Rongeurs

Mutées pour le récepteur des œstrogènes, une partie des 120 souris de ce projet présente déjà un excès d'androgènes et une fonction ovarienne perturbée, à l'image du syndrome des ovaires polykystiques humain. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs ovaires sont échangés par chirurgie avec ceux de souris témoins, en cinq minutes par animal, puis un accouplement est imposé un mois après la greffe pour voir si un ovaire devenu non fonctionnel peut mener une gestation. Le porteur décrit une douleur prise en charge par un analgésique morphinique local et n'annonce aucun autre effet indésirable, les femelles étant tuées en fin de procédure pour prélèvement de l'utérus et des ovaires.

Objectifs

La prévalence des problèmes d'infertilité féminine et du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez les femmes en âge de procréer varie entre 6 et 20 %, selon les critères de diagnostic utilisés. Plusieurs facteurs interdépendants, tels que l'excès d'androgènes, l'hypersécrétion de l'hormone lutéinisante (LH), des anomalies dans la sécrétion de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et la résistance à l'insuline, contribuent à la variabilité des manifestations cliniques du SOPK. Ces caractéristiques sont observées chez des souris mutées pour le récepteur des œstrogènes. Le projet vise principalement à étudier le rôle des mutations du récepteur des œstrogènes dans le contrôle de la fertilité. Dans ce but, nous remplacerons les ovaires des souris contrôles par les ovaires de souris mutés pour le récepteur des oestrogènes, et vice versa. Un mois après la greffe, nous analyserons i) les taux hormonauxcirculants dans le sérum de ces souris et ii) la fonction ovarienne par une analyse anatomopathologique. Enfin, après avoir réalisé des accouplements contrôlés de ces souris greffées, nous déterminerons si ces ovaires greffées non fonctionnels retrouvent leur fonction et permettent de mener à bien une gestation. Nous suivrons ainsi la prise de poids de ces souris et analyserons la gestation en observant le nombre de bébés nés et éventuellement le nombre de fœtus implantés et les résorptions. Des souris intactes serviront de contrôles pour ces expériences.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d'étudier l'impact des mutations du récepteur des oestrogènes dans le syndrome des ovaires polykystiques et de différentier les actions respectives des oestrogènes dans l'ovaire et dans l'hypothalamus. A terme, ceci permettra de mieux comprendre la physiopathologie des troubles de la fonction ovarienne conduisant à l'infertilité dans le syndrome des ovaires polykystiques,

Procédures

Les greffe d'ovaires sont réalisées pendant 5minutes par souris avec observation quotidienne pendant 1 semaine. Un accouplement contrôlé des souris est réalisé après un mois de greffe.

Impact sur les animaux

Les greffes d'ovaires peuvent générer une douleur dûe à la chirurgie mais qui sera traitée par un analgésique injecté en sous-cutané avant et après la chirurgie, un analgésique local et pris en compte par une surveillance accrue de l'animal par le zootechnicien, avec enrichissement du milieu et chirurgie sur plaque chauffante.

Devenir

Tous les animaux sont à mis mort en fin de procédure afin de prélever les différents tissus : utérus, ovaires pour études biomoléculaires et analyses histologiques.

Remplacement

Les effets des œstrogènes, principalement synthétisés par les ovaires, impliquent de nombreuses fonctions dans l’organisme. Ces effets complexes ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. De plus, l'étude de la fertilité, y compris la gestation et la lactation, nécessite l'observation sur animaux vivants. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est indispensable dans ce contexte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous utiliserons principalement les femelles, étant donné que cette recherche concerne la fertilité. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum nécessaire, sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé pour assurer des résultats statistiquement significatifs, permettant de distinguer les effets du génotype, du temps et/ou du traitement. Le nombre de souris a été déterminé en utilisant généralement un test statistique, afin de préciser l'effet des variables étudiées.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris adulte car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation.

2 280 rats vont être utilisés, chacun porteur d'un cathéter implanté dans la veine fémorale ou jugulaire, avec jusqu'à trois administrations par jour pendant quatre semaines, six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, privés d'eau. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, pour rechercher dans leurs organes les cibles de la toxicité des molécules testées. Une partie d'entre eux est hébergée seule, de l'implantation à la fin du traitement, quand le cathéter oblige à poser un harnais qu'un congénère abîmerait. Ces essais interviennent en amont des études réglementaires, pour trier les candidats médicaments d'une recherche pharmaceutique privée avant les tests obligatoires, plus consommateurs d'animaux.

Objectifs

L’objectif de la Recherche et Développement (R&D) Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace et engendre le moins de toxicité possible. Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans ce projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place conformément à la réglementation. Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (marge de dose permettant une efficacité et absence de toxicité). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet concernent des candidats médicaments dont l’administration sera réalisée par administration intraveineuse chez le Rat via un cathéter implanté dans un vaisseau de large diamètre tel que la veine fémorale ou jugulaire (mimant l’administration chez l’Homme, ce qui diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre et permettant des administrations répétées et/ou sur une longue durée sans aucune contention de l’animal). Elles interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (modèles cellulaires de neurotoxicité, d’hépatotoxicité, de cardiotoxicité...) et in silico (analyse informatique de la génotoxicité). Ces études sont réalisées chez le Rat (présentant une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et étant considéré comme le plus prédictif en toxicologie) en utilisant les candidats médicaments les plus prometteurs mais également les composés autres que le principe actif du candidat médicament qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité s’ils n’étaient pas encore établis.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et du développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet de recherche) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires et d’évaluation pharmacologique qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi d’optimiser les études et de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament dans le cadre d’administrations via un cathéter. Les deux procédures de ce projet (et associées aux informations fournies par les études de pharmacologie) permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique donné.

