Rongeurs
Étude de l’inflammation dans la cardiomyopathie dilatée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Huit fois entre 14 et 42 semaines de vie, des souris transgéniques sont anesthésiées, épilées à la crème dépilatoire, munies d'une sonde rectale et échographiées au cœur, avec une prise de sang de 100 microlitres à chaque séance. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et cellules. L'invalidation de leur gène provoque une cardiomyopathie dilatée, et une étude antérieure de la lignée relève une espérance de vie ne dépassant pas 12 mois, avec une perte de poids qui peut dépasser 15 % au stade final. Le porteur ne nomme ni le gène invalidé ni le "certain processus inflammatoire" qu'il dit étudier, et annonce trois phases "détaillées ci-dessous" qui n'apparaissent nulle part dans le résumé.
Objectifs
Plusieurs études visant à augmenter ou diminuer l’inflammation cardiaque in vivo par des approches génétiques et pharmacologiques ont établi une relation entre l’inflammation et la fonction cardiaque. Cependant, aucune étude à partir de modèles animaux directement visant l’importance l’inflammation dans le développement de la pathologie d’intérêt. Nous proposons d’évaluer directement d’un certain processus inflammatoire dans le développement de la pathologie.
Bénéfices attendus
À terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de l’inflammation pour la fonction cardiaque. Ils pourraient permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant l’inflammation, ce qui permettrait de prévenir ou de freiner le développement des maladies chez les patients.
Procédures
Cette procédure sera réalisée à 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, et 42 semaines de vie selon des 300 souris : La souris sera échographiée (10-20 minutes) sous anesthésie générale gazeuse. La souris sera épilée sur la zone d’échographie avec une crème dépilatoire appliquée pendant 2 minutes. Une sonde rectale sera insérée pour mesurer la température corporelle. A chaque séance d’échographie, un prélèvement sanguin de 100 μl sera effectué (quelques secondes).
Impact sur les animaux
L’échographie cardiaque nécessite une anesthésie gazeuse, durant laquelle un prélèvement sanguin de petit volume ne requiert aucune contention supplémentaire pour l’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux ne sont pas susceptibles d’éprouver de douleur. L’invalidation du gène d’intérêt entraine une pathologie, qui peut être suivi par échographie cardiaque. L'étude de la lignée murine réalisée précédemment permet d'observer que ces animaux présentaient une espérance de vie ne dépassant pas 12 mois. De plus, une prise de poids diminuée par rapport aux souris contrôles est observée une ou deux semaines avant la mort. Les signes cliniques apparaissent au stade final, ce qui commence avec une perte de poids entre 5% à 10% et peut impliquer une perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation de la procédure (la mise à mort précède les prélèvements d’organes et cellules, et dans les autres cas les animaux génétiquement modifiés ne peuvent pas être réutilisés ou replacés).
Remplacement
La formation et la fonction du cœur impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre certaines cellules et leur environnement, au sein d’une structure complexe. L’environnement, ou niche, est composé de multiples facteurs. Les cultures in vitro ne peuvent pas reproduire toute la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les analyses moléculaires sera privilégiée chaque fois que cela sera possible, afin de limiter le recours à l’animal, en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.
Réduction
Des calculs statistiques de l'effectif nécessaire pour un test de comparaison de deux échantillons indépendants ont été réalisés avec l’aide de biostatisticiens. Nous prévoyons pour ce projet un total de 300 souris. Les animaux seront ensuite utilisés pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes mitochondriale et cardiologique. Les études pilotes ont déjà été menées, permettant de réduire le nombre d’animaux en ciblant 3 phases distinctes détaillées ci-dessous. 2 types de tests statistiques sont envisagés pour comparer les résultats. L’effet des âge, sexe, date de la mise à mort, cage et nombre de souris dans la cage sera mesuré à l’aide de modèles statistiques pour vérifier qu’elles n’ont pas influé sur les résultats des expériences.
Raffinement
Dans un but de raffinement, l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée (en lien avec le phénotype attendu) permettant un suivi optimal des animaux sera mise en place. Les animaux seront évalués hebdomadairement, ce qui permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Pour ce qui est la gestion de la douleur, nous effectuons un suivi rigoureux et régulier et utilisation d’analgésique le cas échéant. De plus, toutes les procédures potentiellement invasives ou générant un inconfort significatif, telles que les échographies cardiaques, seront réalisées sous anesthésie appropriée afin de minimiser le stress et la douleur des animaux. Puisque les souris porteuses de la mutation d’intérêt manifestent la pathologie étudiée, nous suivrons la fonction cardiaque par échographie durant la durée de vie de l’adulte, ce qui permet d’anticiper l’apparences des nuisances sur le bien-être des animaux. La pathologie étant associée à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue sera effectuée, de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Si, lors de cette surveillance quotidienne, un stress est observé, un enrichissement de la cage sera réalisé et une surveillance accrue sera effectuée.
Choix des espèces
La conservation élevée des mécanismes physiopathologiques entre l'humain et la souris a été largement documentée par de nombreuses études. En particulier, le modèle murin s’est révélé essentiel pour l’étude des pathologies cardiaques. Dans la continuité de cette approche, nous poursuivons notre étude sur une souris transgénique qui a permis de mettre en évidence l'impact d’une altération d’un certain mécanisme sur la fonction cardiaque. L’utilisation de la souris reste donc le choix le plus pertinent pour approfondir l’étude de ce processus in vivo. De plus, ce modèle permet une transposition rigoureuse des connaissances issues de la littérature à nos propres investigations expérimentales. Enfin, nous disposons de nombreux outils génétiques et analytiques spécifiquement adaptés à l’étude de la souris, facilitant ainsi l’exploration mécanistique et fonctionnelle. Pour les études cardiaques, les souris seront suivies par analyse de la fonction cardiaque à partir de 14 semaines (jusqu'à 42 semaines) car la délétion du gène d’intérêt est complète dès la naissance. Les suivis longitudinaux par échocardiographies représentent les fréquences idéales pour observer une défaillance de fonction cardiaque dans ce modèle de pathologie chez la souris.
Gestion de la production d’animaux qui développent spontanément une colite chronique.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 250 souris dépourvues d'interleukine 10 vont être élevées et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sans aucune intervention ni prélèvement pendant l'élevage. Avec l'âge, une partie d'entre elles développe une inflammation chronique du côlon qui peut entraîner de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante, et environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l'âge de 14 semaines. Cet élevage doit fournir à l'équipe et à ses partenaires des souris pour leurs recherches sur les maladies inflammatoires de l'intestin : elles y entrent dès 4 semaines et sont tuées à l'issue des procédures, les autres étant gardées pour la reproduction ou tuées en cas de souffrance, après deux mois sans portée ou à 24 semaines. Le porteur se donne pour objectif de mieux élever ces souris "tout en minimisant leur possible souffrance", et qualifie leur utilisation d'"essentielle" pour cette recherche.
