Saumons

Marqués à l'élastomère sous anesthésie à la base de la nageoire dorsale, 360 alevins de saumon atlantique sont répartis dans douze sections d'un chenal, la moitié subissant pendant un mois un débit d'étiage abaissé de 25 à 10 litres par seconde. Ils sont ensuite capturés à la pêche à l'électricité, puis enfermés seuls quatre heures en chambre respirométrique, dont une heure pendant laquelle l'oxygène de l'eau baisse jusqu'aux premiers signes d'agitation. 60 autres alevins sont tués dès le début de l'expérience pour servir de témoins, ce qui porte à 420 le nombre de saumons utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués, le porteur indiquant que le sang, le muscle et le foie ne peuvent être prélevés sur des animaux vivants.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer si en cas d'étiage sévère, l'utilisation de refuges par les saumons juvéniles atténue les effets négatifs de la baisse de débit sur leur croissance et leur survie. Les étiages réduisent la surface d'habitat disponible pour les organismes aquatiques, et altèrent la qualité physico-chimique des cours d'eau. A court terme, l'ajustement comportemental (par exemple l'utilisation de refuges comme des zones profondes) pousse les individus des zones les plus défavorables vers des habitats plus cléments. A plus long terme, si la survie des individus dépend de leurs caractères physiologiques (comme le métabolisme de repos) et que ces caractères sont héréditaires, la sélection naturelle conduira à l'adaptation Darwinienne des populations au fil des générations. Pour atteindre cet objectif scientifique, nous travaillerons avec 420 saumons juvéniles (7 mois post-fécondation) obtenus auprès d'une pisciculture élevant des alevins à partir de géniteurs sauvages pour le renforcement des populations naturelles. Le principe général de l'expérience est de répartir 360 de ces alevins dans 12 sections d'un chenal expérimental où la disposition des cailloux et le débit d'eau seront manipulés, de sorte qu'après un mois d'habituation à un débit normal (25 l/s) la moitié des alevins seront exposés pendant un mois supplémentaire à un débit normal (25 l/s) et l'autre moitié subiront un débit d'étiage (10 l/s), et pour chaque modalité de débit, la moitié des alevins auront accès à des zones refuges creusées dans le substrat. Les poissons placés dans le chenal seront préalablement mesurés puis marqués individuellement sous anesthésie afin d'évaluer leur survie, leur croissance et leur comportement dans le chenal (surveillance vidéo). Outre l'effet potentiel des conditions environnementales, la croissance, la survie et le comportement individuel pourront être liés au métabolisme de base ou à la capacité à supporter l'hypoxie. Ces caractéristiques seront mesurées par des tests respirométriques, lors desquels la consommation d'oxygène et la réaction comportementale face à des concentrations faibles seront mesurées sur des individus maintenus seuls dans une enceinte close pendant environ 4 heures, après quoi les individus seront anesthésiés et euthanasiés pour évaluer leur réponse cellulaire au stress hypoxique. 60 alevins témoins subiront ce test dès leur sortie de la pisciculture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent les connaissances sur l'écologie et l'évolution des juvéniles de saumon atlantique soumis aux étiages sévères. Le saumon atlantique est une espèce dont les populations naturelles présentent de forts enjeux culturels, écologiques et économiques, et les connaissances sur leurs capacités d'adaptation au changement climatique sont cruciales pour leur conservation. L'expérience quantifiera 1) l'effet négatif d'un étiage sévère (baisse drastique du débit du cours d'eau) sur la survie et la croissance des alevins, 2) la sélectivité de cet effet vis-à-vis de différentes caractéristiques individuelles (consommation d'oxygène, concentration de globules rouges...), 3) l'atténuation des effets négatifs des étiages grâce à l'utilisation de zones profondes comme refuges, 4) l'atténuation par les refuges de l'effet sélectif des étiages sur les caractéristiques individuelles. Outre leur intérêt fondamental, ces résultats informeront des modèles prédictifs simulant l'évolution démographique et génétique de populations de saumons, selon différents scénarios de changement climatique (sévérité des étiages) et de gestion de l'habitat fluvial (conservation/restauration de refuges).

