Rongeurs

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).

9 000 rongeurs, soit 7 200 rats et 1 800 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets indésirables de molécules sur la respiration, le système nerveux et le cœur. Outre les administrations de la molécule et les prises de sang, ils sont isolés jusqu'à 12 heures dans un pléthysmographe, contenus éveillés pour des tests neurologiques non détaillés, et une partie des rats reçoit par chirurgie un émetteur de télémétrie. L'établissement, spécialisé dans les études réglementaires, produit pour chaque composé un rapport d'effets adverses, étape d'un dossier qui débouchera "potentiellement sur la commercialisation d'un nouveau médicament". Les rongeurs sont tués en fin de procédure, et une partie, en général des rats porteurs d'un émetteur, peut être réutilisée dans des procédures sans réveil, comme un prélèvement d'organes, 3 000 étant déclarés réutilisés. Le porteur affirme que "Seule l'expérimentation animale permet de définir leur innocuité".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.

Bénéfices attendus

Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. . 3) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.

Devenir

Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à 3 par cage au minimum, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement . En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par la ligne directrice ICH S7A. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 6-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.

Les souris utilisées portent une altération ciblée des cellules souches du poil, censée désorganiser le follicule, rompre la barrière de la peau et déclencher une inflammation cutanée. 1 113 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont épilées sous anesthésie, reçoivent pendant trois jours l'application cutanée d'un inducteur de recombinaison génétique, puis des injections dans l'abdomen, des prises de sang et un régime hypercalorique pendant cinq semaines que le porteur présente comme sans complications métaboliques notables. Toutes sont tuées pour suivre l'évolution de la réponse immunitaire sur l'ensemble de l'expérience, dont l'objet est de reproduire les premières étapes de l'hidradénite suppurée.

Objectifs

L’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire chronique de la peau, qui touche environ 1 % de la population. Elle se manifeste par des nodules douloureux, des abcès profonds, des fistules et des cicatrices, principalement localisés dans les zones de pli (aisselles, aine, régions anogénitales). La maladie évolue souvent vers une inflammation chronique, accompagnée de lésions malodorantes, de cicatrices rétractiles et de fibrose de la peau. Le diagnostic est souvent tardif, avec un délai moyen de plus de 7 ans entre les premiers symptômes et la prise en charge. L’hidradénite suppurée a un impact majeur sur la qualité de vie des patients, comparable à celui d’autres maladies chroniques sévères. Elle est associée à un risque accru de dépression, d’anxiété, de douleurs chroniques, de surpoids et de difficultés professionnelles. De façon préoccupante, les taux de suicide sont significativement plus élevés chez les personnes atteintes d'hidradénite suppurée que dans d’autres maladies de peau comme le psoriasis. L’hidradénite suppurée reste à ce jour une maladie difficile à traiter, et constitue un besoin médical non satisfait en l’absence d’options thérapeutiques réellement efficaces. Le développement de traitements ciblés est freiné par deux obstacles majeurs : d’une part, la méconnaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués, accentuée par l’hétérogénéité des formes cliniques de la maladie ; d’autre part, l’absence de modèle animal fiable permettant de reproduire les caractéristiques clés de la maladie humaine et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le développement de ce nouveau modèle murin a pour objectif principal de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’hidradénite suppurée, notamment le lien entre dysfonction des cellules souches folliculaires, altération de la barrière épithéliale et inflammation cutanée. À court terme, ce modèle permettra de valider des hypothèses mécanistiques et d’identifier de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’initiation et la chronicisation de la maladie. À moyen terme, il servira à tester des candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires, anticorps monoclonaux) dans un système physiologiquement pertinent. À plus long terme, l’ambition est de contribuer au développement de traitements ciblés pour les patients atteints d’hidradénite suppurée, une maladie encore sans solution curative.