Objectifs
Ce projet vise à décrire la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une inflammation chronique de l’intestin (colite). Ces souris sont un modèle des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn et la colite hémorragique qui sont causées par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule appelée interleukine 10 (IL-10) qui aide à limiter l’inflammation dans l’intestin. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une réaction excessive du système immunitaire et une inflammation chronique du côlon. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques peuvent aggraver cette inflammation en modifiant les microbes intestinaux. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment élever et prendre en charge ces souris tout en minimisant leur possible souffrance, afin de mieux étudier les maladies inflammatoires de l’intestin et, à terme, aider à la recherche sur ces maladies chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à notre équipe et à nos partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener nos recherches sur les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). À long terme, ces souris aideront les chercheurs à mieux comprendre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Grâce à elles, on pourra trouver de nouvelles façons de traiter ces maladies et identifier des marqueurs pour mieux les diagnostiquer. Ces souris permettront aussi de tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et d’évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints de MICI.
Procédures
Ce projet vise à gérer la production d’une lignée de souris qui peuvent développer des problèmes de santé progressifs avec l’âge. En particulier, ces souris pourront développer des signes d’inflammation de l’intestin (diarrhées, perte de poids, comme les patients atteins de MICI). Ils ne subiront aucune intervention ni prélèvement pendant toute la durée de l’élevage.
Impact sur les animaux
Certaines de ces souris peuvent commencer à développer progressivement avec l’âge une inflammation de l’intestin. Cela peut entraîner de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante. Dans ces cas-là, l’expérimentation est arrêtée pour éviter toute souffrance excessive. En général, environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l’âge de 14 semaines.
Devenir
Les souris générées dans ce projet seront soit intégrés dans un protocole expérimental dès 4 semaines de vie, soit gardés en vie pour la gestion des accouplements, soit euthanasiés lorsqu'elles présenteront des signes de souffrance ou lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois ou âgées de 24 semaines (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche). Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales
Remplacement
L’utilisation de souris de laboratoire est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont très complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le système immunitaire, les microbes intestinaux, la génétique et l’environnement. Ces maladies affectent non seulement l’intestin mais aussi d’autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement et les microbes interagissent avec l’organisme, les souris sont le modèle le plus adapté. À ce jour, il est impossible de recréer ces interactions complexes en laboratoire uniquement avec des cellules, d’où la nécessité d’étudier ces maladies sur des animaux vivants.
Réduction
Nous ajusterons l’élevage des souris en fonction des besoins de recherche de l’équipe de recherche. Ayant une connaissance approfondie de cette lignée (son mode de reproduction, le nombre et la taille des portées), nous sommes en mesure de gérer l’élevage de manière efficace et raisonnée. Concrètement, nous maintenons en permanence deux couples reproducteurs pour assurer la continuité de la lignée. Si une expérience spécifique est prévue et approuvée, nous augmentons temporairement le nombre de souris pour répondre aux besoins de l’étude.
Raffinement
Les souris seront surveillées de façon journalière par du personnel technique dans le cadre de la surveillance obligatoire. En outre, une surveillance sera effectuée 1 à 3 fois par semaines par du personnel qualifié pour évaluer la santé des animaux. Si certains développent une inflammation de l’intestin, des soins adaptés seront mis en place en fonction de leur état, comme l’ajout d’un gel de réhydratation. S’il n’y a pas d’amélioration de leur état, elles seront euthanasiées afin d’éviter toute souffrance. L’évolution de la maladie sera suivie grâce à un système de notation qui prend en compte la perte de poids, l’apparence, la présence de diarrhée et le comportement des souris. Selon leur score, des mesures progressives seront appliquées (un suivi plus fréquent, l’ajout de gel de réhydratation, voire l’arrêt du protocole si nécessaire. Enfin, leur environnement sera aménagé avec des éléments comme du coton, des petites maisons et un éclairage respectant le cycle jour/nuit pour leur permettre d’adopter un comportement naturel.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’intestin lui-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entrainant ainsi une inflammation intestinale ressemblant à une colite hémorragique chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris pourront commencer à se reproduire dès l’âge de 5 semaines, qui correspond à leur maturité sexuelle.
Identification et sélection de biomarqueurs d’imagerie chez un modèle murin de dystrophie myotonique de type 1 dans le cadre d’une étude translationnelle.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Jusqu'à huit examens d'IRM de quatre heures chacun, sous anesthésie générale, espacés de 72 heures au minimum: 88 souris porteuses d'une mutation de dystrophie myotonique vont être utilisées, 44 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 44 un niveau modéré. Toutes sont tuées pour prélever les organes et comparer les images aux lésions microscopiques. Le porteur reconnaît que l'anesthésie répétée peut causer hypothermie et difficultés cardio-respiratoires, avec un risque rare de non-réveil, et que la modification génétique entraîne retard de croissance, faiblesse musculaire, anxiété et pousse anormale des incisives. Le détail du raffinement couvre le maintien de la température, le gel ophtalmique et la surveillance respiratoire pendant l'imagerie, sans un mot sur la prise en charge de ces incisives qui poussent de travers.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire héréditaire rare présentant en plus des symptômes musculaires typiques, des altérations du cerveau comme des troubles de l’attention, une somnolence diurne fréquente ou un retard intellectuel. Grâce aux études préliminaires menées chez un modèle souris de la pathologie, nous avons pu mettre en évidence des défauts cellulaires déclenchés par une mutation spécifique retrouvée chez différents types cellulaires présents dans le cerveau. Cependant, nous ignorons encore dans quelle mesure ces altérations affectent le cerveau dans son ensemble et plus localement à l’échelle microscopique au cours du vieillissement et de la progression de la maladie. L’objectif du projet sera donc d’étudier la progression des défauts structurels et cellulaires dans le cerveau au cours du temps. Pour cela, nous utiliserons des techniques avancées de neuroimagerie par imagerie par résonance magnétique (IRM) ainsi que des analyses histologiques et moléculaires dans le modèle de souris de la dystrophie myotonique de type 1.
Bénéfices attendus
Bien que la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) soit une maladie rare, sa prévalence est évaluée à 4,8 sur 10 000 en 2021, ce qui fait de cette maladie la maladie neuromusculaire la plus fréquente chez l’adulte. Ce projet présentera des bénéfices à court terme puisque cette étude s’inscrit dans une étude translationnelle. En effet, ce projet permettra d’optimiser le protocole d’imagerie qui sera réalisé en recherche clinique chez les patients atteints de cette maladie à la suite de cette étude chez les souris, en se concentrant notamment sur les indicateurs d’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui se seront révélés sensibles aux altérations cérébrales chez les souris malades par rapport aux souris contrôles. A long terme, ce projet pourrait également nous permettre de mieux comprendre les phénomènes sous-jacents conduisant aux altérations cognitives chez les patients atteints de dystrophie myotonique de type 1. Cette meilleure compréhension de la maladie pourrait ensuite amener à identifier des pistes thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients pour lesquels il n’existe à ce jour aucun traitement.
Procédures
Tous les animaux réaliseront des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale (durée de 4h maximum par examen et 8 examens d'imagerie maximum par animal, avec 72h minimum entre chaque examen). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les anesthésies nécessaires pour les examens d'iimagerie par résonance magnétique peuvent causer une hypothermie et des difficultés cardio-respiratoires. Il existe aussi un risque rare de non-récupération de la vigilance suite à l’anesthésie. La modification génétique des animaux sera liée à un retard de croissance, une faiblesse musculaire, des anomalies du comportement (anxiété) et une pousse anormale des incisives.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt pour réaliser des analyses histologiques ou de biologie moléculaire dans le cadre de l’évaluation des altérations à l’échelle microscopique.