Procédures

L’ensemble des animaux inclus dans ce projet pourront être soumis : - A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés via le cathéter (de quelques minutes jusqu’ à perfusion de 4 heures maximum) - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie (administration unique de quelques secondes) - A des prélèvements de sang en prélevant une faible quantité de sang prélevée à la veine marginale externe de la patte ou veine caudale sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude (30 secondes par prélèvement environ) - A des prélèvements via le cathéter dédié de courte durée et maximum 6 fois par jour à ces prélèvements si besoin de quantités répétées plus importantes - A des recueils urinaires d’une durée comprise entre 6h (cas standard) et 16 heures (cas exceptionnel) en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) avec diète hydrique d’une durée correspondant à celle du recueil (6h en standard et 16h maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère (en dessous du seuil réglementaire) au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • L’administration via le cathéter nécessite une contention douce quel que soit le système utilisé (VAB ou VAH) et le placement de l’animal dans une cage dédiée au traitement – Traitement hebdomadaire à une fois par jour pendant 4 semaines maximum – Durée de quelques minutes à plusieurs heures – Degré de sévérité modéré • Hébergement individuel : le cathéter implanté peut nécessiter la mise en place d’un harnais de protection sur l’animal. L’utilisation de ce système appelé VAH (Vascular Access Harness), qui sera limitée à son maximum, et mise en place seulement si le système VAB (Vascular Access Button) ne peut pas être utilisé, nécessite une stabulation individuelle des animaux de l’implantation jusqu’à la fin de la période de traitement puis du maintien des animaux (afin d’éviter la dégradation du dispositif par un congénère) ce qui peut générer un stress pour l’animal – Degré de sévérité modéré • Prélèvements de sang à la veine marginale externe de la patte ou à la veine de la queue : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré). Placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux dans le cas d’un prélèvement à la veine de la queue (5 minutes – degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cage à métabolisme) : Le changement d’environnement et l’hébergement individuel de courte durée (6h en prélèvement diurne en standard, exceptionnellement prélèvement nocturne inférieur à 16h, cas qui devra être justifié par le demandeur) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal – 1 seule fois par étude (Degré de sévérité léger) • Administrations sous-cutanées (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, le poids corporel par exemple).

Devenir

Tous les animaux de la procédure ayant reçu une administration de candidat médicament (ou de formulation/véhicule) seront euthanasiés pour prélèvements et examens divers (histologie, toxicogénomique, etc…) puisqu’un des objectifs est de rechercher les organes cibles potentiels. Si les animaux cathétérisés venaient à ne pas être utilisés dans le cadre de ce projet ils seront euthanasiés pour prélèvement d’organes ou de fluides et mise au point (histologie, biologie clinique, études vitro par exemple).

Remplacement

Ce projet couvre la réalisation d’études très précoces réalisées sur l’ensemble des candidats médicaments de notre recherche (intervenant en complément d’autres études de sécurité non clinique décrites dans d’autres projets, et mises en place seulement si nécessité d’utilisation de cathéters pré-implantés des administrations centrales longues ou des composés non tolérés quand administrés par voie périphérique telle que la veine de la queue), études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo.

Réduction

Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel de rats (2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace pour atteindre les objectifs des procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus réduit possible (nombre éprouvé basé sur une solide expérience en interne et sur les recommandations de la littérature). Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer principalement la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer ou d’infirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives. Elles sont mises en place précocement et profitent des informations des études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et recherche du mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un nombre d’animaux plus important. Elles permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact en termes de bien-être pour les animaux. Un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporels, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour cinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, et à son issue prélèvements d’organes …) réduisant aussi le nombre de rats nécessaire dans chaque procédure. En cas de protocole particulier (ex besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques sera sollicité pour définir le design expérimental le plus optimal. Enfin, l’utilisation du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale externe de la patte ou à la veine caudale) peu invasive, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre de rats (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant la volémie physiologique.

Raffinement

L’utilisation du cathéter pour l’administration Intraveineuse permet de réaliser les administrations uniques ou réitérées des substances étudiées sans contention de l’animal contrairement à une administration intraveineuse périphérique. De plus l’administration via un cathéter dans un vaisseau de gros calibre diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre. L’une des voies d’accès au cathéter à l’extérieur de l’animal consiste en un harnais de protection du cathéter, réglé tous les jours pour s’adapter à la croissance du rat (impliquant une manipulation régulière du rat). La présence de ce harnais nécessite néanmoins l’hébergement individuel et nous privilégierons donc, une nouvelle voie d’accès au cathéter consistant en un bouton transcutané (permet l’hébergement collectif et donc un raffinement important). Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable d’étude, la Structure en charge du Bien-être animal (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase de traitement ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat qui est mise en place rapidement. Le personnel technique formé interagit tous les jours avec les animaux (manipulation) pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les prélèvements de sang, la technique de prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale externe de la patte est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique, de respecter la volémie physiologique du rat et d’améliorer ses conditions de manipulation. La durée du recueil urinaire est limitée, réalisée en standard en journée sur une durée de 6h ou exceptionnellement sur une période nocturne

Choix des espèces

Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Un inhibiteur de la protéine HSPB5 développé par le laboratoire comme candidat médicament contre la fibrose pulmonaire motive l'utilisation de 1 040 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dose de bléomycine leur est administrée en trente secondes par aspiration au fond de la gorge sous anesthésie, ce qui déclenche entre le deuxième et le septième jour une inflammation des poumons, une perte de poids et des troubles respiratoires, puis une fibrose progressive. Le porteur justifie un effectif supérieur aux usages du domaine par la quantité de vésicules extracellulaires qu'il doit obtenir des animaux pour les injecter à d'autres souris. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude d'un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.

