Rongeurs
Etude de l’effet anti-hyperalgésique d’une molécule dans un modèle de neuropathie chimio-induites par injections répétées de Paclitaxel chez le rat suivi en Pression de patte
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectés de paclitaxel de façon répétée jusqu'à développer une neuropathie, 1 950 rats sont ensuite soumis à un test de pression de patte, jusqu'à six mesures par jour, trois jours par semaine sur trois semaines. Ils reçoivent en parallèle les composés à évaluer, parfois plusieurs fois dans la journée, et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang en théorie. 1 625 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance sévère, avec une allodynie tactile, une constipation, une alopécie et une déshydratation possibles, et tous sont tués à la fin, le porteur écrivant qu'un anticancéreux administré de façon systémique rend impossible d'évaluer l'impact réel sur l'animal. Le test s'arrête à une valeur de cut-off, la pression maximale que le laboratoire s'autorise à exercer sur la patte.
Objectifs
Les patients atteints de tumeur solide (sein, ovaire, poumon...) sont souvent traités avec une chimiothérapie à base de paclitaxel. Le paclitaxel (Taxol) est un agent anti-néoplasique issus de l'écorce d'un arbre (Taxus brevifolia), qui entraine le développement d’une neuropathie périphérique chez 50-90% des patients dès une injection de paclitaxel à forte dose ou après plusieurs injections à plus faibles doses. La laboratoire a mis au point un modèle de neuropathie chimioinduite par injections répétées de paclitaxel. L’allodynie mécanique induite par ce modèle a été mesurée en Pression de patte et la réversion par des antalgiques de référence a été réalisée. Ce modèle doit permettre l’évaluation des propriétés analgésiques de candidats médicaments. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel. Actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ces molécules ne sont pas efficaces à long terme et présentent de nombreux effets secondaires. Le but de ce projet est donc de permettre une meilleure prise en charge des neuropathies due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : injection afin d’induire le modèle. Tests : stimulation mécanique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours, pour un maximum de 3 tests par semaine sur 3 semaines différentes. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les limites de volume et de fréquence imposées par les recommandations en vigueur (maximum théorique :25 prélèvements).
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine le développement d’une allodynie tactile (nuisance modérée) mais peut également entrainer une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie, de la piloérection et de la déshydratation (nuisances modérées à sévères). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Pour la pression de patte,les tests sont pratiqués avec les animaux en contention pour des durées d’environ une minute par rat par point de cinétique (nuisance légère). Le test peut être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. (nuisance légère). De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisances légères).
Devenir
Les animaux sont induits de manière systémique par administration d’un agent anticancéreux. Il peut donc avoir un impact sur l’ensemble des mécanismes biologiques de l’animal. Il est donc impossible de déterminer l’impact réel. Pour cette raison, il n’est pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP(International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et les données de la mise au point du modèle. un test statistique sera réalisé en fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale),suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation afin de limiter leur stress. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie) est réalisé tous les jours jusque J10 après la première induction puis une fois par semaine. Des croquettes sont déposés dans le fond de la cage pour stimuler la prise alimentaire des animaux. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injectionde NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumés en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g pour les males et 150-200g pour les femelles, le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction.
Prélèvement de tissu pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour la caractérisation du rôle des phospholipases A2 sécrétées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Deux millimètres de queue coupés en dix secondes sur des souriceaux vigiles, sans anesthésie : 300 souris subissent ce prélèvement dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Celles dont le génotype ne correspond pas à celui recherché sont tuées, les autres partant vers un projet autorisé ou vers le maintien de la lignée, quand elles ne sont pas tuées elles aussi. Le porteur écrit que les méthodes non invasives testées n'ont pas donné de résultats exploitables et qualifie ce projet de "nécessaire". Aucune connaissance n'est produite ici, le prélèvement sert à trier un élevage et à fournir aux laboratoires des lots d'animaux homogènes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale. Dans le cadre de certains projets scientifiques, des lignées d’animaux sont développées et élevées. Pour maintenir ces lignées et fournir des animaux adaptés à ces projets, il est donc important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer des lots expérimentaux homogènes et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasives. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée par notre équipe pour caractériser les souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une sélection des animaux d’intérêt et ainsi une optimisation de la gestion et de l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour les projets scientifiques autorisés.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la douleur lors du prélèvement du tissu.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas donné de résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation dans les projets scientifiques autorisés.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans des projets scientifiques autorisés ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - Seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement entre individus de même génotype).
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui permet de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de poser de nombreuses questions scientifiques en biologie fondamentale, environnementale, santé humaine et animale avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces, dont l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 10 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité distale de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Etude des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les complications des traitements de la plaque d’athérome symptomatique : la réendothélialisation et la néoathérosclérose.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une chirurgie de l'artère carotide de trente minutes, cinq injections pour provoquer un diabète, dix jours de gavages ou d'injections d'inhibiteurs et jusqu'à huit semaines de régime gras : 4 120 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche des cibles pour éviter qu'une nouvelle plaque d'athérome ne se forme après la pose d'un stent, en particulier chez les patients diabétiques. Le porteur ramène les atteintes à une douleur légère et de courte durée pour chaque piqûre, à une irritation pour le gavage et à une perte de poids légère après la chirurgie, alors que ce sont ces gestes cumulés qui fondent la gravité modérée déclarée pour les 4 120 animaux. Toutes sont tuées pour examiner la paroi de leurs artères et les dépôts de graisse qui s'y sont formés.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires restent la première cause de mortalité mondiale dont l’athérosclérose est la principales cause sous-jacente. L’athérosclérose est une maladie qui bouche artères. Elle débute dans l’enfance puis se développe de façon croissante, en fonction de l’âge, du mode de vie, ou de l’acquisition d’autres facteurs de risques comme le diabète, une augmentation du cholestérol circulant ou l’hypertension. La dysfonction endothéliale est la première étape de la pathologie et va favoriser l'infiltration de cholestérol et de cellules immunitaires dans la paroi vasculaire, formant ainsi un amas cellulaire et de graisse qui compose la plaque d'athérome. Cette plaque peut se rompre et entrainer des événements cardiovasculaires graves comme l’infarctus du myocarde. Le traitement de choix pour traiter une plaque d’athérome symptomatique est une approche de chirurgie interventionnelle qui consiste à poser un maillage métallique appelé "stent" pour re-ouvrir le vaisseau et favoriser la circulation sanguine. Certaines molécules qui recouvrent le stent entrainent un défaut de cicatrisation endothéliale conduisant à la mise en place d’une nouvelle plaque d’athérome : ce phenomène est appelé néoathérosclérose. De plus, les patients diabétiques ont un risque significativement supérieur de développer des complications post-angioplastie. Il est donc important de mieux connaître les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués au cours de ces complications post-angioplastie afin de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la cicatrisation endothéliale et empêcher la néoathérosclérose. Plusieurs travaux de notre équipe ont déjà identifié des cibles pharmacologiques appartenant à une famille spécifique de protéines dans les pathologies artérielles et ces protéines pourraient présenter un intérêt thérapeutique intéressant dans ce contexte pathologique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pertinentes et efficaces pour prévenir les complications post-angioplastie afin de diminuer le risque cardiovasculaire, notamment chez les patients diabétiques.
