Saumons

400 saumons atlantiques au stade smolt vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés dans la rivière. Chaque individu est hameçonné sous anesthésie puis lâché dans un dispositif de dévalaison de centrale hydroélectrique, pour mesurer les dommages subis au passage des barrages. Le porteur indique que l'hameçon provoque une douleur jusqu'à cicatrisation et que le test est arrêté si plus de 20 % des poissons subissent des dommages sévères. Il présente le recours aux poissons comme une étape "nécessaire" pour calibrer des capteurs censés, à terme, remplacer l'usage d'animaux non-humains dans ce type d'étude.

Objectifs

Suite à son autorisation, le projet « Innocuité » ayant pour objectif : (1) de tester différentes conditions de réception des poissons dévalant, soit au débouché des dispositifs de dévalaison au niveau des prises d’eau des centrales hydroélectriques, soit lors de leur franchissement d’un barrage, afin d’améliorer les critères de réception et d’assurer un transfert sans dommage des poissons, (2) et de développer une méthode alternative à l’usage des animaux pour effectuer ces tests à l’avenir, a débuté en 2019. Cependant, des périodes de confinement liées à la pandémie de la COVID19 sont intervenues au printemps 2020 et 2021. Les tests in situ programmés durant ces périodes n’ont ainsi pas pu être réalisés comme prévus et le projet a pris du retard. D’autre part, les capteurs, initialement prévus pour le développement de la méthode alternative, se sont avérés inappropriés et souvent défectueux, et une nouvelle phase de développement des capteurs a été nécessaire. L’autorisation de projet arrive à sa fin en décembre 2023 sans que l’on ait pu le terminer. Nous souhaitons demander un prolongement d’un an, ce qui nous permettra de bien réaliser les tests initialement prévus. L’approche méthodologique, décrite en détail dans la demande initiale d'autorisation du projet et ayant obtenu l’avis favorable du comité éthique, est conservée à l’identique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est non seulement de définir de critères hydrauliques garantissant le passage des poissons sans dommage par les barrages ou les dispositifs de dévalaison, mais aussi, d’identifier les valeur-seuils des différents paramètres enregistrés par les modules sensoriels, au-delà desquels les dommages sur les poissons apparaissent, afin de pouvoir les utiliser à l’avenir pour vérifier les bonnes conditions de réception, sans avoir recours à des animaux (remplacement).

Procédures

Tous les individus (400) seront attachés, un par un, à une canne à pêche via un hameçon (hameçonnage sous anesthésie générale), relâchés dans le dispositif de dévalaison (lot test) ou dans la rivière à l’aval du dispositif testé (lot témoin), puis récupérés et observés. La durée d’expérimentation ne dépassera pas les 10-15 minutes en tout.

Impact sur les animaux

Stress physique pendant la manipulation (15 minutes cumulées), douleur suite à l’implantation de l’hameçon jusqu’à la cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux en bonne santé seront libérés dans le milieu naturel.

Remplacement

La conduite en parallèle de tests « poissons » et « Sensor » doit permettre d’identifier les valeur-seuils des différents paramètres enregistrés par les Sensors au-delà desquels les dommages sur les poissons apparaissent, ceci dans l’optique de remplacer dans les futures études, l’usage des poissons vivants par les Sensors. Certes, cela ne réduit pas directement le nombre de poissons utilisés pour notre projet mais devrait le réduire, voire le supprimer une fois les critères d’innocuité définis.

Réduction

Chaque test in situ « poisson » sera réalisé sur 100 smolts pour avoir un échantillon représentatif. Toutefois, après avoir lâché 50 poissons, si le taux de dommages sévères est >20%, le test sera arrêté et les 50 smolts restants seront relâchés dans la rivière. Le projet prévoit de réaliser les tests sur plusieurs sites. Les résultats seront élaborés au fur et à mesure de l’acquisition des données. Si les données provenant des premiers sites permettent d’obtenir une relation claire entre mesures Sensor et dommages poissons, les autres sites ne seront pas investigués.