Objectifs

Les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont une accumulation de vésicules, appelées vésicules extracellulaires (EVs). . Ces vésicules aggravent la maladie de ces patients en transportant des molécules actives (protéines, ADN etc). .Si on inhibe la machine des cellules pour incorporer ces molécules actives dans ces EVs, on réduit la progression de la fibrose dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition de la protéine de stress HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Les objectifs de ce projet sont de : 1) Confirmer que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion des EVs 2) Tester si l’absence d’HSPB5 réduit l’activité des EVs pour aggraver la fibrose.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire développe des inhibiteurs de la protéine de stress HSPB5 comme un médicament dans la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Nous devons mieux comprendre les rôles d’HSPB5 pour développer notre médicament et permettre une meilleure prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire.

Procédures

Les souris seront soumises à une administration unique de bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale (isoflurane). Cette intervention dure 30 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine est le modèle le plus utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose. Les souris sont exposées à la bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale. Le modèle est composé d’une étape inflammatoire puis d’une fibrose pulmonaire progressive. Entre 2 et 7 jours après bléomycine, un phénomène inflammatoire se met en place. Il est associé à une perte de poids des animaux, ce qui peut entrainer des troubles respiratoires plus ou moins importants suivant la dose injectée. Pour ce projet, une faible dose de bléomycine sera utilisée. Cette dose permettra de réduire au maximum l’apparition potentielle d’effets indésirables induits chez l’animal, et entrainera une fibrose pulmonaire détectable.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Pour la procédure 2, une analyse de puissance a été réalisée pour établir les effectifs. Pour la procédure 1, les effectifs décrits sont supérieurs au nombre d’animaux utilisés classiquement. Ceci est expliqué par le nombre d’EVs que nous devons produire pour les injections décrites en partie 2 et par les contraintes statistiques associées aux études biochimiques et histologiques (méthodes indispensables à notre projet). Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au centre de zootechnie de l’université de Bourgogne. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane). Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, l’utilisation de souris offre l’avantage de pouvoir travailler sur des modèles génétiquement modifiés. Dans ce projet nous utiliserons des souris délétées pour le gène Hspb5. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, la toxicité de la bléomycine est d’autant plus importante et rapide que les souris sont petites. Pour minimiser les signes de toxicité aigüe de la bléomycine, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.

Des rates gestantes boivent chaque jour une eau additionnée de pesticides organophosphorés ou subissent une exposition quotidienne au bruit, puis l'audition de leurs 294 petits est testée à 21 jours, 3 mois et 6 mois. En parallèle, 90 souris porteuses d'une mutation responsable d'atrophie optique dominante reçoivent une injection dans l'oreille interne, et 45 autres, exposées à un bruit du niveau de ceux rencontrés au travail, reçoivent des injections à travers le tympan. 478 animaux au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur attendant chez les rates gestantes de l'agitation, une baisse d'activité et moins d'interactions sociales. Tous sont tués après les derniers tests, leurs cochlées prélevées.

Objectifs

La surdité représente un enjeu majeur de santé publique, avec des causes multiples telles que des facteurs génétiques, l'exposition au bruit, certains médicaments ototoxiques et le vieillissement. À ce jour, les mécanismes exacts responsables de ces pertes auditives demeurent insuffisamment compris, et aucun traitement curatif n'est disponible. Notre recherche se concentre sur trois axes principaux : 1. Développement de thérapies géniques : Nous utilisons un modèle murin simulant la maladie héréditaire d'Atrophie Optique Dominante, qui entraîne une déficience auditive ou visuelle progressive, liée à l’âge à partir de six mois, en comparaison avec les souris témoins. Nous explorons différentes stratégies visant à ralentir ou stopper l'apparition de la déficience auditive chez ces souris. 2. Utilisation des nanoparticules pour le transport de molécules thérapeutiques dans les cellules de l'oreille interne : Cette approche a pour objectif de favoriser la régénération des fibres nerveuses auditives chez des souris adultes ayant subi des lésions auditives dues à un traumatisme sonore. 3. Étude de l'impact de l'exposition au bruit et aux polluants environnementaux chez les rates gestantes : Nous investiguons les effets de ces expositions pendant la gestation sur l'audition des rats descendants.

Bénéfices attendus

Les implications cliniques, sociales et économiques de ce projet sont importantes. Le développement réussi d’une nouvelle technique innovante basée sur la thérapie génique pourrait être appliqué aux patients, offrant ainsi un nouvel espoir aux personnes souffrant d’atrophie optique dominante. Nous savons aujourd’hui que les synapses reliant les fibres nerveuses auditives aux cellules sensorielles de l'oreille interne sont particulièrement vulnérables aux effets du bruit, du vieillissement ou des substances ototoxiques. En démontrant qu’il est possible de traiter ces lésions précoces, nous pourrions proposer des solutions thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes âgées et favoriser un vieillissement en meilleure santé. Enfin, il n'existe actuellement aucune législation européenne encadrant les risques d'exposition au bruit ou aux polluants sur l'audition du fœtus pendant la grossesse. Nos résultats obtenus de ce projet fourniront des données précieuses sur les troubles auditifs chez les descendants dont les mères ont été exposées au bruit ou aux polluants pendant la grossesse.