Procédures

Les animaux seront soumis initialement à un marquage individuel par injection d'élastomère à la base de la nageoire dorsale. Le marquage, réalisé sous anesthésie une fois par individu en quelques secondes tiendra tout au long de l'expérience, soit environ 3 mois. Lors de l'expérimentation qui durera 3 mois environ, la moitié des individus seront soumis à un étiage, c'est à dire une réduction forte du débit d'eau. Ce stress induit par l'étiage correspond à des situations rencontrées par les poissons en milieu naturel. Après la période dans le chenal expérimental, les poissons seront collectés une fois par pêche à l'électricité. La mesure du métabolisme sera effectuée en chambre respirométrique, une seule fois par individu, pendant environ 4 heures. Lors de ce test, chaque individu est placé seul dans une enceinte close où la concentration d'oxygène est mesurée en continu. Après 3 heures d'acclimatation à l'enceinte, pendant lesquelles la concentration d'oxygène est maintenue à un niveau maximal par un flux d'eau venant de l'extérieur de l'enceinte, le flux d'eau exogène est coupé de manière à ce que le poisson consomme l'oxygène dissout dans l'eau pendant environ une heure, jusqu'à ce que l'individu montre des premiers signes d'agitation indiquant un stress hypoxique, après quoi la concentration d'oxygène retrouve son niveau maximal. Les prélèvements de tissus seront réalisés sur des individus euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux concernent le stress induit par l'étiage simulé dans la rivière expérimentale, en limitant le volume d'habitat disponible, et éventuellement la physico-chimie de l'eau (température, oxygène). Il pourra se manifester par une croissance réduite, voire une surmortalité, comme c'est le cas en milieu naturel. Le confinement dans la chambre respirométrique et la diminution progressive de la concentration d'oxygène pendant le test pourront stresser les individus, qui seront retirés à l'apparition de signes comportementaux d'inconfort, anesthésiés et euthanasiés.

Devenir

Tous les individus (420) seront euthanasiés à l'issue de la procédure, car le phénotypage nécessite des prélèvements de tissus (sang, muscle, foie) qui ne peuvent être effectués sur des animaux vivants. Ces prélèvements sont cruciaux car ils permettront d'accéder à des caractéristiques physiologiques affectant potentiellement la survie et la croissance en situation d'étiage.

Remplacement

Les effets testés concernent les individus vivants, et impliquent leurs interactions. Il est donc nécessaire de travailler sur des organismes entiers, maintenus en groupes. En lien avec des stratégies de gestion des populations de saumons, espèce à intérêt culturel, écologique et économique, le projet nécessite de travailler sur cette espèce car les résultats obtenus avec d'autres espèces (invertébrés par exemple) ne seraient pas transposables. Néanmoins, pour limiter l'impact sur les populations naturelles sans compromettre l'objectif scientifique de l'étude, les poissons utilisés proviendront d'une pisciculture produisant à partir de géniteurs sauvages de grands nombre d'alevins à des fins de soutien de populations naturelles.

Réduction

Le plan expérimental consiste en un plan croisé entre 2 modalités d'étiage (avec/sans) et 2 modalités de refuges (avec/sans), dans lesquelles seront placés des individus ayant chacun leurs caractéristiques comme la longueur initiale (mesurée en début d'expérience) ou des traits physiologiques comme le métabolisme (mesurés en fin d'expérience). La survie et la croissance étant notoirement affectées par les interactions interindividuelles, trois groupes de chacune des modalités environnementales seront constitués pour obtenir une réplication, avec 30 individus par groupe, soit 360 individus. Pour étudier la plasticité en réponse aux étiages, les phénotypes doivent être mesurés avant et après l'expérience, mais certains nécessitant l'euthanasie, un lot de 60 individus seront euthanasiés et phénotypés en début d'expérience pour servir de témoins. L'effectif total retenu (420 individus) est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante étant donné le nombre de variables à tester et leurs interactions.

Raffinement

L'expérience aura lieu dans un chenal expérimental conçu pour la reproduction et la croissance des salmonidés. Chaque groupe de 30 individus sera maintenu dans un bief de 10m de long sur 2.8m de large, soit une densité de 1 individu/m2, similaire à celle observée en milieu naturel. Le chenal est alimenté par l'eau d'un ruisseau, et présente donc la même qualité physico-chimique et la même densité en ressources alimentaires que le ruisseau. Le fond du chenal est tapissé de substrat propice à la croissance des alevins de saumon (cailloux+gravier). Le chenal est couvert par un filet anti-oiseaux pour empêcher la prédation, et bordé par un brise-vue pour limiter le stress causé par la circulation des observateurs. L'étiage qui sera simulé causera certes un stress induit par l'expérimentation, mais similaire à ce que les poissons peuvent rencontrer en milieu naturel (le risque de prédation en moins). Le marquage et la biométrie seront effectués sous anesthésie, par une équipe expérimentée, selon une procédure ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l'anesthésie et le réveil. Lors du test de respirométrie, leur comportement et leur consommation d'oxygène seront suivis en continu, de manière à interrrompre le test au moment où la concentration en oxygène atteindra le seuil où les individus adopteront un comportement agité, traduisant un stress aigu.