Procédures
Tout ou partie des animaux enrolés dans les procédures seront soumis: 1/différents régimes enrichis en gras ou cholestérol pendant 5, 6 ou 8 semaines 2/une chirurgie de l'artère carotide (durée: 30 min) 3/ des injections tous les jours pour induire un diabète (5 jours, 5 injections, durée: 30 sec) 4/ des injections ou des gavages d'inhibiteurs de cibles thérapeutiques (10 jours, 10 injections ou gavages, durée : 30 sec) 5/un prélèvement sanguin le jour de la mise à mort sur animal anesthésié ou animal vigile en fonction des voies de prélèvement (durée: 1 min)
Impact sur les animaux
La piqûre d’une aiguille pour injecter une molécule inductrice du diabète ou les différents inhibiteurs étudiés entraîne une douleur légère et de courte durée. L’injection de la molécule induisant le diabète peut induire une douleur légère de courte durée . L’introduction d’une sonde de gavage sur animal immobilisé par contention peut stresser les animaux et les irriter. La chirurgie peut entraîner une douleur post-opératoire. Une perte de poids légère peut survenir après la chirurgie. Le prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile au moment de la mise à mort entraîne une douleur légère et de courte durée.
Devenir
A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par la structure de l'endothélium ou les dépôts lipidiques signant la présence d'une nouvelle plaque d'athérome qui s'est développée.
Remplacement
Notre équipe développe des modèles 2D et 3D de vaisseaux sanguins afin d’analyser et de modéliser les structures des artères, afin d’éviter d’avoir recours à des animaux quand cela est possible. Cependant, les processus de cicatrisation endothéliale et de néoathérosclérose sont des contextes pathologiques complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires de la paroi vasculaire, ainsi que des facteurs circulants. De ce fait, les mécanismes étudiés ne sont pas toujours modélisables in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire et indispensable. De plus, dans notre contexte d’étude, une lésion endovasculaire in vivo est la seule approche expérimentale permettant de mimer l’angioplastie chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au maximum, en respectant les exigences des publications, sans nuire aux objectifs du projet et en garantissant des analyses statistiques de qualité. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Par ailleurs, les expérimentations ont été optimisées de manière à regrouper les analyses des artères sur un même animal chaque fois que cela est possible. Des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale et compenser la variabilité entre individus. Le choix du groupe contrôle sera réfléchi afin de pouvoir le comparer à plusieurs groupes expérimentaux. Enfin, les tissus non prélevés chez l’animal pourront être récupérés par d’autres membres de l’équipe ou de l’institut pour optimiser la nécessité d’une mise à mort d’un animal.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement approprié (igloo, bâtonnets de bois, coton, sizzle nest) et un statut sanitaire contrôlé tous les trimestres. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal ou la possibilité qu'il ressente de la douleur est évalué quotidiennement. Toute altération du bien-être des animaux sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien être des animaux et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en oeuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques prochesde l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Les animaux enrôlés dans ce projet seront âgés de 7 à 12 semaines. Il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes avec un système vasculaire mature.
Remodelage du système de Purkinje dans les arythmies ventriculaires chez la souris (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une stimulation électrique du cœur qui peut déclencher une fibrillation ventriculaire et tuer l'animal sur la table : 654 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs mères reçoivent du tamoxifène par voie orale juste avant la mise bas, produit qui peut provoquer une fausse route ou déclencher l'accouchement, et les nouveau-nés en reçoivent une injection au deuxième jour, avant un tatouage à dix jours et une biopsie de la queue. Le projet vise à comprendre comment un défaut des fibres de Purkinje, 2 % de la masse du cœur, déclenche les arythmies mortelles chez l'humain. Le porteur retient la souris pour sa petite taille, sa facilité de contention, sa gestation de dix-neuf à vingt et un jours et ses portées de six à quinze petits.
Objectifs
Ce projet se déroule sur 2 établissements EU1 et EU2. La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.
Bénéfices attendus
La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.
Procédures
La première intervention consiste au traitement des souris gestantes, juste avant la naissance et par voie orale avec une molécule qui induit les cardiomyopathies chez la descendance (durée : moins d’une minute). La descendance issue de ces mères gestantes recevra une injection du même traitement au 2ème jour après la naissance (durée : moins d’une minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée : moins d’une minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (durée : moins d’une minute). Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU1/2 Ces animaux seront sous anesthésie générale, et leur activité électrique sera analysée au niveau du cœur entier par électrocardiogramme (ECG), au niveau tissulaire par stimulation cardiaque, et au niveau structurel par IRM. Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU2/2.
Impact sur les animaux
Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.
Remplacement
Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.
Réduction
Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.
Raffinement
Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.
Etude des interactions hôte-microbiote lors d’un challenge nutritionnel chez la souris juvénile
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour un prélèvement d'organes, 466 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Élevées avec une flore intestinale définie ou dépourvues de tout micro-organisme, elles reçoivent pendant cinq semaines un régime appauvri en protéines et en graisses, censé reproduire la sous-nutrition infantile et permettre de suivre l'évolution des bactéries de leur intestin. Le porteur affirme que ce régime n'induit ni sensation de faim ni phénotype délétère et que le projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées. Les effectifs annoncés se recoupent sans être rapportés au total, 180 souris gavées deux fois, 250 saignées juste avant la mise à mort, 160 mesurées sous anesthésie, 90 contenues pour mesurer leur composition corporelle et 36 isolées en cage métabolique.
Objectifs
La période de croissance juvénile, s'étendant de la naissance à la maturation sexuelle, représente une phase cruciale dans la vie des animaux, marquée par des interactions complexes entre l'hôte, sa nutrition et les bactéries de sa flore intestinale (microbiote). La sous-nutrition infantile reste un défi majeur à l'échelle mondiale, et celle-ci conduit à des altérations significatives de la flore intestinale des individus malnutris. Par ailleurs, des travaux de recherche ont démontré qu'une intervention probiotique, consistant en l'administration de micro-organismes vivants en quantités adéquates, peut partiellement atténuer les phénotypes néfastes associés à la sous-nutrition chez un modèle préclinique de rongeur. Notre objectif est d'utiliser divers modèles de souris présentant une flore intestinale définie, composée de bactéries rigoureusement caractérisées, afin d'explorer les interactions entre l'hôte, son microbiote, et les relations au sein de cette dernière au cours de la croissance juvénile dans un contexte de dénutrition. Pour ce faire, nous envisageons d'implanter différentes populations bactériennes dans des souris « stériles », dépourvues de tout micro-organismes et de comparer la dynamique de croissance de ces animaux nourris avec un régime appauvri en protéines et en graisses par rapport à des animaux ayant un régime normal. Dans un second temps, nous souhaitons caractériser l'évolution génétique de ces souches au cours d'un tel challenge nutritionnel. Ces expérimentations visent à approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents permettant à la flore intestinale et à la nutrition d'influer conjointement sur la croissance juvénile des animaux.
Bénéfices attendus
Chez l'homme, 155 millions d'enfants sont aujourd'hui victimes de malnutrition dans le monde et la sous-nutrition chronique au stade juvénile entraîne un retard de croissance sévère et des séquelles physiologiques à long terme qui ne peuvent être corrigées par les stratégies classiques de renutrition. Des études récentes, ont établi que des composants de la flore intestinale peuvent modifier la trajectoire de croissance des animaux. Cependant, malgré les progrès récents dans l'étude des relations complexes entre la nutrition, la croissance et les microbes intestinaux, les mécanismes moléculaires à l'origine de ces bénéfices médiés par la flore bactérienne sur un hôte mammifère restent mal compris. Ici, en utilisant de nouveaux modèles de souris à flore définie, nous nous proposons d’étudier comment les constituants et les activités de la flore intestinale, associés à la nutrition, influencent la croissance juvénile. Au-delà de l'impératif d'améliorer la nutrition mondiale pour prévenir la dénutrition, concevoir des stratégies d'intervention pour remédier à ceux qui souffrent déjà de dénutrition est également un impératif urgent. Ce projet s'attaque à ce problème important et nous pensons que notre travail contribuera à l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'interaction hôte-microbes en relation avec la dénutrition.