Procédures

1. Injection de molécules thérapeutiques génétiques dans l'oreille interne est une technique maîtrisée par notre équipe. Cette intervention, qui durera entre 10 et 20 minutes, nous permettra d'explorer différentes stratégies génétiques pour ralentir ou stopper les troubles auditifs (comme les bourdonnements d’oreille ou les difficultés à comprendre dans un environnement bruyant) causés par une mutation du gène . Pour mener à bien ces tests, nous aurons besoin de 90 souris présentant cette mutation. 2. Injection de traitements pharmacologiques pour traiter les troubles auditifs. Nous allons effectuer des injections intra-tympaniques de molécules thérapeutiques pharmacologiques chez des souris ayant subi des lésions nerveuses auditives, provoquées par une exposition à des bruits fréquemment rencontrés sur les lieux de travail. Cette injection durera environ 5 minutes. Pour cette étude, nous avons besoin de 45 souris exposées à ces bruits. 3. Effets du bruit et des pesticides sur les rats gestants: Des rates gestantes de 5 mois seront exposées quotidiennement à du bruit environnemental ou à des pesticides organophosphorés (dissous dans l’eau de boisson). Ces facteurs de pollution sont courants dans notre environnement quotidien. Nous évaluerons l’audition de leurs petits à l'âge de 21 jours, 3 mois et 6 mois, en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Pour cette étude, nous avons besoin de 49 rates gestantes. Nous estimons obtenir environ 294 descendants. À la fin de chaque expérience, après les tests auditifs finaux (soit 6 mois après le traitement, soit 6 mois après la naissance), les animaux seront euthanasiés, et leurs cochlées seront prélevées pour des analyses morphologiques et immunocytologiques.

Impact sur les animaux

Lors de l’intervention chirurgicale pour l’administration locale de traitements dans la cochlée, les animaux pourraient éprouver une douleur modérée pendant leur réveil et durant les 12 heures suivant l’opération. Pendant les tests fonctionnels, une douleur légère pourrait être observée en raison de l'injection d'un médicament destiné à endormir l'animal. Selon les données publiées dans la littérature, aucune douleur ni perte de poids n'ont été observées chez les rates gestantes exposées aux doses autorisées de pesticides dans l'eau potable . Cependant, bien que le bruit utilisé dans cette expérience soit un bruit à un niveau conforme aux normes autorisées, il pourrait tout de même influencer la physiologie et le comportement des rates gestantes, qui sont plus sensibles aux changements de leur environnement. Nous nous attendons ainsi à observer des modifications de leur comportement, comme de l’agitation, une baisse de leur activité ou une diminution de leurs interactions sociales.

Devenir

A la fin des derniers tests d’exploration fonctionnelle soit à l’âge de plus 6 mois, tous les animaux participant à l'étude seront euthanasiés.

Remplacement

Dans le cadre de notre démarche visant à respecter la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en matière d’expérimentation animale, nous avons déjà réalisé des études in vitro sur des cellules de patients atteints d’atrophie optique dominante ainsi que sur des cellules cochléaires provenant des souris, un modèle qui reproduit une perte de synapse de la cochlée. Cependant, pour prouver que nos stratégies thérapeutiques peuvent réellement restaurer la fonction auditive, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux in vivo, qui sont plus proches des conditions réelles observées chez les humains. Nous avons également étudié l’effet toxique de certains fongicides sur des cellules cochléaires de souris, mais pour mieux comprendre l’impact de ces polluants sur l’audition, en particulier en lien avec des troubles comme l’autisme ou les maladies neurodégénératives, l’utilisation de modèles animaux plus complexes, tels que le rat, s’avère nécessaire. Ces études in vivo nous permettront de mieux comprendre les relations possibles entre une exposition prolongée au bruit ou à des polluants environnementaux pendant la grossesse et les troubles auditifs observés chez les descendants.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques. Voici la répartition prévue : • Pour développer des traitements génétiques visant à ralentir ou stopper l’apparition des troubles auditifs liés à un défaut génétique : Nous tiendrons compte des différences individuelles dans la gravité et la progression des symptômes. Grâce à un calcul statistique, nous avons déterminé qu’un total de 90 souris serait nécessaire, réparties en 6 groupes de 15 souris. • Pour évaluer l’effet de deux traitements pharmacologiques contre une surdité induite par l’exposition au bruit : Afin de limiter le nombre d’animaux, un seul groupe témoin sera utilisé. En tout, 45 souris seront nécessaires, réparties en 3 groupes de 15 souris. • Pour étudier l’impact de l’exposition aux polluants de rates gestantes sur l’audition de leurs descendants : Nous réduirons également le nombre d'animaux en utilisant un groupe témoin de 15 rates gestantes non exposées, et deux groupes de 17 rates chacune, exposées soit à un cocktail de polluants, soit au bruit. Cela représente un total de 49 rates gestantes. Nous prévoyons d’obtenir environ 90 jeunes rats dans le groupe témoin, 102 dans le groupe exposé aux polluants , et 102 dans le groupe exposé au bruit. Ces effectifs sont suffisants pour mener à bien l’ensemble des évaluations fonctionnelles et des analyses morphologiques prévues dans le protocole expérimental. Pour les analyses morphologiques, nous envisageons d’inclure environ 5 à 6 jeunes rats par type d’analyse, à chaque point temporel (21 jours, 3 mois et 6 mois), et pour chaque sexe. Cela représente environ : 5 rats × 3 types d’analyse × 3 âges × 2 sexes = environ 90 rats par groupe. Ces choix ont été faits afin de minimiser l’utilisation d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques solides et fiables

Raffinement

Dans les groupes d'animaux utilisés pour développer des traitements génétiques et pharmacologiques : • Les animaux seront observés quotidiennement dès leur inclusion dans le protocole expérimental. • Ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec des copeaux, des rouleaux de cellulose, et des refuges en plastique pour améliorer leur bien-être. • Après l’opération, une injection sous-cutanée d'antibiotiques sera administrée pour prévenir les infections. Si des signes de douleur ou d'inconfort sont détectés, une euthanasie anticipée sera effectuée pour éviter toute souffrance. • Le réveil après l’opération aura lieu dans un espace isolé. Une fois réveillées, les souris seront remises avec d’autres souris qui étaient dans la même cage et opérées le même jour. • Une visite quotidienne, y compris les week-ends, sera assurée pour veiller à leur état de santé. • Les tests auditifs seront réalisés chez les animaux anesthésiés. Ces tests, non-invasifs, sont couramment utilisés chez l’humain sans anesthésie. Dans l'étude de l'impact de l’exposition aux polluants sur l’audition des descendants de rates gestantes : • Les rats gestants seront surveillés régulièrement tout au long de la grossesse et après la naissance de leurs petits. • Une grille de suivi sera utilisée pour évaluer l'état des animaux. • Pour réduire le stress lié à l’exposition au bruit, les femelles gestantes seront maintenues en groupes sociaux, favorisant ainsi les interactions positives entre elles pour diminuer le stress.

