Rongeurs
Efficacité de biothérapies administrées par les voies aériennes dans un modèle murin de transmission du virus Influenza
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 060 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue, et celles infectées par la grippe traversent la maladie sans antalgique ni anti-inflammatoire, ces traitements étant, selon le porteur, "susceptibles de modifier la réponse inflammatoire". Le virus est inoculé par le nez sous anesthésie à une partie d'entre elles, qui doivent le transmettre à d'autres souris, et 1 200 reçoivent une biothérapie par voie nasale, trachéale ou intraveineuse. L'infection peut provoquer une perte de poids, une prostration et une gêne respiratoire. Une souris est tuée par dislocation cervicale sous anesthésie quand elle perd plus de 25 % de son poids ou atteint le score clinique maximal de 7, qui inclut des difficultés respiratoires.
Objectifs
Les infections respiratoires sont responsables de plus de trois millions de décès chaque année dans le monde. Les infections d'origine virale constituent un défi majeur en raison de la dérive génétique continue des virus, qui favorise l'émergence de nouveaux variants et réduit progressivement l'efficacité des traitements antiviraux et des vaccins disponibles. À l'heure actuelle, la majorité des biothérapies est administrée par voie intraveineuse (i.v.). Cette voie d'administration est toutefois peu adaptée au traitement des infections pulmonaires, les biomédicaments diffusant faiblement vers le territoire respiratoire après administration systémique. Seule une faible fraction des molécules administrées par voie intraveineuse atteint les poumons. Depuis plusieurs années, les travaux précliniques menés au CEPR démontrent l'intérêt de l'administration par inhalation pour améliorer l'index thérapeutique de ces biothérapies. Cette voie est déjà largement utilisée en pratique clinique pour l'administration de bronchodilatateurs et de corticoïdes dans le traitement des pathologies respiratoires. L'administration de biothérapies par inhalation permet un ciblage direct du médicament au niveau pulmonaire sous forme d'aérosol. Dans le contexte des infections respiratoires, cette approche devrait permettre une action plus rapide, une concentration élevée du médicament au plus près du site de réplication virale et une limitation de l'exposition systémique, réduisant ainsi le risque d'effets indésirables. Les travaux du CEPR ont montré que le procédé d'aérosolisation, associé à l'utilisation de nébuliseurs adaptés et de formulations spécifiques, permettait d'administrer des biothérapies tout en préservant leurs propriétés physicochimiques et biologiques. Ils ont également démontré qu'une biothérapie dirigée contre des bactéries ou des virus responsables de pneumonies atteignait les poumons en quantité significativement supérieure après administration par inhalation qu'après administration intraveineuse, avec une amélioration concomitante de son efficacité thérapeutique. Dans ce contexte, le présent projet a pour objectifs : 1_développer et optimiser un modèle murin robuste de transmission du virus influenza. 2_utiliser ce modèle pour évaluer différentes stratégies thérapeutiques et caractériser les réponses immunitaires associées
Bénéfices attendus
Ce projet, fondé sur des données précliniques solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques inhalées destinées à limiter la dissémination des agents pathogènes respiratoires et à mieux comprendre les mécanismes immunitaires associés à leur efficacité. Les connaissances acquises, combinées à celles générées par les autres volets du programme Inhealation, constitueront une base scientifique pour le développement de futures études translationnelles et la conception d'essais cliniques. Le développement d'un modèle murin reproductible de transmission du virus influenza constituera également un outil préclinique permettant d'évaluer de futures stratégies thérapeutiques ou vaccinales destinées à limiter la transmission des virus respiratoires. Les approches évaluées dans ce projet ciblent les infections respiratoires virales touchant les voies aériennes supérieures et/ou inférieures, notamment celles associées à des pneumonies. Ces infections représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur fréquence, de leur impact en termes de morbidité et de mortalité, ainsi que des coûts humains, sociaux et économiques qui leur sont associés. L'administration inhalée de biothérapies pourrait constituer une stratégie permettant d'améliorer leur efficacité locale tout en limitant l'exposition systémique. Au-delà du virus influenza, les connaissances acquises sur les modalités d'administration, les réponses immunitaires induites et les mécanismes de protection pourront être transposées à d'autres infections respiratoires, notamment celles causées par le virus respiratoire syncytial ou le SARS-CoV-2. Les biothérapies sont déjà utilisées en clinique dans de nombreuses indications. Ce projet vise à optimiser leur administration dans le traitement des infections respiratoires en privilégiant la voie inhalée, qui permet un dépôt direct du médicament au niveau du site d'infection. Cette stratégie pourrait améliorer l'efficacité des traitements tout en contribuant à limiter la transmission des virus respiratoires. Enfin, l'administration par inhalation présente l'avantage d'être une approche non invasive permettant de délivrer rapidement les biothérapies directement au niveau des voies respiratoires, principal site de réplication des virus ciblé.
Procédures
_Infection par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1560, 760 ou 1160 animaux, 1 fois _Administration des biothérapies par voie intranasale petit volume: sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois __Administration des biothérapies par voie intranasale grand volume: sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois _Administration des biothérapies par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois _Administration des des biothérapies par voie intraveineuse : sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois
Impact sur les animaux
Des données préliminaires obtenues au laboratoire ont permis d'identifier des doses de biothérapies ne présentant pas de toxicité apparente chez la souris. Les expérimentations prévues seront donc réalisées uniquement avec ces doses. L'infection expérimentale par le virus influenza est susceptible d'entraîner une altération transitoire de l'état général des animaux, caractérisée notamment par une perte de poids, une diminution de l'activité, un pelage ébouriffé, une réduction de la prise alimentaire ou hydrique ainsi qu'une gêne respiratoire liée à l'inflammation des voies aériennes. L'intensité de ces signes cliniques dépendra de l'évolution de l'infection. L'administration d'antalgiques ou d'anti-inflammatoires ne pourra pas être envisagée au cours de l'évolution de la maladie, ces traitements étant susceptibles de modifier la réponse inflammatoire et immunitaire induite par l'infection ainsi que l'évaluation de l'efficacité des stratégies thérapeutiques étudiées. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique quotidienne, voire biquotidienne si leur état le justifie. Les paramètres suivants seront évalués : (i) perte de poids, (ii) altération de l'état général et des comportements physiologiques (prostration, diminution ou absence de prise alimentaire et hydrique, pelage ébouriffé), et (iii) apparition de signes cliniques évocateurs d'une aggravation de l'infection (yeux mi-clos, difficultés respiratoires, sibilances ou autres signes de détresse). Ces observations seront intégrées à un score clinique standardisé compris entre 0 et 7. Des points limites précoces ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive. Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 25 % de son poids initial ou atteignant un score clinique de 7 sera immédiatement euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isoflurane (4 %).
Devenir
Les objectifs de ce projet sont (i) de développer et valider un modèle murin de transmission du virus influenza et (ii) de caractériser les réponses immunitaires induites par des biothérapies inhalées afin d'améliorer leur développement préclinique et leur transposition vers la clinique. Dans la première procédure, les animaux seront euthanasiés afin d'évaluer les paramètres nécessaires à la caractérisation du modèle de transmission, notamment la charge virale dans les voies respiratoires et les tissus cibles. Dans la seconde procédure, l'euthanasie permettra la réalisation de prélèvements terminaux (lavages nasaux et broncho-alvéolaires, poumons, ganglions drainants, rate et autres tissus d'intérêt) indispensables à l'étude de la charge virale, des populations immunitaires et des médiateurs de l'inflammation. Par ailleurs, les animaux auront été infectés expérimentalement par le virus influenza et ne pourront, pour des raisons sanitaires et scientifiques, être réutilisés ou replacés. En conséquence, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure afin de permettre la réalisation des analyses prévues et d'atteindre les objectifs du projet.