Choix des espèces

Le saumon de l'Atlantique est une espèce d'eau froide dont la population étudiée est à la limite sud de l'aire de répartition. Connaître ses capacités d'adaptation au changement climatique est donc important pour sa conservation. En effet, cette espèce à forts enjeux économiques, écologiques et culturels est en régression dans son aire de répartition. C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive, et l'interprétation des résultats obtenus dans ce projet bénéficiera de l'abondante bibliographie. C'est une espèce dont la reproduction artificielle est maitrisée, de sorte que les individus impliqués dans ce projet seront issus de pisciculture (alimentée par des géniteurs sauvages) et non prélevés dans le milieu naturel. Les animaux utilisés seront des alevins au stade 0+, environ quatre mois après leur émergence. C'est un stade auquel les alevins sont assez peu mobiles, donc potentiellement sensibles aux étiages et à la structure du microhabitat. Les résultats obtenus alimenteront un modèle de simulation paramétré pour cette espèce, utilisé pour prédire l'évolution démographique et phénotypique des populations soumises au changement climatique.

Gavées sous anesthésie d'un antibactérien cancérogène et mutagène interdit dans l'Union européenne depuis 1995, 38 truites arc-en-ciel juvéniles subissent ensuite une à deux prises de sang dans les vingt-quatre heures. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que l'exposition à la nitrofurazone n'entraînera "aucune nuisance" et que les prélèvements de sang et d'organes n'en entraîneront pas davantage, la seule gêne reconnue tenant à l'acte de gavage. Toutes sont tuées pour prélever muscle, foie et plasma et y doser un métabolite susceptible de trahir l'usage frauduleux de ce produit en pisciculture.

Objectifs

La nitrofurazone (NFZ) est un principe actif antibactérien présentant une toxicité avérée (cancérogène, mutagène) pour l’homme interdit depuis 1995 sur tout le territoire Européen. Malgré cette interdiction, la nitrofurazone peut être trouvée dans les denrées alimentaires d’origine animale destinées à la consommation humaine. Différentes études démontrent que cette molécule est rapidement métabolisée et ce dès les premières heures suivant son administration. De ce fait, la surveillance des résidus de nitrofurazone dans les denrées d’origine animale est basée uniquement sur la surveillance d’un métabolite, le semicarbazide (SEM). Cependant, le SEM n’est pas spécifique de la nitrofurazone et il peut être détecté dans certains produits alimentaires d’origine animale ayant subi une transformation industrielle, et ce bien qu’il n’y ait pas eu de traitement vétérinaire au cours de l’élevage. Ce manque de spécificité implique que le contrôle basé uniquement sur le SEM peut engendrer des résultats d’analyse faussement positifs. Un autre métabolite a été identifié et pourrait être utilisé pour détecter l’utilisation de nitrofurazone en élevage. Ce métabolite est le 5-nitrofuraldéhyde (5-NF). Cependant, aucune information n'a été publiée sur sa cinétique et en particulier sur sa vitesse d’élimination en élevage aquacole. Ce projet a donc pour objectifs de générer des connaissances sur le devenir, la persistance et la demi-vie de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde dans différents tissus de la truite arc en ciel (plasma, muscle, foie), et d’établir si ce métabolite pourrait être un traceur pertinent pour détecter l’utilisation frauduleuse de la nitrofurazone dans les élevages aquacoles, en particulier lors d’importations.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra : (i) de démontrer la présence du 5-NF dans les tissus musculaires, hépatiques, et le plasma chez les truites traitées à la NFZ ; (ii) d’étudier la cinétique de la NFZ et de son métabolite 5-NF dans ces compartiments et d’établir un modèle pharmacocinétique ; (iii) d’obtenir un profil de disparition du 5-NF après arrêt de l’exposition à la NFZ; (iv) de déterminer si le 5-NF est un marqueur pertinent pour détecter un traitement thérapeutique illégal en élevage aquacole à base de nitrofurazone. La finalité sera une amélioration de la méthode de détection actuelle de la NFZ, basée sur l'intégration d'un métabolite traceur plus spécifique, et donc une meilleure efficacité dans la détection des fraudes.