Choix des espèces

Pour évaluer la possibilité de restaurer la fonction auditive chez les patients atteints d'atrophie optique dominante (AOD), nous avons choisi d'utiliser des souris mutantes qui présentent une neuropathie auditive et optique, reproduisant la condition humaine AODplus. Nous testerons également des traitements pour favoriser la repousse des fibres du nerf auditif à l'aide de de petites molécules qui imitent le facteur de croissance, protégées dans de très petites particules. Ces traitements seront testés sur un modèle de souris ayant une synaptopathie auditive, causée par une exposition à un bruit rencontré dans le lieu de travail. Enfin, nous étudierons l'impact sur l'audition des jeunes rats dont les mères auront été exposées au bruit ou aux pesticides pendant leur grossesse. Les souris mutantes et les souris sauvages exposées au bruit auront entre 1 et 2 mois, et seront suivies pendant 1 à 6 mois après le traitement afin d'évaluer les effets protecteurs des traitements sur l'audition. Pour examiner l'impact des bruits et polluants sur l'audition fœtale, nous utiliserons des femelles rats gestantes. Les humains et les rats réagissent de manière similaire aux sons de basse fréquence, ce qui permet d’étudier les effets de l'exposition au bruit. L’audition des rats se développe après la naissance, tandis que celle des humains est déjà active avant la naissance. Cette différence permet de mieux comprendre comment le bruit et les polluants influencent le développement et la maturation de l'audition.

Tués douze semaines après leur première opération pour que leur mâchoire soit photographiée, scannée et découpée en coupes histologiques, 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux premières molaires du haut leur sont arrachées sous anesthésie, puis ils reçoivent du zolédronate en injection dans l'abdomen, éveillés, avant qu'un implant dentaire ne leur soit posé quatre semaines plus tard. Le porteur qualifie la douleur de modérée et les complications postopératoires de rares. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la cicatrisation osseuse autour d'un implant après la prise de ces médicaments, et présente son propre protocole comme un modèle réutilisable pour tester ensuite le tabagisme ou la maladie gingivale.

Objectifs

L'ostéonécrose des mâchoires associée aux médicaments est une complication potentiellement sévère qui affecte les patients atteints de pathologies concernant le tissu osseux, comme l'ostéoporose et certaines maladies oncologiques, en particulier les cancers du sein et de la prostate. Ces patients suivent des traitements médicamenteux qui modifient le renouvellement normal du tissu osseux, entraînant une augmentation de sa densité. Parmi ces médicaments, on retrouve les bisphosphonates De nombreux modèles précliniques ont été développés chez le rat, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension de cette pathologie. Cependant, les mécanismes à l'origine du développement de la nécrose osseuse restent encore partiellement élucidés. La recherche animale a permis de mettre au point des modèles intégrant des facteurs de risque initialement observés chez l'humain. Il est clairement établi que la nature du médicament administré ainsi que le protocole de dosage influencent le risque de développer cette maladie chez les patients. En fonction de la dose administrée, les patients sous traitement avec ces médicaments sont classés en deux catégories : forte dose (patients oncologiques) et faible dose (patients atteints d’ostéoporose). Selon la littérature actuelle, outre les facteurs systémiques et médicamenteux, des facteurs locaux peuvent également favoriser le développement de cette maladie, notamment la chirurgie implantaire. Les recommandations scientifiques internationales contre-indiquent la pose d'implants chez les patients sous traitement à forte dose. En revanche, chez les patients sous faible dose, l'implantologie est autorisée, bien que le risque de développer une ostéonécrose des mâchoires reste incertain. LL'objectif de cette étude est de développer un modèle expérimental chez le rat afin d'évaluer l'effet de différentes doses de ces médicaments sur le processus d’ostéointégration dans un alvéole totalement cicatrisé. Plus précisément, le médicament choisi est le Zolédronate, qui appartient à la classe des bisphosphonates. Ce modèle exposera les animaux à deux dosages distincts, reproduisant ceux administrés chez l’humain pour le traitement de l’ostéoporose (faible dose) et des pathologies oncologiques (forte dose).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension du processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant dentaire après l’administration de traitements avec des médicaments qui altèrent le fonctionnement normal du tissu osseux. De plus, il aidera à évaluer la faisabilité de la pose d’implants chez les patients recevant une faible dose de ces médicaments (qui représentent la majorité des utilisateurs), ainsi qu'à analyser les risques liés à une administration à forte dose chez les patients oncologiques. Pour les recherches futures, cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (ex. : tabagisme, maladie gingivale, etc.) dans le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implantau sein de cette population vulnérable.