Raffinement

Méthodes de raffinement utilisées : - Implantation des hameçons sous anesthésie générale. - Hameçons avec ardillon protégé par une rondelle de caoutchouc insérée sur la hampe de l’hameçon, évitant toute blessure supplémentaire par l’ardillon qui sera coupé avant de décrocher le poisson. - Fil détendu pour ne pas « brider » les poissons, récupération lente pour limiter leur fatigue. - Très bonnes conditions de stabulation (température, oxygène) et régulièrement surveillées, - Bassins couverts pour réduire la luminosité et tranquilliser les smolts (conditions identiques à la pisciculture). - Faible densité dans les bassins (156 l/kg de smolts, soit une concentration 10 fois inférieure aux préconisations pour la stabulation dans les ascenseurs à poissons). - Manipulation rapide, remis en liberté des poissons après tests.

Choix des espèces

L’utilisation de Sensor doit nous permettre à terme de ne plus utiliser d’animaux pour ce type d’étude. Toutefois pour en arriver là, il est nécessaire de « calibrer » les enregistrements des capteurs en les reliant aux dommages subis par les poissons qui peuvent être de différente nature (écaillure, plaie externe ou interne, endommagement/rupture de la colonne vertébrale…). L’espèce choisie, le saumon atlantique, est une des espèces cibles pour la conception des dispositifs de dévalaison. La morphologie et la physiologie des smolts de saumon atlantique en période de dévalaison, en particulier leur forte sensibilité à l’écaillure à ce stade physiologique, et dont l’intégrité est très importante pour leur survie future en mer, sont des prérequis pour notre étude. La perte d’écailles est l’un des premiers dommages subis par les smolts au passage des obstacles si le dispositif n’est pas approprié. Les juvéniles de saumon atlantique en phase migratoire vers la mer (stade smolt) seront utilisés. La morphologie et la physiologie des smolts de saumon atlantique en période de dévalaison, en particulier leur forte sensibilité à l’écaillure à ce stade physiologique, et dont l’intégrité est très importante pour leur survie future en mer, sont des prérequis pour notre étude.

180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après six semaines d'une alimentation enrichie ou non en levures, 90 poissons reçoivent sous anesthésie une injection simulant une infection bactérienne et 90 une injection saline, avant d'être tués huit heures plus tard pour prélever sang, foie, intestin et rate. Le projet cherche à renforcer l'immunité innée des truites d'élevage pour une aquaculture présentée comme "nécessaire" face à la demande. Le porteur indique qu'une étape d'alimentation empêche de mener l'étude en culture cellulaire.

Objectifs

Qu'ils proviennent de la pêche ou de l’aquaculture, les poissons jouent un rôle important dans l’alimentation humaine. Selon les prévisions, la production aquacole devrait augmenter de 15 % d'ici 2030. Cette croissance est nécessaire pour fournir à une population croissante des aliments sains et nutritifs. Cependant, cette croissance doit s’appuyer sur une production aquacole durable, c’est-à-dire respectueuse de l'environnement mais aussi capable de s’adapter au changement climatique. Il est donc important que les poissons d’élevage soient plus robustes. Une façon de renforcer la robustesse des animaux est d'augmenter leurs défenses immunitaires. Le système immunitaire des animaux comporte deux parties : l'immunité innée et l'immunité adaptative ou acquise. L’immunité innée est une protection naturelle présente dès la naissance. Elle agit rapidement lors d’une infection mais n’est pas spécifique de l’agent pathogène (bactérie, virus…). L’immunité acquise se développe au cours de la vie. Basée sur la production d’anticorps, elle est spécifique d’un agent pathogène et bénéficie d’un effet mémoire c’est-à-dire que l’animal réagira de manière plus rapide et plus efficace lors d’une autre infection par le même pathogène. Cependant, une idée nouvelle en immunologie suggère que l'immunité innée peut également être entraînée pour lui permettre d’être plus réactive face à de futures infections. Pour entrainer l'immunité innée, il suffirait d’exposer les animaux à des molécules capables de déclencher la réponse immunitaire innée. On trouve certaines de ces molécules en abondance dans la paroi des levures, comme la levure de bière ou de boulangerie. L'objectif de ce projet est donc d’ajouter des levures dans l'alimentation de la truite pour stimuler et entrainer son immunité innée et ainsi augmenter ses défenses immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir s’il est possible d’améliorer les défenses immunitaires de la truite arc-en-ciel par le biais de son alimentation. Les levures sont fréquemment utilisées dans l’alimentation des animaux d’élevage pour améliorer la croissance et la santé des animaux. Ainsi cette expérimentation permettra d’évaluer si l'ajout de levure dans l’alimentation de la truite permet d’augmenter les défenses immunitaires de cet animal et le rendre plus robuste face au changement climatique.

