais également de sa transparence au stade embryonnaire, qui rendent possible la visualisation de ces vésicules en temps réel chez l’animal vivant. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées de poissons zèbres qui exprimeront un marqueur de ces vésicules qui sera fluorescent, jouant ainsi le rôle d'une étiquette, ce qui permettra de visualiser directement ces vésicules dans les différents tissus de notre choix (muscles, vaisseaux sanguins, neurones...) puis de les suivre dans tout l'organisme. Nous réaliserons la sélection des individus présentant l’étiquette fluorescente dans le tissu d’intérêt et par technique de génotypage, respectivement. Ces nouvelles lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles de ces vésicules chez l’animal, pour chacun des tissus choisis.
Bénéfices attendus
La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données importantes sur leur potentiel thérapeutique.
Procédures
Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.
Devenir
Les animaux seront réutilisés à la fin de la procédure pour maintenir la lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées de poissons zèbres dont le génome sera modifié pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaires en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.
Réduction
Selon des tests statistiques, nous avons réduit le nombre de poissons à 10 de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives. Nous estimons que des groupes de 10 animaux seront suffisants pour la durée de ce projet, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées de poissons restent encore inconnues.
Raffinement
Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, un enrichissement de milieu sera mis en place, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production en plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du génotypage, un analgésique (lidocaïne) et un anesthésique (benzocaïne) seront utilisés. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes. Enfin, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.
Etude des mécanismes moléculaires et cellulaires de la sarcopénie chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
4 392 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 960 d'entre eux et sévère pour 432. Une partie subit un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour le génotypage, et les lignées reproduisent un vieillissement musculaire pouvant entraîner amaigrissement et changements de comportement, pour étudier la sarcopénie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche l'arrêt du protocole. Il présente le poisson zèbre comme un modèle plus rapide et moins coûteux que le rongeur, et prévoit la mise à mort pour prélever le muscle.
Objectifs
La sarcopénie se définit comme une baisse progressive et généralisée de la masse musculaire, de la force et de la performance physique pour des patients en âge gériatrique. Cette pathologie est accompagnée d’une dépendance vis-à-vis d’autrui ainsi qu’un surcout des soins de santé. L’étiologie de cette pathologie est multifactorielle. La perte du maintien du pool de cellules satellites, une diminution de la vascularisation, l’altération de la balance entre la synthèse et la dégradation protéique, le dysfonctionnement mitochondrial ou encore la sénescence des cellules peuvent contribuer à l’apparition et/ou au développement de la sarcopénie. Dans ce contexte notre objectif est de déterminer, grâce à des approches génétiques chez le poisson zèbre, et de mieux comprendre les mecanismes cellulaires et moléculaires en jeu, au cours de l'atrophie musculaire au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de la perte de masse musculaire liée à l'age. Nous pourrons évaluer quels évènements biologiques sont à l'origine de la sarcopénie, identifier ce qui entre les vaisseaux, les mitochondries ou les cellules satellites ont le plus d'impact. Ceci permettra de designer de nouvelles approches thérapeutiques visant un compartiment biologique en particulier.
Procédures
Aucune procédure chrirugicale n'est prévue dans la DAP. La seule intervention prevue concerne le genotypage où quelques millimètres de la nageaoire caudale seront prélevés sous anesthesire afin d'en extraire l'ADN génomique et pouvoir identifier les individus porteurs des mutations recherchées. Le nombre d'individus génotypés sera de 2592. La durée de l'intervention sous anesthesie est de quelques secondes, et cette procédure n'est réalisée qu'une seule fois par individu.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement, qu'il soit systémique chez le poissons TERT-/- ou musculaire chez le sarcofish. Autres effets à evaluer concernent les conséquences du traitement au tamoxifène (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnés de changement comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui necessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler une quinzaine de gènes et générer au total 30 lignées transgéniques. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle poisson zèbre font de ces poissons un modèle unique pour étudier de manière integrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du stress métabolique et du vieillissement (principe de remplacement).
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 9 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supèrieure à 20% conduira à l'arret du protocole expérimental (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre ou Brachydanio rerio est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un très grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le ZBF est à l’heure actuelle un modèle trés pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies.
Effets d’extraits de la biodiversité sur la prise de poids chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
240 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont suralimentés pendant quatorze jours pour induire un surpoids, traités avec des extraits de plantes puis soumis à une mesure de glycémie, pour évaluer l'efficacité de plantes dites anti-obésité. Le porteur n'attend pas d'effets indésirables mais surveille locomotion, arrêt alimentaire et coloration foncée signalant un stress, les poissons étant tués pour analyser leurs paramètres métaboliques. Il présente le poisson zèbre comme une "alternative" aux modèles mammifères tout en reconnaissant qu'aucune méthode sans animaux ne permet cette étude.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si les plantes médicinales étudiées et utilisées traditionnellement pour leurs propriétés dites "anti-diabétiques" / "anti-obésité" ont une réelle efficacité sur la prise de poids et sur les effets délétères au niveau systémique et central de l'obésité
Bénéfices attendus
Si nous démontrons que certaines plantes présentent des propriétés anti-prise de poids, nous pourrons investiguer la ou les molécules responsables de ces activités afin de développer des analogues chimiques et à terme développer des médicaments contre le surpoids/obésité.