Remplacement
Différents modèles cellulaires ont largement été utilisés pour étudier les aspects moléculaires et cellulaires de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) et évaluer l’efficacité de traitement potentiels. Or cette maladie est une maladie qui touche de nombreux organes. Il est donc fondamental de réaliser les études sur un organisme vivant et entier afin que les divers organes touchés soient bien considérés, c’est pourquoi notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies et pour lesquelles il existe un modèle de dystrophie myotonique de type 1 qui nous intéresse ici. Ces souris transgéniques sont un modèle fiable et reproductible pour étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie cérébrale observée chez les patients atteints de dystrophie myotonique de type 1.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum, nous utiliserons au total 88 souris. Une première étude test menée sur 16 animaux (4 animaux par groupe), nous permettra d'optimiser le protocole d'imagerie par résonance magnétique (IRM). L’étude principale longitudinale par imagerie par résonance magnétique (IRM) nous permet de réduire le nombre d’animaux en examinant 3 temps successifs sur les mêmes animaux (2 mois, 4 mois et 1 an). Notre expertise dans le domaine ainsi que les dernières études (moléculaires et histologiques) réalisées sur le modèle souris de la dystrophie myotonique de type 1 que nous utiliserons, nous permettent d’estimer que 12 animaux par groupe seront nécessaires pour déterminer les paramètres d’imagerie les plus pertinents à utiliser pour l’étude clinique par la suite. Nous avons donc fixé des effectifs à 18 animaux par groupe, afin d’avoir 12 animaux au dernier temps d’imagerie (1 an), sachant qu’une partie de la cohorte sera euthanasiée après les imageries réalisées à 2 mois et 4 mois d‘âge (3 animaux par groupe à chaque temps) afin de réaliser les études à l‘échelle microscopique et les comparer avec les observations d'imagerie par résonance magnétique réalisées.
Raffinement
Les animaux seront observés à leur arrivée et transférés en zone d’hébergement avec les mêmes congénères, de l’enrichissement (buchettes à ronger, nids) dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie et éclairage. Ils bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine avant leur entrée en procédure. Avant l’imagerie, les souris sont laissées 20 minutes dans la pièce de préparation puis observés pour vérifier leur bon état de santé. L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui du système de maintien de l’animal pendant l’imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter la déshydratation oculaire. La température de l'animal est surveillée et maintenue à température physiologique durant toute la durée de l’anesthésie (tapis chauffant, système de circulation d'eau chaude intégré au berceau et chambre de réveil chauffée). Un capteur de pression respiratoire permettra de contrôler la respiration de l’animal durant toute la durée de l’anesthésie également. La profondeur de l’anesthésie est contrôlée pendant l’examen (4 heures maximum) via le rythme respiratoire. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas d’atteinte de points limites établis (respiration trop lente ou rapide, température corporelle anormale). Le réveil de l’animal sera surveillé. Les animaux bénéficieront d’un délai de récupération de 72 heures minimum entre deux examens d'imagerie. Dans tous les cas leur bonne récupération sera validée avant la réalisation d’un nouvel examen. Une partie des animaux engagés présentent un phénotype dommageable dû à leur modification génétique qui se manifestera principalement par une anxiété accrue et des problèmes moteurs. Ils seront surveillés quotidiennement par la zootechnie et un membre de l‘équipera se chargera une fois par semaine de peser et d‘observer les animaux. En cas de signes de mal être, un avis sera demandé au vétérinaire et à la structure en charge du bien-être animal. Des points limites et une grille de score sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur la plateforme d’imagerie. La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie qui touche plusieurs organes nécessitant donc de travailler sur un modèle d’organisme vivant et entier afin que les divers organes touchés soient bien considérés. La souris présente une forte homologie génétique avec l’humain, son génome est connu et de nombreux outils de modification génétiques sont disponibles pour le modifier. Ceci permet la modélisation de nombreuses pathologies humaines avec cette espèce. Pour l’étude de la dystrophie myotonique de type 1 il existe un modèle de souris transgéniques bien caractérisée qui nous permettra d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui découlent de cette modification génétique. De plus, leur taille permet de les utiliser dans des scanners d’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour acquérir des images en 2, 3 ou 4 dimensions (3 dimensions spatiales et une dimension temporelle) capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Les souris (mâles et femelles) seront âgées de 7 semaines à 1 an et deux semaines. D’après nos études préliminaires les stades précoces de la maladie (souris âgées de 2 à 4 mois) montrent des signes moléculaires et cellulaires plus importants qu’aux stades plus tardifs (supérieur à 6 mois), ce qui facilite la mise en place du protocole d’imagerie. Une partie des souris âgées de 7 semaines à 4,5 mois serviront donc à établir le protocole d'imagerie. Le reste des souris servira quant à lui à suivre de façon longitudinale l’évolution de la pathologie du jeune adulte (2 mois) au stade plus tardif de la maladie (1 an).
Évaluation de l’effet de nouvelles molécules sur la multiplication des cellules du cancer du sang
- Recherche appliquée
- Cancers
Valider chez la souris trente-deux combinaisons de médicaments déjà testées sur cellules leucémiques humaines, en vue d'essais cliniques: 1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées quatre-vingt-dix secondes, greffées par voie intraveineuse avec des cellules de leucémie aiguë myéloïde prélevées chez des patients, saignées à la joue chaque semaine et ponctionnées au fémur jusqu'à six fois sous anesthésie. La maladie ainsi installée peut provoquer une perte de poids importante, une déshydratation, une hypothermie et des changements de comportement, avant des traitements administrés par voie orale ou abdominale pendant deux à quatre semaines. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'obtenir des preuves d'efficacité chez des animaux vivants, et justifie ses effectifs par les seules études antérieures du laboratoire.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est un type de cancer du sang où des cellules se multiplient rapidement et ne fonctionnent pas correctement. Ces cellules se retrouvent dans la moelle osseuse et dans le sang, ce qui empêche le sang d’accomplir ses fonctions normales. Le taux de survie à 5 ans pour les personnes atteintes de LAM est faible. Les cellules de LAM présentent souvent plusieurs altérations génétiques qui influencent leur développement et l’évolution de la maladie Ces modifications génétiques persistent tout au long de la maladie, ce qui permet à certaines cellules de survivre au traitement et de provoquer des rechutes. Pour traiter cette situation, des médicaments ont été développés pour bloquer l’expansion des cellules leucémiques. Des essais cliniques ont montré que ces traitements peuvent réduire le nombre de cellules leucémiques ayant ces altérations et améliorer la réponse au traitement. Cependant, d’autres modifications génétiques peuvent rendre ces cellules résistantes aux médicaments, et de nouvelles altérations peuvent apparaître au fil du temps, rendant le traitement moins efficace. Dans ce projet, nous cherchons à tester de nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison avec ceux existants, pour surmonter la résistance aux traitements actuels. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés sur plusieurs types de cellules leucémiques de patients, et certains médicaments ont montré des résultats prometteurs. Cependant, pour vérifier si ces traitements sont efficaces et sûrs, il est nécessaire de les tester sur des modèles vivants de souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients, permettent de recréer les conditions réelles de la maladie en transplantant les cellules leucémiques de patients dans des souris. Ils sont très utiles car ils reflètent bien la diversité des tumeurs humaines, ce qui nous permet de tester les médicaments dans des conditions proches de celles des patients. En résumé, l’objectif de ce projet est de valider les résultats obtenus en laboratoire en les testant sur des modèles vivants afin de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Nos travaux visent à tester un nouveau traitement, ayant des résultats prometteurs sur culture de cellules cancéreuses dans des modèles de souris avant de le tester chez l’homme. L’objectif est de trouver une stratégie efficace et bien tolérée, afin d'améliorer le pronostic des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde..
