Rongeurs

290 rats et 290 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sédatés par inhalation puis piqués à répétition. Chaque animal reçoit une injection sous la peau, une dans le péritoine, une dans une veine de la queue couplée à un prélèvement de sang, et un gavage, tous de sérum physiologique. Ces gestes ne produisent aucune connaissance, ils alimentent une séance de travaux pratiques de quatre heures offerte chaque année à 96 étudiants de première année de BUT et à dix personnes extérieures. Aucun animal n'est tué ici, les rats partant ensuite vers des protocoles sans réveil ou des travaux pratiques hors procédure, et les souris vers des procédures légères à modérées. Le porteur écrit que le recours à l'animal vivant est "indispensable", tout en indiquant que les participants s'exercent d'abord sur des mannequins.

Objectifs

Les laboratoires de recherche privés ou académiques emploient de nombreux techniciens intervenant directement dans la mise en oeuvre de projets scientifiques utilisant des animaux vivants. Ces projets ont pour but d'améliorer à la fois nos connaissances mais aussi la santé humaine ou animale. L'objectif de ce projet est d'assurer les compétences des agents appliquant des procédures expérimentales sur rongeurs conformément à la directive 2010/63/UE et le décret du 1er février 2013 sur l'utilisation des animaux vivants en expérimentation animale. Dans le cadre du module de spécialisation rat-souris, 1 séance de travaux pratiques (4h) sera réalisée chez le rat et la souris vigile. La séance consistera à former les participants aux principales techniques faiblement invasives de préhension manuelle en vue d'administrations de sérum physiologique en mode sous cutané, intraperitonéal, intramusculaire, intraveineux, gavage et de prélèvement sanguin intraveineux (au niveau de la queue) . La règle des 3 R sera respectée sachant que des méthodes alternatives ne sont pas disponibles en remplacement des procédures faiblement invasives dont l'apprentissage sur animal est un requis fondamental dans ce type de formation. De plus le nombre d'animaux (1 rat et 1 souris par participant) a été reduit au minimum nécessaire et suffisant pour assurer un apprentissage de qualité et les compétences demandées. Afin de limiter les contraintes lors des manipulations les animaux seront préalablement sédatés facilitant ainsi les procédures. Ce projet concerne la formation chaque année de 96 étudiants du parcours BMB 1ère année du BUT Génie biologique nécessaire aux manipulations lors des TP inclus dans le programme national de la formation. Il concerne aussi la formation (pour applicateurs) de personnels extérieurs à l'IUT que l'établissement délivre chaque année (1 session) pour 10 participants.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre aux futurs applicateurs de procédures de maitriser (dans le cadre des 3Rs) les techniques d'administrations et prélévements peu invasifs sur rat ou souris vivantes.

Procédures

Les animaux subiront chacun une sédation qui pourra être suivie d'une injection intrapéritonéale de serum physiologique , d' une injection sous cutanée de serum physiologique, d'une injection intraveineuse de serum physiologique couplée à un prélèvement sanguin (veine de la queue). Ils recevront également une administration per os (gavage) de serum physiologique. Tous ces actes sont de tres courtes durées (quelques secondes à 1 minute maximum).

Impact sur les animaux

Chaque animal subira : - une sédation par inhalation gazeuse entrainant un stress léger de courte durée. - 1 piqure d'aiguille pour l'injection intrapéritonéale, entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 piqure pour l'injection sous cutanée entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 piqure pour l'injection/prélévement intraveineuse entrainant une douleur légère de courte durée. - 1 administration orale entrainant un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie à la fin de la procedure, et réutilisés , apres avis du vétérinaire référent, dans d'autres procedures d'autres projets dans le but de Réduire le nombre d'animaux des dits projets. Les animaux seront utilisés soit pour des experiences hors procedures ( mise à mort dans le but de prélevee des organes ou tissus) ou bien dans des projets avec procedures sans reveil pour les rats , et dans projets à procedures légéres à modérées pour les souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est ici adaptée. En effet, afin de former les personnels aux gestes techniques et expérimentation in vivo, le recours à l’animal vivant est indispensable. Les personnels impliqués directement dans l’expérimentation animale in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques pratiques de base de l’expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation de niveau applicateur agréée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE. Il est à noter que préalablement à la procédure d'administration/prélèvements sur animaux vivants, les participants seront formés aux gestes sur des mannequins (rat souris).