Procédures

Dans cette expérimentation, des jeunes truites arc-en-ciel seront nourries pendant 6 semaines avec des aliments contenant ou non des levures. Au bout de ces 6 semaines, 90 poissons recevront sous anesthésie, une piqûre d’un produit simulant une infection bactérienne et 90 autres recevront également sous anesthésie, une piqûre de solution saline (eau salée). Huit heures après l’injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus et organes (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour induire une réaction inflammatoire.

Impact sur les animaux

Les 6 semaines d’alimentation qui précèdent l'injection du produit destiné à provoquer une réaction immunitaire chez les poissons, ne devraient causer aucune nuisance ni effet indésirable aux poissons car ceux-ci seront élevés de manière traditionnelle et nourris avec des aliments adaptés à leurs besoins. De plus, la levure qui sera introduite dans l’aliment bénéficie d’une autorisation d’utilisation en alimentation des poissons d’élevage. Pour réduire le risque d’infection lié au fait de piquer la peau du poisson avec une aiguille, la seringue et l’aiguille seront stériles et changées entre chaque poisson. L’injection de la solution saline stérile n’a aucun effet sur l’état de santé du poisson et son comportement comme l’ont démontré des études précédentes. L’injection du produit simulant une infection bactérienne devrait déclencher une réaction inflammatoire chez la truite. Des études ont montré que ces injections ne présentent aucun risque pour la vie de l’animal mais entrainent une réaction immunitaire similaire à celle que l’on peut observer après une vaccination.

Devenir

Huit heures après l’injection, la totalité des poissons (180) seront anesthésiés puis euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de foie, d’intestin, de rate et de sang.

Remplacement

Le projet requiert une étape prélable d'alimentation des animaux, il ne peut donc pas être réalisé en culture cellulaire.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au strict minimum tout en restant suffisant pour prendre en compte les différences de réaction entre les truites arc-en-ciel lors de l'injection du produit stimulant l'immunité, garantissant ainsi la fiabilité des résultats. Ce nombre de poissons a été établi en utilisant des outils statistiques.

Raffinement

Les mesures de raffinement prévues visent à garantir des conditions idéales pour les poissons, notamment en faisant en sorte qu’il n’y ait pas plus de 9 à 10 kg de poissons par mètre cube d’eau, en renouvelant l'eau en continu pour apporter suffisamment d’oxygène aux poissons, en créant une colonne de bulles pour enrichir l'environnement, en respectant le rythme naturel du jour et de la nuit et en plaçant un nombre suffisant de poissons dans chaque bassin (27 poissons) pour favoriser les interactions sociales. Les bassins seront équipés de couvercles ajourés pour éviter la prédation par des oiseaux et limiter le stress lié aux activités des techniciens. Les poissons seront nourris manuellement deux fois par jour jusqu'à ce qu’ils ne montrent plus de signe de faim, les techniciens surveilleront deux fois par jour, à l’occasion des repas, le comportement et le bien-être des poissons, en complétant une fiche basée sur des critères comportementaux et physiques. Si un point limite est atteint, l'animal sera euthanasié conformément aux réglementations. La manipulation des truites sera effectuée par des personnes expérimentées, les injections seront faites sous anesthésie générale, et tous les prélèvements d’organes et de tissus seront réalisés sur des animaux préalablement euthanasiés.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale en France. L’expérimentation sera réalisée sur de jeunes truites arc-en-ciel d’environ 150g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons de tissus ou d'organes dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.