Remplacement
À ce jour, aucune méthode in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les infections respiratoires virales, notamment les interactions complexes entre le virus, les différents compartiments du système immunitaire et les tissus de l'appareil respiratoire. Un des objectifs principaux de ce projet est d'étudier la transmission naturelle d'un virus respiratoire entre individus. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire ce phénomène biologique complexe., ne peuvent pas être modélisés de manière pertinente à l'aide de systèmes cellulaires. Par ailleurs, ce projet vise à évaluer l'efficacité de biothérapies administrées directement dans les voies aériennes. L'étude de leur distribution pulmonaire, de leur activité biologique, de leur impact sur la transmission virale ainsi que des réponses immunitaires locales et systémiques qu'elles induisent nécessite l'utilisation d'un organisme entier. Le modèle murin d'infection par le virus influenza est largement décrit et validé dans la littérature comme modèle préclinique des infections respiratoires virales. Il permet de reproduire les principales caractéristiques de l'infection ainsi que les réponses immunitaires associées. Enfin, la disponibilité de nombreux outils génétiques et immunologiques chez la souris constitue un atout majeur pour caractériser les mécanismes impliqués dans la protection induite par les biothérapies et les immunomodulateurs
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est optimisé en réalisant un maximum d'analyses sur chaque animal. Les prélèvements permettront notamment d'évaluer les populations immunitaires, les cytokines, l'expression génique, l'histologie ainsi que la charge virale, maximisant ainsi les informations obtenues à partir de chaque individu. Le modèle murin d'infection par le virus influenza est maîtrisé par l'équipe et le porteur du projet, ce qui limite les phases de mise au point expérimentale. De plus, de nombreuses données préliminaires sont déjà disponibles, permettant de restreindre le nombre de souches virales, de doses de biothérapies et de temps d'analyse à évaluer. Les expériences sont organisées de manière à mutualiser les groupes témoins lorsque cela est scientifiquement justifié, afin d'éviter toute répétition inutile. Une première procédure est spécifiquement dédiée au développement et à l'optimisation du modèle de transmission. Cette étape permettra de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes avant l'évaluation des biothérapies et contribuera ainsi à réduire le nombre d'animaux nécessaires aux études d'efficacité. Les effectifs ont été déterminés à partir de calculs de puissance statistique (voir Annexe). Pour la procédure 1, la différence attendue de charge virale entre les souris index et les souris contact est estimée à 4,5 avec un écart-type de 1,9 (données de la littérature). Pour la procédure 2, la différence attendue entre les souris traitées et les souris non traitées est estimée à 1,5 avec un écart-type de 0,9 (données de la littérature). Dans les deux cas, en considérant un risque α de 5 % et une puissance statistique minimale de 80 %, la taille d'échantillon calculée est de cinq animaux par groupe. E nfin, un lot limité d'animaux est prévu pour le tutorat des intervenants afin de garantir la maîtrise des gestes techniques avant la réalisation des procédures expérimentales. Cette formation, assurée par le Dr Thomas Sécher, membre de la Structure chargée du Bien-Être Animal (SCBEA) et tuteur validé par la PSTA, contribue à limiter les échecs expérimentaux et la répétition de manipulations.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (papier absorbant et fragments de boîtes à œufs), conformément aux recommandations en vigueur. Une période d'acclimatation sera respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié au changement d'environnement. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié ou en cours de formation sous tutorat, afin de garantir la maîtrise des gestes techniques et de limiter le stress ainsi que les manipulations inutiles. Notamment, les administrations par voie respiratoire seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de limiter le stress des animaux et de garantir la qualité du geste technique. Tout au long des expérimentations, les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique pluriquotidienne assurée conjointement par les animaliers et les expérimentateurs, permettant de détecter précocement toute altération de leur état de santé et l'atteinte des points limites définis dans les procédures expérimentales (section 4.2). Une vigilance particulière sera maintenue durant les quatorze jours suivant l'infection, période correspondant au développement des signes cliniques. Afin de limiter les conséquences de l'infection sur l'état général des animaux, de la nourriture humidifiée (gel alimentaire) sera mise à disposition de manière préventive directement dans les cages afin de faciliter l'accès à l'eau et à l'alimentation des animaux présentant une diminution de leur mobilité ou de leur prise alimentaire. Tout animal atteignant un point limite sera immédiatement pris en charge conformément aux critères d'arrêt définis dans le projet.
Choix des espèces
La souris (Balb/cJRj) constitue le modèle préclinique de référence pour l'étude des infections expérimentales par le virus influenza. Elle permet de reproduire les principales caractéristiques de l'infection respiratoire ainsi que les réponses immunitaires induites au niveau des voies aériennes. De plus, des modèles murins de transmission du virus influenza sont largement décrits dans la littérature (Edenborough et al. J Virol, 2012 / Price et al. J Virol, 2014) et constituent une approche pertinente pour étudier les mécanismes impliqués dans la dissémination virale et leur inhibition par des stratégies thérapeutiques. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable pour ce projet. Les réponses immunitaires des voies respiratoires reposent sur des interactions complexes entre les différents compartiments anatomiques (cavités nasales, voies aériennes et poumons), les cellules immunitaires innées et adaptatives, ainsi que le contexte inflammatoire induit par l'infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des approches in vitro ou ex vivo. En outre, l'évaluation de la transmission virale entre individus ainsi que de son inhibition par des biothérapies nécessite un organisme entier. La souris offre également un large éventail d'outils expérimentaux permettant une caractérisation fine des mécanismes immunitaires impliqués dans la protection contre la transmission virale. Les techniques disponibles au laboratoire (cytométrie en flux, microscopie confocale, analyses multiplex des cytokines, biologie moléculaire et histologie), ainsi que l'accès à de nombreux modèles transgéniques si nécessaire, permettent d'exploiter pleinement les prélèvements réalisés sur chaque animal et de maximiser les informations obtenues.
Impact des fongicides sur le neurodéveloppement avant sevrage
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposés aux fongicides dans l'utérus puis par le lait maternel, les souriceaux de ce projet sont tués à 21 jours d'âge, encore allaités. 108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans que le résumé distingue les mères des petits. Les femelles gestantes sont gavées une fois par jour pendant sept semaines, avec un risque d'irritation de l'œsophage, puis subissent une prise de sang à l'éveil. Toutes sont tuées pour analyser leurs tissus, une partie par une "chirurgie terminale sous anesthésie profonde" dont le résumé ne décrit pas le geste.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées lors du développement sous l’exposition aux fongicides durant la lactation.