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum ( 1 rat + 1 souris par participant) tout en restant dans des limites pédagogiques efficaces pour la formation et l’acquisition des compétences dans le cadre de la formation spécifique des personnels appliquant les procedures expérimentales sur animaux vivants. De plus ces animaux seront réutilisés ce qui contribue à une réduction a posteriori du nombre d'animaux dans d'autres projets (du BUT). En effet Les rats seront re-utilisés plus tard pour une utilisation dans les travaux pratiques hors procédures (mise à mort en vue de prelever organe), ou dans des procedures sans reveil d'autre projets. Les souris pourront être re-utilisées dans des travaux pratiques ultérieurs avec procedures légères à modérées d'un projet autorisé pour le parcours de 2eme année BUT.

Raffinement

Afin de favoriser au maximum le bien être de l'animal ( limiter les nuisances , la douleur, le stress,...) pour les animaux mais également pour assurer l'apprentissage des gestes des participants, différentes actions sont mises en place. Pour ce faire, une periode d'habituation de quelques heures à la salle /poste de manipulations pour les animaux est sytématiquement respectée. Les animaux sont préalablament sédatés (inhalation de courte durée de gaz anesthésiant) avant la pratique des différentes administrations. De plus les participants ont pu simuler sur mannequins les différentes opérations ce qui optimise leur apprentissage sur animaux vivants. Les caractéristiques du matériel (aiguilles sondes) sont adaptées à l'espece rat ou souris afin de garantir la résussite de l'acte en limitant la douleur ( considérée comme légère pour une administration) ou le risque physiologique (volume d'injection ou de prélévement et intervalles de temps suffisant entre chaque administration). La substance injectée (serum physiologique) est à pH controlé (selon les règles d'utilisations des médicaments). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard (cage enrichies ) mais beneficient en plus d'une game room en dehors des manipulations. Cette game est un espace de jeu pour les rat ou souris qui leur permet ,en groupe , d'interagir avec différents objets ( tunnels, boites à trous, grelots hamacs ...), en dehors de leurs cages, et ce pendant 1h par jour (2 à 3 fois par semaine). La methode d'administration volontaire par le rat ou la souris via micropipette (solution appétante) est utilisée en vue d'une substition à la methode de gavage.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les animaux modèles les plus utilisés dans l’expérimentation in vivo pour les études en pharmacologie ou en physiologie Animaux adultes pour faciliter les manipulations.

Soumises à une ou deux injections d'une substance qui déclenche une réaction inflammatoire, puis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie, 1 720 souris vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La substance peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine et des dysfonctionnements rénaux et hépatiques, le geste d'injection pouvant lui-même provoquer ulcération, induration et crampes abdominales. L'objet déclaré est de montrer que des candidats médicaments développés au laboratoire bloquent le récepteur TLR4, en vue de traiter des maladies inflammatoires chroniques comme celles de l'intestin ou de la peau. Le porteur indique que ces candidats ont été testés au préalable sur des cellules pour s'assurer de leur non-toxicité, puis reconnaît ne pas pouvoir exclure une toxicité chez la souris, ces travaux étant les premiers menés sur des animaux.