1 800 poissons sauvages, des truites, blageons et chabots, vont être capturés et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants. Chaque individu est anesthésié, mesuré, pesé, puis incisé au ventre pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, en restant hors de l'eau de trente secondes à une minute. L'objectif déclaré est d'évaluer si une passe à poissons aménagée sur un cours d'eau alpin laisse remonter ces espèces vers leurs zones de reproduction. Le porteur affirme que l'étude comportementale in situ est "indispensable" et sans alternative, et prévoit une mortalité post-opératoire faible ainsi que des pertes de marqueurs.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité d’une passe à poissons (rampe à plots) aménagée pour rétablir la migration piscicole dans un cours d’eau alpin. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur passifs dans des poissons sauvages. Les espèces cibles sont la truite et deux espèces accompagnatrices (blageon et chabot). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante. Le projet doit permettre d’évaluer scientifiquement le fonctionnement de cet ouvrage piscicole.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, et des petites espèces accompagnatrices (blageon et chabot), c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer encore davantage la migration piscicole et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles favorables à l’amont, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1800 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des dispositifs de montaison/dévalaison doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le blageon et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. A noter également que peu de données existent quant aux comportements et capacité de montaison du blageon et du chabot. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer une franchissabilité théorique : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Pour le blageon et le chabot, il est difficile de préciser un taux de montaison, ces espèces étant encore trop rarement étudiées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm par exemple). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

Les espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta), le blageon (Telestes souffia) et le chabot (Cottus gobio). La truite est l’espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Le blageon et le chabot sont des espèces accompagnatrices de la truite, régulièrement capturées en pêche de sondage au niveau du site d’étude. Ces espèces sont moins bonnes nageuses que la truite et leur étude permet de nuancer l’évaluation de l’efficacité de la rampe à plots. Autrement dit, le franchissement du seuil par ces espèces confirmera le bon fonctionnement du dispositif de franchissement. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. Pour les blageons et les chabots, les individus seront marqués avec des tags de 13 mm, la taille minimum de marquage étant alors calée à 80 mm. Pour ces espèces, cette taille correspond à des animaux de 2 ans et plus, considérés comme adultes et reproducteurs. Tout comme la truite, les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

64 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Chaque poisson reçoit un gavage puis une injection intraveineuse d'antibiotiques, espacés de trois semaines, et subit quatre à huit prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur n'attend qu'un léger stress lié aux manipulations et vise à ajuster les doses d'une association d'antibiotiques utilisée en pisciculture. Il indique qu'aucune méthode alternative ne permet encore de suivre la cinétique plasmatique des molécules.

Objectifs

Afin de limiter les risques liés à l’antibio-résistance pour la santé de l’humanité, l’Agence européenne des médicaments préconise l’utilisation d’antibiotiques spécifiques de première intention pour la médecine vétérinaire. L’association de deux antibiotiques avec un ratio 5:1 est classiquement utilisée en médecine vétérinaire pour leur effet synergique. Ce ratio de 5:1 utilisé dans la quasi-totalité des préparations vétérinaires mises sur le marché correspond à une transposition utilisée chez l’Homme, où les vitesses d’élimination sont assez proches ce qui permet de conserver un rapport de concentrations efficaces entre les deux molécules et de maintenir leur effet synergique dans le temps. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, les temps de demi vie peuvent être très variables d’une espèce à l’autre, ce qui peut entrainer un déséquilibre des concentrations avec une perte probable de l’effet synergique entre les deux molécules et par conséquence une perte de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires ainsi que les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). L’objectif du projet est d’optimiser les schémas posologiques de l’association de deux antibiotiques chez la truite arc-en-ciel (TAC) qui est une espèce de destination de ce traitement.

Bénéfices attendus

Les formulations d'antibiotiques destinées aux animaux sont des transferts des données permettant une synergie chez l’Homme sans tenir compte des spécificités des espèces animales ou de leurs bactéries pathogènes. Le projet générera des données pharmacocinétiques (PK) in vivo qui seront couplées aux études pharmacodynamiques sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées et qui à l’aide de la modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD), vont permettre d’optimiser le traitement (doses, posologies) chez la TAC. Le projet contribuera à une utilisation responsable et prudente des combinaisons d'antibiotiques en pisciculture et sera bénéfique à terme pour la santé humaine et environnementale en évitant les traitements inefficaces et en limitant le recours à des antibiotiques de deuxième intention plus critiques pour la santé humaine.

Procédures

Durant l'expérimentation, un acte de gavage et une injection intra-veineuse seront réalisés sur chaque animal, espacés de 3 semaines. Des prélèvements (4 à 8) de 0.3 mL de sang chacun seront également effectués sur chaque poisson, et répartis sur une période allant de 96 h à 240 h après chaque administration (orale ou intra-veineuse). Tous ces actes seront faits sur animal anesthésié et ne dureront pas plus de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales (hausse de la température et prélèvements de sang en cinétique). Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés aux concentrations usuelles (non toxiques) des antibiotiques.