Procédures
Pour la mise en place du modème d'étude, un groupe d’animaux sera irradié (durée 90s) pour favoriser la prise de greffe, puis les cellules cancéreuses humaines seront injectées (3 à 6h plus tard) par voie intraveineuse (veine de la queue; durée: 2 min sur souris éveillées). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue seront réalisés chaque semaine (durée: 1 min) et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur sera effectué toutes les deux semaines sous anesthésie (durée: 5 min; maximum 6 prélèvements) si aucune cellule humaine n'est détectable dans le sang. Une fois la maladie installée, différents traitements seront administrés en fonction du groupe une fois par jour : 1. Un premier groupe recevra un médicament par injection abdominale tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l'injection: 30s, sur souris éveillée). 2. Un deuxième groupe recevra un autre médicament par voie orale 3 jours par semaine pendant 4 semaines ((durée de l'injection: 1 min, sur souris éveillée). 3. Un troisième groupe recevra un autre traitement par voie orale pendant 5 jours par semaine pendant 3 semaines. 4. Un quatrième groupe recevra un médicament similaire pendant 3 semaines. 5. Un cinquième groupe recevra un autre médicament par voie orale pendant 4 semaines. 6. Un sixième groupe recevra un traitement combiné de médicaments par voie orale pendant 3 à 4 semaines, en fonction de la combinaison. Des groupes supplémentaires recevront des traitements combinés de ces médicaments selon différents protocoles.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses.
Remplacement
Nous avons dans un premier temps tester sur des cellules cancéreuses humaines 32 conditions différentes afin d'identifier les combinaisons les plus efficaces. Néanmoins, nous devons valider à l'aide d'un modèle d'étude de souris ces résultats. En effet, les cultures de cellules ne permettent pas de reproduire complétement la pathologie humaine et dans ce type de tests, nous n'avons pas la problématique de distribution des molécules médicaments au travers des tissus. Il est donc indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles utilisant des animaux vivants.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés qui vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi clinique hebdomadaire des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettra de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal. Si un signe de détérioration est détecté, la fréquence du suivi sera augmentée et s’il n’y a pas d’amélioration de l’état général de l’animal, il sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Anse intestinale chez la souris pour évaluer l’entrée des particules vaccinales dans le cadre de la vaccination muqueuse
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Mises à jeun, anesthésiées, ouvertes au niveau de l'intestin pendant vingt minutes, 436 souris sont réveillées sous anti-douleur puis maintenues en vie six heures au maximum. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et une partie des souris génétiquement modifiées subit en plus une biopsie de l'oreille pour être identifiée. Le porteur justifie le recours aux animaux par des modèles de tissus respiratoires reconstitués qui ne reproduisent ni la structure complète ni le microbiote, alors que le projet porte sur la muqueuse intestinale, et il annonce en une ligne que l'étude "permettra de développer des vaccins par voie orale plus efficaces". Toutes sont tuées au terme des six heures, le temps de prélever l'anse intestinale et d'y chercher les particules vaccinales.
Objectifs
Développer des vaccins plus efficaces contre les infections intestinales est un enjeu majeur dans le domaine de la vaccination. La vaccination par voie orale est une stratégie prometteuse pour avoir des réponses vaccinales protectrices plus efficaces contres les pathogènes bactériens ou viraux intestinaux. Un des point clé est de mieux comprendre l'entrée des particules vaccinales au niveau de la muqueuse intestinale et d'essayer d'ameliorer leur entrée avec differentes stratégies de type vecteur ou en modificant le microbiote localement. Le modèle de l'anse intestinale est le modèle idéal pour caractériser l'entrée des particules vaccinales dans des conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer des vaccins par voie orale plus efficaces.
Procédures
Les souris seront anesthesiées et elles subiront une intervention chirurgicale au niveau de l'intestin qui dure 20 min. Les souris resteront sur un tapis chauffant durant toute l'intervention et jusqu'à leur réveil. Les souris pourront être maintenues en vie au maximum 6 heures après l'intervention et elles recevront des anti-douleurs. La même intervention sera réalisée sur des souris modifiées mais sans que ça n'amène de souffrance. Ces souris pourront subir une petite biopsie à l'oreille sous anesthesie plusieurs semaines avant l'intervention (durée 1 minute) ou les selles seront prélévées (durée 20 min), afin de les identifier génétiquement.
Impact sur les animaux
Avant la chirurgie, les souris seront mises à jeun. Après la chirurgie, les souris pourront ressentir des douleurs au niveau du ventre mais un anti-douleur sera administré. Pour les souris modifiées, celles-ci pourront ressentir une petite douleur à l'oreille après la biopsie.
Devenir
Afin d'analyser l'entrée des particules vaccinales dans la muqueuse intestinale, il faut prélever l'anse intestinale après la mise à mort. Ainsi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Le passage des antigènes dans la muqueuse est préalablement étudié dans des modèles de tissus respiratoires reproduits en laboratoire. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas complètement les conditions physiologiques notamment parce qu'il n'y a pas la structure complète des tissus permettant de générer des réponses immunitaires et il n'y a pas non plus de microbiote.
Réduction
En se basant sur notre experience de cette technique chirurgicale, les expériences seront optimisées pour réduire le nombre d'animaux au minimum. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer les différences dans l'entrée des particules vaccinales.
Raffinement
Les souris seront sous anesthesie durant la chirurgie et un anti-douleur sera administré afin que le réveil ne soit pas trop douloureux. Des point limites ont été mis en place et seront appliqués après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est le modèle de predilection pour étudier le système immunitaire humain car il ressemble beaucoup au sytème immunitaire humain. De plus, ce modèle animal est parmi les plus aisé à manipuler. Seules des souris adultes de plus de 7 semaines seront utilisées car elles ont un système immunitaire mature. Des souris transgéniques adultes seront aussi utilisées pour déterminer l'impact de certains facteurs immunitaires sur l'entrée des particules vaccinales dans la muqueuse.