Procédures
Dans le cadre de ce projet : - 180 souris seront gavées à l’aide d’une sonde 2 fois à 48h d’intervalle. Ce geste prend une trentaine de seconde. - 268 souris seront soumise à un régime nutritionnel faible en protéines et en graisses pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime normal), ni de phénotype délétère.- Sous anesthésie générale, 160 souris auront leur taille mesurée en début et en fin de procédure sous anesthésie générale ce qui prend moins de 2 minutes et subiront deux prélevement sanguin à 15 jours d’intervalle. Ce prélevement prend de l'ordre d'une minute - 250 souris subiront un prélèvement de sang juste avant la mise à mort. - 304 souris seront pesées chaque semaine pendant 5 semaines au maximum ce qui prend environ une minute - 90 souris subiront une contention de 2 minutes maximum afin de mesurer leur composition corporelle - 36 souris seront placées seules dans une cage adaptée pour mesurer leurs dépenses énergétiques.
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux : Le gavages des animaux ne devrait entrainer qu'un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. La mesure de la taille des animaux à P21 et P56 et les prélèvements sanguinss n'induiront qu'un léger stress lors de l'induction de l'anesthesie. Les pesées induiront un leger stress associé à la contention de l'animal afin de déterminer son identification. La contention pour analyse de la masse corporelle des animaux induira également un stress modéré : le temps de contention associé à la mesure est au maximum de 2 minutes Le stress associé à l'isolement des animaux en cages métaboliques restera modéré et limité au strict necessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes après mise à mort.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme et de sa flore à l'ingestion de divers régimes alimentaires ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier et des interactions avec sa flore dans un contexte de malnutrition. C'est pourquoi cette étude nécessite d’expérimenter sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure, après mise à mort, l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Dans la mesure du possible, les anciens reproducteurs seront utilisés dans le cadre d’autres projets ou mis à mort pour collecter des organes.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, la croissance en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés en début de procédure afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse suivi d’un point de compression jusqu’à l’hémostase complète. Tout au long des expériences, à l’exception des mesures de dépense énergétique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le challenge nutritionnel réalisé a déjà été pratiqué au laboratoire et ne devrait pas apporter de souffrance animale. La contention lors la mesure de la composition corporelle est limitée au strict minimum. L'analyse du métabolisme se fera dans une cage comportant des enrichissements (morceau de bois, tube en plastique) n'interférant pas avec l'analyse.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier la flore dans une étude nutritionnelle. Pour l’élevage, les animaux doivent être matures sexuellement c’est pourquoi l’inoculation de la flore intestinale des animaux se fait à 8 semaines de manière à pouvoir accoupler les animaux vers 10 semaines. Pour les expériences les animaux utilisés seront suivis tout au long du challenge nutritionnel du sevrage à l'âge de 21 jours jusqu'à l'âge de 56 jours. L'objectif du projet est d'étudier les interactions entre l’hôte et son microbiote pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé de la croissance de l’animal.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavés deux fois par sonde, vingt-quatre heures puis une heure avant d'être tués, 92 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur sérum et leur cœur servent ensuite à mesurer, sur cellules et ex vivo, l'effet protecteur d'extraits de romarin issus de l'agriculture régionale. Une grille de score de 0 à 18 est prévue, la mise à mort étant décidée au-delà de 15, pour une procédure qui se réduit à deux gavages. Le porteur écrit que ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes aux doses choisies, après avoir indiqué que le gavage peut être à l'origine de douleurs modérées ou de stress.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus d'extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), plante issue de l’agriculture régionale, sera intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre but sera d’évaluer les effets protecteurs cellulaires de la prise préventive d'extraits de Romarin. Notre approche est novatrice puisque les extraits ne seront pas disposés directement sur les cellules, mais le seront indirectement : après passage dans l’organisme, via le contact avec le sérum des rats traités par voie orale. Ainsi nos cellules seront mises en contact avec des extraits de Romarin, mais également avec leurs formes métabolisés ayant eux-aussi des propriétés anti-oxydantes. Notre objectif sera d’étudier des effets protecteurs cellulaires de sérum issus de rongeurs ayant eu un traitement oral avec des extraits de Romarin et leurs implications sur le stress oxydant. Nous évaluerons également ex vivo la cardioprotection induite par ces extraits suite à un test mimant l'infartus du myocarde. Ce projet a reçu un financement.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus de Romarin, plante issue de l’agriculture régionale, sera donc intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger les cellules endothéliales ainsi que le cœur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires ne sont pas très nombreuses et sont très attendus pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun deux traitements par voie orale (intervention évaluées à moins de 15 minutes) 24h puis 1h avant le sacrifice. Ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes sur les animaux aux doses choisies.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Néanmoins, toutes ces procédures seront réalisées par des personnels expérimentés. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. Par ailleurs, les prélèvements de sang seront réalisés seulement après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et endothéliales. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules et de leurs extractions sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (gavage avec utilisation d'aiguille en plastique souple), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Au cours de la procédure expérimentale, le bien-être des animaux sera évalué par un personnel formé à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites (cf annexe). Sur la base de cette grille, un score est attribué (de 0 à 18). Si le score est compris entre 5 et 9, l’animal sera alors observé attentivement (deux observations par jour), et une prise en charge antalgique pourra être envisagée. Si le score est compris entre 10 et 14, un soulagement de la souffrance sera systématiquement envisagé (même protocole d’analgésie), l’animal sera surveillé de façon renforcée (plusieurs observations par 1/2 journée afin de s'assurer des effets de l'antalgie), et un second avis pourra être demandé en vue d’une éventuelle euthanasie. Enfin, si le score est compris entre 15 et 18, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences d’ischémie-reperfusion ainsi que nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les rats seront utilisés à un stade mature (12semaines) pour être représentatif d’une population adulte.
Evaluation des effets antinociceptifs de plusieurs molécules injectées par voie intrathécale à l’aide d’un cathéter dans chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
945 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cathéter leur est implanté par une chirurgie du dos, puis une injection de formol sous la peau de la patte provoque une inflammation que le porteur décrit comme une douleur locale intense, avec des gonflements et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang possibles par animal. Les retombées annoncées pour les patients, des antalgiques efficaces sans les effets secondaires des opiacés, sont renvoyées au long terme, l'attente à court terme se limitant à des posters et des articles. Sur le remplacement, le porteur affirme que les modèles in silico et in vitro n'atteignent pas la douleur comme "expérience sensorielle et émotionnelle" et conclut au recours au rat.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. La douleur inflammatoire est associée à des phénomènes d’inflammation qui perdurent anormalement. Dans des conditions normales, l’inflammation aiguë est essentielle pour protéger l’organisme contre les agents pathogènes ainsi que pour favoriser la réparation des tissus. À l’inverse, une inflammation chronique, qui dure 6 semaines ou plus, entraîne des lésions tissulaires et des douleurs indésirables. Les modèles in vivo, aident à comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de la génération de douleurs inflammatoires chroniques et permettent l’identification de nombreux candidats médicaments analgésiques. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de l'efficacité de composés administrés en perfusion directement au niveau central. elle sera évaluée par le test du formol, qui est couramment décrit dans la littérature et est réalisé dans le laboratoire depuis plusieurs années. L’objectif de ce projet est donc de proposer une méthode pertinente qui permettra l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisées en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
L’implantation du cathéter nécessaire pour le traitement se fait via une chirurgie au niveau dorsale qui dure 10-15min sous anesthésie avec un traitement local de la douleur. La stimulation chimique induisant une douleur locale intense. Les animaux seront également isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux pendant 3 semaines maximum) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur (nombre maximum théorique: 25 prélèvements)
Impact sur les animaux
Le modèle du formol est un modèle de douleur inflammatoire. Des nuisance liées à l’inflammation sont donc attendues notamment des gonflements ( nuisances modérées à sévères selon l’inflammation). Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’une injection unique d’un agent inflammatoire (stimulation chimique) en sous-cutanée plantaire (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 1h maximum) De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle : nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie.
