Rongeurs

L'objet réel est d'obtenir une autorisation de mise sur le marché pour des dispositifs médicaux, à partir de données fournies par un client. 166 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un implant sous la peau, sous le muscle abdominal ou dans l'utérus après ligature des cornes utérines, puis des injections d'analgésique deux fois par jour pendant trois jours, avec un risque de réouverture des sutures et des difficultés locomotrices possibles selon la zone opérée. Le nombre de rats est fixé par la norme ISO 10993-6 et ne peut donc pas être réduit, aucun test statistique n'étant prévu sur ces essais.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux, que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct et indirect avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer les risques pour l’ensemble des dispositifs implantable et/ou en contact de longue durée avec l’organisme. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de ce type de dispositif, nous réaliserons des essais d’implantation de dispositif afin d’étudier les effets locaux. Les essais d’implantation suivent la norme ISO 10993-6. Ces évaluations sont imposées par les instances réglementaires européennes et internationales.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales qui seront utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un dispositif médicale, et par conséquent sur sa biocompatibilité. Il découle d’une évaluation du risque réalisée au préalable en tenant compte de l’utilisation des dispositifs médicaux et des données fournies par le client. Ce projet fait donc partie intégrante de l’évaluation biologique des dispositifs médicaux, une exigence essentielle en matière de sécurité, exigée par le règlement européen 2017/745 et par les organismes notifiés afin d’accorder ou non l’autorisation de mise sur le marché. Ces tests pré-cliniques, qui visent à évaluer la biocompatibilité des dispositifs médicaux, ont donc pour but d’obtenir une autorisation de mise sur le marché sans risque pour la santé humaine.

Procédures

Traitement pré-opératoire (injections sous-cutanées: analgésique 1min et anti-inflammatoire 1min). Anesthésie gazeuse dans boite d'induction (quelques minutes). Traitement chirurgical sur animaux anesthésiés : implantation sous-cutanée (incision cutanée 1min, dépot de l'implant (plusieurs minutes), sutures en fin d'opération (plusieurs minutes)), implantation intra-utérine (incisions cutanées et musculaires 1-2min, ligatures des cornes utérines et dépot de l'implant (quelques minutes), suture du plan musculaire et du plan cutanée (quelques minutes), et implantation intra-péritonéale (incision du plan cutanée et plan musculaire (1-2min), dépot de l'implant sous le muscle et suture (quelques minutes), sutures cutanée en fin d'opération (quelques minutes)). Traitement post-opératoire (injection sous-cutanée de sérum physiologique (1min) et injections sous-cutanées d'analgésique (1min) 2 fois par jour pendant 3j). Pesées (avant la chirurgie puis une fois par semaine, manipulation breves durant quelques secondes). Observation de la zone d'implantation et examen clinique (tous les jours la semaine suivant l'opération puis une fois par semaine, ces observations prennent 1 à 2 minutes et sont réalisées en même temps que la pesée pour diminuer le nombre de fois où l'animal est manipulé). Analgésie (injection sous-cutanée, quelques secondes). Injection létale d’euthanasiant (1 minute). Prélévements des sites implantés et éventuellement des ganglions lymphatiques drainant le site d'implantation.