Bénéfices attendus
L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de développement cérébrale dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce geste dure environ une minute. Certains animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil : Réalisée une seule fois en fin de protocole. Durée totale de la procédure de l'injection d'anesthésique au prélèvement des tissus : environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'œsophage. Le prélèvement sanguin sera réalisé sur un animal vigile, ce qui pourrait induire un stress. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience. À l'issue de l'étude une partie des animaux sont mis à mort par chirurgie terminale sous anesthésie profonde.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 10 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, deux pesées hebdomadaires pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux, seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Dans la cadre d’un prélèvement de sang, les dispositions suivantes seront prises pour améliorer la récupération : un temps de récupération sur plaque chauffante, une injection de NaCl 0,9% (sérum physiologique) chauffé à la température de 37°C du volume équivalent au volume de sang prélevé sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques pertinentes pour évaluer la toxicité. Les animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation via la mère. Les souris issues de cette gestation seront prélevées à 21 jours d'âges. A cette phase, les animaux sont toujours exposés aux fongicides via la lactation.
Etude de l’effet d’activateurs du canal sodique musculaire sensible au voltage sur la faiblesse musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
72 souris, mutantes pour le canal sodique musculaire ou témoins, vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. Après une injection d'analgésique à l'éveil, chacune est anesthésiée, incisée aux deux pattes arrière et injectée dans un muscle de chaque patte avec des peptides tirés de venins, puis maintenue endormie trente minutes avant d'être tuée pour disséquer ces muscles. La force se mesure ensuite sur muscle isolé, en vue de molécules candidates contre des myopathies congénitales. Le porteur juge "nécessaire de les injecter en intramusculaire avant la mise à mort" parce que ces peptides, trop gros, pénètrent mal dans un muscle déjà disséqué.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester si 3 molécules peptidiques issues de venins d’animaux et synthétisées en laboratoire, augmentent la force développée par des muscles squelettiques isolés de souris (protocoles dits « ex vivo »). Nous avons montré que ces molécules augmentent l'activité du canal sodique musculaire dans des cellules en culture. Or, l'activité de ce canal régule l'intensité de la force développée par les muscles : plus il est actif, plus la force musculaire est importante. Nous souhaitons déterminer si ces 3 molécules sont capables d’augmenter la force musculaire. Malheureusement, les molécules peptidiques pénètrent très peu dans le muscle lorsqu'elles sont mises dans le milieu dans lequel un muscle disséqué baigne, ceci à cause de leur grande taille. Il est donc nécessaire de les injecter en intramusculaire avant la mise à mort de l’animal pour améliorer leur diffusion intramusculaire et réduire le risque de faux négatifs lorsque nous devons mesurer la force développée par un muscle isolé de souris en présence de ces molécules.
Bénéfices attendus
Le canal sodique musculaire est une protéine indispensable à la contraction musculaire chez les mammifères. Une forte réduction de son activité d’origine génétique cause chez l'homme des myopathies congénitales avec perte de force (faiblesse) musculaire invalidante voire mortelle à la naissance de type myopathique. Aucun traitement n'existe pour améliorer ces myopathies. Nous avons établi une lignée de souris mutée pour ce canal. Les muscles des souris avec moitié moins de canal sodique sont faibles comparés aux muscles de souris contrôles lorsqu’on mesure la force qu’ils développent ex vivo. Réaliser ce projet déterminera si les 3 molécules peptidiques identifiées, qui activent le canal sodique dans des cellules, sont capables d’améliorer la faiblesse des muscles de souris ayant moitié moins de canal sodique comparés aux muscles de souris contrôles. Nous espérons ainsi identifier des molécules thérapeutiques candidates contre les myopathies causées par une forte réduction d’activité du canal sodique musculaire.
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil d'1h30 est prévue. Chaque animal aura une injection sous-cutanée d'un analgésique à l’état vigile (5 min). Il sera anesthésié 30 min après cette injection (anesthésie gazeuse, 10 min induction). Une incision de la peau des 2 pattes arrière et une injection intramusculaire dans un muscle de chaque patte arrière seront effectuées sous anesthésie (15 minutes). L'animal sera maintenu anesthésié pendant 30 min après l’injection intramusculaire puis mis à mort pour dissection des muscles injectés.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée d'un analgésique à l’état vigile peut engendrer un stress. L'injection intramusculaire et les molécules injectées peuvent avoir des effets douloureux locaux. Les molécules injectées pourraient avoir des effets sur le système cardiaque ou respiratoire si elles pénètrent dans la circulation générale sanguine en trop grande quantité.
Devenir
Nous devons mettre à mort les animaux pour disséquer les muscles injectés et mesurer la force qu'ils développent en réponse à des stimulations électriques directement appliquées sur le muscle.
Remplacement
Nous étudions l'effet des molécules peptidiques testées sur le canal sodique musculaire dans des cultures cellulaires pour remplacer les animaux. Ces études nous permettent de déterminer quelles sont les molécules les plus intéressantes à étudier. Différentes doses par molécule sont étudiées en culture, ce qui nous permet de définir une dose à utiliser in vivo et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Néammoins, ces modèles cellulaires ne sont pas des cellules musculaires, et ne peuvent pas se contracter. Des modèles de culture de cellules musculaires existent, mais ils correspondent à des cellules musculaires en début de développement qui se contractent de manière anarchique et non contrôlée contrairement aux cellules musculaires adultes fonctionnelles. L'organisation des cellules musculaires in vitro ne reproduit pas aujourd'hui l'alignement des cellules musculaires composant un muscle. Leur contraction asynchrone ne permet pas de développer une force suffisamment robuste pour être mesurée de manière reproductible. Enfin, les modèles musculaires en culture expriment en forte quantité un second canal sodique sensible au voltage dont la présence faussera les résultats observés. C'est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de déterminer l'effet des molécules peptidiques sélectionnées sur la force développée par un muscle squelettique adulte.
Réduction
L'injection intramusculaire permet d'optimiser la diffusion intramusculaire des molécules peptidiques étudiées. Cela permet de réduire le nombre d'animaux requis pour palier une grande variabilité des résultats, voire le risque de faux-négatifs et donc de mises à mort inutiles, si nous placons les molécules dans le milieu dans lequel baigne le muscle isolé. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaires pour voir un effet. Les effectifs ont été ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet statistique significatif.
Raffinement
Une période d'acclimatation de 2 semaines sera respectée à l’arrivée des animaux. Un analgésique sera injecté afin de contrecarrer la douleur liée à l'incision de la peau et à l'injection intramusculaire et celle éventuellement liée à l’action biologique des molécules peptidiques. L'injection intramusculaire et la faible quantité de molécules injectée réduisent fortement les risques liés à une diffusion dans la circulation générale. L'animal anesthésié sera placé sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire et l'absence de mouvements ou d'hémorragie seront contrôlés tout au long de l'anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est utilisée car c'est le mammifère pour lequel les outils de modification du génome, les protocoles d'anesthésie, d'injection intramusculaire et de mesure de force développée par les muscles isolés sont les mieux établis, ce qui permet au mieux de respecter les 3R. Nous utiliserons des souris d'une lignée génétiquement modifiée pour le canal sodique musculaire que nous avons développée pour cet objectif. L'utilisation de cette lignée est essentielle pour envisager un développement à visée thérapeutique pour les myopathies congénitales humaines. Des adultes agés de 2,5 à 6 mois seront utilisés car à ces âges les muscles ont une taille suffisante pour réaliser des expériences robustes. C'est à ces âges que nous avons montré une perte de force des muscles isolés d'animaux mutants pour le canal sodique. Des mâles seront utilisés pour tester les 3 molécules, nos résultats précédents montrant que la faiblesse liée au canal sodique musculaire est plus marquée pour ce sexe. Des femelles seront utilisées uniquement pour la molécule identifiée comme étant la plus efficace chez les mâles afin de confirmer qu'elle est également efficace pour ce sexe tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Amélioration de traitement anticancéreux chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.