Objectifs

L’inflammation est une réponse de l’organisme face à une menace d’origine exterieure ou intérieure. Il s’agit d’une réaction transitoire mais peut dans certains cas, durer des mois ou des années et donner lieu à une inflammation dit chronique. Dans le cas des maladies inflammatoires dites chroniques, la balance entre l’inflammation et la reconstitution d’une équilibre immunologique est perturbée et peut conduire à des réactions disproportionées de l’organisme. Les traitements actuels sont insuffisants ou inexistants dans certains cas, ce qui rend difficile la prise en charge des patients et impacte leur qualité de vie. De nouvelles cibles sont en cours d’étude pour agir sur la réponse inflammatoire exagérée liée à l’activation de l’inflammation via les facteurs microbiens ou endogènes. Il a été montré que le récépteur TLR4 est impliqué dans le déclenchement de la réponse inflammatoire et au développement de ces maladies inflammatoires chroniques. Les études menées dans le cadre de ce projet s’appuyent sur le ciblage et l’interaction de ce récepteur avec les candidats médicaments développés dans notre laboratoire pour leur effet anti-inflammatoire. Ce projet repose sur deux objectifs. Le premier objectif est de reproduire chez l’animal un contexte inflammatoire similaire à ce qu’il se passe chez l’homme. L’inflammation est induite chez la souris par l’administration d’un produit qui va agir spécifiquement sur ce récepteur TLR4 et déclencher ainsi une réponse inflammatoire. Le second objectif est de démontrer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments administrés chez ce même animal pour lequel l’inflammation a été provoquée. Les candidats médicaments vont reconnaitre spécifiquement le récepteur comme cible sur laquelle agir. L’interaction entre le candidat et la cible permettra de bloquer la réponse inflammatoire et inhiber ainsi les symptômes qui y sont liés. La finalité de ce projet est de démontrer l’efficacité de candidats médicaments ayant une action anti-inflammatoire afin de proposer un nouveau traitement et améliorer la prise en charge des patients atteints de ces maladies inflammatoires chroniques telles que Crohn, Alzheimer, maladies inflammatoires de la peau. Les modifications dans les voies d'administration et de prélèvement nécessitent une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels permettent de soulager les symptômes mais ne permettent pas de traiter l’origine de la maladie. Démontrer l’efficacité de ces candidats médicaments nous permettrait de proposer un traitement de fond avec une nouvelle stratégie qui se focalise davantage sur les mécanismes qui favorisent l’inflammation que sur les symptômes uniquement. Ce nouveau médicament pourrait être envisagé seul ou en combinaison avec d’autres traitement existants pour améliorer le potentiel thérapeutique et assurer une meilleur prise en charge et qualité de vie des patients sur le long terme. De plus l’utilisation de ce médicament pourrait être envisagée dans différentes applications cliniques car le mécanisme ciblé dans ce projet provoquant le développement de la réponse inflammatoire, se retrouve dans beaucoup de maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de substance espacées d'une minute à minima. Les animaux resteront vigiles ou seront anesthésiés selon le mode d’administration (modification) utilisé. Un prélèvement de sang terminal (modification) est prévu chez tous les animaux et sera effectué sur animal anesthésié. Cette intervention durera cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances dues au geste technique au moment de l’injection sont également à prendre en compte : ulcération, induration, crampes abdominales. La substance inflammatoire peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine ainsi que des dysfonctionnements rénaux et hépatiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés au préalable sur des cellules avant de lancer des études chez l’animal pour vérifier la non toxicité et les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Néanmoins, aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la réponse inflammatoire à l’échelle de l’organisme. La réponse inflammatoire entraîne la libération de molécules qui vont diffuser à travers la circulation jusqu’à atteindre différents organes et provoquer des lésions notamment au niveau du foie, reins, thymus, rate, poumons. Ces interactions ne peuvent pas être modélisées par une méthode alternative et nécessitent de réaliser des études chez l’animal sur lequel on a reproduit la réaction inflammatoire afin d’obtenir des symptômes similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique ayant déjà utilisées ce modèle d’étude. Néanmoins les paramètres expérimentaux utilisés pour mettre en place le modèle sont variables d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Dans cette étude, nous étudierons la réponse inflammatoire au cours du temps et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et cinq points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon 4 doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.

Raffinement

L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de deux semaines est prévue à l’arrivée des animaux incluant une phase d’habituation à la contention pour limiter le stress de l’animal avant une injection. Le recours à une anesthésie préalable pourra être réalisée selon le mode d'administration utilisé. Un suivi quotidien sera effectué pour évaluer l’état de l’animal et l’apparition d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur ces observations permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.

Choix des espèces

La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle inflammatoire aigu, notamment dans la phase précoce. Cette réponse inflammatoire se traduit par des phénomènes physiologiques similaires à ceux observés lors de la phase inflammatoire induite après une infection chez l’homme : taux élevé et précoce de cytokines pro-inflammatoires, baisse de la pression sanguine, modification de la fréquence cardiaque, et dysfonctionnements des organes périphériques. Les phénomènes physiologiques observés chez la souris sont autant d’indicateurs pour corréler les bénéfices obtenus chez l’animal à ceux que l’on pourrait obtenir chez l’homme. Cette espèce permet de développer un modèle efficace dans la phase précoce de l’inflammation et de le proposer comme un outil permettant d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Il s’agira de souris adulte afin d’inclure dans ce projet des animaux possédant un système immunitaire mature.