Devenir
La douleur induite par ce test ne permet pas un retour à l’état physiologique de base. Les animaux ne peuvent donc pas être gardés. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité du laboratoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus, mais pas sur la douleur dans sa globalité. Selon sa définition par l’IASP (International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi la douleur n'est pas étudiée dans toute sa complexité.
Réduction
Ce test est couramment mis en place au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (enceinte) afin de limiter leur stress. Un système de surveillance de l’état général des animaux associé à des points limites est mis en place au laboratoire. Lors de ce test un temps maximal d’observation est en place afin de limiter la douleur. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, pose de cathéter. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite à la pose de cathéter : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection de solutions hydratantes en cas de déshydratation.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles (4-7semaines). Ce stade a été choisi car il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats.
Enseignements pratiques : étude de la réponse immunitaire post-vaccinale chez la souris
- Enseignement supérieur
Trois injections d'un vaccin sous la peau, une par semaine pendant trois semaines, puis la mise à mort par dislocation cervicale et la dissection : 115 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, pour un travail pratique d'immunologie. Le porteur indique que l'injection provoque une masse au flanc droit et une inflammation d'environ vingt-quatre heures, sans altération attendue de l'état général. Les compétences visées sont la contention, la préparation du vaccin, l'injection sous la peau, puis le repérage et le prélèvement de la rate et des ganglions. La dislocation cervicale est annoncée comme une connaissance théorique, non pratiquée par les étudiants, et l'effectif est fixé à une souris par binôme.
Objectifs
L’objectif du projet est pédagogique. Ces travaux pratiques d’immunologie couvrent deux objectifs. 1.Les étudiants apprennent à induire une réponse vaccinale chez la souris par injection sous-cutanée. Dans cet objectif ils pourront accroitre leur technique d’expérimentation animale sur la contention et l’injection sous-cutanée. 2. Les étudiants apprennent à disséquer les souris de manière à identifier et prélever les organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de transmettre un savoir théorique et pratique aux étudiants dans le domaine de l’immunologie, de la réponse vaccinale, des techniques biologiques et des bonnes pratiques en expérimentation animale. Voici les compétences en lien avec l’expérimentation animale qui seront acquises par les étudiants à l’issue de ce projet : - Contention des souris - Préparation d’un vaccin et technique d’injection sous-cutanée - Connaissance théorique sur la mise à mort par dislocation cervicale (non pratiquée par l’étudiant) - Connaissance de l’anatomie du système immunitaire chez la souris - Dissection et prélèvement des organes lymphoïdes secondaires (rate et ganglions)
Procédures
Injection sous cutanée du vaccin ou de la solution témoins : 3 injections par animal (1/semaine sur 3 semaines) - Durée de l’injection : 15 secondes
Impact sur les animaux
L’injection du vaccin en sous-cutanée génère une petite masse au niveau du flanc droit qui s’estompe dans les 4 heures qui suivent l’injection. Pour les souris vaccinées, le tampon dans lequel est injecté le vaccin contient une molécule (CpG) qui génère une inflammation sur le site d’injection durant les 24 heures qui suivent l’administration. L’administration du vaccin peut donc provoquer une gêne légère et une douleur légère. Elle ne génère cependant pas de nécrose cutanée. Aucune altération de l’état général n’est attendue.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort au moment de l’analyse de la réponse immunitaire une semaine après la fin de la procédure de vaccination.
Remplacement
L’étude de la réponse immunitaire post-vaccinale est complexe et implique des mécanismes et des interactions cellulaires que l’on ne peut étudier que dans un organisme vivant. En conséquence, l’évaluation d’un vaccin doit être réalisée sur les organismes vivants. Les étudiants de 3° année de BUT-GB-BMB (BUT3) sont destinés à des métiers de techniciens ou d’assistant ingénieurs en biologie et seront amenés à travailler dans des structures académiques ou privés dans les domaines de l’immunologie et/ou de la cancérologie. Ces domaines nécessitent des compétences poussées en expérimentation animale ce qui justifie la formation des étudiants de BUT3 dans ce domaine.
Réduction
Nous limiterons le nombre de souris à une par binôme. C’est un nombre minimum pour garantir l’apprentissage des bons gestes de contention, d’injection sous-cutanée et de dissection. Une analyse statistique sera possible en mettant en commun l’ensemble des données du groupe d’étudiants. Par ailleurs, en utilisant des données disponibles de la littérature scientifique intégrant des données d’expérimentation animale autres que celles obtenues dans le TP (effet sur la croissance des tumeurs, sur la survie des souris, sur des paramètres de la réponse immunitaire), nous pourrons aider les étudiants à interpréter, à critiquer leurs résultats et imaginer des perspectives à leur travail dans le contexte scientifique actuel.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension par les responsables de l’animalerie de l’IUT. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Contrairement à d’autres produits existants, l’adjuvant utilisé n’est pas toxique pour les souris et la solution injectée n’induit pas de douleur à l’animal. Ces modifications de la composition du vaccin ne modifient en rien l’efficacité de celui-ci (données sur cette formulation connues dans la littérature).
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme dans un contexte de vaccination. Des données sur la vaccination chez la souris avec le peptide RIOK1 existe dans la littérature, ce qui permettra d’utiliser ce modèle en tenant compte de la règle des 3R. Les outils d’analyses ex vivo chez la souris sont maitrisés par l’équipe encadrante. Par ailleurs, les outils (anticorps) permettant l’analyse et la déplétion des populations immunitaires sont aussi très nombreux chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Recherches sur les conséquences motrices et non motrices d’une mutation génétique d’intérêt dans un modèle murin de maladie du mouvement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à la fin des procédures pour prélèvement de tissus, 900 souris au maximum vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent des tests comportementaux quatre à sept jours par semaine pendant six semaines, dont un test de coordination, un test de motivation, un test d'addiction avec jusqu'à dix injections de drogues, et un apprentissage par récompense obtenu en réduisant leur ration pendant dix-huit jours jusqu'à 15 % de perte de poids. Une partie est hébergée seule pendant quatre semaines, et les souris qui servent de partenaires dans le test de sociabilité peuvent être agressées et blessées par les souris mutantes. Le porteur annonce huit à dix animaux par groupe comme effectif minimal, sans détailler comment ces groupes conduisent au total de 900.