Objectifs
Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.
Bénéfices attendus
À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.
Remplacement
Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.
Raffinement
Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.
Evaluation de l’effet de candidat-médicaments sur la régulation de la calcémie sur un modèle de rat thyroidectomisé
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Opérés sous anesthésie pendant trente à quarante-cinq minutes pour retirer la thyroïde et les parathyroïdes, puis pour certains réopérés afin d'implanter une minipompe, des rats reçoivent chaque jour, pendant quinze jours au plus, un candidat-médicament ou un placebo, avec des prises de sang à l'éveil. 345 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'hypocalcémie provoquée pouvant entraîner des tremblements, une baisse d'activité et une perte de poids. Le porteur prévoit cinq rats par groupe pour en inclure trois dans l'étude, sans dire ce qu'il advient des deux autres. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes, ou plus tôt si l'hypocalcémie produit des "effets marqués".
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicaments sur la régulation du calcium chez le rat ayant subi une thyroïdectomie préalable. L'hypoparathyroïdie est un déficit en hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou des suites d'une chirurgie au niveau des glandes thyroïdes ou parathyroïdes. L'hormone parathyroidienne, ou parathormone, est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont liés à une hypocalcémie et comprennent des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement ne répond pas correctement sur tous les patients et ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). Il ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (p. ex., hypercalciurie, diminution de la densité minérale osseuse). Dans ce cas des traitements à base de parathormone recombinée sont nécessaires. Aucun traitement de ce type n'est approuvé à ce jour.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de démontrer les effets bénéfiques de nouveaux médicaments pour traiter l'hypoparathyroïdie, une pathologie humaine touchant 40 personnes pour 100000 et pouvant avoir une application également en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Ce projet nécessite différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée sur certains animaux afin de réaliser une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes (durée: 30-45min). Certains animaux pourront subir une seconde chirurgie afin d'implanter un dispositif (minipompe) permettant la délivrance d'un produit en perfusion continue (durée: 15-20 min). Les animaux opérés seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la/les chirurgies, les candidat médicament ou le placebo seront administrés tous les jours aux animaux par voie sous-cutanée (bolus ou perfusion) (durée 1-2minutes) pendant un maximum de 15 jours. Des prélèvements sanguins seront effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile (durée des prélèvements: moins de 3min).
Impact sur les animaux
Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont connus et clairement identifiés chez l'homme, et consistent en des fourmillements dans les extrémités ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Ces effets sont liés à une hypocalcémie et seront maitrisés par des apports quotidiens en calcium ou des traitements à base d'analogue de la parathormone endogène, partiellement ou totalement absente dans ce modèle. Les effets potentiellement indésirables du/des produit(s) font l’objet d’échanges avec les inventeurs du nouveau candidat médicament pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiperau mieux de potentiels signes cliniques. Chez le rat, l'hypocalcémie peut entrainer des tremblements, une diminution de l'activité locomotrice et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort en fin de procédure pour la réalisation de prélèvement d'organes ou suite à des effets marqués liés à l'hypocalcémie.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteints d'hypoparathyroïdie ou, si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de calcium circulant dans le sang, et d'évaluer les mécanismes de régulation de ce dernier, ce qu'il n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. 5 animaux par groupe seront utilisés pour en inclure 3 par groupe en étude et ce nombre a été montré suffisant pour répondre aux objectifs de l'étude.
Raffinement
Le raffinement de la procédure expériementale sera obtenu par un protocole anesthésique et analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire et un suivi post opératoire de l'état de santé des animaux (avec grille de scoring) avec des soins adaptés. Les animaux seront manipulés pour diminuer le stress lié aux contentions. Les animaux sont également suivis quotidiennement (suivi pondéral et signes cliniques). Des points limites adpatés sont définis et le recours à une supplémentation orale en calcium + vitamine D en cas d'hypocalcémie associée à des signes cliniques, ou à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets d’un produit sur la calcémie et le métabolisme du calcium dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Une souris qui montre une perte de poids, une blessure ou de "mauvaises relations sociales" est soignée, isolée ou mise à mort, sur la base d'une surveillance deux fois par semaine au minimum. 5 209 souris issues de lignées génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées pour une part sous anesthésie sans réveil, pour une autre d'un niveau de souffrance sévère. Une des lignées présente des troubles de la coordination des mouvements, l'état des lignées à créer reste inconnu selon le porteur, des souris sont gardées jusqu'à 24 mois, et leur comportement moteur est testé pendant deux jours sans que les tests soient nommés. Le résumé ne décrit comme nuisance qu'une ouverture du thorax sous anesthésie, sans réveil, et ne dit rien de ce qui vaut à une partie des souris le niveau sévère.
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire : d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Cette étude a pour ambition d’analyser les relations entre ces différents aspects et d’établir comment ils coopèrent dans la régulation de fonctions du squelette des cellules, le cytosquelette. Le cytosquelette étant impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation. La modification proposée permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur l’effet du cytosquelette sur la fonction neuronale.
Procédures
Une partie des animaux est soumise à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie. Le comportement moteur de certains autres animaux d’intérêt sera ensuite analysé (duré de test : 2 jours), les animaux seront ensuite mis à mort pour permettre les analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.
Étude des interactions entre Horloge circadienne et Réponse au stress du réticulum endoplasmique dans l’épithélium intestinal sain et inflammatoire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Des souris reçoivent une eau de boisson qui déclenche une inflammation de l'intestin et des douleurs intestinales, et 832 d'entre elles sont privées de nourriture dix-huit heures par jour pendant douze semaines au plus. Au total, 1 434 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, une partie dès leur vie embryonnaire et pendant l'allaitement. Le porteur écrit pourtant que les "seules interventions" subies sont des injections d'une "durée de 2 secondes", une fois par jour pendant 8 ou 51 jours. Toutes sont tuées au terme des procédures ou quand les points limites sont dépassés, pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) provoquent une inflammation durable de l’intestin, avec des périodes où les symptômes s’aggravent (poussées) et d’autres où ils diminuent (rémissions). Elles apparaissent chez de jeunes adultes, mais leurs causes, en lien avec leur environnement, ne sont pas connues. On pense aujourd’hui que deux mécanismes importants pourraient jouer un rôle dans ces maladies. Le premier est l’horloge biologique interne (appelée horloge circadienne), qui régule le fonctionnement du corps tout au long de la journée. Le second est un système de défense des cellules qui aide les cellules à survivre dans un environnement difficile. Chez les patients atteints de MICI, ces deux systèmes sont perturbés, mais on ne sait pas si ces perturbations sont liées, ce qui les causent, ni si elles jouent un rôle dans l’apparition de l’inflammation intestinale. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de ces mécanismes dans l’apparition des MICI. Pour cela, des études seront réalisées chez la souris afin de : 1) observer le fonctionnement de l’horloge biologique et du sytème de défenses des cellules dans un intestin sain ou inflammé ; 2) comprendre comment ces deux systèmes interagissent et influencent l’inflammation intestinale ; 3) déterminer si des perturbations précoces (pendant le développement ou l’allaitement) de l’Horloge peuvent augmenter le risque de développer une MICI une fois adulte ; et 4) tester de nouvelles approches, notamment alimentaires ou médicamenteuses, pour rétablir le fonctionnement normal de ces mécanismes et réduire l’inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre l’origine des MICI et à ouvrir la voie à de nouveaux traitements, car les thérapies actuelles ne permettent pas de guérir les MICI, ne sont pas efficaces chez tous les patients et entraînent de lourds effets secondaires. À court terme, ce projet apportera des connaissances fondamentales nouvelles sur le (dys)fonctionnement de l’intestin, en décrivant pour la première fois la rythmicité des cellules du côlon en temps normal et durant les MICI. Il fera un lien entre la rythmicité des cellules du côlon, la sévérité de l’inflammation intestinale et la rythmicité des comportements alimentaires. À moyen et long terme, les résultats attendus pourraient améliorer la compréhension des mécanismes précoces (en particulier durant le développement embryonnaire ou l’allaitement) de prédisposition aux MICI. Le projet pourrait aussi contribuer à identifier des marqueurs biologiques prédictifs de l’activité de la maladie ou de la réponse thérapeutique. Enfin, en évaluant chez la souris l’efficacité d’une régulation de la rythmicité des cellules du côlon, il pourrait poser les bases d’une stratégie thérapeutique innovante, non immunosuppressive, combinant une intervention pharmacologique ciblée et des recommandations hygiénodiététiques. À terme, ces avancées pourraient bénéficier aux patients atteints de MICI en contribuant à réduire la fréquence ou l’intensité des poussées inflammatoires et à prolonger les phases de rémission.