1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

Aucun animal porteur du phénotype dommageable n'est gardé au-delà de vingt semaines, et tout individu atteignant un point limite est tué aussitôt. 2 880 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignées à inflammation chronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Le phénotype produit une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires, et les souris qui ne l'expriment pas rejoignent les groupes témoins. L'élevage alimente un projet sur le métabolisme des lipides dans le syndrome d'Aicardi-Goutières, et le porteur écrit que les animaux développeront une inflammation chronique vers vingt semaines tout en affirmant que les conditions d'élevage seront adaptées pour qu'ils ne développent pas de symptômes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Les animaux développeront aux alentours de 20 semaines d'âge une inflammation chronique liée à leur phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Pour savoir si la réparation de l'ADN dans les neurones commande la mémoire et si elle peut être ciblée contre la maladie d'Alzheimer, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever des organes et alimenter une biobanque. 1 152 d'entre elles subissent une chirurgie cérébrale de moins de 40 minutes, 360 une infection chronique dont la phase d'invasion provoque un syndrome fébrile de sept jours, et 216 des injections hebdomadaires pendant treize semaines. Toutes passent des tests cognitifs sur quinze jours, dont un labyrinthe de Barnes qui impose un hébergement individuel, et le porteur fixe la mise à mort à deux signes de souffrance parmi perte de poids supérieure à 20 %, déshydratation, léthargie et absence de toilettage. Les bénéfices annoncés restent de l'ordre de "mieux cerner la stratégie thérapeutique de demain", quand la fièvre, les chirurgies et l'isolement sont déjà programmés.

Objectifs

Des modifications épigénétiques notamment liées aux dommages causés à l'ADN jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les dommages sont transitoires et efficacement réparés par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de ces processus épigénétiques, qui aboutissent à leur signalisation chronique contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer (AD), ainsi qu'au cours d'infections. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection ou de la réparation des dommages dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans le processus de neurodégénérescence liée à l'AD. L'étude utilisera un modèle trangénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et l'infection subclinique ou l'expression combinée avec un modèle transgénique permettant de modifier le processus épigénétique dans des régions cérébrales d'intérêt.

Bénéfices attendus

Comprendre l'impact d'infections latentes communes (de seroprevalence 30-70% chez l'humain et qui augmente avec l'âge) sur la réponse au traitement contre la maladie d'Alzheimer est un enjeu clé pour mieux définir les stratégies thérapeutiques futures. Comprendre par quels mécanismes le senseur épigénétique contribue au processus mnésiques et à leurs altérations et évaluer par preuve de concept son potentiel thérapeutique contre la maladie d'Alzheimer permettront de mieux cerner ensuite la stratégie thérapeutique de demain concernant sa manipulation.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections répétées hebdomadairement pendant 13 semaines, sur animaux vigiles (216 souris, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection de l'agent infectieux, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (360 souris, une injection de quelques secondes); iii) un type de chirurgies sous anesthésie générale de moins de 40 minutes par animal ( 1152 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1368), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), test d'apprentissage et de mémoire spatiale (chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), v)un prélèvement sanguin à la veine caudale pour test sérologique (360 animaux, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les 1368 souris seront euthanasiées par anesthésie profonde et irréversible, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux dommages de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. De plus, seule l'utilisation de l'animal permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires lors d'infection et de 12 dans le groupe non infecté. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe pour obtenir des résultats interprêtables.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. Les souris sont préalablement familiarisées avec le gel diet dans les jours précédant une chirurgie ou l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Les chirurgies seront menées sous anesthésie générale accompagnée d'une analgésie opiacée en périopératoire et maintenue pendant 48h en post-opératoire. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids) . Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatés à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les test ne requièrent que mobilité, exploration d'objets.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel de l'agent infectieux que nous étudions, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques de la réponse aux dommages dans l'ADN des neurones dans le cadre d’une infection pertinente. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés ( modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux pour ces modifications géniques n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

73 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur animal vigile, chacune subit quatre prises de sang, quatre pesées, deux ou trois instillations nasales et parfois une ou deux injections intradermiques, certaines étant identifiées au poinçon à l'oreille. Le vaccin testé vise les bovins, chez qui la besnoitiose provoque infertilité, atteintes cutanées et jusqu'à 10 % de mortalité dans les troupeaux, et le porteur reconnaît qu'aucun modèle animal, bovins compris, ne reproduit la maladie. Pour le remplacement, il écrit en une phrase qu'aucun modèle ne reproduit la complexité du système immunitaire.