Procédures

Les souris seront épilées sous anesthésie (durée de l’intervention : environ 5 minutes) afin d’assurer une application homogène des traitements topiques. L’application cutanée d’un inducteur de recombinaison génétique ou de son solvant (type solvant organique hydrophobe) sera réalisée pendant 3 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalles réguliers au cours de l’expérimentation. Chaque prélèvement durera moins de 20 secondes, afin de minimiser le stress animal. L’administration des substances expérimentales sera effectuée par voie intrapéritonéale, avec des injections réalisées en moins de 20 secondes, de manière à limiter l’inconfort des animaux. La bactérie utilisée dans ce protocole ne provoque pas d’infections cutanées chez la souris, garantissant une exposition sans risque infectieux significatif. Enfin, l’introduction d’un régime alimentaire hypercalorique sur une période de 5 semaines ne génère pas de complications métaboliques notables dans notre modèle, assurant le maintien du bien-être animal tout au long de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

L’administration d’un inducteur de recombinaison génétique pourrait entraîner des effets secondaires transitoires tels qu’une légère perte de poids, une réduction de l’activité locomotrice ou des modifications du métabolisme hépatique. Notre modèle cible spécifiquement les cellules souches du follicule pileux, considérées comme l’un des éléments déclencheurs de la maladie. Leur altération pourrait entraîner une désorganisation de la structure folliculaire, une rupture de la barrière épithéliale et une inflammation cutanée localisée

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Plusieurs modèles in vitro ont été évalués, comme les cultures cellulaires ou les systèmes de type organoïdes. Toutefois, l’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire complexe, impliquant des interactions entre les cellules de la peau, le microbiote cutané et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire fidèlement cette complexité. Les systèmes actuels permettent d'étudier certains mécanismes isolés, mais ils ne permettent ni d’observer l’infiltration de cellules immunitaires, ni de modéliser les interactions dynamiques entre les différents compartiments cellulaires de la peau. C’est pourquoi nous avons recours à un modèle animal spécifique, permettant de mieux comprendre les premières étapes de la maladie. Ce modèle permettra également de tester des stratégies thérapeutiques dans un environnement physiologique pertinent. En parallèle, nous poursuivons le développement de modèles alternatifs non animaux, dans l’objectif de réduire au maximum le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité scientifique de nos résultats. Des calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. Nous utilisons aussi des approches multimodales sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Des modèles in vitro, en amont, nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel formé afin de détecter précocement tout signe de souffrance : lésions cutanées, altération du pelage, changements de comportement ou de posture, perte de poids, ou automutilation. Ils sont hébergés en cages collectives enrichies, avec litière douce, matériaux de nidification (neslets), abris (dômes ou tubes en carton) et accès à l’alimentation et à l’eau ad libitum. L’environnement est contrôlé (température, humidité, cycle lumière/obscurité) pour garantir des conditions de vie optimales tout au long de l’expérimentation. Nous collaborons avec les vétérinaires référents afin d'assurer un raffinement constant des procédures, notamment par l’adaptation des soins ou l’euthanasie anticipée dès l’apparition de signes cliniques dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi pour l’étude des maladies humaines. Ce modèle présente plusieurs avantages : 1. De nombreuses souches sont disponibles et bien caractérisées sur le plan génétique, ce qui permet de cibler précisément certaines populations cellulaires impliquées dans la maladie étudiée. 2. La petite taille de l’animal, sa facilité d’élevage, et la courte durée de sa gestation permettent de conduire des études dans des délais raisonnables. 3. Il existe aujourd’hui des outils permettant d’activer ou de désactiver certains gènes de façon localisée ou temporaire, ce qui est essentiel pour étudier les mécanismes biologiques complexes de la maladie.

1 543 souris génétiquement modifiées pour exprimer une protéine humaine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à six injections hebdomadaires d'un candidat vaccin, des prises de sang hebdomadaires et, pour une partie, une greffe de cellules tumorales. Pour ces dernières, le porteur décrit une nécrose, une ulcération, des saignements de la tumeur, une difficulté à se déplacer et, en cas d'échappement métastatique, une cachexie et un isolement social. Il conclut que le modèle murin reste un "élément incontournable" du projet, seul à permettre d'étudier l'infiltration immunitaire dans les tumeurs.