Procédures
Les seules interventions auxquelles seront soumis les animaux sont des injections d’une durée de 2 secondes une fois par jours pendant 8 jours ou 51 jours. Induction de l’inflammation de l’intestin par l’eau de boisson. Restriction alimentaire, 18h par jour, pendant 12 semaines au maximum pour une partie des animaux (832)
Impact sur les animaux
Fatigue durant les premiers jours jours d’acclimatation au cycle circadien standard (12h lumière / 12h obscurité) utilisé durant la procédure. Stress lié aux manipulations répétées. Stress durant les premiers jours de restriction alimenatire lorsque les souris ne sont pas encore habituées aux heures d’accès à la nourriture. Douleurs intestinales liées à l’eau de boisson pour induire une inflammation de l’intestin. Stress physique liés aux injections des traitements (et douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille). Stress lié aux effets cumulatifs (rythme alimentaire, induction de l'inflammation de l’intestin, manipulations répétées).
Devenir
Lorsque les points limites sont dépassés ou lorsque les temps définis sur les différentes procédures sont atteints les animaux sont euthanasiés afin de prélever des organes pour analyses ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour étudier les interactions entre l’horloge circadienne, la réponse au stress et la physiopathologie des maladies inflammatoires, car ces processus reposent sur une intégration complexe à l’échelle de l’organisme entier. Le fonctionnement de l’horloge circadienne repose sur une organisation intégrée à l’échelle de l’organisme, où des signaux environnementaux tels que la lumière, l’alimentation et les cycles veille/sommeil synchronisent l’horloge centrale. Cela assure la coordination temporelle des fonctions physiologiques et leur synchronicité avec l’environnement de l’organisme. Dans l’intestin, l’Horloge coordonne de manière dynamique les fonctions immunitaires, métaboliques et épithéliales qui interagissent entre elles et avec le microbiote intestinal. Il s’agit d’éléments clés des maladies inflammatoires impossible à reproduire in vitro. De plus, le stress cellulaire dépend de signaux systémiques (hormonaux, nutritionnels, inflammatoires) et de la synchronisation entre organes, qui ne peuvent être modélisés de façon adéquate dans des systèmes cellulaires isolés. Ainsi, seule l’approche in vivo permet d’appréhender la complexité spatio-temporelle des mécanismes intégrés au niveau systémique que nous étudions. Par ailleurs, le développement de notre nouvelle approche thérapeutique nécessite d’être réalisé chez le petit animal car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant d’évaluer son efficacité, sa toxicité et sa pharmacocinétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base de calculs de puissance statistique garantissant l’obtention de résultats fiables et scientifiquement interprétables, tout en limitant l’utilisation des animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en cages ouvertes, disposées en regroupement, et bénéficiant d’un enrichissement du milieu comprenant notamment du coton et des éléments de type jouets, afin de favoriser l’expression des besoins comportementaux et de réduire le stress lié à l’hébergement. Une période d’acclimatation de 15 jours sera mise en place avant le début des procédures expérimentales, afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux conditions d’hébergement.Les mesures de prise en charge de la douleur et de la détresse seront adaptées en fonction de l’état clinique des animaux. Les protocoles expérimentaux seront adaptés, atténués ou interrompus en fonction de la tolérance des animaux aux nuisances induites et de l’apparition de signes cliniques de souffrance, conformément aux principes du raffinement.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue un modèle pertinent et transposable pour étudier les interactions entre horloge circadienne, stress cellulaire et inflammation intestinale. En effet, bien que les souris soient des animaux nocturnes, elles sont largement utilisées en chronobiologie car leur système circadien est fortement conservé par rapport à celui de l’être humain, tant aux niveaux moléculaire que physiologique. La principale différence réside dans un décalage de phase de 12 heures de leur activité par rapport au cycle lumière–obscurité : les souris sont ainsi actives durant la phase obscure, tandis que les humains le sont durant la phase lumineuse. En dehors de cette inversion, l’organisation, la régulation et les sorties du système circadien, incluant les rythmes hormonaux, métaboliques et cellulaires, sont remarquablement similaires, faisant de la souris un modèle approprié et transposable pour les études circadiennes. Enfin, les mécanismes moléculaires de la réponse au stress sont similaires entre la souris et l’humain. Les animaux utilisés dans toutes les procédures (à l’exception de la procédure n°3) ont achevé leur développement et sont jeunes adultes lors de leur entrée en expérimentation, car les MICI sont généralement diagnostiquées chez de jeunes adultes. Cependant, les mécanismes physiopathologiques à l’origine des MICI se mettent vraisemblablement en place tôt au cours de la vie, et c’est la raison pour laquelle une fraction des animaux utilisés au cours de la procédure n°3 sont employés durant leur développement embryonnaire et leur période d’allaitement.
Mise au point d’une technique d’administration de métabolites marqués et d’une méthode d’extraction double des métabolites polaires et apolaires appliquées à l’étude des flux métaboliques dans un contexte d’inactivation des tissus adipeux 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".
Objectifs
Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.
Procédures
Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.
Remplacement
Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.
Réduction
Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).
Comparaison de l’efficacité d’antihistaminiques H2 sur la progression des maladies hépatiques chroniques et la prévention du cancer du foie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Toutes mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour récupérer leurs organes, 172 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection unique dont le résumé ne précise pas la nature, elles suivent un régime spécifique pendant 24 à 40 semaines pour développer une maladie chronique du foie, et une partie reçoit chaque jour par voie orale, par gavage ou prise volontaire, un antihistaminique ou un traitement de référence pendant 12 à 20 semaines. Ces antihistaminiques sont déjà autorisés chez l'humain contre l'acidité gastrique, et leur profil, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont, selon le porteur, "déjà bien documentés". Il conclut pourtant que l'utilisation des souris "demeure donc nécessaire".