Objectifs
Nous étudions une maladie rare et invalidante avec des troubles du mouvement. Cette maladie est due à des mutations d’un gène exprimé dans une région du cerveau qui contrôle l’exécution des mouvements. Ces mutations pourraient changer le fonctionnement de cette région du cerveau et donc perturber l’exécution du mouvement. Toutefois, cette maladie fait l’objet de peu d’études. Un modèle animal porteur d’une des mutations impliquées dans la maladie humaine a été développé et a permis de montrer que la mutation affecte l’activité dans le cerveau des animaux mutés qui, de plus, ne peuvent pas exécuter certains mouvements complexes. Cependant, les résultats des tests de comportement réalisés dépendent de différents facteurs (coordination, endurance, motivation…) et la région du cerveau concernée est aussi impliquée dans la motivation et d’autres comportements en dehors des mouvements. Les patients présentent d’ailleurs d’autres troubles que ceux affectant leurs mouvements, encore mal documentés, qui pourraient résulter d’un dysfonctionnement de cette région du cerveau en raison de la mutation génétique. L’objectif de ce projet sera donc d’explorer chez ce modèle de souris génétiquement modifiées, avec des tests plus spécifiques, les conséquences de cette mutation sur différents comportements (mouvements, motivation, cognition…), afin de mieux comprendre les perturbations du fonctionnement du système nerveux entrainées par la mutation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront scientifiques et thérapeutiques. Les troubles du mouvement étudiés ici sont une maladie rare faisant partie d’un ensemble de maladies du mouvement dont les causes sont des perturbations du fonctionnement d’une région du cerveau impliquée dans l’exécution des mouvements. Ces perturbations, plus ou moins sévères, altèrent la qualité de vie des patients et s’accompagnent parfois de troubles psychomoteurs, développementaux, psychiatriques ou cognitifs. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre comment cette mutation induit des troubles moteurs ou non moteurs. A ce jour, de nombreux traitements de cette maladie ont été testés avec un bénéfice limité. Le traitement médicamenteux le plus efficace montre un bénéfice variable selon les patients, allant d’une franche amélioration pour une majorité d’entre eux, à une aggravation des symptômes pour certains. Un traitement invasif est également possible mais est envisagé seulement dans les cas les plus graves. Le modèle animal utilisé dans ce projet, avec le complément de caractérisation obtenu grâce à nos travaux, pourrait permettre de tester d’autres traitements médicamenteux pour traiter l’ensemble des troubles observés. A court terme, nous espérons donc que le projet fera progresser les connaissances sur le fonctionnement de cette région du cerveau, sur le lien entre la mutation et les symptômes des patients, et plus généralement sur les causes de plusieurs maladies du mouvement. A plus long terme, les résultats récoltés pourraient permettre de développer de nouvelles thérapies pour cette maladie, et d’en faire profiter l’ensemble des maladies du mouvement altérant les mécanismes dans lesquels le gène muté joue un rôle pour le fonctionnement du cerveau.
Procédures
Les animaux participeront à des tests comportementaux pendant 4 à 7 jours par semaine répartis sur 6 semaines max, visant à évaluer la motricité, l’anxiété, la sociabilité, la motivation, l’apprentissage ou l’addiction. Une partie des animaux commencera par un test de coordination motrice et équilibre (5 jours, 5 essais max par jour de 5min). Puis ils feront un test de motivation (1 jour, 1 essai de 5min). Puis une partie d’entre eux réalisera un test évaluant l’addiction, où ils recevront des injections intrapéritonéales de substances (max 10 injections au total par animal vigile, soit 2 injections par jour pendant 5 jours, d’une durée de quelques secondes par injection). Les autres animaux seront hébergés seuls pendant 4 semaines max pour réaliser un test de motivation, d’endurance et de motricité pendant 4 nuits consécutives, puis un test d’apprentissage par la récompense (10min par essai pendant 4 jours pour habituation, 30min par essai pendant 8 jours pour entrainement puis 1 essai de 60min pour évaluation), où pour obtenir une motivation optimale à chercher la récompense alimentaire, leur apport alimentaire en cage sera réduit (18 jours max). L’autre partie des animaux commencera par un test d’anxiété (1 jour, 1 essai de 10min), puis un test évaluant la démarche, l’équilibre et la coordination (4 jours, 3 essais max par jour de 2min). Ils feront ensuite un test pour évaluer leur sensibilité à l’effort (2 jours, 1 essais de 10min le 1er jour et 8 essais de 2min, le 2e jour), puis seront évalués sur leur sensibilité à la nouveauté (3 jours, dont 1 essai de 30min le 1erjour, de 10min le 2e jour et 2 essais de 5min le 3e jour). Par la suite, les animaux réaliseront un test évaluant leur motricité fine au cours duquel, la nourriture leur sera retirée la veille du test (jeûne de moins de 16 h) afin d’optimiser leur motivation à consommer un capellini (6 jours, 1 essai par jour de 10min pendant l’habituation ou plus lors de l’évaluation). A l’issue de ce test, les animaux auront une semaine de pause, puis seront hébergés seuls pendant 1 semaine pour tester leur capacité individuelle à préparer un nid. Enfin, ils passeront un test évaluant l’équilibre et la coordination (2 jours, 3 essais par jour de 2min), puis un test d’interaction sociale (2 jours, 1 essai par jour de 20min). En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Une mise à jeun sera réalisée sur une durée courte (inférieure à 16h) impliquant un stress, une sensation de faim et un risque de légère perte de poids associée. Une restriction alimentaire sera réalisée sur 18 jours générant un stress, une sensation de faim et une perte de poids (stabilisée à 15 pourcents de perte du poids initial). L’hébergement individuel des animaux à certaines étapes sera associé à un stress. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Les drogues utilisées entraineront une augmentation de locomotion ou d’activité. Les tests comportementaux effectués pourraient induire un stress. Les souris utilisées dans le test évaluant la sociabilité seront susceptibles de se faire agresser par les souris à étudier, impliquant un stress et un risque de blessures.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés pour permettre les analyses scientifiques par prélèvements de tissus.
Remplacement
Notre projet propose d’étudier les mécanismes et les conséquences d’une mutation d’un gène impliqué dans une maladie humaine touchant les circuits moteurs, les circuits de la récompense, l’apprentissage, l’addiction, la motivation, la sociabilité, la sensibilité à la nouveauté et l’anxiété. Des études in vitro ont déjà été menées pour étudier l’effet de la mutation sur la protéine correspondant au gène muté chez les patients. Cela a permis de démontrer une activité trop importante de cette protéine mutée en réponse à une stimulation dans une lignée de cellules humaines en culture, par rapport à la protéine non mutée. Une modélisation de la structure de cette protéine a permis d’identifier la position de la mutation dans la protéine et de proposer un mécanisme pour expliquer la modification d’activité de la protéine mutée. L’ensemble de ces études soutient donc l’importance de pouvoir étudier les effets de la mutation dans la région du cerveau où ce gène est exprimé en observant les conséquences comportementales de la perturbation de l’activité de la protéine directement dans les tissus où elle est présente. Cette région du cerveau est à la fois impliquée dans le contrôle des mouvements volontaires, l’apprentissage par la récompense, mais aussi dans d’autres fonctions psycho-cognitives (Ex : sociabilité, anxiété, etc…) par ses interactions avec d’autres structures du système nerveux. Le fonctionnement de ce réseau de régions ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles de cellules en culture ou par outil informatique. Le projet nécessite donc des approches intégrées sur animal entier et ne peut se faire qu'à l'aide d'études comportementales chez l'animal. Il existe une lignée de souris génétiquement modifiées avec une mutation du gène trouvée fréquemment chez les patients, qui constitue donc un modèle pertinent pour cette étude. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement d'évaluer nos approches et d’adapter nos expériences pour réduire l’utilisation des modèles in vivo autant que possible.