Procédures
1) Suralimentation pour les animaux traités. La suralimentation aura lieu pour une durée de 14 jours (11 groupes de 20 animaux) 2) Traitement par les plantes (10 groupes de 20 animaux) 3) Pesée des animaux et mesure de la taille des animaux pour le calcul de l'indice de masse corporelle (12 groupes de 10 animaux) 4) En fin d'expérimentation, mesure de la glycémie (12 groupes de 10 animaux)
Impact sur les animaux
Ces plantes étant enregistrées à la pharmacopée française, elles sont reconnues pour leurs absences d'effets toxiques dans les conditions d'utilisation de la médecine traditionnelle. De plus, nous avons aussi déjà réalisées des études de toxicité chez l'embryon de poisson zèbre selon les recommendations de l'OCDE. Ainsi, les doses utilisées chez le poisson adulte ont déjà été montrées comme non toxique chez l'embryon. Par conséquent, nous n'attendons pas d'effets indésirables. Cependant, nous ne pouvons extrapoler ces informations obtenues chez l'Homme et chez des stades embryonnaires de poissons zèbres adultes. Par conséquent, nous devons être vigilants quant à de possibles effets délétères/toxiques chez l'adulte.
Devenir
Après l'analyse des différentes mesures (poids etc...) les animaux seront remis dans les conditions expérimentales afin de poursuivre l'expérimentation. Néanmoins, à l'issue de l'expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser la glycémie et l'impact du traitement sur un certain nombre de paramètres d'intérêts au niveau périphérique et central (notamment inflammatoire et oxydatifs)
Remplacement
Le modèle animal est le seul modèle permettant d'étudier l'impact d'un régime alimentaire déséquilibré au niveau de l'organisme dans son ensemble (poids, perturbation hépatique, glycémique, cérébrale...). De plus, afin de tester l'effet d'extraits de la biodiversité sur les conséquences de ce régime alimentaire, le modèle animal est le seul nous permettant d'appréhender la complexité de cette approche. En effet, elle implique des effets pléiotropes à l'échelle physiologique des molécules issus des extraits de plantes et doit impérativement prendre en compte la métabolisation de ces molécules par un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux par conditionest de 20 au maximum Nous réaliserons d'abord l'expérience par groupe de 10 et si les résultats sont déjà intéressants d'un point de vue statistique, nous pourrons ainsi éviter de relancer une expérimentation avec 10 autres animaux Néanmoins, l'hétérogénéité des animaux et de la prise alimentaire individuelle ne nous permet pas dès lors de limiter l'expérimentation à 10 animaux/condition.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupe, avec une alimentation en artemia (petits crustacés) représentant une diversification et un enrichissement alimentaire. Les points limites qui seront obéservés seront la locomotion de l'animal (sil reste en bas de l'aquarium ou en haut, l'expérimentation sera arrétée). De même un arrêt de la prise alimentaire nous amènera à arréter l'expérimentation. Une coloration foncée témoignant d'un stress important sera étudiée et rapportée au vétérinaire afin d'arréter ou non la procédure (arrêt obligatoire si le changement de couleur est associé à des troubles du comportement dont la prise alimentaire).
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Ceci tient au fait d’une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle bien établi d’étude de l’immunité, de l’oncologie, de la réparation cellulaire et de toxicologie. Il possède toutes les enzymes de détoxification (CYP) tout comme l’Homme. De par des mécanismes physiologiques fortement conservés au cours de l’évolution, le poisson zèbre présente l’avantage d’être un modèle simplifié pour la physiologie humaine et la modélisation de maladies humaines. Il constitue une alternative à l’utilisation de modèles animaux mammifères. C'est un modèle couramment utilisé pour des études d'hyperglycémie (diabète) et de surpoids, ainsi que pour tester des extraits aux propriétés biologiques d'intérêts. Les animaux choisis seront des animaux adultes entre 3 mois et 1 an. Cet âge correspond à de jeunes adultes et la pathologie de surpoids/obésité touche particulièrement les jeunes adultes. Entre 3 mois et 1 an, il n'y a que peu de changements physiologiques. C'est pourquoi nous avons choisi cet âge.
Détermination de la composante neurodéveloppementale d’une neuropathie fatale chez l’Homme dans un modèle de poisson zèbre et modulations pharmacologiques à visée thérapeutique (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Ce projet est le volet jumeau d'une même étude sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.
Procédures
- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.
Réduction
Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.
Détermination de la composante neurodéveloppementale d’une neuropathie fatale chez l’Homme dans un modèle de poisson zèbre et modulations pharmacologiques à visée thérapeutique (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 060 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent un prélèvement d'un à deux millimètres de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, l'administration de molécules candidates par l'eau ou par injection, et un test comportemental de tunnel de nage prolongé jusqu'à la fatigue de l'animal. Le projet porte sur une maladie neuromusculaire humaine sans traitement curatif, et le porteur affirme qu'un essai dans un "organisme entier" est nécessaire, l'in vitro ne permettant pas d'étudier le comportement. Tous les poissons sont tués pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Ce projet s’intéresse à une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène entrainant des troubles moteurs chez les patients dès l’enfance. Deux modèles poisson zèbre de la pathologie ont été créés et présentent les défauts de motilité au stade larvaire. Des molécules ont été identifiées comme capables de restaurer la motilité à ce stade de développement. Le premier objectif du projet est de définir s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la maladie. Le deuxième est de déterminer si les molécules ont un potentiel thérapeutique lorsqu’elles sont administrées à un stade présymptomatique ou symptomatique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale en permettant de déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie. Il s’inscrit également dans une démarche de recherche translationnelle puisqu’il permettra de déterminer quelle fenêtre de temps est adéquate pour le traitement.