Objectifs

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche fondamentale visant à développer et à mettre en place un protocole optimal de vaccination contre le cancer de la prostate. Le modèle murin de cancer permet de simuler le contexte de la réponse immunitaire, tout en offrant une certaine assurance que les effets observés pourraient, au moins partiellement, être transposables à l'humain. La stratégie vaccinale sera optimisée en explorant plusieurs aspects : 1) L’utilisation potentielle d’adjuvants pour renforcer la réponse immunitaire ; 2) La combinaison avec d’autres traitements immunothérapeutiques ; 3) L’optimisation de la fréquence et du calendrier des injections. Par ailleurs, l’efficacité de la vaccination sera évaluée dans deux contextes : a) Prophylactique : pour prévenir l’apparition du cancer ; b) Thérapeutique : pour traiter une maladie déjà installée.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche a pour objectif d’améliorer les stratégies thérapeutiques actuelles contre le cancer de la prostate. À l’aide d’un candidat vaccin, nous visons à induire une réponse immunitaire capable d’accroître l’infiltration des cellules effectrices dans les tumeurs, de surmonter les mécanismes de résistance aux immunothérapies actuelles et de transformer des tumeurs initialement réfractaires en tumeurs sensibles à ces traitements. Ce projet pourrait révolutionner les traitements des cancers solides en apportant de nouvelles perspectives pour dépasser les limitations des approches thérapeutiques actuelles, tout en ouvrant la voie à des traitements personnalisés plus efficaces.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux sous anesthésie consisteront en des injections hebdomadaires pendant une durée maximale de six semaines, ainsi qu’en des prélèvements sanguins périodiques (hebdomadaires entre la sixième et la huitième semaine) après la vaccination. Chaque intervention durera entre 1 et 2 minutes sur des animaux anesthésiés. Les animaux anesthésiés pourront également recevoir une injection unique de cellules tumorales pour la greffe. Par ailleurs, des injections de cellules immunitaires pourront également être réalisées sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront un maximum de six injections de vaccin, à un intervalle d'une semaine (provoquant une nuisance légère au moment de l'injection), ainsi que des prélèvements sanguins réguliers, également à un intervalle hebdomadaire (nuisance légère au moment du prélèvement). La réponse immunitaire générée est sans conséquence pour l’animal tout au long de la cinétique expérimentale. En revanche, pour les animaux impliqués dans la greffe tumorale, des nuisances et effets indésirables sont attendus, principalement liés à la croissance tumorale. Tous les traitements administrés aux animaux ont été publiés dans la littérature comme étant bien tolérés dans les lignées de souris utilisées. Ainsi, hormis quelques nuisances sporadiques parfois observées chez les animaux sains, l’apparition des effets indésirables possibles se produit dès le début des expériences et peut donc être surveillée rapidement. Le mal-être des animaux en cas d’échappement métastatique constitue le principal risque d’effets graves, avec la formation de métastases dans les organes internes, pouvant entraîner des altérations physiologiques telles que la perte d’appétit (sans autres signes cliniques évidents), la cachexie, ainsi que des modifications comportementales comme l’agressivité et l’isolement social. Les nuisances liées à la croissance tumorale comprennent : nécrose, ulcération, saignements tumoraux, difficulté à la locomotion, perte de tonicité générale aux stades avancés de la maladie, ainsi qu'une perte de poids.