Objectifs
Les maladies chroniques du foie touchent environ 1,5 milliards de personnes dans le monde. Elles évoluent dans la majorité des cas vers la fibrose du foie, qui peut progresser vers une cirrhose puis un cancer du foie. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, les options thérapeutiques permettant de ralentir cette progression restent limitées. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel d'une stratégie thérapeutique reposant sur le repositionnement de médicaments déjà utilisés chez l'Homme pour d'autres indications. Les travaux permettront d'étudier leur capacité à limiter la progression des maladies chroniques du foie et à prévenir le développement du cancer dans un modèle expérimental pertinent. Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour le traitement des pathologies liées à l'hypersécrétion acide gastrique. Leur repositionnement thérapeutique est particulièrement intéressant, car leur profil pharmacologique, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont déjà bien documentés. Le projet vise également à améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l'évolution des maladies hépatiques chroniques chez la Femme. Le CHC présente un dimorphisme sexuel marqué : son incidence est plus élevée chez les hommes que chez les femmes, et des différences liées au sexe influencent également la progression de la fibrose, la carcinogenèse et la réponse aux traitements. Afin de prendre en compte ces différences biologiques et d'améliorer la transposabilité des résultats à l'ensemble de la population de patients, cette étude sera réalisée chez des animaux mâles et femelles. Une étude pilote permettra d'abord de caractériser la cinétique de progression de la maladie chez les femelles afin d'adapter le calendrier expérimental à leur évolution plus lente.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies de traitements des maladies hépatiques chroniques et de prévention du cancer du foie. Si l'efficacité des molécules étudiées est confirmée, leur repositionnement thérapeutique pourrait accélérer leur évaluation clinique dans cette indication, grâce aux données déjà disponibles concernant leur sécurité d'emploi, réduisant ainsi les délais de mise à disposition par rapport au développement d'une nouvelle molécule. Les connaissances acquises sur les différences biologiques liées au sexe pourraient également contribuer au développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux femmes et aux hommes, favorisant à terme une prise en charge plus personnalisée des maladies hépatiques chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure expérimentale visant à reproduire une maladie chronique du foie observée chez l'Homme. Cette procédure comprend une injection unique réalisée en début d'étude, réalisé en moins d’une minute, ainsi que la mise en place d'un régime alimentaire spécifique pendant 24 à 40 semaines, selon le sexe. Une partie des animaux recevra un traitement expérimental ou un traitement de référence administré par voie orale, une fois par jour, pendant une durée de 12 à 20 semaines selon le sexe. Les administrations seront réalisées sur des animaux vigiles et dureront moins d'une minute. Les animaux seront surveillés après chaque administration afin de détecter précocement toute complication liée au gavage ou à l'administration volontaire, selon la modalité retenue. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite mis à mort et les organes d'intérêt seront prélevés afin d'évaluer l'évolution de la maladie et les effets des traitements étudiés.
Impact sur les animaux
Les principaux effets attendus sont liés au développement progressif de la maladie hépatique induite expérimentalement. Cette maladie est généralement asymptomatique tout au long de son évolution. Une légère perte de poids transitoire peut être observée au début du régime alimentaire spécifique, avant une compensation progressive. Dans de rares cas, au cours de la progression de la maladie, certains animaux pourront présenter une altération modérée de leur état général, se traduisant notamment par une diminution de l'activité, un pelage moins soigné, une modification de la posture ou une diminution de la prise alimentaire. Les manipulations répétées nécessaires à l'administration quotidienne des traitements peuvent entraîner un stress léger et transitoire. Ils seront surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement toute complication éventuelle liée à la procédure. Les traitements évalués pourraient avoir un effet bénéfique en ralentissant la progression de la fibrose hépatique et en limitant le développement des lésions tumorales. Toutefois, ces effets constituent précisément l'objet de cette étude.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les organes et tissues nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Avant la mise en place de cette étude, des travaux ont été réalisés sur des modèles expérimentaux cellulaire. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les maladies chroniques du foie, notamment leur progression et le développement du cancer. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet et évaluer le potentiel de notre stratégie thérapeutique à l’échelle de l’organisme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique réalisée à partir de données préliminaires et de résultats déjà obtenus dans ce modèle expérimental. Cette approche permet d'utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement fiables et répondre aux objectifs du projet.
Raffinement
Afin de limiter au maximum les nuisances subies par les animaux, les procédures expérimentales ont été optimisées et les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi comprenant du matériel pour nidifier, pour ronger et des abris pour se cacher. Une période d'acclimatation et d’habituation à la méthode de traitement sera respectée avant le début des expérimentations. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques de l'étude, une administration volontaire sera privilégiée afin de limiter le stress lié aux manipulations. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière de leur état général et de leur poids. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin de mettre fin à la procédure si un animal présente des signes de souffrance ou d'altération importante de son état de santé. Les procédures terminales seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour étudier les maladies chroniques du foie. Les mécanismes responsables de l'accumulation de graisse dans le foie, de l'inflammation, de la fibrose et du développement du cancer du foie sont largement similaires entre les deux espèces. Les modèles murins ont ainsi permis de mieux comprendre ces maladies et de développer de nouveaux traitements, dont certains sont aujourd'hui utilisés chez les patients. Les animaux seront inclus dans l'étude à partir de l'âge de 8 semaines, correspondant à un jeune âge adulte chez la souris, afin de reproduire les premières étapes de développement de la maladie hépatique.
Exposition alimentaire chronique à un cocktail de pesticides : Nouveaux mécanismes d’initiation du cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si un cocktail de pesticides aux doses réglementaires, associé à un régime riche en graisses et en sucres, favorise le cancer du pancréas, 230 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes. Gardées jusqu'à sept mois d'âge au plus, elles peuvent développer un diabète modéré et une fibro-stéatose du foie, et subissent trois prises de sang, deux échographies sous anesthésie et deux tests de tolérance au glucose après jeûne. Le gavage, absent de la liste des procédures, n'apparaît que parmi les effets néfastes, sans fréquence ni durée. Une grille d'évaluation fixe le seuil de souffrance "trop importante" qui déclenche la mise à mort d'une souris, sans que ses critères soient donnés.
Objectifs
Le cancer du pancréas PDAC (adénocarcinome canalaire pancréatique) est un cancer très mortel ; il est devenu la troisième cause de décès par cancer. La France fait partie des pays pour lesquels l’augmentation de l’incidence et de la mortalité par cancer du pancréas est la plus élevée, avec une augmentation constante depuis les années 1970. Comprendre les stades initiaux de ce cancer est essentiel pour prévenir l'augmentation de son incidence et de sa mortalité et pour développer des stratégies de prévention pour ce cancer létal. Les facteurs génétiques de ce cancer sont bien identifiés : environ 80 % des patients présentent une mutation sur le gène KRAS, un véritable "accélérateur" biologique qui, lorsqu'il est altéré, pousse les cellules à se multiplier de façon incontrôlée. De plus en plus d’études (épidémiologiques et/ou expérimentales) suggèrent que les facteurs environnementaux contribuent également au développement du cancer du pancréas. Parmi ceux-ci, certaines études montrent qu’un régime riche en graisses peut contribuer à ce cancer et l’obésité est l'un des facteurs décrits pour ce cancer. Certains contaminants alimentaires comme les pesticides sont considérés comme des facteurs de risques potentiels dans l’induction de cette pathologie, mais il n’y a pas à ce jour de données expérimentales pour émettre une conclusion définitive. Notre objectif principal est le suivant : La population humaine Française en général n'étant pas exposée à de fortes doses d'un seul pesticide, nous souhaitons évaluer si l'exposition chronique à un cocktail de pesticides, individuellement présents à des doses réglementaires, trouvés dans l'alimentation de la population française combinée à un régime alimentaire occidental (riche en graisse, riche en sucres) pourrait favoriser l'initiation du cancer du pancréas via des dérégulations du métabolisme. Nous testerons ces changements de régime alimentaire dans un modèle murin génétiquement modifié qui est susceptible de développer un cancer du pancréas en présence de stress.