Étude des altérations visuelles dans un modèle murin d’AVC ischémique.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une prothèse crânienne, subir un accès chirurgical à l'artère cérébrale moyenne, un AVC provoqué, puis six séances d'imagerie fonctionnelle d'une heure étalées jusqu'au quatre-vingt-dixième jour. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère et toutes les souris sont tuées à J+90, le porteur estimant que les maintenir en vie plus longtemps entraînerait une souffrance chronique. Les déficits fonctionnels et cognitifs consécutifs à l'ischémie cérébrale sont eux-mêmes classés sévères, et la mise à mort intervient dès une perte de poids supérieure à 20 % ou un score de grimace supérieur à 7. Le même document affirme pourtant que les acquis du laboratoire montrent des animaux qui se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, caractérisé par l'obstruction d'un vaisseau sanguin cérébral, induit des lésions cérébrales séquentielles : les premières atteintes touchent le compartiment vasculaire, suivies d'une altération de la barrière hémato-encéphalique et de lésions du parenchyme cérébral. Bien que l'injection intraveineuse de l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rtPA) soit le traitement de référence pour les AVC aigus, les séquelles neurologiques, notamment au niveau du cortex somatosensoriel, restent importantes. De nombreux travaux ont mis en évidence que l'ischémie cérébrale induit des lésions neurologiques sévères, notamment au niveau du cortex somatosensoriel de la souris. Ces lésions, consécutives à l'occlusion vasculaire, altèrent significativement la plasticité cérébrale et entraînent des déficits sensoriels persistants. Ces résultats soulignent l'importance du cortex somatosensoriel dans la perception tactile et la localisation spatiale, ainsi que sa vulnérabilité face à l'ischémie. Si les conséquences d'un AVC sur le cortex somatosensoriel ont été largement étudiées, celles sur le cortex visuel demeurent méconnues. Cette lacune souligne l'importance d'une caractérisation approfondie des atteintes visuelles post-AVC. De plus, l'utilisation d'anesthésiques chez les modèles animaux, bien que nécessaire, peut influencer les résultats expérimentaux. Ainsi, notre étude vise à combler ces lacunes en caractérisant les atteintes visuelles structurelles et fonctionnelles consécutives à un AVC, ainsi qu'à évaluer la récupération fonctionnelle du cortex visuel et du cortex barrel. Nous porterons une attention particulière à l'intégrité du système vasculaire, notamment sous traitement thrombolytique associé ou non à un neuroprotecteur, en évaluant leur potentiel prédictif des altérations cérébrales à long terme. Cette approche originale permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux atteintes visuelles post-AVC et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À notre connaissance, une telle caractérisation approfondie n'a pas encore été réalisée, soulignant ainsi l'originalité et l'importance de ce projet.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en plaques ; SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Procédure 1 (n=500) : Modèle d’AVC 1 & Procédure 2 (n=500) : Modèle d’AVC 2. - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale. Procédure 3 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 1 & Procédure 4 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 2. - J-11 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 45 minutes). - J-6/J-2 : Habituation (durée : 15-30 minutes). - J-1 : Accès à l'artère cérébrale moyenne (durée : 30 minutes). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Maintenir en vie des animaux ayant subi un AVC ischémique sur le long terme pourrait engendrer une souffrance chronique et une qualité de vie altérée, rendant la mise à mort éthiquement préférable pour minimiser leur douleur et préserver leur bien-être. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet aucune approche statistique n'a été réalisée, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.
Étude du métabolisme mitochondrial au cours de la migration neuronale dans le cerveau embryonnaire et post-natal chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une échelle de grimace et la recherche d'un défaut de toilettage servent à décider si la douleur postopératoire justifie d'intervenir. 4 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 332 d'entre elles et modéré pour 3 528. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de 45 minutes pour électroporer le cerveau de leurs embryons in utero, ou reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours, et les petits ainsi traités présentent une hyperactivité persistante avec, dans environ la moitié des cas, des crises d'épilepsie légères. Le porteur justifie ses effectifs par dix animaux par condition et quatre embryons correctement électroporés par gestante, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 4 860.
Objectifs
L’hippocampe est une structure cérébrale impliquée dans la mémorisation. Les patients atteints d’une mutation affectant certains gènes présentent des déficits cognitifs sévères et des épilepsies résistantes aux traitements. Les souris portant une mutation sur ces gènes sont un modèle de choix pour mimer la pathologie humaine et présentent des défauts de développement de l’hippocampe et également une propension à l’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre l’origine de ces défauts et de tenter de les corriger. En effet, les cellules progénitrices se divisent et génèrent des neurones qui vont migrer jusqu’à leur destination finale dans l’hippocampe. Cette migration des neurones est très finement régulée. Une des pistes de recherche nouvelle consiste à comprendre comment la régulation du métabolisme énergétique par ces gènes et les composantes des microtubules contrôle cette migration.
Bénéfices attendus
Les malformations au niveau du cortex cérébral sont des maladies rares (incidence 1:100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
Procédures
Une chirurgie est réalisée sur des femelles gestantes sous anesthésie générale avec analgésie pendant une durée d’environ 45 minutes. Une injection, soit en aiguë (injection unique sur animal vigile d’une durée de 30 secondes), soit en chronique (une injection par jour pendant 5 jours) d’agents pharmacologiques est administré à des femelles gestantes. Les embryons traités in utero sont euthanasiés à l'âge adulte au cours d'une chirurgie réalisée sous anesthésie générale, avec administration préalable d'un traitement analgésique. La procédure dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable se manifeste par une hyperactivité persistante et, dans environ 50 pour cent des cas, par des crises d’épilepsie légères survenant au repos ou pendant le sommeil lent. Ces troubles entraînent fatigue, stress et perturbation du sommeil . Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. L’injection d’agents pharmacologiques peut induire une péritonite au niveau du site d’injection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses histologiques. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont subi une chirurgie.
Remplacement
Pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes. Des données préliminaires in vitro de notre équipe, ont montré un rôle du gène étudié dans la régulation du transport axonal au niveau cellulaire. Nous étudierons son rôle sur des cultures de tranches de cerveau, ex vivo.et in vivo.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. Pour les études d’immunohistochimie après électroporation, 10 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Dans le cas du protocole d’électroporation, en moyenne, 4 embryons sont correctement électroporés dans l’hippocampe par souris gestante sur 6 embryons électroporés. Ces considérations permettent de limiter le nombre de souris nécessaires. Le nombre total d'animaux utilisé est de 4860.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois par jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin de limiter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées (points limites définis). Les souris sont placées dans les cages avec de la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont anesthésiées et placées sur une plaque chauffante, et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques, une analgésie locale sur le site d’incision. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (points limites définis et traitement des plaies). Une échelle de grimace est utilisée pour déterminer le niveau de douleur, ainsi que des comportements anormaux comme le manque de toilettage. L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique de chirurgie d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 16,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles à la naissance, 7 et 15 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype ou de son atténuation/correction.