Procédures
- Génotypage par prélèvement d’une petite partie de la nageoire caudale (1 – 2 mm) sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 15mn) : réalisé 1 fois – concerne 240 poissons - Administration de molécules candidates au stade développemental (durée d’administration de 8 à 48 heures post-fertilisation) directement dans l’eau : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Administration de molécules thérapeutiques au stade adulte par injection sous anesthésie générale (durée totale de l’endormissement au réveil : 20mn) : réalisée 1 seule fois – concerne 400 poissons - Test du tunnel de nage sur animal vigile (Durée totale : 9 x 15mn) : réalisé 1 seule fois – concerne tous les poissons
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons par fin clip (prélèvement de 1 à 2 mm de la nageoire caudale) se fera à 4 mois sous anesthésie générale. La nageoire se reconstituant au cours du temps, il s’agit d’un acte pour lequel aucun effet indésirable n’est attendu (durée totale comprenant balnéation, prélèvement et réveil : 20mn – stress faible). Avant de réaliser le test du tunnel de nage, chaque individu est placé dans le tunnel de nage (phase d’habituation – durée : 15h) avec mise à jeun pour éviter toute contamination de l’eau avec les déjections et une altération des performances de nage. Le tunnel de nage (durée : 9 x 15mn – stress moyen) se déroule sur animal vigile dans un environnement proche de son habitacle naturel (faible court d’eau, oxygénation) et s’arrête dès lors que l’animal est fatigué, visualisé par le recul de l’animal dans le tunnel. L’administration des molécules thérapeutiques au stade développemental se fera par balnéation (durée : 40h – stress faible). L’administration des molécules thérapeutiques au stade adulte se fera par injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (durée totale comprenant balnéation, injection et réveil : 20mn – stress faible). Les molécules thérapeutiques ne devraient apriori n’avoir aucun effet indésirable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issu de chaque procédure pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à déterminer s’il existe une composante neurodéveloppementale dans la pathologie par analyse comportementale, et de déterminer le potentiel thérapeutique de molécules candidates sur les défauts moteurs de deux modèles poisson zèbre de la maladie. Les modèles in vitro ne permettant pas d’étuder le comportement, seul le modèle animal est donc possible. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce projet puisque son système neuromusculaire est similaire à celui de l’Homme et fonctionnel au stade larvaire. De plus, l’utilisation de molécules candidates nécessite en première intention un essai dans un organisme entier. La formulation et l’administration de ces molécules sont simplifiées chez le poisson zèbre par rapport aux mammifères.
Réduction
Le projet est mené sur un nombre d’animaux réduit tout en permettant une analyse statistique suffisante. L’unique procédure de ce projet repose sur un test comportemental (tunnel de nage) qui permet d’évaluer les performances de nage dans un couloir qui reproduit le flux d’eau des habitats naturels. Un seul test par animal suffit à déterminer différents paramètres (temps de nage, distance de nage, vitesse de nage…) qui sont quantifiés par analyses statistiques. L’expérience indique qu’il est nécessaire d’avoir 20 animaux par condition. Le criblage pharmacologique effectué dans une étude antérieure in vivo nous permet également de réduire le nombre de molécules candidates à tester et donc le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les modèles poissons utilisés dans le projet permettent un élevage en conditions d’hébergement standards avec une surveillance quotidienne. Le temps entre le prélèvement de la nageoire caudale pour génotypage (4 mois) et le test du tunnel (6 mois) de nage permet de laisser le temps à la nageoire de se régénérer et de permettre une performance de nage optimale pour nos poissons. Les conditions du test comportemental sont proches de celles de son habitat naturel et des points limites adaptés ont été déterminés en amont pour éviter toute souffrance à l’animal. Dans le cas de l’injection intrapéritonéale, les animaux seront mis à jeun 24h avant pour permettre la rapidité du geste.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et d’organisme entier. Il permet également de tester des approches pharmacologiques grâce à une formulation et administration simplifiées. L’étude de nos modèles a permis de démontrer des défauts moteurs durant les stades de développement. Il est maintenant nécessaire d’évaluer le phénotype au stade adulte pour considérer la robustesse de nos modèles, et de valider l’effet bénéfique de nos molécules candidates au regard de la pathologie humaine. Notre projet vise à déterminer si l’absence d’expression du gène causant la maladie durant le développement conduit à un phénotype moteur lors d’une stimulation (épreuve motrice) chez l’adulte. Pour cela, les poissons passeront le test du tunnel de nage à 6 mois, considéré comme stade adulte. Notre projet a également pour but de déterminer l’effet bénéfique de molécules candidates à deux temps différents, au stade développemental et au stade adulte. Les poissons seront donc traités avec les molécules candidates soit durant le développement (2 jours), soit à 4 mois.
Evaluation ecotoxicologique de substances et d’effluents sur l’organisme modele Danio rerio.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures à la souffrance déclarée modérée pour 500 et sévère pour 1100, les 500 témoins étant proposés à l'adoption et les 1100 exposés tués. Ils sont plongés 96 heures dans des concentrations croissantes d'un produit chimique industriel pour déterminer la dose qui tue la moitié des poissons, sous jeûne pendant toute la durée. Le porteur décrit des pertes d'équilibre, des difficultés respiratoires, des lésions cutanées et des déformations du corps, la gravité des signes pouvant entraîner la mise à mort. Il indique proposer d'abord au client des méthodes de calcul ou l'usage d'œufs mais juge le poisson juvénile "parfois nécessaire", au service de l'étiquetage réglementaire des produits.
Objectifs
L'évaluation des composés chimiques sur l'environnement (selon réglementations) nécessite des données de toxicité sur le compartiment aquatique. Pour cela, des essais sont à mener sur les différents niveaux de la chaine alimentaire (des algues aux poissons en passant par les zooplanctons). Ce projet a pour but d'évaluer les effets de produits chimiques en déterminant une concentration induisant 50% de mortalité sur les poissons (Danio rerio).
