Rongeurs

Un assemblage de biomatériaux est implanté chirurgicalement chez 54 rats sous anesthésie générale, et la moitié d'entre eux reçoit ensuite six séances d'irradiation réparties sur trois semaines. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur y attend des douleurs postopératoires, une dermatite radio-induite, des difficultés d'alimentation, de l'anxiété et de l'agressivité. Le texte annonce 54 animaux puis décrit la moitié du groupe comme "25 rats", écart que rien ne vient expliquer. Trois mois après la dernière intervention, tous sont tués et le dispositif retiré, les analyses d'intégration ne se faisant pas sur animal vivant.

Objectifs

La présente demande couvre une partie d’un large projet multidisciplinaire qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un fragment d’os du patient - en proposant un dispositif idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le succès de ce projet permettra donc d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du dispositif médical, et de la caractérisation des biomatériaux. Le dispositif médical mis au point sera constitué par un assemblage de 4 éléments distincts qui seront associés le jour de l’intervention. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité de cet assemblage en termes de capacité à s’intégrer avec ou sans radiothérapie. La tenue du dispositif médical post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. La biocompatibilité sera évaluée par analyse du tissu autour de l’implant dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure mise au point sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health », puis sur des patients atteints de cancers de la tête et du cou.

Bénéfices attendus

A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le dispositif médical mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du dispositif médical suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.

Procédures

Les 54 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes. La moitié des animaux (25 rats) sera ensuite irradiée 2 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 6 séances d’une heure maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience : 1. Douleurs post-opératoires qui seront prise en compte par une antalgie adaptée 2. Difficultés à l'alimentation 3. Infection du site opératoire 4. Mauvaise cicatrisation 5. Dermatite radio induite 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Cette étude vise à évaluer l’intégration d’un nouveau dispositif médical (DM) dans un de tissu irradié (modèle de radiothérapie). Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation. Il est nécessaire de vérifier la tolérance du biomatériau dans une étude préalable à l’utilisation chez l’Homme

Réduction

Le projet s’inscrit dans la démarche One Health (une seule santé). En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettent de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participant à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le protocole d’irradiation a été défini avec la société européenne d’oncologie vétérinaire .

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux,. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité.. De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes.

Tués à l'issue parce que les données d'élimination des composés n'arrivent que bien après la fin des expériences, 11 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des candidats médicaments par gavage, par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à trois fois par jour pendant dix semaines, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et des séjours de 48 heures en cage métabolique sans enrichissement. Le projet prévoit de tester 150 entités pour le compte du développement préclinique, en amont d'une première administration à l'être humain ou d'un médicament vétérinaire. Le porteur reconnaît que des tests in silico et in vitro prédisent déjà l'absorption et le métabolisme, avant de conclure que "seul un modèle animal" caractérise l'ensemble des paramètres.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme ou l‘animal. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme mais aussi dans le développement de médicaments vétérinaires, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Il est envisagé de tester 1500 candidats-médicaments sur la durée du Projet.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme ou à l’animal dans le cadre de médicaments vétérinaires.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie, sur une durée maximale de 10 semaines o Par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour, sur une durée maximale de 10 semaines • Prélèvements de sang : o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque transcutanée en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, tunnel et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 72h. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à un certain stress (manipulation non invasive de l'animal, administration orale, hébergement en cage individuelle ou en cage métabolique) ou à une douleur passagère liée au geste lui-même (injection de l'administration de type intraveineux, intramusculaire ou sous cutanée ou réalisation du prélèvements). Ces nuisances sont de niveau de gravité léger, à modéré par leur cumul. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme ou l’animal.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. Ce nombre est augmenté à 5 dans le cas d’administration topique qui présente plus de variabilité.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui assurent leur bien-être. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Quand un hébergement individuel est nécessaire pour les besoins des études,, ils seront hébergés dans des cages conformes à la réglementation, équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Une période d’habituation sera mise en place avant l'hébergement d'individuel pour permettre à l’animal de s’habituer à cet hébergement tout en maintenant les contacts visuels et olfactifs entre les animaux. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné, ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur, expérimenté pour les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques utilisées.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.

Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, encore affaibli par un traitement supplémentaire, pour que des cellules de leucémie humaine se développent dans leur corps. 1 945 d'entre elles reçoivent cette greffe puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles développent la maladie transplantée et sont toutes tuées à la fin, pour mesurer où en était la progression du cancer. L'établissement se présente comme prestataire de services et vend ces modèles à des laboratoires publics ou privés, une biobanque de leucémies humaines entretenue dans des corps de souris.

Objectifs

Les leucémies et maladies apparentées sont aujourd’hui le plus mortel des cancers du sang. Ces pathologies, en tout premier lieu les leucémies aiguës myéloblastiques, affectent 2,3 millions de personnes dans le monde et font partie des cancers les plus dévastateurs. Pour une incidence annuelle de 467.000 cas, les leucémies tuent environ 310.000 personnes chaque année. Le besoin médical insatisfait concernant les hémopathies est donc considérable. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de mettre en place une stratégie expérimentale qui permettra de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles molécules innovantes avec un fort potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouvelles molécules avec un fort potentiel thérapeutique à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-cancérologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules cancéreuses humaines (1 injection durant 2min / animal) puis subira des prélèvements sanguins (au maximum 8) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 14 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, une partie des animaux recevra l’injection de thérapies de référence de la pathologie dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du traitement (devenir du medicament après son administration dans l’organisme) choisi (au maximum 1 injection/jour/4semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une pathologie cancéreuse humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 8 espacés de 15 jours) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 procédures afin de pouvoir caractériser la progression de la pathologie développée.

Remplacement

La régulation de l’ensemble des mécanismes qui assurent la production continue et régulière des différentes cellules sanguines, que ce soit de façon normale ou pathologique, implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux et spécifiques à ces cellules. Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro . Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance des tissus voisins, du contexte immunitaire, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro. A l’inverse, sur le plan physiopathologique, la transplantation d’une leucémie se développant ensuite chez un animal présente des caractéristiques hautement similaires à celles de la pathologie humaine dont elle est issue, avec une complexité impossible à reproduire in vitro. Ainsi, le passage dans un modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettrait pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-cancéreuse ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir la mise en place et la caractérisation de modèles précliniques de pathologies malignes humaines. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. Les échantillons générés dans le cadre de ce projet seront, une fois leur caractérisation effectuée, rendu accessible à la communauté scientifique, sous conditions strictes inhérentes à l'origine et à l'utilisation des prélèvements d'origine humaine, au travers d’un consortium de 27 entités académiques françaises qui a pour but de favoriser le développement de nouvelles solutions thérapeutiques et diagnostiques destinées aux leucémies et maladies apparentées. Cette mutualisation au sein de la communauté scientifique française sera un moyen efficace de réduire globalement le nombre d'animaux rentrant en expérimentation puisqu'ainsi, il ne sera plus nécessaire à chaque laboratoire de générer ses propres modèles précliniques de ces pathologies.

Raffinement

Afin de réduire au minimum l’inconfort qui pourrait être ressenti par les souris qui ont un phénotype dommageable lié à leur système immunitaire déficient, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes (portoir ventilés, enceinte de change stérile, alimentation stérile, boisson acidifiée…). L’induction supplémentaire mais transitoire de leur déficience immunitaire nécessaire à la transplantation de cellules humaines sera compensée par une antibiothérapie préventive. Le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie volatile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines dont le système immunitaire est déficient constitue un avantage déterminant pour le développement de pathologies humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules cancéreuses humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

Privées de nourriture pendant vingt-quatre ou quarante-huit heures, soumises à différents régimes pendant quatre-vingt-dix jours, puis à un antibiotique dans l'eau de boisson et à un probiotique par voie orale, 1 700 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer une perte de poids, un affaiblissement et parfois une hypothermie, et que les antibiotiques peuvent donner des diarrhées passagères. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leurs tissus et leurs organes. Le projet cherche des composés qui miment les effets du jeûne pour déclencher l'autophagie, le bénéfice invoqué visant l'obésité et les maladies métaboliques qui toucheraient, selon le porteur, un quart de la population mondiale.