Sclérodermie systémique : Rôle des macrophages et thérapies ciblées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux injections par jour, cinq jours par semaine, six semaines de suite: chaque souris de ce protocole reçoit une soixantaine d'injections destinées à lui faire développer une sclérodermie. 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir quels macrophages entretiennent la fibrose et à tester des vésicules issues de cellules stromales, une piste jamais essayée dans cette maladie. Le modèle a été retenu parce que la sclérodermie se déclenche chez 100 % des souris qui y sont soumises, et le porteur décrit les blessures cutanées obtenues comme réversibles à l'arrêt des injections.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie rare où le corps attaque ses propres organes, comme la peau, les poumons et le cœur. Cela cause une cicatrisation excessive (fibrose), des problèmes de vaisseaux sanguins et un mauvais fonctionnement des défenses du corps (le système immunitaire). Même si des progrès ont été fait, on ne comprend pas encore bien ce qui déclenche ces problèmes ni pourquoi ils persistent. Les macrophages, qui sont des cellules du corps jouant un rôle important pour se défendre et réparer les tissus, semblent très impliqués dans cette maladie. Il existe plusieurs types de macrophages : certains vivent déjà dans les tissus (on les appelle "résidents"), et d'autres viennent du sang pour aider quand il y a un problème (on les appelle "recrutés"). On ne sait pas encore bien lequel de ces types de macrophages est le plus impliqué dans la maladie. Aujourd'hui, les traitements pour la sclérodermie ne sont pas très efficaces. Mais il existe des cellules appelées "cellules stromales mésenchymateuses" (CSM), qui produisent des vésicules contenant des substances utiles (elles sont appelées "vésicules extracellulaires" ou VE). Ces vésicules pourraient peut-être aider à réparer les macrophages et à réduire les cicatrices et l'inflammation, mais cela n'a pas encore été testé dans cette maladie. Notre projet a donc pour objectif : 1. De mieux comprendre les différents types de macrophages dans les organes touchés par la sclérodermie. 2. De savoir si ce sont les macrophages "résidents" ou "recrutés" qui jouent un rôle plus important dans la maladie. 3. De tester si les vésicules des CSM peuvent aider à réparer les macrophages malades. 4. Et de rendre ces vésicules encore plus efficaces pour traiter la maladie. Pour cela, nous allons utiliser un modèle de souris qui imite la sclérodermie humaine. Ce modèle nous permettra d’étudier les phases de la maladie, comme l’inflammation et la cicatrisation, et de tester les effets des vésicules sur les macrophages. Nous espérons ainsi mieux comprendre cette maladie et développer un traitement plus ciblé et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants : 1. Mieux comprendre la maladie : La sclérodermie systémique est une maladie rare et grave dont on connaît encore mal les causes. Cette étude pourrait nous aider à mieux comprendre pourquoi elle apparaît et comment elle évolue. 2. Trouver un traitement : Actuellement, il n'existe pas de traitement efficace pour cette maladie, qui est mortelle. Ce projet pourrait permettre de développer un médicament capable d’aider les personnes atteintes à vivre mieux et plus longtemps. 3. Améliorer les connaissances scientifiques : En étudiant les macrophages et en utilisant des vésicules extracellulaires, les chercheurs pourraient découvrir une nouvelle façon de soigner non seulement cette maladie, mais peut-être aussi d’autres maladies.
Procédures
Pour mener ce projet, nous utilisons des souris afin d'étudier la maladie. Voici comment cela fonctionne : 1. Créer la maladie chez l'animal : Les souris vigiles reçoivent deux injections par jour, 5 jours par semaine pendant 6 semaines, cette injection dure 30 secondes. Cela permet de reproduire les symptômes de la sclérodermie pour les étudier. 2. Suivre les macrophages : Pour voir comment les macrophages se comportent, on injecte une molécule qui les rendent fluorescents. Cette injection d’une durée de 10 secondes est répétée à 3 reprises sur la souris vigile, elle permet de suivre les macrophages et de mieux comprendre leur rôle. 3. Tester le traitement : Une fois les vésicules extracellulaires prêtes, elles sont injectées dans la souris, cette injection unique est réalisé sur la souris vigile et dure 10sec. Cela permet de voir si le traitement peut réduire les symptômes de la maladie.
Impact sur les animaux
Pour réaliser cette étude, les souris reçoivent des injections permettant de reproduire la maladie. Voici comment cela se passe : 1. Injections rapides : Les souris sont contentionnées pour les injections, qui durent 30 secondes. Ces injections peuvent causer une douleur légère à modérée d’environ 1min, les souris ne montrent plus de signes d’inconfort après s’être habituées aux manipulations quotidiennes. 2. Effets sur la peau : Le modèle peut parfois provoquer des petites blessures sur la peau, mais celles-ci s’améliorent lorsque les injections sont arrêtées ou après avoir reçu le traitement. Si des blessures apparaissent et ne guérissent pas spontanément, les injections sont suspendues pour laisser le temps à la peau de cicatriser. Ces précautions permettent de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des souris tout au long de l’étude. Cela est important pour obtenir des résultats fiables tout en respectant les animaux utilisés.
Devenir
À la fin de l’étude, toutes les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et d’analyser les effets du modèle expérimental et des traitements testés.
Remplacement
À ce jour, il n'existe aucune alternative non animale permettant d’étudier de manière complète l’origine et le rôle des macrophages dans les tissus malades. Également, avant de proposer un traitement pour les humains, il est crucial de prouver que les vésicules extracellulaires sont à la fois efficaces et sûres en utilisant un modèle pré-clinique qui ressemble le plus possible à la réalité. Bien que des tests en laboratoire (modèles in vitro) soient effectués en amont, ces tests ne suffisent pas à évaluer correctement l’efficacité des traitements dans un organisme vivant, où la situation est beaucoup plus complexe. En effet, les modèles in vitro actuels ne parviennent pas encore à recréer fidèlement les interactions complexes entre les organes et les systèmes biologiques d’un organisme vivant.
Réduction
Nous avons utilisé les résultats d'expériences précédentes menées au laboratoire et avons calculé que l'inclusion de 16 souris par groupe expérimental est suffisante pour obtenir des résultats fiables et significatifs tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre de souris nous permet d’avoir confiance dans les résultats obtenus avec notre traitement pour le proposer par la suite chez les patients.
Raffinement
Les souris sont examinées quotidiennement pour détecter d’éventuelles lésions cutanées et s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. On cherche aussi des signes de douleur ou de souffrance, en utilisant des méthodes validées d’évaluation de la douleur. Par exemple en surveillant la perte de poids ou les changements dans leur comportement. Si les lésions cutanées ne guérissent pas, les injections seront arrêtées jusqu'à ce que la cicatrisation soit complète, et des médicaments contre la douleur seront administrés pour soulager les animaux. En cas de perte de poids, les injections seront arrêtées et de la nourriture enrichie sera donnée.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé pour la sclérodermie systémique a été choisi parce qu'il reproduit de manière très fidèle les caractéristiques de la maladie observées chez l’être humain et est largement reconnu comme une référence pour étudier cette pathologie. Les souris utilisées dans l’étude ont entre 8 et 12 semaines, c'est-à-dire qu'elles ont atteint leur maturité sexuelle. Les tests de mise en place du modèle ont montré que la sclérodermie se développe chez 100 % des animaux utilisés.
Exploration de l’atteinte rénale après pré-conditionnement ischémique supra-coeliaque et utilisation d’une anti-héparanase chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués à l'issue, sous une nouvelle anesthésie destinée au prélèvement des organes et du sang, 80 rats Wistar de huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de l'aorte de 60 à 72 minutes avec arrêt du flux sanguin vers les reins, puis des douleurs abdominales dès le réveil et une mobilité réduite en postopératoire. Le projet sert à caler un modèle d'atteinte rénale et à tester une molécule anti-héparanase, les retombées annoncées pour les personnes opérées d'un anévrisme de l'aorte étant renvoyées à la suite des travaux. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucun modèle non vivant ne reproduit un corps humain en activité et conclut au "besoin" de refaire la chirurgie sur le rat, "un rongeur qui est proche de l'Homme".
Objectifs
Il existe des patients ayant une maladie de l'aorte (la plus grosse artère du corps humain) qui nécessite d'être opérée. Cette maladie s'appelle les anévrismes de l'aorte. Le risque de cette maladie est le décès brutal si elle n'est pas prise en charge. Le traitement chirurgical de ces anévrysmes de l’aorte peut nécessiter un clampage rénal, c'est à dire un arrêt du flux sanguin vers les reins, induisant une souffrrance de ceux-ci. Cette souffrance rénale, le plus souvent temporaire, peut-être amenée à se chronisicer et à évoluer vers une insuffisance rénale chronique (défaut de fonctionnement du rein sur le long terme). Il existe ainsi un risque de dialyse rénale pour cette chirurgie. Quelques études sur l'animal et l'Homme ont pu mettre au point des molécules responsables de cette souffrance rénale. Notre hypothèse est de cibler ces molécules par l'intermédiaire de médicaments et de techniques chirurgicales afin de réduire cette souffrance rénale. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de mettre en place ce modèle afin de réduire cette souffrance pour pouvoir opérer les malades avec le moins de complications et de séquelles rénales possibles.