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus grâce à ces essais permettent d'approfondir la connaissance de la toxicité des produits chimiques. Evaluer ainsi la toxicité de ces produits utilisés industriellement permet d'appréhender leurs potentiels impacts environementaux s'ils sont amenés à se retrouver dans le milieu naturel. Cela permet également d'aider le fabricant à s'orienter vers la fabrication de produits moins nocifs pour l'Homme et l'Environnement, et à reformuler leur produit si nécessaire. Ces données peuvent aussi servir à l'étiquetage des produits et à la détermination des pictogrammes de danger.
Procédures
Les poissons seront pêchés à l'épuisette un à un et transférés immédiatement (durée de transfert d'environ 5 secondes) de l'aquarium aux récipients d'essai au début de l'essai, de l'ancien au nouveau récipient d'essai après 24h, 48h, 72h, et du récipient d'essai à l'aquarium de stabulation ou au bain d'euthanasie à la fin de l'essai après 96h (ou au cours de l'essai si l'individu atteint des points limites). Les poissons seront exposés à différentes concentrations du produit à tester (solubilisé dans l'eau) durant les 96h de l'essai.
Impact sur les animaux
S'agissant d'essais écotoxicologiques sur de nouveaux produits, les effets indésirables sont inconnus. Cependant, un essai peut potentiellement entrainer la manifestation de signes cliniques pouvant modifier l'état de santé des poissons, concernant notamment : - certains signes comportementaux (perte d'équilibre, difficulté respiratoire, attitude inhabituelle, et agressivité) - l'aspect physique (perte de poids, décoloration pigmentaire, déformations du corps et lésions cutanées). L'accumulation et/ou la gravité des effets visibles chez un poisson peut entrainer sa mise à mort. La norme demande une mise à jeun des poissons 24 heures avant l'essai et pendant toute la durée de l'essai (96h), entrainant une sensation de faim chez le poisson.
Devenir
Les poissons ayant servis en tant que témoins négatifs sont récupérés et donnés à l'adoption. Les poissons ayant été exposés à des concentrations en produit chimique sont mis à mort à la fin de la procédure. Leur réutilisation engendrerait un potentiel biais dans les futures analyses étant donné qu'ils ont déjà été exposés à des substances chimiques leur ayant laissé de potentielles séquelles au niveau physiologique et cellulaire.
Remplacement
Préalablement à la mise en place de ce projet, il est systématiquement proposé au client des méthodes alternatives : - une alternative basée sur une approche mathématique - une alternative basée sur le regroupement de substances et références croisées - une alternative basée sur l'utilisation des oeufs de poissons. Cette dernière implique l'utilisation des poissons au stade embryonnaire et non juvénile/adulte, mais il est précisé que cela ne permet pas de mettre en évidence les déchets pouvant être plus toxiques que le composé initial, ou encore que les molécules de certains produits ne peuvent pas atteindre l'embryon à cause de la paroi de l'oeuf qui forme une barrière. L'utilisation du modèle Danio rerio est donc parfois nécessaire pour déterminer l'effet de la métabolisation des produits.
Réduction
En amont du projet, une bibliographie sur le produit chimique est effectuée afin de vérifier l'absence de données correspondant au projet et donc d'éviter un essai non indispensable. S'il s'agit d'un produit appartenant à la même famille d'un autre produit précédemment testé, il peut être judiceux de s'affranchir d'un essai préliminaire pour réduire le nombre de poissons utilisés. La ligne directrice préconise : "Un minimum de sept poissons doit être utilisé à chaque concentration expérimentale et dans le(s) témoin(s). Les poissons doivent être répartis au hasard dans les différents groupes de traitement. Aucune répétition inutile des cuves expérimentales n'est requise." Notre projet privilégie un mode opératoire séquentiel : une série de concentrations du produit doit être testé, mais seules les concentrations les plus faibles sont testées dans un premier temps. Si aucun effet n'est observé, alors les concentrations plus élevées sont testées. Cela permet d'éviter d'exposer inutilement des poissons à des concentrations trop élevées. Selon la toxicité des produits testés, différents scénarii d'analyses sont possibles. Dans le cas où 50% des produits testés ne présentent pas de toxicité, alors, sur l'ensemble des essais réalisés, nous observerons une réduction d'effectif de 27%. Les résultats sont ensuite analysés statistiquement grâce à des modèles permettant l'obtention d'une valeur indiquant la concentration en produit qui engendre la mort de 50% des poissons. Il se peut que les produits à tester ne soient pas solubles, or, la tendance actuelle lors de la réalisation des essais d'écotoxicologie est de s'affranchir de l'utilisation de solvant en optimisant les méthodologies de mise en solution d'un composé peu soluble . Par conséquent, le nombre de poissons utilisés lors d'un projet sera réduit.
Raffinement
Les béchers accueillant les poissons lors de la procédure sont entourés d'un poster reproduisant le milieu naturel des poissons. Le milieu dans lequel se trouvent les poissons est renouvellé tous les jours. La température, l'oxygène dissous et le pH sont contrôlés quotidiennement. Tout au long d'un essai, l'apparition de points limites précoces est surveillée. L'observation et l'enregistrement de ces signes doit se faire au minimum deux fois dans les premières 24 heures avec au moins 3 heures d'intervalle entre deux observations (exemple : 2h, 5h, et 24h après le début de l'exposition). Cette observation doit ensuite se faire deux fois par jour (matin et soir de préférence) et les points limites sont évalués dans la grille de score. Les poissons atteignant un score témoignant d'une douleur, d'une souffrance ou d'une angoisse intense sont retirés de l'essai et mis à mort . Les poissons non exposés (témoins) sont récupérés et placés dans un aquarium de stabulation afin d'être conservés jusqu'à leur adoption.