Bénéfices attendus
La population générale étant exposée quotidiennement à des doses de pesticides ne dépassant pas les LMR (Limites Maximales de Résidus), ce projet vise à évaluer l'impact réel de ces substances sur la santé. Nous étudierons si une exposition prolongée à un mélange représentatif des pesticides retrouvés dans l'alimentation française, ou à un régime alimentaire de type occidental (riche en graisses et en sucres), peut favoriser le déclenchement du cancer du pancréas. Dans ce cadre, nous analyserons également les perturbations hormonales et métaboliques causées par ces régimes, notamment sur la régulation de la glycémie ou sur les signaux chimiques libérés par le foie et le tissu graisseux. Retombées et bénéfices attendus : Ce projet permettra de déterminer pour la première fois si des doses faibles mais répétées de pesticides jouent un rôle clé dans l'apparition du cancer du pancréas. À moyen terme, ces découvertes fourniront des preuves scientifiques solides pour guider les politiques de santé publique, établir de meilleures recommandations nutritionnelles et environnementales, et ainsi mieux prévenir et réduire le risque de développer ce cancer très agressif.
Procédures
Les souris feront l'objet de trois prises de sang, réalisées à plus d'un mois d'intervalle. Pour suivre l'état du pancréas, deux échographies de 15 minutes seront effectuées sur chaque animal, à plus d'un mois d'intervalle. Cet examen d'imagerie non invasif réalisé sous une anesthésie utilise des ultrasons pour visualiser les organes en direct et en profondeur sans douleur. Pour évaluer la fonction pancréatique, deux examens de suivi appelés tests de tolérance au glucose seront réalisés. Cet examen consiste à administrer aux souris une eau très sucrée après une période de jeûne, puis à mesurer l'évolution du taux de sucre dans le sang grâce à de courtes prises de sang régulières, afin de vérifier la capacité du corps à réguler le taux de sucre dans le sang.
Impact sur les animaux
Les animaux nourris avec le régime occidental hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète d’intensité modérée et d’une fibro-stéatose (infiltration de graisse et rigidifié par du tissu cicatriciel) d'intensité légère du foie. Ces altérations s'installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d'intensité modérée, sans altération brutale de l'état général des animaux. Les altérations génétiques n’entraînent pas au stade précancéreux de modifications du fonctionnement normal ni du pancréas ni des souris ; on dit que ces modifications sont asymptomatiques. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une douleur aigüe de faible intensité et de très courte durée (quelques secondes), sans effet persistant. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress de courte durée et d'intensité modérée lié à la contention préalable à l’anesthésie. Le gavage peut également entraîner un stress des animaux lié à la contention, d'intensité modérée et de courte durée (quelques minutes). Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ces gestes n'entraînent pas de douleur significative ni de complication.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet décrit l’utilisation de souris génétiquement modifiées dans le contexte d’une exposition alimentaire à un cocktail de pesticides. Ces souris seront utilisées pour le prélèvement d’organes. A ce jour, elles ne peuvent être substituées par un autre modèle : - Il n’existe pas d’organoïdes (assemblage de cellules cultivées en 3D qui reproduit en miniature la structure et le fonctionnement du pancréas) établis de lésions pancréatiques précancéreuses ; Les organoïdes ou des lignées de cellules de ne permettent pas d’étudier l’effet sur tous les types cellulaires du microenvironnement. - Nous étudions une exposition par la nutrition, les étapes de digestion et l’effet sur le dialogue entre les organes métaboliques sont nécessaires à la compréhension de notre problématique.
Réduction
Pratiques mises en œuvres pour réduire le nombre d’échantillons : Cette étude est basée sur une étude pilote réutilisant les échantillons de pancréas d’une expérience étudiant le foie. Elle nous a permis de valider le cocktail de pesticides utilisés, les doses, et d’exclure un bras de l’étude pour lequel les pesticides n’ont pas eu d’effet additifs avec le régime alimentaire occidental. Ceci nous évite des expériences de test de doses et a permis de réduire le nombre d’individus.
Raffinement
Les souris seront hébergées en petits groupes stables dans des cages thermo-régulées et ventilées, dans un environnement sanitaire très strict garanti sans microbes pathogènes. La température, l'humidité et le rythme jour/nuit (12 heures de chaque) sont réglés automatiquement. La nourriture et la litière sont systématiquement stérilisées. Pour leur bien-être et leur confort, les cages sont équipées de matériel d'enrichissement (maisonnettes dômes, de quoi fabriquer un nid). Une surveillance quotidienne est assurée par un personnel qualifié pour détecter tout signe d'inconfort ou de douleur. En cas de souffrance trop importante (définie par une grille d'évaluation), l'animal est immédiatement euthanasié sans douleur par du personnel agréé pour éviter tout mal-être prolongé. Enfin, le suivi de l'état du pancréas est réalisé en direct par imagerie médicale non invasive sous anesthésie gazeuse (isoflurane), permettant à la fois de suivre précisément l'évolution chez chaque individu et de limiter au maximum le stress et l'inconfort de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle de la souris (Mus musculus) est le seul qui permette de reproduire fidèlement l'ensemble des étapes de formation du cancer, la diversité des cellules impliquées ainsi que la complexité des mécanismes biologiques clés. Les souris seront étudiées uniquement à l'âge adulte (à partir de 8 semaines), une fois le développement de leur pancréas totalement achevé, et jusqu'à l'âge de 7 mois maximum pour l'analyse de leurs organes.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Nourries par voie orale du microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, et pour une partie injectées dans la patte d'un produit inflammatoire, 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cerveau et leur intestin. Chaque semaine, elles passent des tests de sensibilité au toucher par filaments de nylon et à la température, et des tests d'anxiété et de dépression que le résumé ne nomme pas, alors que l'hypersensibilité de la patte peut durer 20 à 25 jours. Le but est d'identifier des composés du microbiote contre la douleur chronique, avant d'éventuels essais chez les patients. Le porteur exclut tout antalgique, "aucun traitement antalgique ou analgésique systématique ne peut être appliqué", et affirme dans le même résumé vouloir "assurer le bien-être des animaux".