Bénéfices attendus
Nous comptons évaluer et caractériser les effets protecteurs de notre médicament et de la technique chirurgicale
Procédures
La procédure expérimentale concerne l'ensemble des 80 rats de l'étude. Pour tous les groupes la procédure chirurgicale va durr 60 à 72 minutes. La mise a mort nécessitera une nouvelle induction anesthésique pour le prelevement des organes et du sang, d'une durée de 10 minutes par rat.
Impact sur les animaux
Pour la Classe légère, la nuisance sera la contention de l'animal qui peut le stresser lors de l'injection des anesthésique et analgésique Pour la classe modérée, les douleurs attendues seront d'ordre abdominal dès le réveil pendant la période de reperfusion et en postopératoire, nous nous attendons également à une réduction de la mobilité du rat.
Devenir
Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la récupération des organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles. Cette démarche vise également à prévenir toute éventuelle souffrance.
Remplacement
La chirurgie de l'aorte se fait chez une personne vivante, avec un coeur battant et du sang circulant dans tout le corps. L'agression engendrée par cette chirurgie va être responsable d'une série de réactions qui ne peuvent se mettre en place que sur un être vivant. Actuellement, il n'existe pas encore de modèle non vivant permettant de mettre en place une copie du corps humain en activité, avec les liens étroits entre le flux sanguin et les différents organes. C'est pour cette raison que pour notre étude de modèle de chirurgie nous avons besoin de la reproduire sur un être vivant : le rat. C'est un rongeur qui est proche de l'Homme. Ce modèle de chirurgie chez le rat permet de reproduire ainsi les conditions réelles chez l'Homme de cette même chirurgie aortique. L’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle non vivant reproduisant pleinement une chirurgie aortique.
Réduction
Nous avons opté pour des études sur des espèces animales élevées à des fins scientifiques, caractérisées par une faible variation génétique entre individus. Cette homogénéité réduit la variabilité des réponses biologiques, permettant ainsi de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux requis a été estimé à partir des études antérieures au sein de notre unité. De plus, nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses lors de la mise à mort. Ce nombre d’animaux garanti un effectif suffisant pour réaliser les analyses . En l’absence de données existantes sur le traitement dans ce modele nous avons estimé qu’il faudrait 20 rats par groupe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément aux normes réglementaires, avec un enrichissement des cages pour favoriser leur bien-être. Un contrôle rigoureux de l’analgésie et de l’anesthésie sera également assuré. Pour limiter l’angoisse des animaux, les interventions auront lieu 1 à 2 semaines après leur arrivée à l’animalerie, leur laissant ainsi le temps de s’adapter et de se reposer après le transport. Les interventions chirurgicales et les prélèvements se dérouleront dans une pièce isolée et calme, avec un seul expérimentateur présent, afin de limiter les sources de bruit et les mouvements perturbateurs. Durant toute l’expérimentation, les signes cliniques suivants seront surveillés : respiration pénible, bruyante ou faible, poils hérissés, dos arrondi, position recroquevillée, prostration, et réduction importante de l’activité motrice. L’apparition de l’un de ces signes cliniques constituera un point d’arrêt anticipé, et l’animal sera immédiatement exclu de l’étude et euthanasié pour éviter toute souffrance supplémentaire en l’absence de moyens de soulagement efficaces et rapides. Une grille d’évaluation du bien-être animal, basée sur la perte de poids, le comportement et l’état général, sera utilisée pour définir des points limites. Des mesures spécifiques seront mises en place pour réduire les nuisances et les effets indésirables. Par ailleurs, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de favoriser leur habituation. Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés à raison de trois individus maximum par cage, avec un enrichissement. Le réveil post-anesthésique se fera dans des cages individuelles pour garantir leur sécurité.
Choix des espèces
Les premiers modèles ont été développés chez le rat, en particulier chez le rat Wistar. Les études antérieures menées au laboratoire sur ce type de chirurgie chez le rat ont permis d’identifier et de valider des marqueurs spécifiques de cette pathologie. Par ailleurs, notre animalerie dispose d’une infrastructure adaptée, garantissant des conditions optimales d’hébergement et de bien-être pour les animaux. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 8 semaines et qui pèseront entre 300 et 400 g.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisé dans l’étude de la mécano-biologie
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Nées dans les lignées génétiquement modifiées de l'établissement, 2 000 souris subissent l'amputation de deux millimètres de leur queue ou de leur oreille, à l'âge de deux à quatre semaines, pour que leur génotype soit identifié. La procédure dure cinq secondes et se fait sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale ajouterait une nuisance non justifiée au regard d'un niveau de souffrance qu'il déclare léger. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet. Leur sort se décide au vu du résultat du génotypage : entrée dans l'expérience d'un autre projet, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement d'organes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles d'animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. La gestion de l'élevage de l'ensemble des lignées génétiquement modifiées de notre établissement utilisateur répond à des programmes établis en amont par les responsables des projets dans lesquels elles sont nécessaires. Les programmes de reproduction (effectifs de reproducteurs, rythme de production) sont adaptés aux besoins des équipes de recherche en prenant en compte les caractéristiques propres à chaque modèle pour l’obtention des cohortes nécessaires (taux de fertilité, tailles des portées, résultats des génotypages). Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés en utilisation continue et ceux nécessaires au maintien des lignées lorsqu’elles sont régulièrement utilisées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des biopsies de tissus selon des méthodes non invasives ou couplées à une méthode d’identification des animaux. L’objectif de ce projet est de présenter les méthodes de biopsie utilisées au sein de notre équipe pour le génotypage des lignées d'animaux génétiquement modifiés à phénotype non dommageable, utilisées à des fins scientifiques dans le cadre de nos projets et thématiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles d'animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour des projets autorisés dans le cadre d’une utilsation continue. De plus le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille constitue une méthode de génotypage de gravité légère, fiable et minimisant les risques de contaminations entre échantillons.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue ou de 2mm de tissu à l’oreille x 5 secondes x 1 par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement de tissus.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de ces uniques procédures. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé dans le cadre d’une utilisation continue b/ Utilisés pour le maintien de la lignée c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
Il n’existe aucune alternative à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser in vitro. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation continue dans d’autres projets.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire, à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement en individu de même génotype). - Développer et favoriser le recours à des méthodes de biopsies non invasives chaque fois que cela est compatible avec les impératifs scientifiques des projets.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiée au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements à l’oreille sont réalisés en routine sur des animaux de 2 à 4 semaines. Le développement de l’oreille n’atteint sa forme définitive qu'a l'age de deux semaine, permettant de réaliser des biposies sans risques hémorragiques. Les prélèvements de l’extrêmité de la queue peuvent être réalisés jusqu'a 4 semaines après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Etude des mécanismes permettant aux cellules B régulatrices induites de soigner la sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 283 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 2 387 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 1 896 un niveau sévère. Une paralysie partielle leur est provoquée par deux injections sous-cutanées qui déclenchent une attaque de leur propre système nerveux central, et elles subissent par ailleurs quatre gavages, des prélèvements de sang, une biopsie de la queue dès l'âge de sept jours et plusieurs injections. L'enjeu déclaré est de comprendre comment des cellules B régulatrices, transférées en grand nombre, ramènent la maladie en rémission, avec l'espoir d'un traitement contre la sclérose en plaques. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central n'étant pas modélisable in vitro à ce jour.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B dans différents modèles de sclérose en plaques. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. L’activation des cellules pathogènes est normalement inhibée par un autre type de cellules immunitaires appelées cellules B régulatrices. Les cellules B régulatrices sont déficitaires chez les patients atteints de sclérose en plaques si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter la sclérose en plaques en transférant des cellules B régulatrices chez ces patients. Des cellules B régulatrices peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris, et il a été démontré dans ce modèle que les cellules B régulatrices étaient essentielles à la rémission de la maladie. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ces cellules sont capables de contrôler le développement de la pathologie ainsi que d’en induire la rémission. Nous souhaitons dorénavant mieux comprendre le mode d'action des cellules B régulatrices ainsi que de raffiner leur utilisation.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les cellules B régulatrices pour traiter la sclérose en plaques, et la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet thérapeutique de ces cellules immunorégulatrices au niveau de l'organe atteint dans cette maladie, le système nerveux central. Ce modèle est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie.