Impact sur les animaux

Des réactions locales (sécheresse cutanée, érythème, œdème) ainsi qu’une mauvaise tolérance biologique du dispositif peuvent apparaitre pendant le projet suite à l’implantation et engendrer des nuisances modérées. Les réactions attendues sont limitées aux zones d’implantation. Des effets locaux internes peuvent également être présents et remarqués en fin d’étude suite à l’autopsie et à l’analyse histopathologique. De plus l’étape de chirurgie implique l’utilisation d’Isoflurane qui peut induire des dépressions cardiovasculaires et respiratoires, ces constantes seront suivies durant toute la durée de la chirurgie. En post opératoire les sutures pourraient se réouvrir, une surveillance accrue et traitement analgésiques est donc mis en place sur les premiers jours qui suivent la chirurgie. Selon la zone opérée des difficultés locomotrices peuvent être présente jusqu’au rétablissement complet de l’animal. Par ailleurs, ces études peuvent s’étaler sur une longue période. De ce fait, certains animaux peuvent développer spontanément des pathologies non liées à l’implantation de l’élément d’essai. Dans ce cas, les possibilités de soins à apporter aux animaux sont assez réduites. Ces animaux devront être suivis régulièrement et le vétérinaire sera contacté pour statuer sur leur état de santé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d’étude pour prélèvements des sites de traitement, il est aussi possible que les ganglions lymphatiques drainant le site d'implantation soient également prélevés.

Remplacement

Les dispositifs médicaux doivent faire l’objet d’un ensemble de tests réglementaires de toxicité afin d’évaluer leur biocompatibilité. Pour ce qui est de l’évaluation des effets locaux après implantation, la norme impose l’utilisation d’animaux vivants car aucun modèle in vitro ne permet d’imiter le fonctionnement d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque procédure est fixé par la norme, il ne peut donc pas être réduit. Cependant, sauf demande contraire, ce type de projet ne sera réalisé que sur un seul sexe (le plus souvent des femelles) afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé. Le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vu du nombre de tests effectués les années précédentes. Aucun test statistique ne sera effectué dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par groupe de 2, 3 ou 5 animaux, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes et contiennent de la litière constituée de copeaux de bois résineux déshydratée puis tamisée, ainsi que des frisottis, un tunnel en carton et des briquettes en bois comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour ces tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de choix utilisé pour les études des effets locaux après implantation. Ces tests sont décrits dans le norme ISO 10993-6. Des rats Wistar seront utilisés. L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser est imposé par la norme ISO 10993-6. Nous utilisons des jeunes adultes de 8 à 15 semaines. Lorsque des femelles sont utilisées, elles doivent être nullipares et non gravides.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Vingt administrations intranasales, cinq injections dans le muscle et quatre prélèvements sanguins par souris sur dix-sept semaines : 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de tester un vaccin dirigé contre une molécule du système immunitaire, l'interleukine-5, présenté comme moins coûteux et moins contraignant que les anticorps injectables déjà commercialisés. Le porteur ajoute que les réactions immunitaires provoquées par les injections interdisent toute réutilisation, tout placement et toute adoption. Sur le choix de l'espèce, il retient des lignées consanguines et déclare que pour les souris de laboratoire "la pertinence biologique et biomédicale est établie", ajoutant que ses procédures ont "un caractère de stricte nécessité".

Objectifs

Certains globules blancs appelées éosinophiles jouent un rôle important dans plusieurs maladies inflammatoires chroniques, notamment l'asthme allergique, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la sinusite chronique avec polypes nasaux. Dans ces cas, les éosinophiles peuvent devenir hyperactifs et contribuer à une inflammation persistante, entraînant des symptômes tels que des difficultés respiratoires, des poussées fréquentes et une diminution de la qualité de vie. Une substance naturelle présente dans l'organisme, appelée interleukine-5 (IL-5), est un facteur clé de la croissance, de l'activation et de la survie des éosinophiles. C'est pourquoi des traitements bloquant l'IL-5 ou son récepteur ont été mis au point. Ces médicaments, administrés par injection, ont démontré leur efficacité pour réduire les poussées de la maladie, diminuer les hospitalisations et améliorer les symptômes et le bien-être général des personnes souffrant d'asthme éosinophilique, de BPCO et de sinusite chronique avec polypes nasaux. Bien que ces traitements soient efficaces, ils sont coûteux et nécessitent des injections à vie, ce qui peut être gênant et pénible pour les patients. Une approche alternative envisagée dans le cadre de ce projet pourrait consister à mettre au point un vaccin qui aide l'organisme à réduire l'activité de l'IL-5 sur une plus longue période. Cela pourrait offrir une option thérapeutique plus pratique et plus rentable aux personnes atteintes de maladies liées aux éosinophiles.