Devenir

A la fin de l’expérimentation tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’a encore été développée pour suivre la cinétique plasmatique (Tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche PK/PD envisagée.

Réduction

La procédure expérimentale sera menée en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique. Le nombre de points de prélèvements permet de couvrir l’ensemble de la cinétique. Le nombre de poissons prélevés par temps a été estimé au plus juste pour limiter l’impact des prélèvements sur chaque poisson tout en permettant d’estimer correctement les variabilités inter-individuelles des paramètres cinétiques (clairance, etc) et pour générer suffisamment de données pour construire les modèles de pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD). Une période de « wash-out » adaptée permet de garantir la fiabilité des résultats. Une fois le modèle PK développé et fiable, il permettra d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement anormal et/ou des signes cliniques de mal-être (selon une grille d’évaluation du point limite).

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce cible pour le traitement à base de sulfadiazine/triméthoprime (pour lutter contre la furonculose), d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes ; c'est une espèce facile à élever en laboratoire. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte. Ils seront suffisamment gros et résistant pour réaliser les prélèvements de sang en cinétique sur plusieurs semaines.

360 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un stress d'entassement provoqué par la baisse du niveau d'eau une heure par jour pendant dix jours, pouvant entraîner des blessures aux nageoires, une perte de poids et un refus de s'alimenter, puis un prélèvement de sang avant la mise à mort. L'objet réel est de tester des taux de vitamines plus élevés dans l'aliment pour améliorer la résistance des poissons en élevage intensif. Les bénéfices annoncés visent les producteurs et une "pisciculture plus raisonnée", le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ne peut mettre en évidence ces effets.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer des taux d’incorporation optimum de vitamines dans les rations alimentaires des poissons face à un stress. L’amélioration des conditions d’élevage participe au développement d’une aquaculture plus raisonnée. La nutrition vitaminique joue un rôle clé dans l'optimisation des performances de production et la résistance au stress. Cependant, les conditions d'élevage actuelles ont révélé que les niveaux de vitamines recommandés ne permettent plus d’optimiser la croissance et la résistance au stress et ainsi de promouvoir la santé des salmonidés. En effet, la réduction de la part de farine de poisson au profit d’une part de plus en plus importante d’ingrédients d’origine végétale dans les rations alimentaires et la pression pour réduire l'utilisation d'antibiotiques nécessite de revoir régulièrement les niveaux de vitamines dans l’alimentation, de les adaptés aux différents stades de vie des poissons et aux facteurs de stress que subissent les poissons. Malgré l’importance des fonctions des vitamines, peu d’études ont été réalisées pour déterminer les besoins vitaminiques chez les salmonidés. De plus, ces études, réalisées dans des conditions de laboratoire contrôlées et optimales, se basaient uniquement sur la modification d’une seule vitamine dans la ration alimentaire négligeant de ce fait les interactions de fonctions entre les vitamines et les autres nutriments. Ainsi, les recommandations précédemment établies pour les niveaux d'inclusion de vitamines alimentaires étaient probablement biaisées et sous-optimales pour des applications pratiques avec des formulations alimentaires modernes. De nombreux travaux ont montré les effets bénéfiques de l’incorporation de taux élevés de vitamines par rapports aux besoins recommandés sur la croissance et la santé des poissons, notamment en conditions d’élevage sous-optimales. Le concept de vitamine optimale s’avère une stratégie nutritionnelle bénéfique afin d’optimiser la physiologie du poisson et les fonctions du système immunitaire en réponse à des conditions de stress.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront à court terme de mieux comprendre les effets bénéfiques de taux élevés de prémélange de vitamines sur la capacité des poissons à faire face à des conditions de stress. La mise à disposition des résultats et leur interprétation permettra aux producteurs de poisson d’améliorer leurs conditions d’élevage et de participer à une pisciculture plus raisonnée.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 17 jours, dont 10 jours de stress d'entassement et 7 jours de récupération. Au cours du stress, le volume de l'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours pouvant entrainer des blessures au niveau de la nageoire pectorale et caudale. Ces blessures ne pourraient apparaitre qu'à la fin de la période de stress. Les animaux risquent déprouver une douleur transitoire à l'endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal. Le temps de prélèvement ne dépassera pas une minute.