Procédures

Pour tous les animaux, une période d’acclimatation (minimum 7 jours) est appliquée avant l’initiation du protocole T0 : Extraction dentaire Au début de l'expérience (T0), une extraction de la première molaire maxillaire gauche et droite sera pratiquée sur tous les animaux. Ils recevront une injection d’analgésique (quelques secondes), puis seront anesthésiés pendant 15 minutes sur un tapis chauffant. L'administration de l'analgésique (renouvelée 2 fois par jour) se poursuivra pendant les deux jours suivants. T1 : Administration des traitements Quatre semaines après, l'administration des traitements assignés ou l’absence de médicament débutera sur animal vigile par une injection intrapéritonéale de quelques secondes. T2 : Chirurgie implantaire Quatre semaines après administration médicamenteuse, la pose d'implants sera réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention durera 15 minutes. Une couverture analgésique sera mise en place. Le même protocole pré- et post-opératoire que celui décrit pour l'extraction dentaire sera appliqué. T3 : Analyses post-mortem Quatre semaines après la chirurgie implantaire, les rats seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - L’extraction ainsi que la pose des implants peuvent entraîner une douleur modérée, qui peut être facilement contrôlée par l’administration d’analgésiques. Les complications post opératoires sont rares. - L’administration du traitement ou de l’analgésie peut induire une courte douleur (moins d’une minute) - Lors du reveil après les chirugies, les animaux peuvent être désorientés et stréssés

Devenir

Afin d’évaluer l'effet des traitements, il est necessaire • D’analyser le site avec l’implant et prendre des photographies. • De réaliser d'un scanner • De prélever des échantillons pour analyse histologique. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de tous les animaux du projet.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’évaluer le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant en simulant le métabolisme osseux après la prise de médicaments. Cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (tels que le tabagisme, etc.) dans le processus d'ostéointégration au sein de cette population vulnérable.

Réduction

Les lots ont été réduits au minimun pour obtenir toutefois des résultats significatifs. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur la littérature et sur une analyse statistique.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation sera observée avant le début du projet afin de réduire le stress des animaux. Avant l’extration dentaire et la chirurgie, les animaux seront analgésiés. Les interventions seront ensuite réalisées sous anesthésie médicamenteuse et sur tapis chauffant. Le bien-être des animaux sera évalué par du personnel compétent à l’aide d’une grille de score. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. De même un arbre décisionnel ainsi que des critères d’arrêt sont définis si nécessaire.

Choix des espèces

Le rat représente une espèce appropriée pour cette expérience. En effet, la chirurgie d’implant dentaire est bien décrite dans la littérature, et les processus de cicatrisation et d’intégration d’implant sont largement documentés. Cependant, peu d’études se sont spécifiquement intéressées au risque associé à la chirurgie implantaire. Cette expérience pourrait ainsi offrir une opportunité de comparaison avec la littérature existante et d’apporter des données précieuses dans ce domaine. Les animaux utilsés auront de 8 semaines en début de projet. Les rats seront alors adultes, leur machoire ne se developpera donc plus.

Pour valider des produits de décontamination des dispositifs médicaux avant leur inscription sur une liste officielle prévue pour 2027, 1 200 souris et 1 200 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit dans le cerveau une tige métallique porteuse de prions, traitée ou non par le procédé à évaluer, puis attend que la maladie se déclare, de trois à dix-huit mois chez le hamster et de six à vingt-quatre mois chez la souris. Aucune analgésie n'est prévue après l'opération, le porteur indiquant qu'elle risquerait d'interférer avec l'installation de l'infection. Agressivité, tremblements, troubles de l'équilibre et perte de poids sont attendus, et c'est l'apparition de ces signes neurologiques qui déclenche la mise à mort.

Objectifs

Plusieurs cas de transmission inter-humaine de maladies à prions ont été rapportés, liés pour certains à l’utilisation de dispositifs médico-chirurgicaux contaminés et traités par la suite de façon inappropriée (principalement lors de neurochirurgie). En effet, les prions présentent des spectres de résistance très étendus à la plupart des méthodes d’inactivation et de stérilisation classiquement utilisées vis-à-vis des agents infectieux conventionnels (bactéries, virus, champignons…). Par ailleurs, ces maladies transmissibles ont des périodes d’incubation très longues qui peuvent excéder la moitié de l’espérance de vie de l’espèce considérée (incubation jusqu’à 50 ans chez l’homme). En France, plusieurs circulaires et instructions de la Direction Générale de la Santé régissent le traitement de reconditionnement des dispositifs médicaux et chirurgicaux après utilisation vis-à-vis du risque lié aux prions. Ces textes prévoient notamment que des produits ou des procédés (autoclavage, fumigation…) puissent, dans des conditions précises d’application (concentration, temps, température...), revendiquer une élimination ou une inactivation des prions. Cependant, ces revendications doivent se faire sur la base d’études réalisées selon un « protocole standard prion », ou PSP, imposé par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM), tel que défini en 2011 et révisé en 2018. Le projet présenté ici s’inscrit dans le cadre de ce protocole imposé par l’ANSM. Son objectif est d’étudier dans deux modèles animaux rongeurs l’efficacité de plusieurs produits/procédés pour nettoyer des dispositifs médicaux et chirurgicaux et de participer à l’optimisation de ce PSP qui est amené à évoluer dans le futur.

Bénéfices attendus

Les produits/procédés qui seront validés dans le cadre de ces études (démonstration d’une efficacité à éliminer et/ou inactiver les prions à un niveau identique ou supérieur à ceux des traitements d’efficacité maximale) seront inscrits dans la nouvelle liste des produits efficaces vis-à-vis des prions à paraître en 2027 : ces produits seront utilisés selon les mêmes paramètres (temps, concentration, température…) testés pour traiter les dispositifs médicaux utilisés lors d’actes à risque prion dans toutes les structures hospitalières françaises. Certaines variations de conditions d’utilisation des produits et procédés (mode d’exposition des outils et dispositifs, qualité de l’eau utilisée…) pourront permettre de faire évoluer le PSP dans le futur. Ces variations concernent les préparations des supports et n’ont pas d’impact sur la partie in vivo de cette étude.