Procédures
Identification d'un animal : ~10 secondes. Biopsie caudale : ~5 secondes. Prélèvement sanguin : ~15 secondes. Gavage x4 : ~20 secondes/gavage. Anesthésie : ~15 minutes. Deux injections sous cutanées : ~30 secondes. Injection intra-péritonéale : ~10 secondes/injection. Une injection intra-veineuse : ~45 secondes. Anesthésie x2 par voie intra-péritonéale : ~15 minutes. Les injections sous-cutanées se font sur animaux anesthésiés. Les autres interventions se font sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection sous-cutanée = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Gavage = contention soutenue, introduction de la sonde dans l’œsophage et jusqu’à l’estomac pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle EAE=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de lymphocytes B dans deux modèles de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter la duplication inutile de travaux.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement. les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 7 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que le prélèvement pour la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage ou pour effectuer un gavage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer les gestes susmentionnés sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie.
Modification génétique sur le modèle souris par CRISPR/Cas9
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles "réformées", déjà destinées à la mise à mort par l'animalerie, sont utilisées pour prélever les embryons qui servent à tester les stratégies d'édition génétique. 325 souris au total vont être utilisées, 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 200 un niveau modéré. Les donneuses reçoivent deux injections espacées de deux jours puis sont tuées pour qu'on prélève leurs embryons, et les porteuses subissent une chirurgie de réimplantation de dix minutes. Elles sont tuées après le sevrage de leurs petits, au motif qu'une femelle déjà opérée ne peut pas être réutilisée, tandis que les souriceaux génétiquement modifiés partent vers le projet du chercheur qui les a commandés.
Objectifs
Lorsque l’on veut étudier les mécanismes biologiques complexes qui régulent le développement et le fonctionnement des mammifères, la souris est un modèle privilégié, autant pour sa facilité d'élevage que pour sa proximité génétique avec l'homme. Les recherches scientifiques en biologie s'appuient depuis de nombreuses années sur les souris modifiées génétiquement. La technique que nous utilisons consiste à délivrer un ciseau moléculaire (CRISPR/Cas9) dans un embryon de souris au stade 1 cellule, ce qui va introduire une modification génétique spécifique dans le génome. Les souriceaux issus de la réimplantation dans une mère porteuse sont testés pour détecter la modification génétique. Les animaux porteur de la modification sont ensuite accouplés pour établir une lignée génétiquement modifiée. Par rapport aux techniques précédentes (transgénèse par cellules souches embryonnaires notamment), la technique de CRISPR/Cas9 permet de produire des modèles expérimentaux plus rapidement, en utilisant moins d’animaux. Notre Institut a mis en place un plateau commun pour développer ces modèles de souris transgéniques. La mise à disposition de ce plateau équipé et de personnels expérimentés permet d’augmenter de façon importante les taux de réussite et donc à la fois de réduire le nombre d’animaux utilisés et de raffiner la mise en œuvre des procédures.
Bénéfices attendus
La souris est un modèle privilégié pour la recherche fondamentale en biologie, notamment lorsqu'il faut étudier les mécanismes complexes du développement, de la neurogénèse, etc... Les modèles transgéniques murins que nous réalisons sont indispensables pour mieux comprendre ces mécanismes. Les bénéfices attendus de ce projet sont de maintenir un niveau de compétence élevé du plateau commun, tant sur le plan matériel qu’humain, grâce à la prise en charge régulière de projets d’obtention de lignées transgéniques.
Procédures
Les animaux seront soit soumis à 2 injections d’une durée de 10 secondes chacune (espacées de 46-48 heures), soit soumis à une unique chirurgie d’un maximum de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La réimplantation est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. Les signes de douleurs ne sont plus normalement présents le lendemain de la chirurgie. Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 10 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum. Les animaux génétiquement modifiés peuvent éventuellement présenter un phénotype dommageable.
Devenir
Toutes les femelles donneuses seront mises à mort afin de pouvoir obtenir les embryons zygotes. Toutes les femelles porteuses seront mises à mort lorsque leurs petits auront été sevrés. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser une femelle qui a déjà subi une chirurgie. Les animaux générés par le plateau technique seront transférés dans le projet du chercheur qui les utilisera.
Remplacement
Le modèle souris est un modèle d’étude indispensable pour les recherches qui sont menées dans notre institut, notamment pour les thématiques de biologie du développement. Même si des modèles in vitro de remplacement sont largement utilisés (modèles in silico, cultures cellulaires 2D, cultures de neurosphères, d’organoides), seuls les modèles animaux (la souris dans notre cas) permettent des études intégrées, reflétant la complexité d’un organisme entier. Les possibilités de remplacement seront aussi évaluées en amont par chaque responsable de projet accepté par la plateforme.
Réduction
La technique d’édition du génome CRISPR/Cas9 est très efficace. Grâce aux performants outils de bio-informatique disponible, il est possible d’optimiser les résultats, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour générer les souris fondatrices modifiées génétiquement. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires, nous avons mis en place une expérience test in vitro pour vérifier/comparer les stratégies d’édition et ainsi choisir les outils les plus performants. Pour cette expérience, nous utilisons des femelles donneuses d’embryons issus de notre animalerie et qui sont réformées (et donc normalement destinées à la mise à mort). En sélectionnant la meilleure stratégie d’édition, nous pouvons limiter le nombre de femelles à réimplanter.
Raffinement
Pour la réimplantation, les souris porteuses reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié. En fin de chirurgie, les souris reçoivent une injection d’analgésique. Après la chirurgie, la surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d’expérimentation et la détection de l’atteinte des points limites.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Les femelles donneuses seront utilisées entre 4 et 7 semaines car c’est à cet âge qu’on obtient le plus grand nombre d'embryons au stade 1 cellule. Les femelles porteuses réimplantées seront mises à mort après le sevrage de leurs petits (on ne peut pas réutiliser un animal ayant déjà subi une chirurgie).