Procédures

Durant l'expérimentation, un acte de gavage sera réalisé sur chaque animal. Un à deux prélèvements de sang chacun seront également effectués sur chaque poisson, et répartis sur les 24 premières heures après l'administration orale. L'acte de gavage sera fait sur animal anesthésié et ne durera pas plus de 1 minute. Les prises de sang sur les poissons de cette taille se font aisément et très rapidement sur animaux vigiles, avec une bonne contention.

Impact sur les animaux

La voie de contamination par gavage, bien qu’elle se fasse sous anesthésie, peut entrainer des nuisances modérées. L’exposition au NFZ sera réalisée à de faibles doses n’entrainant aucune nuisance. De même, les prélèvements de sang et d’organes cibles n’entraineront aucune nuisance.

Devenir

Tous les poissons seront mis à mort pour prélever de la matrice biologique et ainsi réaliser les futures analyses chimiques.

Remplacement

Les méthodes alternatives pour étudier le métabolisme sont souvent des méthodes basées sur des lignées cellulaires ou des enzymes de mammifères. Il n’existe pas d’équivalent basée sur des cellules de poissons permettant ces études. Seul le recours à l’utilisation d’animaux permettra d’obtenir des informations sur le métabolisme. De même, seule une étude globale sur les individus permet de caractériser les processus d’absorption, de distribution et de disparition des composés de l’organisme et de caractériser également la variabilité individuelle nécessaire à la compréhension des processus biologiques mis en jeu.

Réduction

La procédure expérimentale sera menée en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique. Le nombre de points de prélèvements formant la cinétique ainsi que le nombre de poissons prélevés par temps a été estimé au plus juste pour limiter l’impact des prélèvements sur chaque poisson et pour générer suffisamment de données pour construire les modèles de pharmacocinétique.

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement anormal et/ou des signes cliniques de mal-être (selon une grille d’évaluation du point limite).

Choix des espèces

La nitrofurazone peut être potentiellement utilisée de manière illicite et venir contaminer les produits de pisciculture. La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) présente un grand intérêt économique pour la filière piscicole et représente donc un bon modèle de poisson d'élevage pour réaliser ce projet ; c'est une espèce facile à élever en laboratoire. Les animaux seront utilisés au stade juvénile, âgés environ d’un an (environ 100g) pour assurer assez de matrice biologique pour les analyses.

Tuées trois par bassin à chacun des six temps de prélèvement, pour que le tissu cicatriciel soit analysé, 72 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson reçoit un transpondeur dans le muscle du dos, puis une lésion cutanée pratiquée au trépan à biopsie. Six prises de sang suivent sur 56 jours, avec une anesthésie cumulée pouvant atteindre soixante-dix minutes et une sortie de l'eau cumulée de treize minutes trente. Le projet sert à caler un modèle de cicatrisation pour tester ensuite des additifs alimentaires, dans une filière d'élevage où les blessures cutanées sont fréquentes et traitées aux antibiotiques.