Bénéfices attendus

Malgré le succès relatif des médicaments à base d’anticorps thérapeutiques (anticorps monoclonaux) visant à réguler une molécule du système immunitaire (comme le messager appelé interleukin-5 « IL‑5 » dans l’asthme), ces traitements sont chers et nécessitent de nombreuses injections à l’hôpital. Nous pensons qu’un traitement tel qu’une vaccination contre une molécule du système immunitaire (IL-5) sera aussi efficace et moins couteux et contraignant afin de réduire à long terme les symptômes asthmatiques.

Procédures

Procédure 1 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 70 jours. 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 80 jours. Procédure 2 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 70 jours 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 80 jours 1 administration intranasale (durée de quelques secondes) 12 fois par animal sur une période de 6 semaines Procédure 3 : 1 injection intramusculaire (durée de quelques secondes) 5 fois par animal sur une période de 17 semaines 1 prélèvement sanguin (durée de quelques secondes) 4 fois par animal sur une période de 17 semaines 1 administration intranasale (durée de quelques secondes) 20 fois par animal sur une période de 17 semaines

Impact sur les animaux

Il se peut que l'administration d'un vaccin induise une réaction locale inflammatoire de courte durée. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume requièrent une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs poumons pour des analyses post-mortem. Par ailleurs, les réactions immunitaires induites par les injections empêchent toute réutilisation scientifique ultérieure, ainsi que tout placement ou adoption.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé avec l’objectif de le réduire autant que possible, tout en ayant suffisamment d'individus pour estimer correctement la variabilité inhérente à la recherche biologique in vivo. Ce nombre inclut le nombre nécessaire de contrôles et la nécessité de reproduire les résultats. L'estimation du nombre minimal d’animaux par groupe a été réalisée par analyse de puissance, sur la base de données publiée pour ce modèle d’asthme et des test statistiques qui seront employés ici.

Raffinement

Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux : Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des maisonnettes/igloo en plus du coton compressé (utilisé par les souris pour construire des nids) pour donner un abri immédiat aux souris, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Il se peut que l'administration d'un vaccin induise une inflammation locale. Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Une désinfection locale (bétadine ou alcool) sera réalisée avant l’injection et un massage à l’eau tiède après l’injection pour minimiser ou éviter l’inflammation locale. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal déterminé par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si une aggravation des signes cliniques est observé malgré le traitement. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis pour chaque procédure afin d’anticiper toute douleur et/ou détresse de l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention manuelle de courte durée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Pour reproduire chez la souris une malformation d'une veine du cerveau qui touche les enfants, 572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent l'ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale pendant 45 minutes, avec points de suture, puis des injections sous anesthésie une fois par jour pendant deux jours. Les embryons reçoivent dans le cerveau une injection de cinq secondes, qui peut provoquer leur mort. L'effectif n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant l'avoir réduit "au minimum nécessaire" et renvoyant l'analyse à un test statistique qu'il qualifie d'"adéquat".

Objectifs

Notre projet a pour objectif de générer un modèle d’étude de la malformation anévrysmale de la veine de Galien chez la souris. Cette pathologie pédiatrique due à la connexion directe anormale entre une artère et une veine cérébrales et conduisant à un anévrysme est associée à des troubles neurologiques graves. Ce projet vise à étudier l’interaction entre le développement du cortex cérébral et du système vasculaire, en exprimant la forme humaine contrôle et des formes mutées de deux gènes impliqués dans cette pathologie chez un modèle de souris contrôle.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est de connaître l’implication du système neuronal, en particulier le rôle de certains neurones, dans l’apparition des troubles neurologiques de la malformation de la veine de Galien dans un modèle de souris contrôle. Ce projet permet également d’étendre nos connaissances sur le rôle de ces cellules d’intérêt sur le développement vasculaire cérébral et du cerveau en général.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Certaines subiront 1 fois 1 injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Elles subiront des injections sous anesthésie générale, 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection intracérébrale d’une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie gazeuse et la chirurgie des femelles gestantes entrainent un stress modéré. Les injections intra-cérébrales in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses phénotypiques.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. En effet, le développement cérébral et vasculaire ne peut être étudié qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau et des vaisseaux sanguins.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté. Lors des actes chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et placées sur une plaque chauffante et régulièrement hydratées. Elles recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral et de la vascularisation du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.