Choix des espèces
Les poissons sont des organismes qui intègrent les données de l'environnement dans lequel ils évoluent car ils se situent en haut de la chaine trophique et représentent un bon indicateur de leur environnement. L'utilisation des poissons permet de mettre en évidence la potentielle toxicité des déchets qu'ils rejettent après avoir dégradé le produit initalement présent dans le milieu. Cet impact ne peut pas être mis en évidence par les oeufs ou les larves de poissons qui ne dégradent pas ou moins les produits. Les poissons utilisés sont de l'espèce Danio rerio comme préconisé par la ligne directrice suivie lors de cette procédure. Leur taille varie entre 1 et 2 cm de longueur (juvéniles) pour respecter les critères de taille indiqués. Le Danio rerio est un modèle scientifique très étudié et utilisé, de part sa facilité d'élevage, d'entretien, et de reproduction, avec des conditions environnemenales de bien-être peu exigeantes et facile à mettre en place. Selon la norme OCDE les poissons utilisés seront des juvéniles de 1 à 2 cm (poissons n'ayant pas atteint la maturité sexuelle).
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
Autres poissons : 60
216 animaux aquatiques (xénopes, poissons-zèbres, carpes koï) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée à l'issue, d'autres adoptés ou réutilisés d'une session à l'autre. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone puis un massage abdominal pour prélever des ovocytes, les poissons-zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire, le tout lors de travaux pratiques de formation. Le porteur présente ces séances comme une obligation réglementaire et emploie surtout des animaux "de réforme". Il affirme que le remplacement des animaux vivants est "impossible" pour la pratique, tout en l'évoquant pour la théorie.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séance, les expérimentateurs maitriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.
Impact sur les animaux
La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation (tricaïne ou benzocaïne) limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourra it apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.
Devenir
Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (IPS, organoïdes, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années.
Raffinement
Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de miniser toute douleur potentielle. Des points limites prédictifs stricts et adaptés au projet de formation sont mis en place et appliqués dès leur seuil atteint.
Choix des espèces
Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'œufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Autres poissons : 240
800 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée ou adoptée et environ 450 tués. Des poissons zèbres subissent un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire sous anesthésie, tandis que des carpes koï et poissons rouges sont manipulés par les stagiaires, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de futurs expérimentateurs. Le porteur décrit une formation réglementaire encadrée par un arrêté et censée améliorer le bien-être des animaux non-humains détenus. Il affirme que le remplacement des animaux par un modèle est "impossible" lors des travaux pratiques.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séances, les expériementateurs maitriseront les aspects élémentaire de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'élements permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les carpes koï/poissons-rouges et les poissons-zèbres seront soumis à une anesthésie. Les carpes koï ne seront pas soumises à des prélèvements. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes (sperme et ovocytes) de manière non-invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale. La durée des interventions ne devra pas excéder 2 minutes pour les femelles et 4 minutes pour les mâles. Dans le cas de poissons-zèbres gardés d'une session sur l'autre, nous veillerons à ce que le lot d'individus qui est déjà passé en procédure n'en subisse pas une deuxième et ne soient utilisés que pour la mise en reproduction.
Impact sur les animaux
L'ensemble des manipulations réalisées par les stagiaires est encadré par des professionnels et un vétérinaire spécialisés sur les espèces aquatiques. La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie. L'anesthésie peut être considérée comme une nuissance en tant que telle. Ainsi, celle-ci n'excédera pas 10 minutes au total. Le temps de recouvrement de l'anesthésie est en général rapide et le poisson reprend ses comportements natatoires rapidement. Les manipulations faites sous anesthésie, à savoir le fin-clip et le prélèvement de gamète, sont considérées aussi comme des nuisances. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette. Concernant la biopsie de la nageoire caudale (fin-clip) : Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, la nageoire caudale présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement.
Devenir
carpe koï/poisson-rouge : En fin de procédure les animaux seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet. Poisson-zèbre : en cas de sessions rapprochées, les animaux seront maintenus en vie et réutilisés pour la mise en reproduction. Si les sessions sont trop éloignés, les poissons-zèbres seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (un animal par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard (animaux dit de réforme) dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques.
Raffinement
S’agissant d’une formation réglementaire soulignant les bonnes pratiques zootechniques, un soin particulier sera apporté à l’enrichissement de l’environnement (ajout d’éléments de décors, pondoirs avec une plage etc.), des éléments d’enrichissement alimentaire (zooplanctons) seront également apportés (1 fois par jour si possible). Une grille de score pour la détection des points limites sera utilisée, que ce soit lors des procédures mais aussi lors de l'observation quotidienne des animaux. La grille de score regroupe différents paramètres à observer chez le poisson (apparence physique, respiration, comportements alimentaire, social et natatoire) et donne un score aux problèmes observés. En fonction du score obtenu, l'animal va soit être monitoré très attentivement, soit soigné, soit euthanasié. Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anethésie.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est la principale espèce utilisée à des fins scientifiques. La facilité d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font un modèle de choix pour la recherche. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (facilité de reproduction, nombres d'œufs, température, etc.) de cette espèce permettent de présenter de manière optimale l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. La carpe koï est un poisson téléostéen d’eau froide, présentant des caractéristiques complémentaires au poisson-zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie. Il en va de même pour le poisson rouge. Poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures. Carpes koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés. Poissons-rouges : les animaux seront des adultes de réforme.