Objectifs

Les poissons interagissent directement avec leur environnement par leur peau, et la fonction d'homéostasie de la muqueuse cutanée dépasse de loin celle des organismes terrestres. La peau des poissons est constituée d'un grand nombre de cellules sécrétrices de mucus, de macrophages et de divers lymphocytes, permettant la fonction de barrière primordiale au maintien de l'homéostasie. En condition industrielle, des lésions cutanées, des abrasions et des ulcères apparaissent fréquemment chez les poissons d’élevage. Cela entraine des pertes de sang et la contamination des tissus sous-jacents par des particules étrangères et des agents pathogènes. Dans ces situations, les plaies cutanées doivent être traitées rapidement afin d'éviter des conséquences encore plus négatives pour les poissons. Cela entraine un accroissement de l’utilisation de traitements et notamment d’antibiotiques. Si le processus de cicatrisation est très bien décrit chez les mammifères, les travaux chez les poissons sont beaucoup plus récents. La principale différence est une inversion des phases d’inflammation et de ré-épithélialisation dans les premiers jours après une blessure chez les poissons. Des travaux ont également démontré qu’ il était possible d’améliorer le processus de cicatrisation par l’ utilisation d’additif alimentaire. Ces travaux sont importants pour améliorer les conditions d’élevage des poissons et participer au développement d’une filière plus durable limitant l’utilisation d’antibiotiques. Ce projet pilote propose de (1) mettre au point un model expérimental subclinique de suivi des processus de cicatrisation du filet après utilisation d’un trépan de biopsie (2) de déterminer la variabilité individuelle et inter-bassin de la mesure des différents paramètres dans nos conditions expérimentales. Cela permettra par la suite, si le modèle est validé, de mener des expériences utilisant ce modèle pour prévenir de la dégradation des lésions par l’utilisation d’additifs alimentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet exploratoire s’inscrit dans l’amélioration des conditions d’élevage des salmonidés. Il permettra, en premier lieu, de suivre et de caractériser toutes les phases de la cicatrisation chez la truite arc en ciel dans les conditions de nos installations. A l’issu de cette étude exploratoire, il sera possible de déterminer quels sont les paramètres à suivre les plus pertinents et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires pour utiliser ce modèle. Enfin, ce projet permettra à terme d’évaluer le bénéfice réel des additifs alimentaires sur l’amélioration de la cicatrisation cutanée chez la truite arc en ciel dans le cadre d’essais ultérieurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pou une durée de 56 jours. Au début de la procédure, les poissons (12) seront identifés par un transpondeur (durée introduction 3 secondes) placé dans le muscle du dos après anesthésie, et tous les poissons seront soumis à une lésion à l'aide d’un trépan à biopsie (durée 15 secondes). Aux jours 0, 3, 7, 14, 35 et 56 post-lésion des prises de sang seront réalisées. A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant pour l'analyse des paramètres biochimiques sera prélevé sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. En fonction du poisson et de la cinétique d'échantillonnage, la durée totale de l'anesthésie durera entre 8 et 70 minutes, et la mise hors de l'eau totale entre 3 et 13 minutes 30 secondes sur trois mois (durée cumulée).

Impact sur les animaux

Changement du comportement alimentaire, saignement localisé au niveau du site de ponction du tissu. Réaction inflammatoire dans les premiers jours de la cicatrisation, guérison anormale de la lésion.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au fur et à mesure de la procédure (soit 3 animaux par bassins , 6 temps de prélèvements) afin de réaliser les prélèvements de tissus cicatriciels. Plus d'animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mimer l’intégralité des acteurs cellulaires et acellulaires participant à la complexité des processus de cicatrisation et à la modulation de cette réponse par la nutrition.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d'animaux à utiliser pour évaluer ce projet exploratoire. Le nombre d'animaux a utilisé permettra d'obtenir une densité adéquate pour favoriser une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux. Des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer un maximum d'information possible par animal afin de valider le modèle exploré dans ce projet. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont été établis en suivant une approche statistique validée par un biostatisticien.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies afin que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux, l'enrichissement des bassins ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne restera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours de cette étude, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits au maximum par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs lors des pesées, des prises de sang et des mesures. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d'un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Un analgésique sera utilisé par voie intramusculaire afin de réduire la douleur après l’introduction du transpondeur et lors de la réalisation des lésions et de permettre une meilleure récupération et une réduction des effets secondaires comme les frottements de l'animal contre les murs. Utilisation de pansement hydrorésistant antiseptique et antifongique après la réalisation de la lésion pour éviter l'infection de la lésion. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques de dommages corporels et pour vérifier que les poissons s’alimentent correctement. Dès l’observation d’un signe clinique, les animaux sont suivis au moyen d’une grille de score de point limites.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle animal de salmonidé. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée permettant de rester dans le cadre du développement d’un modèle de cicatrisation subclinique. Au début de l’étude les truites pèseront 50 grammes. Elles seront élevées pendant 4 semaines, puis, à 100 g les poissons seront blessés et un suivi de cicatrisation sera réalisé pendant 56 jours. Le poids final à la fin de l’étude sera de 320g.

1 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries pendant 90 jours avec trois doses d'argile, 1 200 d'entre elles peuvent perdre l'appétit et du poids, et 64 subissent un test de stress consistant en une minute de pourchasse à l'épuisette suivie de cinq minutes de confinement dans un seau, avant d'être tuées trente minutes plus tard. Les truites sont ensuite disséquées pour analyser leur sang, leurs organes, la composition de leur chair et son goût. Le demandeur est un exploitant et vendeur de substances minérales qui cherche une autorisation de mise sur le marché pour une de ses argiles, et présente l'essai comme démontrant à la fois l'innocuité du produit et son bénéfice pour le "bien-être" des poissons, dont il prévoit pourtant la mise à mort intégrale.