Objectifs

L’autophagie est un processus physiologique, très conservée au cours de l’évolution, qui régule l’homéostasie cellulaire. L’autophagie est un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies métaboliques, neurodégéneratives et cancers. La restriction calorique est un inducteur physiologique majeur de l’autophagie. Nous avons identifié et sélectionné in vitro des composés capables de mimer les effets biochimiques du jeûne, et qui sont capables, donc, d’induire l’autophagie. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les liens entre nutrition et santé sont de mieux en mieux connus, et le risque de développer de nombreuses maladies - cancer, maladies cardiovasculaires, obésité ou encore de diabète de type 2 – peut être réduit en suivant les recommandations nutritionnelles nationales. Ces résultats permettront d’identifier des nouvelles cibles pour les traitements des pathologies métaboliques et de l’obésité, qui affectent dans le monde environ le 25 pour cent de la population et qui deviennent des problématiques de santé significatives.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à un jeûne de 24h ou 48h. Une partie des animaux sera soumise à différents régimes pour 90 jours. Une partie des animaux sera soumise à des traitements administrés sur animal vigile (2 administrations au maximum en 48 heures, 2 minutes/animal). Une partie des animaux sera soumise (1 fois) à un traitement antibiotique via eau de boisson (pour 3 jours) et, la moitié de ces animaux (vigiles), recevra (1 fois par voie orale, 2 minutes/animal) l’administration d’un probiotique intestinale.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les régimes spéciaux peuvent induire une augmentation et/ou perte d’appétit et de poids. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeûne (pour 24h ou 48h) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. Le traitement avec des antibiotiques peut induire des diarrhées passagères.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du métabolisme systémique et la réponse à la modulation du microbiote intestinal.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1700 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 10 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes, etc). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Les mâles qui se battent seront hébergés individuellement. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Jusqu'à huit anesthésies par animal, une injection d'aiguilles dans le derme suivie d'une décharge électrique, et sept injections dans le péritoine : 433 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Les nuisances attendues sont les douleurs des injections, celles liées à l'électroporation et le stress des anesthésies répétées. Le modèle retenu est une souris à peau saine, le projet visant à comparer dix candidats à base d'ARN messager destinés à traiter chez l'humain des ulcères et des brûlures. Le porteur annonce des groupes de trois animaux pour la première partie et de cinq pour la seconde, sans rapporter ces effectifs au total de 433 déclaré.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle murin (non pathologique) d’administration par électroporation (micro choc éléctrique permettant au candidat de de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) de nos candidats médicaments pour le traitement des problèmes de peau, comme par exemple des ulcères, brulures, lésions de peau etc. puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse afin de sélectionner les meilleurs candidats. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection d’ARNm (=copie de l'ADN) pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d'injections seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion et du système immunitaire (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés).

Réduction

Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe (11 groupes de 3 animaux dans la première partie et 8 groupes de 5 animaux / constructions) permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non toxicité (sur peau reconstruite) des vecteurs d’intérêts, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « le plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation, est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des peptides (élimination plus ou moins rapide par l’organisme) Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié d'entre elles passant dix-huit mois sous régime gras avant d'être transportées vers un second établissement pour y subir jusqu'à six tests de comportement. Dans le premier site, elles sont pesées sept fois, injectées, gavées, prélevées à trois reprises, mesurées trois fois pour leur masse grasse et isolées quarante-huit heures en cage individuelle. Les tests portent sur l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices et les capacités physiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une avancée potentielle en connaissances et l'identification de cibles pour de futurs médicaments, quand la certitude porte sur dix-huit mois de régime imposé et sur la mise à mort finale pour analyse histologique.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d’évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal (degré modéré). La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux (degré léger). La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux à l'occasion des prélèvements (degré léger à modéré), ou de leur isolement dans certaines procédures (degré léger). La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements (degré léger), ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement (degré léger à modéré). D'autres nuisances sont la douleur à l'injection (degré modéré), lors des prélèvements (degré léger à modéré), ou à l'occasion de certains tests comportementaux (degré léger à modéré).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire (application d’un désinfectant et d’une pommade cicatrisante en cas des blessures superficielles sur la peau) , - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.