Devenir

Tous les les animaux seront mis à mort en raison des nombreux prélèvements d’organes effectués pour déterminer la réponse immunitaire.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les candidats à vaccin seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape que permettre de cribler laquelle sera utiliser sur étape suivante. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti- tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti- cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces protocoles permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées conformément aux calculs de puissances statistiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissements (bandelette de coton, neslets, tubes de carton) afin de réduire au maximum la souffrance animale qu’elle soit physique ou psychique. De plus, pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Diet Gel et/ou des réhydratations en sous- cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques et spécifiques de ce modèle tumoral. Cette grille nous permet comprend l'évaluation de signes cliniques et prend en compte des points limites pour bien agir ou anticiper la souffrance. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du septième jour (quand la tumeur sera mesurable) après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, car notre projet nécessite l’étude des réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés pour exprimer un gène humain dans un type cellulaire spécifique. En effet, certains de nos vaccins sont constitués d’anticorps associés à de petits fragments de protéines cibles. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines exprimées à la surface de cellules clés impliquées dans l’activation du système immunitaire. Pour tester ces vaccins, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés exprimant ces protéines humaines, ce qui est réalisable chez la souris. Par ailleurs, les modèles murins de vaccination ainsi que les modèles tumoraux murins sont déjà bien établis et largement décrits dans la littérature. Toutes les expériences sont faites sur des souris adultes de 7 à 15 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux. Cet âge constitue un compromis adéquat entre une maturité suffisante du système immunitaire et une mise en expérimentation à partir de 7-8 semaines de vie.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections espacées de deux semaines et subissent trois prises de sang, avec un risque d'accumulation de liquide dans l'abdomen qui peut gêner l'alimentation et les déplacements. Leur rate est prélevée après la mise à mort pour fabriquer des anticorps monoclonaux. Ces anticorps alimentent des kits de détection des maladies des plantes destinés aux agriculteurs et aux viticulteurs.

Objectifs

Nous avons recours à l’immunisation de souris pour fabriquer des anticorps spécifiques monoclonaux capables de reconnaitre des pathogènes végétaux afin d’établir de nouveaux outils de phytodiagnostic pour détecter rapidement et efficacement les maladies des plantes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des kits de phytodiagnostic permettant de détecter de manière rapide et précoce les maladies des plantes, qui peuvent entraîner des retards de croissance, des pertes de récoltes significatives et des conséquences économiques importantes pour les agriculteurs, viticulteurs, etc. Les kits de phytodiagnostics permettent de réduire la propagation des maladies grâce à une détection rapide avant que la maladie ne se propage et évitent donc la perte de grandes superficies de culture. Ils permettent également de cibler les traitements grâce à un diagnostic précis, à l’aide des anticorps monoclonaux, et de réduire l’usage inutile de produits phytosanitaires. Les bénéfices de ce projet sont donc d’ordres environnemental et économique (moins de pertes de récoltes et de traitements non appropriés). Du coté scientifique, ce projet permet d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront être par la suite produit in vitro grâce à l’obtention d’hybridomes, ce qui permet de limiter l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.

Procédures

4 injections espacées de 2 semaines. 3 prélèvements sanguins espacés de 3 à 4 semaines.

Impact sur les animaux

Il existe un risque de production d’ascite (accumulation anormale de liquide dans l’abdomen) suite aux injections pouvant entrainer des difficultés pour l’animal à se nourrir ainsi qu’une gêne pour se déplacer. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations et une douleur modérée suite aux injections tel que des rougeurs au point d’injection et des courbatures.

Devenir

A l’issue de chaque programme les animaux serons mis à mort afin de récupérer la rate pour réaliser la production d’anticorps monoclonaux.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode ou technique in vitro permettant de produire de nouveaux anticorps monoclonaux murins. L’induction d’une réponse immunitaire chez l’animal est nécessaire afin de pouvoir fusionner la rate contenant les cellules productrices d’anticorps avec des cellules cancéreuses pour obtenir des hybridomes permettant par la suite, la production d’anticorps monoclonaux in vitro. Une fois la production réalisée, il ne sera donc plus nécessaire de renouveler le protocole d’immunisation et donc d’utiliser les animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum afin d’obtenir dès le 1er projet une quantité suffisante d’anticorps monoclonaux pour ne pas avoir besoin de réitérer les productions.

Raffinement

Pour réduire au maximum les sources de souffrance, les animaux seront anesthésiés avant les prélèvements. Les souris seront hébergées en communauté, avec enrichissement du milieu, et dans des conditions appropriées afin de préserver leur bonne santé et leur bien-être. Les aiguilles utilisées pour les immunisations seront adaptées au point d’injection et les plus fines possibles afin de limiter la douleur. Une période d’acclamation de 7 jours sera respectée avant les manipulations. Les souris seront manipulées précautionneusement et déplacée à l’aide des enrichissements et dans la paume de la main autant que possible afin de s’habituer au manipulateur. Les gestes techniques seront réalisés par du personnel formé. Les souris seront surveillées quotidiennement après les injections afin de réagir rapidement en cas de production d’ascite. Si une gêne dans la mobilité est détectée, l’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités.