Objectifs

La besnoitiose, causée par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), représente une menace significative pour l’élevage bovin. Cette maladie entraîne des conséquences graves telles que l’infertilité, des atteintes cutanées, une perte de poids et une mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau peuvent être transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’application d’insecticides. Le développement d’un vaccin efficace offrirait aux éleveurs une meilleure stratégie de contrôle de cette maladie. Le but de ce projet est d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité d’un vaccin sous-unitaire à administration nasale et dermique contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitué de protéines et de glycolipides de B. besnoiti associés à un muco-excipient à base d’amidon. Les souris seront immunisées par voie nasale seule ou par voie nasale puis par voie intradermique afin de déterminer la meilleure stratégie d’administration pour déclencher une réponse immunitaire optimale, tant systémique que locale (cutanée). En effet, la voie nasale d’administration du vaccin devrait déclencher une réponse immunitaire muqueuse, notamment du système respiratoire et de l’intestin, permettant une protection contre une infection orale. Cependant, il n’est pas certain que cette voie d’administration déclenche une réponse immunitaire protectrice contre une infection cutanée. Dans ce cas, une administration intradermique pourrait être nécessaire. Au total, 73 souris adultes seront nécessaires. Puisque le remplacement par des méthodes in vitro n'est pas envisageable en raison de la complexité du système immunitaire et de la nécessité d'étudier l'ensemble de ses réponses, le nombre de souris a été réduit au minimum requis pour obtenir des résultats significatifs. Les souris seront hébergées conformément aux directives européennes, avec un enrichissement (cachette, matériaux à ronger, renforcement positif alimentaire). Toute médication interférant avec la réponse immunitaire est proscrite.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise en évidence du développement d’une immunité protectrice contre Besnoitia besnoiti associée à un effet protecteur contre une infection par le parasite. Ces résultats sont essentiels pour envisager une vaccination de bovins, cibles du vaccin anti-besnoitiose.

Procédures

Les animaux vigiles subiront 4 prises de sang et 4 pesées à 2 semaines d’intervalle et recevront 2 ou 3 instillations par voie nasale à 2 semaines d’intervalle. Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 administrations intradermiques à deux semaines d’intervalle et certains animaux seront identifiés une fois à l'oreille. Chacune de ces interventions dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire pour les administrations nasales et intradermiques ainsi que pour les prises de sang peut engendrer du stress. L’identification des animaux par poinçon à l’oreille peut entrainer une douleur locale temporaire. Les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur localisée temporaire. L’injection intradermique peut entrainer une douleur locale temporaire. L’administration du vaccin peut entraîner une inflammation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d'étudier les réponses immunitaires cellulaires induites par les différentes formulations vaccinales, de déterminer la capacité du parasite à se multiplier in vivo et de déterminer la protection induite par la vaccination en terme de réduction de la charge parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience acquise sur des projets de vaccination contre des parasites de la même famille. Les analyses statistiques seront faites sur les dosages des molécules produites par les cellules du système immunitaire et sur le nombre de parasites.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés à raison de 4 maximum par cage, dans un environnement enrichi permanent (de type igloo pour se cacher) ou ponctuel (de type carré en cellulose pouvant être dépouillé pour la confection d’un nid) après chaque procédure. Une habituation à la prise en main sera réalisée avant le début du protocole. Un renforcement positif sous forme de récompense alimentaire (par exemple : rondelle de banane séchée, popcorn…) sera appliqué après chaque utilisation d’aiguille. Les responsables du projet ont l’habitude de pratiquer les procédures mises en place. Des points limites sont déterminés en vue de mettre fin à d'éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les rares essais d’infection expérimentale par Besnoitia besnoiti sont peu concluants puisqu’aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie. De plus, le parasite n’est pas détecté chez tous les individus infectés lors d’une même expérience. Le choix de la souris peut se justifier par le fait que Besnoitia besnoiti a déjà été détecté chez la souris sauvage, que les parasites ont été localisés dans la cavité péritonéale et les organes internes après infection intrapéritonéale de souris et que les parasites présentaient la même morphologie chez des souris expérimentalement infectées que chez des bovins naturellement infectés. Animaux adultes. Cette expérience ne nécessite pas un stade de développement particulier.