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions inflammatoires, chez des souris avec une inflammation à la patte pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois le rôle du microbiote prouvé, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio-dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de la douleur et de la dépression pour permettre de mieux les soigner. Une fois le rôle de la flore intestinale prouvé, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites qui pourraient expliquer la douleur et la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Ces expériences sont menées chez des souris saines et dans un modèle d’inflammation locale de la patte, induite par l’injection de molécules inflammatoires dans la patte des souris, qui sera réalisée sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées, nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucun traitement antalgique ou analgésique systématique ne peut être appliqué car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés au modèle inflammatoire utilisé pour induire l’inflammation locale de la patte. L’injection d’un produit inflammatoire dans la patte provoque un gonflement et une rougeur de courte durée, visible surtout les premiers jours. La sensibilité de la patte au toucher peut durer plus longtemps (20 à 25 jours), ce qui permet d’étudier la douleur inflammatoire résiduelle. Les animaux sont surveillés et des mesures sont prises pour limiter leur inconfort. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post-mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio-dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de la douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans les tests comportementaux. Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations antérieures, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécessaire pour observer une différence statistique et biologiquement pertinente. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien-être des animaux. Cela passe par une étape d’habituation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro-immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Etude des mécanismes cellulaires des complexes de récepteur dans les pathologies liées au stress et développement de molécules à potentiel thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 978 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Jusqu'à 1 728 d'entre elles subissent dix jours de "défaite sociale" face à des mâles plus âgés, jusqu'à 2 628 une chirurgie du cerveau d'une heure trente à deux heures pour implanter une fibre optique ou injecter des vecteurs viraux, puis des tests d'hédonie, d'anxiété, de comportement social et de prise de risque que le résumé ne nomme pas. Le bénéfice annoncé, de nouveaux antidépresseurs, reste au conditionnel. Le porteur décrit ces séances comme des "interactions sociales courtes" au "stress léger et passager", et choisit les mâles dominants, d'anciens reproducteurs, pour leur "agressivité territoriale suffisante".
Objectifs
Notre cerveau réagit en permanence à de nombreux signaux de l’environnement. Parmi eux, le stress joue un rôle important: il peut être utile lorsqu’il est bien géré, mais, s’il devient chronique, il peut favoriser des troubles mentaux comme la dépression. Pour comprendre comment le stress peut conduire à la dépression, notre équipe étudie deux régions du cerveau: toutes deux impliquées dans la réaction au stress et le système de récompense. Le stress perturbe l’équilibre entre deux messagers chimiques, la dopamine et le glutamate, ainsi que leurs récepteurs. Nous avons découvert qu’un stress prolongé augmente la formation de complexes (appelés hétéromères) entre ces récepteurs dans une région cérébrale, probablement à cause de changements dans l’activité dans une autre région. Ces mêmes changements ont été observés dans des tissus cérébraux de patients dépressifs. Grâce à des outils pharmacologiques, nous avons pu empêcher la formation de ces complexes et avons constaté que cela corrigeait certains effets négatifs du stress sur le comportement et les cellules. Notre objectif est maintenant de mieux comprendre comment ces complexes se forment, comment ils affectent les cellules, et de développer de nouveaux traitements ciblant ces mécanismes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines zones du cerveau réagissent au stress à l’âge adulte et comment des modifications dans la communication entre les cellules nerveuses peuvent influencer les émotions et le comportement. Il pourrait aussi ouvrir la voie à une nouvelle génération d’antidépresseurs agissant sur des récepteurs précis du cerveau. Ces nouveaux traitements offriraient une alternative aux antidépresseurs actuels, parfois peu efficaces ou responsables d’effets secondaires gênants.
Procédures
Les animaux (1728 max) seront soumis à des épisodes de stress social pour une durée maximale de 5 minutes par jour sur une période de 10 jours. Au maximum 2628 animaux subiront 1 injection de 5s pour anesthésie puis une chirurgie cérébrale avec implantation de fibre et/ou d’outils génétiques pour l’apport de molécule d’intérêt d’environ 1h30-2h. Les animaux (1728 max) subiront différents tests comportementaux permettant d’évaluer l’hédonie (recherche du plaisir), l’anxiété, les comportements sociaux, la prise de risque.
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à des interactions sociales courtes, d’environ cinq minutes par jour pendant dix jours, pouvant provoquer un stress léger et passager. Dans certaines étapes, ils recevront une ou deux injections d’anesthésiques et d’antalgiques pour éviter toute douleur. Une partie d’entre eux subira une chirurgie pour injecter des vecteurs viraux ou implanter des fibres optiques. Après l’opération, une brève période de récupération est prévue, mais les animaux devraient retrouver un comportement normal rapidement. Une légère perte de poids (moins de 10%) peut survenir au cours des tests. Toutes les procédures sont conçues pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’anxiété, et les effets secondaires attendus devraient rester temporaires et sans conséquences sur le long terme.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les souris C57BL/6JRj seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réaliser des études post-mortem. Les CD1 sont mis à mort afin de prévenir toute souffrance inutile liée à la dégradation physiologique de l'animal liée à l'âge.
Remplacement
Le projet repose sur des approches de physiologie intégrée visant à comprendre les mécanismes de communication inter-organes et les dérégulations affectant le système de récompense, un système hautement conservé au cours de l’évolution. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode substitutive in vitro ou in silico permettant de reproduire la complexité des interactions neuronales et comportementales impliquées dans ce système. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. La souris constitue le modèle le plus approprié, car elle présente une forte similarité avec l’humain en ce qui concerne les circuits neuronaux impliqués dans la motivation et la récompense. De plus, des tests comportementaux validés chez la souris permettent d’évaluer des altérations comparables à certains symptômes psychiatriques observés chez l’homme, renforçant ainsi la pertinence translationnelle du modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide du logiciel G*Power, permettant d’estimer de manière fiable les effectifs nécessaires pour garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis. Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre en utilisant des stratégies de Go-NoGo. Les stratégies de Go/No-Go consistent à définir, après chaque étape expérimentale, des critères prédéfinis de poursuite (“Go”) ou d’arrêt/modification (“No-Go”) du protocole en fonction des résultats obtenus. Chaque individu sera impliqué dans plusieurs procédures expérimentales compatibles entre elles, dès lors que cela n’induit pas d’interférence physiologique ou comportementale, afin de maximiser les données obtenues tout en minimisant le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (sauf cas de la procédure de défaite sociale) avec un enrichissement du milieu comprenant des dômes, des briques en bois à ronger et du matériel de nidification. Les animaux sont observés quotidiennement. Des signes potentiels de souffrance sont recherchés et des points limites adaptés aux différentes phases des procédures ont été fixés. Quatre phases vont être à distinguer : • Phase 1 : le suivi hebdomadaire avec recherche de signes de souffrance • Phase 2 : le suivi de trois jours selon une grille de score comprenant des points limites et les actions associées si certains signes de souffrance sont relevés pendant la phase 1 de suivi quotidien • Phase 3 : le suivi pendant les périodes de défaites sociales imposées pendant 10 jours consécutifs • Phase 4 : les périodes pré et post-opératoire de chirurgie stéréotaxique (chirurgie crânienne très ciblée via l’utilisation de coordonnées), elles-mêmes obligatoirement suivies de cinq jours de surveillance selon la même grille de score. La douleur générée par la chirurgie sera limitée grâce à des anesthésiques et anti-inflammatoires. L’administration d’un anti-inflammatoire non stéroïdien après la chirurgie permettra de prévenir/limiter la douleur de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L'élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. La souris possède une proximité évolutive, un cycle de vie court. C’est un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Les mâles dominants sont des anciens reproducteurs âgés de plus de six mois, cet âge leur permet d’avoir développé une agressivité territoriale suffisante pour la procédure de défaite sociale. Les souris utilisées seront âgées de 1 à 4 mois. Bien que l’adulte (2 mois) soit la tranche d’âge étudiée, certains outils moléculaires ont besoin d’un temps d’expression relativement long (3 à 6 semaines), c’est pourquoi certaines souris seront utilisées dès l’âge d’1 mois.