Choix des espèces

L’utilisation de souris permet d’obtenir à la fois des cellules qui fabriquent des anticorps et des cellules qui peuvent se multiplier facilement, compatibles entre elles pour l’étape suivante, la fusion. Les souris utilisées ont un organisme qui contient peu d’anticorps naturels, elles permettent ainsi une bonne réponse de leurs système immunitaire donc une production d’anticorps hautement spécifique à l’antigène. Les souris seront âgées de minimum 6 semaines car c’est à ce stade qu’elles permettent une bonne réponse immunitaire à une stimulation antigénique.

Les rats utilisés portent une mutation qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui leur vaut une perte de poils, des poils qui s'accumulent sous les paupières et une sensibilité accrue aux infections. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur rétine est lésée au laser ou par injection d'un composé chimique, puis un fragment de rétine cultivé à partir de cellules souches humaines est greffé sous la rétine au cours d'une opération de quinze à vingt minutes, suivie d'imageries hebdomadaires et d'électrorétinogrammes sous anesthésie générale. Tous sont tués à la fin pour analyser la rétine et le devenir des cellules greffées, et tout signe d'infection de l'œil entraîne une mise à mort anticipée.

Objectifs

Les maladies choroïdiennes héréditaires et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), sont des pathologies qui entraînent une perte de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité. Elles affectent des millions de personnes dans le monde, et dans la plupart des cas aucun traitement disponible. Ce projet a pour objectif de démontrer que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations seront réalisées dans un modèle de rats porteur d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Afin de mimer les pathologies humaines, la rétine des animaux sera lésée avec le laser ou avec l’injection d’un composé chimique. Le potentiel thérapeutique des greffons sera évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière).

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les dystrophies rétiniennes (prévalence de 1 sur 3000) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (8 pourcent de la population française) ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Pour cette étude une lignée de rats immunodéprimés sera transplantée avec des cellules humaines. Afin de mimer la pathologie humaine, deux techniques seront testées : lésion de la rétine avec le laser (moins d'une minute) ou injections d’un composé chimique (injections d’une durée de quelques secondes) : 1 injection pour les animaux concernés. Chirurgie: Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. La procédure chirurgicale consiste en une transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet de 3 types d’examen : 1/Un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique); cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes. Cet examen sera réalisé une fois par semaine pendant 2 mois pour mettre en place le modèle par injection de composé chimique (maximum 8 fois) ou 1 fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux greffés et gardés le plus longtemps). 2/ Un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu. Cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale. L’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). 3/ Un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois). Analgésies et antidote anesthésie (injections d’une durée de quelques secondes): maximum 11 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 3 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’œil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statuts immunodéficient. Un léger stress et une brève douleur localisée au moment de l’introduction de l’aiguille peuvent être induits par les injections des différents médicaments en intrapéritonéale ou sous cutané. L’anesthésie peut entrainer un risque cardio-respiratoire et d’hypothermie. La photocoagulation au laser et les greffes sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Une douleur et/ou un risque infectieux peuvent survenir pendant ou après les greffes. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologies) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration aux tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non pas des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptes aux petits effectifs. Au final, 180 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés avec enrichissement de nourriture et boisson à volonté. Les animaux utilisés dans ce projet ont une perte de poils dans la 3-4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'œil sous les paupières nécessiter un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Pour les expérimentations qui le nécessitent, les rats bénéficieront d’une anesthésie générale. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré-opératoire et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil entrainera l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats immunodéficients : Ces rats possèdent une modification génétique qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Les différentes analyses seront réalisées chez le rat adulte sur une durée maximum de 3 mois après greffe, le stade le plus tardif prévu per l’étude. Le choix de l'âge adulte est lié au fait que les greffes sont plus aisées à réaliser dans l'oeil adulte (plus grand) de même que les traitements lasers. De plus , la DMLA est une maladie qui touche les adultes.