Domestication et programme de sélection artificielle chez le poisson zèbre (Danio rerio)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 648 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 2 340 en gravité sévère. Ils subissent un marquage par aiguille sous sédation, des mesures de cortisol et d'agressivité par isolement, un test de résistance à un choc thermique poussé jusqu'à la perte d'équilibre et, pour 2 340 larves, un test de résistance virale suivi sur 72 heures. L'objectif est de concevoir un programme de sélection artificielle pour améliorer le "potentiel aquacole" de l'espèce sur plusieurs générations, soit une finalité de production. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" cette expérimentation portant sur l'"organisme entier".
Objectifs
L'objectif de ce projet est double. Il vise : (i) A suivre les conséquences d'un processus de domestication chez les poissons sur plusieurs générations (ii) A concevoir un programme de sélection artificielle multi-fonctions et de comparer son impact sur l'évolution du potentiel aquacole au fil des générations à celui des programmes de sélections artificielles traditionnellement appliqués en pisciculture (mono-fonction). Pour ce faire, il sera pris en compte des réponses portant sur la croissance, le comportement, le bien-être et la reproduction des poissons. Plus en détail, la méthode in vivo utilisée sera fondée sur l'étude de traits fonctionnels morphlogiques, physiologiques, comportementaux, moléculaires, génomiques et génétiques. Nos hypothèses de travail sont les suivantes : (i) a. En raison de la relaxation de la sélection naturelle et des pressions de sélection du nouvel environnement, nous émettons l'hypothèse que plusieurs changements apparaitrons dans la population de poissons zèbre sauvages au fil des générations, comme cela a été démontré chez d'autres espèces de vertébrés. (i) b. Puisque le syndrome de domestication semble être robuste entre les différents programmes de sélections (chez les mammifères et oiseaux), la deuxième hypothèse est que si ces changements sont dus à la domestication elle-même (et non pas au programme de sélection), les animaux devraient évoluer de manière similaire entre les populations qui subiront des programmes de sélections artificielles différents. Le syndrome de domestication est ici définit comme regroupant un ensemble de caractéristiques comportementales et physiologiques convergentes chez plusieurs espèces ayant subit des programmes de sélection différents. (ii) Nous émettons également l'hypothèse qu'un programme de sélection artificielle multi-fonctions peut conduire à une amélioration du potentiel aquacole, ainsi qu'à une plus grande robustesse de ce potentiel, par rapport à un programme de sélection mono-fonction. Nous définissons ici le potentiel aquacole comme étant la quantité mesurable d'expression de traits/fonctions souhaitables, favorable à la domestication et ultérieurement, à la production.
Bénéfices attendus
La domestication reste un processus difficile. Il échoue souvent (i) en raison de limitations zootechniques, de contraintes socio-économiques, d’erreurs de conception ou de caractéristiques intrinsèques des espèces/populations, (ii) conduit à un problème de bien-être animal, ou (iii) entraîne des productions peu durables avec un faible potentiel d’adaptation pour faire face aux changements dans les attentes humaines et aux changements globaux. Cela soulève la nécessité d’améliorer les approches de domestication pour façonner la production d’espèces de demain. Récemment, les programmes de domestication ont récolté les avantages des progrès de la génétique, de la génomique et de la physiologie pour concevoir des programmes de sélection artificielle (PSA). Ces PSA visent à modifier intentionnellement traits/fonctions biologiques des populations contrôlées par l’homme afin d’améliorer les performances des organismes d’élevage. La plupart des PSA se concentrent sur peu de fonctions biologiques particulières mais sans tenir compte de l’évolution d’autres au cours des générations domestiquées. Pourtant, une domestication réussie nécessite l’expression favorable de plusieurs traits impliqués dans diverses fonctions biologiques ainsi que le maintien du potentiel d’adaptation des populations domestiquées. De plus, la PSA monofonction peut entraîner la co-sélection d’expressions de traits délétères, ce qui peut condamner la production animale. L’élaboration de PSA qui tiennent compte de toutes les fonctions biologiques importantes (c.-à-d. un PSA multifonction) pourrait surmonter les pièges des PSA monofonction et améliorer la production. Cependant, le développement de PSA multifonctions est difficile car ils nécessitent (i) d’effectuer une évaluation intégrative de divers traits (du gène aux phénotypes de toutes les fonctions biologiques), (ii) de définir les expressions optimales recherchées des caractères qui peuvent varier en fonction des objectifs de domestication, et (iii) de parvenir à un consensus entre des résultats parfois discordants obtenus pour différentes fonctions. Pour favoriser une aquaculture plus efficace et durable. Notre projet vise à proposer une approche d’un PSA multifonction pour faciliter les futurs développements aquacoles et avoir compréhension de l’évolution de cette espèce sous différents processus de domestication.
Procédures
6336 individus seront soumis à des contrôles de croissance réguliers sous anesthésie (moins de 5 min/individu, répétés 7 fois à 20 jours d'intervalles). Parmis ces 6336 individus, 3696 seront soumis à une indentification par VIE sous sédation (introduction d'une aiguille, moins de 5 min/individu). Suite à cette identification, 2640 individus seront aléatoirement sélectionnés pour évaluer le niveau de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l'eau et seront par conséquent isolés (1h). Ils seront ensuite soumis à une évaluation des paramètres de reproduction impliquant une anesthésie et un massage des paroies abdominales pour évacuer le sperme (pour les mâles, 1 fois, moins de 2 min/individu) puis à un test d'aggressivité impliquant un isolement (18h d'acclimatation + 1h de test). Toujours parmis ces 6336 individus, suite aux contrôles de croissance, 1584 individus seront soumis à une évaluation du potentiel adaptatif (plusieurs semaines) puis à la même évaluation des paramètres de reproduction que décrits précédemment ; et 1056 individus seront soumis à un test de résistance à un choc thermique (1h). 2340 nouveaux individus seront soumis à un test de résistance virale impliquant une infection par balnéation des larves et un suivi des mortalités sur 72h.