Procédures

Les animaux seront chacun soumis à une seule anesthésie générale, durant laquelle une tige métallique contaminée par les prions / décontaminée par le procédé à tester est implantée dans le cerbeau; L’intervention dure moins d’une minute par animal (durée anesthésie environ 15 minutes). Ils seront surveillés au quotidien (observation et manipulation des animaux sans anesthésie) pour la détection des signes cliniques (qui apparaissent après une incubation de 3 à 18 mois chez le hamster, et de 6 à 24 mois chez la souris). Au terme de l’étude, les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées à l’anesthésie (temporaires au cours de la seule anesthésie) Hypothermie, difficultés au réveil, Nuisances liées à l’implantation intracérébrale des tiges métalliques Douleur temporaire liée à l’implantation, lésions durables (rares) se manifestant souvent par un port de tête incliné Nuisances liées au développement des maladies à prions Agressivité, troubles du comportement, hypersensibilité, tremblements, troubles de l’équilibre, troubles moteurs, perte de poids Développement de maladies intercurrentes Durant la longue période d’incubation des animaux (jusqu’à 18 mois chez le hamster et 24 mois chez la souris), des maladies intercurrentes liées à l’âge (principalement tumeurs, perte de poids) peuvent être observées.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de pouvoir confirmer la suspicion de diagnostic clinique : en effet, le diagnostic définitif de maladie à prion (également chez l’Homme) n’est possible qu’après avoir mis en évidence dans le cerveau des individus concernés soit des lésions spécifiques (histologie), soit la présence de la forme anormale de la protéine prion par technique biochimique

Remplacement

Dans un premier temps, les différents traitements sont testés in vitro afin d’identifier ceux inefficaces ou avec une efficacité très limitée (

Réduction

Le nombre optimal d’animaux dans chaque groupe est défini par le PSP (équilibre entre réduction du nombre d’animaux et pertinence statistique) : « * Pour la gamme contrôle (supports contaminés avec des doses décroissantes de prion afin de juger par comparaison de l’efficacité des traitements) : un minimum de 4 animaux pour les trois concentrations les plus importantes, et un minimum de 8 animaux (préférentiellement 12 pour renforcer la puissance statistique de l’étude) pour les autres dilutions. * Pour les traitements évalués et les traitements de référence : un minimum de 12 animaux inoculés par traitement, à raison de 4 animaux pour chacun des triplicats de traitement ».

Raffinement

Les interventions (implantation des tiges métalliques et des puces d’identification) seront réalisées concomitamment pour ne réaliser qu’une seule anesthésie générale par animal. Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Lorsqu’ils sont anesthésiés, les animaux sont couchés dans leur cage sur des essuie-tout et placés sous lampe chauffante durant la période de réveil. Les protocoles d’anesthésie sont optimisés en fonction des espèces pour limiter les effets indésirables. Lors des interventions, l’animal est positionné sur un tapis chauffant. Il n’est pas prévu d’analgésie en post opératoire pour éviter toute interférence avec l’installation de l’infection par les prions. Au regard de notre expérience passée les rongeurs supportent particulièrement ces protocoles sans manifester de douleur ou de symptômes particuliers avant la mise en place des signes cliniques liés à l’infection par les prions. Néanmoins, les animaux seront surveillés avec précaution durant les dix jours suivant l’inoculation. Durant cette période, les animaux recevront en cas de signe de douleur (prostration, tête penchée…), une injection d’analgésique. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils seront surveillés cliniquement au quotidien par les expérimentateurs ou les zootechniciens en charge de l’animalerie tout au long de l’expérience, pour permettre une intervention de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. A l’installation de signes neurologiques spécifiques des maladies à prions (tremblements, hyperexcitabilité) ou des points limites définis, qu’ils soient liés ou non à l'inoculation, les animaux seront euthanasiés. Le diagnostic clinique sera confirmé par la mise en évidence post mortem de protéine prion pathologique (PrPres) dans le cerveau par technique in vitro.

Choix des espèces

La souche prion requise par l’ANSM est la souche de référence pour la validation de procédures de décontamination vis-à-vis du prion, compte tenu de son potentiel de résistance vis-à-vis des principales méthodes physiques et chimiques. Cette souche a été sélectionnée et développé chez le hamster syrien, ce qui en fait le seul hôte permissif de cette souche de prion . Pour la souche de prion humaine testée dans cette étude, (responsable de la maladie de la vache folle che l’Homme), nous avons privilégié le modèle rongeur (souris) le plus sensible connu, Pour ces deux espèces, les animaux approvisionnés sont de jeunes adultes (8 semaines), pour être compatibles avec une incubation pouvant aller jusqu’à 18 mois (hamsters) ou 24 mois (souris).

Rasées sur le dos et le ventre, pincées chaque jour du doigt pour voir si leur épiderme se décolle, testées sur plaque chaude avec chronométrage du retrait, 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles est modifiée génétiquement pour supprimer les neurones sensoriels du toucher et de la chaleur, afin de mesurer le rôle de ces neurones dans une réaction allergique aux médicaments mortelle dans environ 30 % des cas chez l'humain. Le porteur attend un œdème de la peau, des grattages, une perte de poids, puis un détachement de l'épiderme par endroits, la mise à mort intervenant dès ce stade. Il qualifie le rasage et les tests de simple inconfort sans douleur persistante, sur des animaux dont il a par ailleurs supprimé les neurones qui transmettent la douleur.