230 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie de une heure trente à une heure quarante-cinq sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une thrombose est provoquée dans une veine, puis suivie par échographie-doppler sous anesthésie, avec une ou deux injections d'analgésique sur souris vigile. Pendant les 48 heures qui suivent la laparotomie, les souris peuvent éprouver des difficultés à se mettre debout sur leurs pattes arrière et des démangeaisons au niveau de la suture. Toutes sont tuées à l'issue, l'équipe indiquant devoir prélever le sang et les organes de chaque souris.

Objectifs

La maladie veineuse thromboembolique (MVTE), qui comprend la phlébite et l’embolie pulmonaire, est causée par la formation d’un caillot sanguin dans une veine. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste fréquente, grave et peut entraîner des complications durables ou des récidives. Les traitements anticoagulants sont efficaces mais ne suffisent pas toujours à empêcher le retour de la maladie ni les séquelles vasculaires. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes impliqués afin d’identifier les patients les plus à risque et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Depuis quelques années, des équipes de recherche ont étudié le rôle du système immunitaire dans les pathologies cardiovasculaires. Notre équipe propose une approche innovante en s’intéressant au rôle du système immunitaire adaptatif dans la physiopathologie de la MVTE. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment certaines cellules immunitaires (principalement les lymphocytes B et T) réagissent au cours d’une thrombose veineuse et d’identifier des signatures immunitaires qui pourraient servir de biomarqueurs ou de cibles thérapeutiques. Pour cela, une thrombose sera provoquée chez des souris puis étudiée à différents moments, depuis la formation du caillot jusqu’à sa résorption. Différents tissus biologiques seront prélevés, notamment la veine touchée et des organes du système immunitaire. Ces tissus serviront à quatre grands types d’expériences complémentaires afin d’obtenir une vision globale de ce qui se passe au cours de la thrombose, depuis la formation du thrombus jusqu’à sa résolution. L’ensemble de ces approches permettra de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la thrombose veineuse et pourrait contribuer au développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui bien qu’efficaces à la phase aiguë de la maladie sont associés à un risque hémorragique important ce qui nuit à la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements ne préviennent pas les complications chroniques telles que la récidive ou les atteintes vasculaires. Le but de ce projet est d’identifier précisément les cellules immunitaires impliquées dans ces complications chroniques afin de proposer de nouveaux biomarqueurs et de traitements adjuvants aux anticoagulants.

Procédures

L’ensemble des 230 animaux subiront : - une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). - Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par une échographie-doppler sous anesthésie (durée 15 minutes). - Une ou deux administration(s) sous-cutanée d’analgésique sur animal vigile (durée 1 minute maximum). - Un prélèvement sanguin terminal (souris analgésiées et anesthésiées).

Impact sur les animaux

Pour les 230 souris de la procédure, les nuisances seront les suivantes sont envisageables : - stress lié à la contention (2 à 8 selon les groupes) et à la douleur liée à l’injection de l’analgésique (1 ou 2 injections sur animal vigiles). La nuisance subie est légère et d’une durée de 1 minute maximum. - stress des animaux (1 à 8 selon les groupes) lié à l’anesthésie gazeuse : durée 3 minutes maximum, d’intensité légère. - un inconfort lié à la chirurgie est à prévoir malgré la prise en charge de la douleur. Des démangeaisons sont possibles au niveau du site de suture et les animaux, du fait de la laparotomie, peuvent éprouver des difficultés à se mettre debout sur leurs pattes arrières. Durée 48 h en post-chirurgie d’intensité modérée.