Réduction
Nous chercherons à réduire le plus possible la variabilité expérimentale par des protocoles expérimentaux rigoureux et par l’utilisation de groupes d’animaux les plus stables possibles en termes de génétique et d’hébergement. De plus, les groupes de souris de lignée modèle de la maladie d’intérêt seront issus des mêmes portées dans la mesure du possible et l’élevage des souris sera piloté pour produire les nombres d’animaux strictement nécessaires aux expériences. Le nombre total d'animaux impliqués sera de maximum 900 pour l'ensemble des procédures. Les expériences ne seront réalisées que 2 fois pour confirmation, afin de limiter le nombre d'animaux, une 3ème occurrence ne sera réalisée qu'en cas de résultats incohérents ou contradictoires afin de permettre de conclure. La taille des groupes d’animaux expérimentaux est estimée en se basant sur des travaux précédents, défini comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 8 à 10 animaux par groupe seront nécessaires pour dégager des effets statistiquement significatifs dans les réponses que nous proposons de tester. Les résultats obtenus seront analysés avec des méthodes statistiques rigoureuses et éprouvées.
Raffinement
Pour toute cette étude, les conditions d'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d'inconfort possible. Pendant les procédures, en complément de la surveillance quotidienne, ils seront observés et manipulés au moins 4 fois dans une semaine et une pesée sera effectuée entre une fois par jour et une fois par semaine. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la règlementation en vigueur pour l’espèce à l’exception des étapes spécifiques au cours desquelles ils devront être hébergés individuellement, ou être soumis à une restriction alimentaire. Lors de ces étapes précises nous surveillerons les animaux de manière spécifique au moins 4 fois par semaine afin de détecter tout signe de détresse chez les animaux. Lorsque cela sera compatible avec notre procédure nous apporterons également un enrichissement supplémentaire. Nous évaluerons les signes de douleurs ou détresse au minimum 1 fois par semaine et pour chaque procédure des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les animaux seront également observés quotidiennement tout au long du projet ; en cas d’anomalie, celle-ci est déclarée à la structure chargée du bien-être animal et au vétérinaire qui apporteront conseils et recommandations pour mettre en place une prise en charge adaptée de l’animal. Dans la procédure nécessitant des injections répétées de substances, nous changerons si nécessaire la zone d’injection. De plus, avant chaque injection nous nous assurerons que la zone soit saine et sans lésion apparente. Nous vérifierons également le bon état général de l’animal lors de la réalisation des tests afin de détecter tout effet secondaire à l’administration de drogue. Pour réduire le stress lors des tests comportementaux, les souris seront manipulées 5min par jour pendant au moins 5 jours avant le début des tests, elles seront également placées au moins 30min avant le test comportemental dans la pièce d’expérimentation et une phase d’habituation au matériel utilisé lors des tests sera prévue. Lors de l’euthanasie médicamenteuse nous administrerons à l’animal un sédatif au préalable, afin d’éviter tout stress ou douleur lors de l’injection de l’euthanasiant.
Choix des espèces
Dans le projet, la souris sera utilisée. Il s’agit du modèle le plus utilisé pour modéliser les maladies humaines du mouvement. La souris, ayant des mouvements coordonnés des pattes, constitue un modèle d'étude du mouvement pertinent, notamment pour l’étude de comportements moteurs élaborés et de mouvements anormaux. De nombreux tests comportementaux nécessaires pour cette étude sont développés chez la souris. De plus, elle est très utilisée pour les études de récompense, addiction, anxiété dont les protocoles sont bien définis. Enfin, la région du cerveau dans laquelle le gène muté est exprimé comporte une organisation anatomo-fonctionnelle proche entre la souris et les primates non humains et humains, faisant ainsi de la souris un modèle particulièrement utile à l'étude de cette maladie. Les expériences ont lieu chez des animaux adultes âgés de 6 à 22 semaines, afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux. De plus, les tests expérimentaux utilisés sont tous adaptés à des souris adultes avec des capacités motrices bien caractérisées.
Étude de la livraison au cerveau de deux composés utilisés comme traitement thérapeutique potentiel contre la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans la veine de la queue en état vigile, dans une boîte de contention, 85 souris reçoivent une dose unique d'un composé, tandis que 25 autres, porteuses d'un cathéter dans la veine jugulaire, en reçoivent matin et soir pendant quatre jours. Ces 110 souris subissent des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, avec un risque de lésions et d'inflammation au point d'injection. L'objet est de vérifier si deux composés bloquant l'action d'un peptide franchissent la barrière entre le sang et le cerveau, étape que le porteur qualifie d'"impérative" avant d'envisager un usage contre la maladie d'Alzheimer. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, foie, reins et sang, et y doser le composé.
Objectifs
L'objectif de cette étude est de faire une première analyse préclinique pour optimiser la livraison de composés thérapeutiques dans le cerveau chez la souris. Deux composés ont été sélectionnés en amont comme bloquant l'action d'un peptide sécrété naturellement dans le cerveau en condition physiologique. Une étude scientifique a montré un impact direct de ce peptide sur la régulation de l'activité des synapses (points de connexion entre les neurones). De plus, des données obtenues par l'équipe montrent qu'une augmentation anormale des niveaux de ce peptide dans le cerveau de patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourrait contribuer à la perte d'activité des synapses et de la mémoire, symptômes typiques de cette maladie. Enfin, il est possible que ce peptide soit impliqué dans d'autres maladies neurologiques comme la schizophrénie. Afin de prévenir cette action néfaste, nous avons criblé une banque de composés afin de bloquer son action à la synapse. Il est impératif aujourd'hui d'évaluer la capacité de ces composés à entrer dans le cerveau pour confirmer leur potentiel thérapeutique. Ce projet s'engagera à répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Déterminer si ces composés parviennent à traverser la barrière hémato-encéphalique avec succès. 2. Définir les doses et les temps de stabilité de ces composés après injection. 3. Analyser la dose et le temps de stabilité pour un traitement chronique (jusqu'à un maximum de 4 jours).
Bénéfices attendus
Dans le monde, on estime qu'il y a environ 50 millions de personnes atteintes de démence, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante. Cette maladie impacte un tiers des personnes de plus de 80 ans. Ces chiffres sont cependant en augmentation en raison du vieillissement de la population. Il n'y a pour l'instant aucune solution thérapeutique permettant de soigner ces patients. Trouver de nouvelles solutions thérapeutiques est donc une priorité absolue de santé publique. Notre groupe se concentre sur un nouveau peptide associé à la maladie d'Alzheimer, mais aussi possiblement à d'autres maladies neurologiques (schizophrénie…), comme nouvelle cible thérapeutique. Les analyses de pharmacocinétique prévues dans ce projet vont être essentielles pour confirmer la livraison au cerveau des composés bloquant l'action du peptide étudié, et donc renforcer leur potentiel thérapeutique. Ces données précliniques seront précieuses en vue d'une application thérapeutique future chez l'homme.
Procédures
Des souris vigiles seront soumises à une seule administration aiguë d'un composé par injection intraveineuse au niveau de la queue (85 souris, 5 minutes de manipulation). Un autre groupe de 25 souris avec un cathéter placé au niveau de la veine jugulaire sera soumis à l'administration du composé le matin et le soir via le cathéter sur un maximum de 4 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection en intraveineuse à la veine caudale de la queue dans une boite à contention ce qui peut entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Une nuisance légère dûe à la contention de l'animal lors des injections via le cathéter est attendue.