Impact sur les animaux
La technique d’identification utilisée implique l’introduction d’une aiguille chez l’animal. Elle pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections. Les tests de cortisol (hormone impliquée lors d'un stress physique ou émotionnel) dans l’eau et comportemental implique d’isoler les individus. Or le poisson zèbre est une espèce grégaire. Ces expérimentations peuvent donc induire un stress chez les individus. Nous nous attendons à ce que les tests de résistance thermique et de résistance virale est un impact très négatif sur les individus. En effet, l’objectif de ces tests est de connaitre la résistance maximale des individus. Cela entrainera donc un stress ainsi qu’une probable souffrance pour les individus.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort soit afin de limiter la douleur (test de résistance virale, resistance thermique) soit afin d'être utilisés pour des prélèvemens de tissus biologiques.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer cette expérimentation animale qui a pour but de mettre en évidence l’efficacité d’un programme de sélection artificielle et ses conséquences au niveau de l’organisme entier, sur plusieurs générations.
Réduction
La petite taille des Danio rerio ne nous permet pas de réaliser un nombre conséquent d’analyse sur un même individu. Le nombre d’animaux utilisé est le minimum nécessaire pour évaluer chacun des paramètres utiles pour répondre à notre objectif. De plus, nous avons réduit au minimum le nombre de famille afin de nous permettre la production des 5 générations nécessaire au projet sans consanguinité. En effet, nous effectuerons des croisements interfamiliaux, en croisant des reproducteurs sélectionnés entre les familles. La méthode de croisement est basée sur la "duplication" du nombre d'ancêtres pour la progéniture à chaque génération. Ainsi, chaque poisson à la F1, aura 2 ancêtres, à la F2, 4 ancêtres, et ainsi de suite jusqu'à la F5 où chaque poisson aura 32 ancêtres. Hormis la méthode de croisement basé sur la duplication du nombre d'ancêtre, aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Les procédures d’identification, contrôle de croissance et de collection du sperme peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau et/ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (identification). De ce fait, les animaux seront préalablement sédatés ou anesthésiés avant la manipulation. De plus, lors de l’identification, un analgésique sera utilisé en complément de la sédation. Le test de résistance virale peut induire un stress et/ou des infections et conduire à la mort de l’animal. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (72h) afin de limiter le stress et la douleur. De plus, les animaux ayant subi cette procédure seront immédiatement mis à mort à la fin de la manipulation. L’isolement provoqué par les tests de cortisol et le test comportemental peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. De ce fait, ce test sera réalisé sur une courte période (30 minutes pour le cortisol et 19h pour le test comportemental – 18h d’acclimatation + 60 min de test filmé) afin de limiter le stress et la douleur. Le test de résistance thermique, peut entrainer un stress chez l’animal mais nécessite un animal éveillé, que l’on ne peut donc pas anesthésier. Nous utiliserons donc la perte d’équilibre comme point limite pour retirer l’animal de l’expérimentation et le mettre à mort. De plus, nos structures expérimentales d’hébergement sont équipées d’un enrichissement intégré de l’environnement. Il s’agit d’un fond imprimé de gravier qui fournit une sensation de profondeur dans le réservoir. La conception est basée sur le fait démontré que le poisson zèbre à une préférence pour le visuel gravier dans le fond du réservoir. Pour chaque procédure, les points limites portent sur la surveillance du comportement des poissons et l'apparition d'éventuelles blessures au niveau cutané. De telles observations nous amènent à retirer l'animal de l'expérimentation et à le mettre à mort.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un poisson avec un cycle de vie court ce qui nous permettra d’obtenir rapidement plusieurs générations. De plus, c’est un poisson facile à élever et de nombreuses données sont disponible. Les animaux seront utilisés à tous les stades de développement, du stade embryon à l’âge adulte. Le projet visant à comprendre comment les animaux évoluent sous l’impact de la domestication, cela inclut d’étudier des paramètres liés à chaque stade développement. De plus, le projet visant à produire plusieurs générations, cela inclut de réaliser un cycle de vie complet de l’individu. Plus précisément, les contrôles de croissance débuteront au stade larvaire et se poursuivront jusqu'à l'âge adulte, le test de résistance virale se fera sur des larves âgées de 3 jours post-fécondation et l'ensemble des autres expérimentations se feront à l'âge adulte.
Evaluation du potentiel effet perturbateur endocrinien de substances et d’effluents sur des poissons sexuellement matures
- Protection de l’environnement
Autres poissons : 8320
11 880 poissons, poissons zèbres et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus vingt et un jours dans une eau contenant des substances chimiques ou des effluents, avec des effets que le porteur décrit comme irréversibles, changement de sexe, baisse de la fécondité et modification du comportement. Les poissons exposés sont tués à la fin de l'essai, ceux des groupes témoins pouvant être réutilisés. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'absence de test alternatif validé par l'OCDE et par la conformité réglementaire de son activité.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’impact des substances chimiques sur le système endocrinien des groupes de poisson exposés, composés de mâles et de femelles sexuellement mâtures, sur une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours).
Bénéfices attendus
Le projet visant à évaluer l’effet néfaste des substances et effluents testés sur la santé des organismes aquatiques, il participe activement à la protection et la préservation de l’environnement.