Devenir

A l'issue de la procédure, nous devrons prélever du sang et des organes sur tous les animaux, pour cela ils devront tous être mis à mort.

Remplacement

La maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Nous souhaitons justement explorer au cours du temps le lien entre le système immunitaire adaptatif et l’évènement thrombotique. Les modèles in vitro, ex vivo ou ex silico sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué en fonction des expériences que nous devrons réalisées sur les tissus prélevés, il est estimé à partir des résultats obtenus dans des projets similaires que nous avons menés. Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes qui seront ajustées en fonction de nos besoins. Les tissus prélevés seront utilisés dans 4 grands groupes d’expériences. Les échantillons prélevés dans un groupe subiront un traitement adapté à l’expérience auxquels ils sont destinés et ils seront utilisés dans leur entièreté pour cette expérience, ils ne pourront donc pas être utilisés dans un autre groupe. Selon les expériences, nous aurons besoin au minimum de 5 ou de 10-12 animaux/groupe/expérience pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Ces estimations prennent en compte le taux de réussite de la thrombose qui est de 80% (15 animaux au départ pour 12 inclus) et les résultats obtenus par notre laboratoire dans des projets antérieurs. Toutefois, quand nous aurons inclus 8 animaux par groupe, nous ferons une première estimation statistique des données obtenues. Nous arrêterons les inclusions si les résultats obtenus entre les groupes sham et chirurgie montrent une différence significative.

Raffinement

Nous avons mis en place des mesures de raffinement strictes et adaptées à notre modèle expérimental. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : (1) La survenue d’une infection (travail en condition aseptique avec des instruments stériles et du matériel à usage unique), (2) La douleur par la mise en place d’analgésie, (3) L’hypothermie par l’utilisation d’un tapis chauffant (4) La déshydratation par administration d’une solution d’hydratation, (5) le desséchement oculaire par l’utilisation d’un gel ophtalmique. En post-opératoire, les animaux auront à disposition au fond de la cage des croquettes humidifiées et du gel d’hydratation. De J0 à J2, nous administrerons de façon systématique un analgésique à tous les animaux et ils auront à disposition un gel d’hydratation supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Le bien-être et la douleur seront évalués 4-6h après la chirurgie, à J1, à J2 à l’aide d’une grille de score spécifique à notre modèle expérimental. Lors de ce scoring, tous les animaux seront anesthésiés et ils recevront une dose d’analgésique. Chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement par les responsables du projet. Une surveillance journalière sera mise en place jusqu’à la fin de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle de thrombose veineuse chez la souris que nous utiliserons est le modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, y compris par notre équipe, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. La maladie thromboembolique veineuse touchant les adultes, tous les animaux que nous utiliserons seront âgés de 7 à 12 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.

Pour mesurer les effets d'une baisse des hormones thyroïdiennes sur le cerveau adulte et sur l'odorat, 40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant deux ou six semaines une alimentation contenant une molécule qui diminue la production de ces hormones, ce qui provoque selon le porteur une baisse progressive du poids, une diminution de l'activité et un ralentissement général, plus marqués après six semaines. Deux tests suivent, l'un de discrimination où deux odeurs sont présentées successivement au coton-tige, l'autre de mémoire où la même odeur revient à trente ou soixante minutes d'intervalle, la reconnaissance se lisant à la baisse du temps d'exploration. Les souris qui perdent plus de 15 à 20 % de leur poids, se prostrent ou présentent des troubles de l'équilibre sont retirées de l'étude et tuées, les autres l'étant à l'issue des tests pour l'analyse de leur cerveau.