Devenir
À la fin du traitement, nous procéderons à la mise à mort de l'animal et au prélèvement de ses organes (le cerveau, le foie, les reins, le sang) afin d'évaluer la concentration des composés injectés ainsi que ses caractéristiques pharmacocinétiques et sa capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Pour compléter les études in vitro et ex vivo précédemment réalisées dans notre laboratoire sur des neurones de souris, il est désormais nécessaire d'utiliser ce même modèle comme modèle animal. En effet, la souris est idéalement adaptée pour des analyses de pharmacocinétique, notamment pour une livraison dans le cerveau avec une barrière hématoencéphalique intacte. Malheureusement, pour ce type d'analyse pharmacocinétique, il est impossible de recourir à des méthodes alternatives pour remplacer l'utilisation d'animaux ou pour opter pour des animaux moins sensibles. Bien qu'il existe des modèles ex vivo dédiés à l'étude du passage de la barrière hémato-encephalique, ce type d'analyse de pharmacocinétique chez l'animal vivant est nécessaire comme pré-requis avant transfert de l'utilisation de ces composées chez l'homme. Cette étude chez la souris est donc capitale pour fournir les données essentielles in vivo en vue d'une application thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous nous baserons sur des études pilotes précédemment menées ex-vivo. Ces expériences, déjà réalisées dans notre laboratoire, ont permis d'identifier une dose optimale à administrer de manière directe et aiguë sur des neurones en culture et des tranches de cerveau de souris ex vivo. Nous sommes toutefois conscients que passer d'un modèle ex vivo, avec une administration directe sur le tissu et en aigu, à une étude in vivo présente des différences significatives. C'est pourquoi le calcul final des doses sera recalibré si besoin de façon à ce que le niveau de concentration passant du flux sanguin au cerveau soit comparable à celui obtenu lors des expériences ex vivo. Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons essentiellement des mâles pour la première partie de l'étude pharmacocinétique. Après identification des doses et temps optimaux en injection aigue et chronique, nous validerons ces points aussi chez la femelle. Aussi, c'est dans l'optique de reduction d'animaux que nous séparons ce projet en 2 procédures, en espérant ne devoir utiliser que la procédure 1 si la stabilité des composés lors de livraison in vivo en aigu le permet. Enfin, nous avons regroupé les groupes 'contrôle' pour les mâles pour les deux procédures afin de minimiser le nombres d'animaux utilisés et nous avons estimé avec l'outil statistique prédictif g-power le nombre de souris nécessaire par groupe (5 souris) pour obtenir une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses d'effets des composés obtenus ex vivo.
Raffinement
Nous nous sommes assurés de la non toxicité des composés à injecter en amont de cette étude. En effet, les études préliminaires réalisées in vitro et ex-vivo avec les composés à l'étude n'ont montré aucune toxicité sur des neurones en culture ou sur des tranches de cerveau, même après application à forte dose et à temps long (24h). D'autres composés de même profile (même famille de molécules) ont déjà été utilisés in vivo montrant qu'ils ne présentent pas d'effets secondaires notoires. Nous accorderons une attention particulière aux conditions d'hébergement, en plaçant les animaux 5 par cage. Ils auront accès à l'eau et nourriture, dans un environnement enrichi où la temperature et l'hydrometrie sont controlées. Un suivi régulier sera assuré par des opérateurs formés, et les animaux seront surveillés de manière à permettre, le cas échéant, la mise en œuvre de points limites précoces et adaptés. Si les données obtenues montrent que la souris devra subir des injections répétées pour obtenir un niveau suffisant des composés dans le cerveau, nous avons aussi proposé une livraison du composé sur plusieurs jours via un cathéter inséré dans la veine jugulaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que toutes nos données ex-vivo ont été obtenues sur des neurones de souris. Cela permettra de calibrer du mieux possible les doses à utiliser in vivo. La souris possède un système vaculaire, une barrière hémato-encéphalique et un cerveau avec des propriétés très similaires à celles décrites chez l'humain. Nos données de pharmacocinétiques obtenues dans ce modèle seront donc très pertinentes comme pré-requis pour pouvoir ensuite transferer l'utilistation des composés chez l'homme. Pour réaliser notre étude, nous utiliserons des souris adultes d'environ 8 semaines (environ 24-28g chacune). L’utilisation des composés pourrait être à terme envisagée pour d’autres maladies liées à la dysfonction des synapses, notamment aussi des pathologies présentes chez le jeune adulte, en plus d'une utilisation potentielle pour la maladie d'Alzheimer. La barrière hémato-encéphalique étant moins poreuse chez le jeune adulte que chez les sujets âgés, il est préférable d’obtenir ces données de pharmacocinétique chez le jeune adulte comme passage ‘à minima’ des composés.
Travaux pratiques du BUT Génie Biologique 1ere année : clairance renale et telemetrie ECG pharmaco chez le rat,
- Enseignement supérieur
Déjà utilisés quinze jours plus tôt dans une séance de télémétrie cardiaque, 120 rats sont repris pour une seconde séance de travaux pratiques, où ils sont opérés sous anesthésie et tués sans réveil. 165 rats mâles de 250 à 350 grammes vont ainsi être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les unes, menées sous anesthésie sans réveil pour l'autre. Ils reçoivent une injection d'un agent qui ralentit le cœur puis, une heure après, d'un agent qui l'accélère, avant que des cathéters posés par les enseignants ne permettent de prélever sang et urine pendant quarante-cinq minutes en moyenne. Cette réutilisation d'un même animal dans deux séances est présentée au titre de la réduction, et le porteur juge "nécessaire" que la formation intègre les méthodes in vivo en plus des méthodes alternatives déjà enseignées.
Objectifs
Le projet s'inscrit dans le progamme pédagogique de la formation universitaire des techniciens supérieures en biologie médicale en accord avec le programme pédagogique national de la dite formation. Il correspond à la realisation de travaux pratiques (2 ) de physiologie sur animaux vivants : la mesure de la clairance rénale chez le rat anesthésie et l'étude des effets cardiovasculaires de l'administration systémique ( sous cutanée) d'agents cardio-inhibiteur et cardio-excitateur (par enregistrement télémetrique non invasif) chez le rat vigile. Ces TPs visent à mieuxcomprendre la physiologie renale et les régulations du systeme nerveux autonome sur l'activité cardiaque. La transmission télémétrique de l'electrocardiogramme sera effectué via le port par chaque rat de gilets permettant un recueil et un enregistrement non invasif des données. Les animaux sont des rats de 250-350 g (mâles).
Bénéfices attendus
Outre les benefices dans la comprehension des mécanismes de regulation de la physiologie rénale et cardiovasculaire , le projet permettra de potentialiser l'apprentissage pour les futurs techniciens des methodes d'étude et d'analyse des parametres physiologiques sur des modèles utilisant des animaux vivants.
Procédures
Les animaux de la procedure 2 seront soumis à 2 injections et seront tous réutilisés 15 jours plus tard dans la procédure 1 pour laquelle il subiront une chirurgie ( en vue de prélèvements urinaire et sanguin) sans reveil ( mise à mort par injection d'un euthanasiant). La durée de la procedure 1 sera de 45 minutes en moyenne. Cette dernière procedure necessitera un lot d'animaux supplementaire car elle s'adressera à 2 groupes d'étudiants supplémentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cas de la procédure 1, les animaux subiront l'injection (douleur légère de courte durée) d'un anesthésique précédée de celle d'un sedatif. Dans le cas de la procedure 2 , les animaux subiront une injection d'un agent cardioinhibiteur suivie une heure plus tard de celle d'un agent cardioexcitateur (sévérité modérée car effets cardiovasculaires épisodiques de courte durée sur animal éveillé).
Devenir
A l'issue de la procedure 2 les 120 animaux sont gardés en vie en vue de leur utilisation ultérieure ( Reduire) dans la procédure 1 Tous les animaux de la procedure 1 seront mis à mort ( Sans reveil) car les prelevement invasifs et les cathéterismes rendent impossible la récupération.