Objectifs

Les argiles sont une famille de minéraux d’origine volcanique, ayant une très bonne capacité d’échange d’ions, les rendant intéressants dans de nombreux domaines (industrie, agriculture, médecine...), et notamment en nutrition animale. Dans ce domaine, ils sont utilisés comme agents de liaison et/ou fluidifiant pour la fabrication d’aliment. De plus, ils améliorent l’utilisation des nutriments et par conséquent les performances de croissance des animaux en élevage. Un exploitant et vendeur de substances minérales, souhaite étudier la faisabilité d’une mise sur le marché d’une de ses argiles à la composition différente de celles déjà autorisées dans l’alimentation animale. C’est pourquoi l’objectif de cet essai est double, il vise à mettre en évidence 1) l’innocuité d’une nouvelle argile pour l’alimentation des poissons, ainsi que 2) son effet positif sur la nutrition et le bien-être animal. Cet essai a été mis en place en tenant compte des exigences de l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) afin que les données obtenues puissent servir à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché en tant qu’additif zootechnique pour l’alimentation des salmonidés. Ainsi, un essai d’une durée de 90 jours va être réalisé sur des truites arc-en-ciel de 15 g, au cours duquel des aliments contenant différentes doses d’argiles seront distribuées. En plus d’un suivi d’élevage traditionnel (rationnement, croissance, mortalité) qui visera à la fois à démontrer l’innocuité et l’intérêt zootechnique de l’additif, des analyses sur le sang et les organes des poissons seront réalisées en fin d’essai afin de confirmer l’innocuité de l’additif, et des études sur la digestibilité de l’aliment, son impact sur le stress des poissons et sur la qualité de la chair (composition et dégustation) seront également menées. La truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test (à réaliser sur truite ou saumon).

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu de ce projet est que les quantités d’argile incorporées à l’aliment ne mettent pas en évidence d’effets délétères sur les animaux en essais, contribuant à démontrer que cet additif n’a aucun effet néfaste sur la santé des poissons, et qu’il peut faire l’objet d’une évaluation pour autorisation de mise sur le marché. Le second bénéfice attendu est qu’au moins une des doses d’argile testées mette en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite, comme de meilleures performances de croissance, une meilleure digestibilité ou une meilleure résistance au stress. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à moyen terme, puisqu’ils devront être évalués ensuite par l’EFSA avant d’obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 1536 poissons (transfert dans bac pour mise à mort), et 2 fois sur 64 poissons (changement de bac, puis test de stress). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 64 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement), et sera suivi 30 min plus tard d’une mise à mort.

Impact sur les animaux

Une inappétence, une croissance moindre et une perte de poids pourront être observées sur les 1200 poissons nourris avec un aliment à base d’argile (3 lots de 400 poissons). Ces nuisances sont considérées comme modérées sur une durée de maximum 7 jours. A l’issu des 90 jours d’alimentation expérimentale, 64 poissons seront soumis à un test de stress aigüe (16 poissons par lot, 4 par bac), nécessitant au préalable un changement de bac, suivi d’une acclimatation de 96h. Les nuisances attendues sont le stress généré par ce transfert qui durera 1 minute (pêche à l’épuisette et changement de bac), puis le test de stress en lui-même qui consiste en une chasse à l’épuisette d’une durée de 1 minute, suivi d’un confinement dans un seau pendant 5 minutes. Afin de limiter la production de déjections et d’éviter une pollution de l’eau, notamment pendant la phase de confinement, les poissons ne seront pas alimentés le jour du test de stress. Cette période de mise à jeun sera inférieure à 24h. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison du nombre limité de nuisances et de la durée relativement courte des stress induis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes analyses (sang, organes, composition nutritionnelle, dégustation).

Remplacement

Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet argile spécifique. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit n’a pas d’effet délétère, et qu’il amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de stress par rapport à d’autres argiles, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 répétitions de bac pour chaque régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (30 par bac) et associées au test de stress (4 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte du nombre de poissons par bassin pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, tout en assurant la robustesse statistique de l’analyse de données. Ces données seront étudiées paramètre par paramètre.

Raffinement

La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les poissons impliqués dans les mesures de poids moyens seront préalablement anesthésiés puis, suite à la mesure de poids moyen d’une durée inférieure à la minute, mis à récupérer en eau neuve avant d’être replacé dans leur bac d’origine. Les 16 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.

Choix des espèces

L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, et de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 15 g en début d’essai. Cette taille initiale est demandée par l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (taille minimale de 10 g en début d’essai pour la truite) dans le cadre d’une étude de tolérance.