Impact sur les animaux

Perte de poids, diminution du facteur K (facteur de condition de Fulton), refus de s’alimenter, dégradation de l’état corporel

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet de concentrations élevées en vitamines sur la résistance des poissons au stress d'élevage et d'optimiser de ce fait les rations alimentaires pour leur bien être.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, la protection vitaminique sera investiguée au niveau des organes et dans la circulation sanguine. Or, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico intégrés capables de mettre en évidence ce type d’effet sur la stimulation du système immunitaire pour faire face aux stress d’élevage subis par les poissons. Enfin les paramètres zootechniques sont également d’importance pour cette évaluation car étroitement liés à la physiologie du poisson et nécessitent des animaux vivants.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur les paramètres du stress (réponse immune, expression de gènes…) chez la truite arc en ciel ayant subis un stress d'élevage. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie social essentiel au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Avant toute manipulation, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins, les prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans la procédure qui définit le volume limite de sang et les périodes de récupération nécessaires. Pour protéger le bien-être des animaux, ils seront suivis au moyen de grilles d'évaluation du bien-être animal, et des points limites adaptés seront appliqués immédiatement si un animal semble éprouver des effets indésirables imprévus. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température…) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les concentrations de vitamines évaluées chez la truite arc en ciel sont destinées à être incorporées dans les aliments comme additif alimentaire pour les salmonidés. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Truites adultes pesant 210± 15grammes seront utilisées pour pouvoir effectuer les échantillonnages d’organes et les prélèvements de sang demandés par la procédure.

192 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont exposés par bain à la bactérie Aeromonas salmonicida et subissent deux prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point une infection expérimentale par balnéation et déterminer la dose létale médiane. Le porteur indique que l'infection peut provoquer un mal-être allant de l'inconfort à la douleur, les poissons moribonds étant retirés et tués par surdosage d'anesthésique. Il justifie le recours aux animaux en affirmant que l'évaluation d'un antibiotique ou d'un vaccin "ne peut se faire que sur animaux vivants".

Objectifs

Le projet FEAMP Medic'eau vise à optimiser les données posologiques des antibiotiques et les conditions d'administration des vaccins utilisés en aquaculture afin d'améliorer leur efficacité et de réduire l'usage d'antibiotiques en élevage aquacole

Bénéfices attendus

Nous maitrisons actuellement les infections expérimentales à A. salmonicida chez la Truite arc en ciel par administration par voie intra-musculaire. Cependant, ces modalités d'infection sont éloignées des modalités naturelles

Procédures

Prises de sang sur animaux anesthésiés. Prélèvement deux fois (T0 et Tfinal) de 200 µl de sang. exposition à une infection bactérienne

Impact sur les animaux

Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peut entrainer du mal être chez le poisson allant de l'inconfort à la douleur;

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet Medic'eau étant d'évaluer l'efficacité d'un traitement antibiotique et/ou de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

l'objectif du protocole est de mettre au point le challenge infectieux par balnéation permettant de déterminer la DL 50. Afin de vérifier que les poissons survivants ont bien été infectés, une analyse immunologique sérique sera effectuée sur chacun des poissons. Du fait de la variabilité individuelle importante de certains paramètres immunitaires, les modèles statistiques avec un risque alpha de 0,05 et une puissance de test de 95% préconisent des lots de 10 poissons nécessaires/restant en fin d'expérimentation

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (4 semaines). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm2) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel d'Aeromonas salmonicida Les truites utilisées pèseront environ 200g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, portion -200-250g- et grosse truite > 1kg). Sur le terrain les problématiques sont plus importante chez les truites pesant plus de 1 kg car elles arrivent en fin de production. Du fait du matériel de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible d'élever des truites arc en ciel de cette taille (> 1 Kg) en nombre suffisant et pour permettre l'aquisition de résultats répétables. L'étude sur des poissons de poids de 200 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant rentrer dans l'étude. A ce poids (200g) les animaux sont considérés comme physiologiquement proche des animaux d'un poids plus élevé > 1 Kg (hors période de gamétogènèse). Les truites utilisées seront des femelles triploides, ne rentrant pas en gamétogènèse, et représentant le type de truite arc en ciel le plus élévée en aquaculture.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.