Procédures
Pas de prélèvements prévus sur animaux vigiles. L'exposition se fait via le milieu d'essai, les animaux baignants dans des concentrations en substance maintenues constantes durant 21 jours tout au long des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : - Changement de sexe des organismes exposés (par exemple : les femelles peuvent développer des caractères sexuels masculins, les mâles peuvent produire de la vitéllogénine,…) ; - Diminution du nombre d’œufs pondu par la femelle et/ou diminution de la qualité du sperme chez le mâle ; - Diminution du taux de fécondité ; - Changement du comportement pouvant impacter l’ensemble des activités métaboliques des poissons exposés (par exemple : diminution de l’appétit, aggresivité,…) ; L’ensemble de ces nuisances seraient irréverssibles, même si les poissons ne sont plus exposés.
Devenir
Les poissons issus du contrôle et du contrôle solvant pourront être réutilisés. Les poissons exposés à des substances chimiques seront mis à mort à la fin de la procédure. Lorsque des prélèvements terminaux sont réalisés sur les organismes, tous les organismes sont mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives non animales comprennent : les méthodes in sillico (références croisées, modèle mathématique prédictif tel que le modèle « Quantitative Structure-Activity Relationship ») ; les méthodes in vitro (comprenant les tests sur lignées cellulaires ou sur organoïdes) ; et les recherches bibliographiques (partage de données entre industriels, Fiches de Données de Sécurité). Malheureusement les méthodes ci-dessus ne peuvent être appliquées pour plusieurs raisons : Premièrement, l’insuffisance de données disponibles pour les molécules testées. Les méthodes in sillico ont une forte dépendance aux bases de données disponibles concernant la substance d’essai (notamment aux fiches de données de sécurité). Néanmoins dans le cadre de notre activité, ces données sont absentes ou insuffisantes pour permettre d’établir des modèles robustes. De plus certains processus, comme les effets sur le comportement ou les effets à long termes, sont difficiles à paramétrer dans ces modèles. Deuxièmement, le manque de concordance entre les lignées cellulaires seules et les organismes complets. Les méthodes in vitro ne peuvent prendre en compte l’ensemble des interactions complexes tissus-organes ce qui empêche de connaitre l’effet global d’une molécule sur un organisme. Troisièmement : les limites expérimentales. Dans le cas d’utilisation de culture cellulaire, le milieu de culture peut en lui-même constituer un biais. En effet, il peut potentiellement interagir avec les xénobiotiques et empêcher, ou aggraver, leur toxicité ce qui ne permet pas de statuer sur son danger réel en cas de rejet dans l’environnement. Dernièrement, la validité réglementaire des méthodes alternatives. La mise sur le marché européen des produits de consommations s’appuie sur des règlements adoptés au sein des pays membres de l’Union Européenne. Malheureusement à ce jour, aucun test alternatif n’a été standardisé et intégré aux normes de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique) concernant les perturbateurs endocriniens. L’activité de l’établissement s’appuyant sur les normes de l’OCDE, et les Bonnes Pratiques de Laboratoires, l’utilisation de méthodes alternatives non standardisés peut conduire à une invalidité des études auprès des instances réglementaires. Par conséquent, pour les raisons citées, il n’est pas encore possible de remplacer l’expérimentation animale au sein de notre établissement.
Réduction
Comme cité plus haut, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en garantissant la robustesse des tests statistiques. Concernant la partie statistique, celle-ci est détaillée dans deux documents : 1) la norme relatif au projet (par exemple, pour le présent projet, il s’agit de l’annexe 8 de la norme OCDE 229 montré en Figure 1), et 2) le guide « Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OCDE Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54 ». De plus, avant de démarrer l’essai préliminaire, une veille bibliographique est réalisée. Si cette veille permet de déterminer la Concentration Maximale Tolérée, et donc la gamme de concentration de l’essai définitif, alors l’essai préliminaire n’est pas réalisé. Dans le cas contraire, les organismes témoins de l’essai préliminaire peuvent être réutilisés dans l’essai définitif.
Raffinement
Les mesures visant à réduire les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure sont les suivantes : 1) Les organismes sont acclimatés pendant deux semaines avant le début de la procédure afin de réduire le stress lié au changement de conditions de maintien (passage des conditions d’élevage aux conditions expérimentales) ; 2) Les conditions environnementales (température, luminosité, paramètres physico-chimiques de l’eau) sont réglées de manière optimales. Elles sont strictement maintenues et sont contrôlées régulièrement afin d’éviter toutes variations environnementales pouvant impacter le bien-être des organismes ; 3) Une ronde quotidienne est mise en place et permet d’observer quotidiennement les organismes afin d’évaluer leur état de santé ; 4) Une feuille de points limites a été établie afin de détecter le plus précocement possible d’éventuels signes de souffrance. Si l’organisme dépasse un certain seuil, ce dernier est retiré du test et mis à mort .
Choix des espèces
Danio rerio, Oryzias latipes et Pimephales promelas sont des espèces recommandées par l’OCDE. En effet, elles sont reconnues comme étant des espèces modèles en biologie, c’est-à-dire qu’elles possèdent des qualités importantes pour la recherche dont : 1) une biologie bien connue (dimorphisme sexuel bien documenté, génétique maîtrisée) ; 2) elles sont faciles à maintenir en élevage et à faire se reproduire (descendance nombreuse, développement rapide) ; 3) elles sont économiquement accessibles et faciles à manipuler en expérimentation (petite taille) ; 4) elles sont robustes (résistance à la consanguinité, aux maladies et aux stress environmentaux) ; et 5) les résultats expérimentaux obtenus avec ces espèces sont transposables à d’autres poissons d’eau douce. L’ensemble de ces critères montre que ces espèces sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisant compte tenu de l’activité de l’établissement utilisateur. Des poissons adultes, sexuellement mâtures et identifiables doivent être utilisés pour la procédure. En effet la procédure vise a étudier la reproduction et le développement de caractères sexuels secondaires.