Remplacement
L"analyse de la clairance rénale requiert une quantité suffisante d'urine et de sang qui necessite le prelevement in vivo de ces fluides ( via cathétérismes) donc l'utilisation d'animaux vivants et anesthésiés. L'étude telemétrique de l'activité cardiaque necessite l'utilisation d'animaux vivants et de plus les effets des substances pharmacologiques étudiées ne peuvent raisonnablement être évaluées que sur un organisme entier intégrant tous les paramètres physiologiques. Enfin, mêmes si les étudiants du parcours sont formés aux methodes alternatives, il est necessaire que cette formation intègre aussi les méthodes in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum ( 1 rat par binôme participant) tout en restant dans des limites pédagogiques efficaces. De plus une partie des animaux seront réutilisés (ceux de la procédure de télémétrie) dans la procedure clairance rénale (sans reveil).
Raffinement
Afin de favoriser au maximum le bien être de l'animal ( limiter les nuisances , la douleur, le stress,...) différentes actions sont mises en place. Pour ce faire, une periode d'habituation de quelques heures à la salle /poste de manipualtions pour les animaux est systématiquement respectée. Les animaux sont anesthésiés pour la procedure sans reveil qui a une durée tres limitée pour le recueil des fluides (sang et urine). La mise à mort survient en moyenne 45 minutes après le debut de l'anesthésie. La chirurgie et les cathétérismes sont effectués par les enseignants compétents. Les caractéristiques du matériel (aiguilles cathéters) sont adaptées à l'espece rat afin de garantir la résussite de l'acte en limitant la douleur ( légère pour l'administration du mélange anesthésique) ou le risque physiologique (volume d'injection ou de prélévement ). Dans le cas de la procedure d'étude télémétrique des effets cardiovasculaires d'agents phamacologiques, la methode est tres peu invasive car elle evite une implantation chirurgicale. En effet les animaux sont habitués à porter un gilet qui enregistre l'activité cardiaque et respiratoire du rat (éveillé et libre de ses mouvements) et la transmet à un ordinateur à distance (sans fil). Les injections des agents pharmacologiques sont realisées avec des aiguilles les plus fines possible pour limiter la douleur (légère) et les doses sont calculées de manière à éviter les effets secondaires. Une surveillace de chaque animal est effectuée apres chaque injection le jour meme de la procedure mais également le lendemain dans l'animalerie. En dehors des procedures, les animaux sont hébergés dans les conditions standard (cage enrichies dans des salles thermoregulées et en cycle lumière J/N inversé ) mais beneficient en plus d'un espace de jeux ( game room )en dehors des manipulations. Cette game room est un espace de jeu pour les rat ou souris qui leur permet ,en groupe , d'interagir avec différents objets ( tunnels, boites à trous, grelots hamacs ...), en dehors de leurs cages, et ce pendant 1h par jour (2 à 3 fois par semaine).
Choix des espèces
Les rats Sprague Dawley sont les animaux modèles les plus utilisés dans l’expérimentation in vivo pour l'étude de la physiologie animale et la pharmacologie Animaux adultes pour faciliter les manipulations des étudiants et répondant au mieux pour le but des TP réalisés, notamment pour l'utilisation des gilets de telemetrie non adaptés pour des animaux trop jeunes ( taille trop petite).
Rôle d’une population cellulaire mémoire dans un modèle d’eczéma allergique chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à treize anesthésies générales et voir ses oreilles mesurées six fois par semaine pendant quatre semaines. Un allergène est appliqué sur leur ventre rasé, puis sur leurs oreilles trois fois par semaine, pour installer un eczéma chronique et suivre une population de cellules mémoires de la peau. Le porteur écarte tout traitement anti-inflammatoire ou cicatrisant, au motif qu'il perturberait la réponse inflammatoire étudiée. Les souris qui se grattent jusqu'à s'ouvrir la peau sont mises à mort immédiatement.
Objectifs
L’eczéma allergique de contact est une maladie inflammatoire de la peau qui se développe suite à des contacts avec un allergène de l’environnement, induisant, chez certains individus, la production de cellules spécifiques de cet allergène. Lorsque ces cellules migrent dans la peau, elles induisent une poussée d’eczéma et certaines d’entre elles acquièrent alors des propriétés mémoires. Ces cellules résidants mémoires ont une capacité à répondre très rapidement et plus efficacement à des expositions ultérieures au même allergène. Ces cellules vont être clés dans la chronicité et la sévérité de l’eczéma. Récemment décrits dans la littérature, ils ont de plus la capacité de persister pendant de longs mois dans la peau. Ce projet vise à étudier l'effet de l'application répétée d'un allergène (phase chronique) sur la peau et plus particulièrement sur cette population spécifique de cellules mémoires qui persite. Nous chercherons à comprendre quel est l’effet de l’application répétée de l’allergène sur ces cellules. Nous chercherons de plus à documenter la participation de ces cellules dans les modifications de la peau induite par la chronicité et notamment dans l'apparition de fibrose cutanée très fréquente chez les patients atteints d’eczéma chronique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de progresser dans la connaissance des cellules présentes de la peau qui persistent aprés des lésions d'eczema et plus largement de mieux comprendre la sévérité de ces eczémas. Ce projet permettra egalement de mieux comprendre l'implication de ces cellules dans les modifications du tissu induites par l'application répétée de chimique et plus particulierement dans l'apparition de fibrose.
Procédures
Les animaux recevront une application sur la peau d'un produit allergisant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront des applications du même produit sur leurs oreilles (3fois /semaines pendant 4 semaines), afin d'induire une réaction allergique chronique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 30min (13 injections au maximum sur toute la durée du protocole) . Les animaux pourront également être injectés (4 injections suplémentaires au total) avec un produit permettant d'induire sélectivement la suppression de cellules cibles. Ce traitement sera réalisé sur animal endormis par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 6 fois par semaine, pendant 4 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie gazeuse : 30secondes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur ou inflammation au point d’injection et un stress généré lors des injections ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application de l'allergène sur la peau ; iii) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application de l'allergène. iv) certains des animaux ont un sytème immunitaire réduit qui dans la nature leur serait défavorable, mais cela n'aura pas de répercution dans ce protocole car elles évolueront dans un milieu controlé et protégé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs peaux ( oreilles) et leurs ganglions. Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire et histologique.
Remplacement
Aucun test in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules qui initialement circulent dans le sang et qui migrent dans la peau suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. En effet, les expériences d'induction de poussée d'eczéma génèrent classiquement des réponses d'intensité variable chez les animaux, aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. En effet, le nombre d’animaux utilisés pourra diminuer en fonction des résultats obtenus . Par exemple, la totalité des procédures ne seront réalisées que si une dose définie en manip pilote permet de valider un modèle d'eczema allergique chronique tel que décrit dans la litterrature.
Raffinement
Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 6 fois par semaine. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non mais egalement pour éviter un risque de propagation de l'allergène qui pourrait entrainer des lésions d'eczema sur les pattes ou la face. Afin de limiter la douleur liée aux injections répétées, les souris seront injectées alternativement à gauche et à droite. Lors des injections, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mamelles des souris afin de ne pas les blesser. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans ce projet. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif allant jusqu'à entrainer l'apparition de plaies seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour étudier les maladies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes . Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de facteurs impliqués dans l'inflammation ou l'induction de populations spécifiques mémoires. Nous utiliserons des animaux adultes de 6 semaines à 8mois car ces animaux possédent un système immunitaire complètement mature. Nous avons choisi d'inclure des animaux de tous âges afin d’utiliser au mieux les animaux transgéniques qui seront disponibles et parce que nous savons, grâce à des expériences antérieures, que la réponse attendus chez des souris de 8 mois est comparable à celle observée chez des animaux plus jeunes.