Objectifs

Les réactions d’allergie médicamenteuse sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%). Il s’agit de réactions de type allergie retardée dues à des cellules immunitaires et la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée. Les plus sévères sont connues sous le nom de nécrolyse épidermique toxique (NET). Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau, parfois sur l’ensemble du corps. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). L’un des premiers symptômes de la nécrolyse épidermique toxique est une douleur cutanée généralisée tels que des picotements. La douleur est perçue par des neurones sensoriels spécialisés dans la peau. Il existe un modèle murin de nécrolyse épidermique qui présente des symptômes cliniques ainsi qu'une réponse immunitaire très proche de ceux des patients atteints de NET. La déplétion chimique des neurones sensoriels dans ce modèle murin a réduit le délai d'apparition des symptômes. Ces neurones sensoriels semblent protecteur dans l'apparition de la nécrolyse épidermique. En revanche, la supression chimique ne cible pas l'ensemble des neurones sensoriels donc dans ce projet nous utiliserons des souris modifiées génétiquement afin de supprimer l'ensemble des neurones sensoriels impliqués dans le toucher (chaleur et pression) sans affecter les autres sens. Le premier objectif est de caractériser le rôle des neurones sensoriels dans le développement de la NET au cours du temps. Dans un second temps, des tests de déplétion des cellules immunitaires impliquées dans cette pathologie seront réalisés pour évaluer leurs rôles.

Bénéfices attendus

1/ Caractériser de la réponse immunitaire d’un modèle murin de nécrolyse épidermique en l'absence de neurones sensoriels 2/ Définir les interactions entre les neurones sensoriels et les cellules immunitaires dans le développement de la nécrolyse épidermique. L'objectif à long terme est de trouver de nouvelles cibles afin de traiter cette pathologie pour laquelle il n'existe pas à l'heure actuelle de traitement spécifique.

Procédures

Les souris seront rasées sur une grande partie du dos et du ventre, cette procédure est réalisée sous anesthésie et dure 30s. Le test à la chaleur consiste à vérifier leur sensibilité à la chaleur, le temps de retrait est chronométré. Le test est arrêté à 20s en cas de non-retrait. Le test mécanique consiste à voir la sensibilité à la pression des souris et dure 30s. Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (3 ou 5 injections au total, durée 30sec). Parmi ces injections, certaines sont réalisées sous anesthésie. Des legères pressions de la peau avec le doigt seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés quotidiennement (30sec). Les oreilles des animaux seront également mesurées quotidiennement sous anesthésie (durée 30 sec).

Impact sur les animaux

Les souris seront rasées sur le dos et le ventre pour observer les atteintes cutanées, ce qui n'entraine pas de douleur mais un léger inconfort durant la procédure. Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Le test à la chaleur est perçu comme sensiblement inconfortable par la souris mais n'induit aucune brûlure ou douleur persistante chez l'animal. Les tests comportementaux peuvent être stressant pour la souris. Les injections génèrent un stress et une légère douleur. Pour les animaux qui vont développer une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent environ 8 jours après le début de l'expérience, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger oedème cutanée (qui sera suivi par la mesure de l'épaisseur de l'épiderme de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peut être des grattages chez ces animaux. On pourra aussi observer une perte de poids, qui sera suivi par une mesure quotidienne. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivie quotidiennement par la réalisation d'une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache sur des animaux anesthésiés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau, ganglions et sang. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissu au cours du temps afin de caractériser la réponse immunitaire en l'absence de neurones sensoriels de notre modèle et également d’évaluer les interactions neuro-immunes dans le développement de la nécrolyse épidermique.

Remplacement

La finalité du projet est de caractériser la réponse immunitaire de la nécrolyse épidermique toxique au cours du temps et l’implication des interactions neurones sensoriels-cellules immunitaires dans le développement de la pathologie. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de l'épiderme suite à l'activité de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissu. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un modèle in vivo est obligatoire pour caractériser les acteurs cellulaires de cette pathologie.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience . Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes et pour caractériser également l'infiltration cellulaire dans le tissu car d'après la littérature, comme on s'attend à ce qu'entre 50 et 100% des animaux développent la pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les animaux seront maintenus à 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les griffes des animaux seront également coupées afin de limiter l'apparition de plaie qui pourrait être induite par un grattage excessif (qui induit des plaies ou un oedème), et le poids sera suivi quotidiennement, en cas de perte de poids modéré (-10%) des aliments gélifiés seront mis dans la cage. Une anesthésie est réalisée pour le rasage du dos, la mesure des oreillles et les injectionsintraveineuses afin de diminuer le stress des animaux et la durée de la manipulation. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne la réponse immunologique. Les animaux seront utilisé entre 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

73 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif humain leur sont greffées dans les tissus mammaires, puis la tumeur est mesurée deux fois par semaine, jusqu'à cinq fois quand elle grossit assez pour gêner leurs déplacements et leur couper l'appétit. Le projet vise à confirmer sur un animal vivant ce que des cultures cellulaires ont déjà montré. Les retombées pour les malades sont renvoyées à une phase ultérieure de recherche, le porteur affirmant par ailleurs que seul un "organisme entier" permet de suivre la dissémination d'une tumeur et concluant que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations de ce gène pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Nous souhaitons maintenant vérifier ces observations dans un modèle vivant (chez l’animal), pour confirmer que cette mutation augmente bien le risque de métastases. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gèe étudié dans des tumeurs TNBC est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations d'un gène dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules TNBC. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si le gène étudié pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de TNBC métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances pour les souris. La greffe des cellules, sous anesthésie locale, engendre du stress et de la douleur légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. Si la tumeur devient plus volumineuse (volume cumulé), elle peut limiter la mobilité de la souris, affectant ainsi son comportement et son bien-être général, avec des effets modérés pouvant entraîner une perte d'appétit.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux seront surveillés quotidiennement et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permettra de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. En cas de besoin, ils reçoivent une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Les animaux bénéficient d’enrichissement environnemental dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Les interventions seront faites sous anesthésie, avec analgésie adaptée. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant au suivi régulier de l’état de santé des animaux. Des points limites précoes ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).