Objectifs

Les hormones thyroïdiennes jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau, aussi bien pendant le développement que chez l’adulte. Elles participent notamment au renouvellement de certains neurones et au maintien des circuits cérébraux impliqués dans la perception des odeurs. Lorsque la production de ces hormones diminue (hypothyroïdie), cela peut modifier l’équilibre des cellules du cerveau et altérer certaines fonctions sensorielles. Des travaux récents ont montré qu’une hypothyroïdie de courte durée peut modifier le renouvellement des neurones chez l’adulte. En revanche, les effets d’une hypothyroïdie plus prolongée sur l’organisation des circuits cérébraux et sur les capacités à distinguer ou mémoriser des odeurs restent mal connus. L’objectif de ce projet est d’étudier comment une hypothyroïdie de courte durée (2 semaines) ou prolongée (6 semaines) influence le fonctionnement du cerveau adulte et les capacités olfactives. Il permettra de mieux comprendre comment les hormones thyroïdiennes contribuent au maintien des fonctions cérébrales chez l’adulte et comment une perturbation prolongée peut affecter la perception des odeurs. À terme, ces résultats pourraient améliorer la compréhension des troubles sensoriels associés aux déséquilibres hormonaux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre comment une diminution des hormones thyroïdiennes affecte le fonctionnement du cerveau adulte. En comparant une exposition courte et une exposition prolongée, il sera possible de déterminer si les effets observés sont transitoires ou s’ils entraînent des modifications plus durables des circuits cérébraux impliqués dans la perception des odeurs. Les résultats permettront de relier des modifications biologiques au niveau du cerveau à des changements mesurables du comportement, notamment la capacité à distinguer et mémoriser des odeurs. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des effets des troubles thyroïdiens sur les fonctions cérébrales chez les mammifères. Ils pourront aider à mieux appréhender certains troubles sensoriels associés aux déséquilibres hormonaux et enrichir les connaissances fondamentales sur la plasticité du cerveau adulte.

Procédures

Les animaux recevront temporairement une alimentation spéciale contenant une molécule utilisée en recherche pour diminuer la production d’hormones thyroïdiennes. Les animaux recevront cette alimentation pendant 2 semaines (exposition courte) ou 6 semaines (exposition prolongée). Durant la période d’exposition, les animaux seront régulièrement surveillés (poids, état général, comportement). À la fin du traitement, les animaux participeront à deux tests comportementaux simples permettant d’évaluer leurs capacités à distinguer et à mémoriser des odeurs. Dans le test de discrimination, deux odeurs différentes seront présentées successivement plusieurs fois à l’aide d’un coton-tige. La capacité à distinguer les odeurs sera évaluée à partir du temps passé par l’animal à les explorer. Dans le test de mémoire, une même odeur sera présentée plusieurs fois, avec un intervalle de 30 à 60 minutes entre certaines présentations, afin d’évaluer si l’animal la reconnaît. La mémoire olfactive sera estimée à partir de la diminution du temps d’exploration lors des présentations répétées. Chaque session dure quelques minutes, ne nécessite ni contention ni privation alimentaire, et est précédée d’une courte phase d’habituation. La reconnaissance et la mémoire olfactive seront estimées à partir de la diminution du temps d’exploration lors des présentations répétées : un animal qui reconnaît une odeur y consacre moins de temps. À l’issue des tests, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre l’analyse de leur cerveau. Aucun animal ne sera maintenu en vie après la procédure, les analyses nécessitant le prélèvement des tissus. L’ensemble des interventions est limité à une modification alimentaire, des tests comportementaux non invasifs et une euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

La diminution des hormones thyroïdiennes induite par l’alimentation spécifique peut entraîner chez les animaux une baisse progressive du poids, une diminution de l’activité et un ralentissement général. Ces effets sont généralement modérés et peuvent être plus marqués après 6 semaines d’exposition qu’après 2 semaines. Aucune douleur aiguë n’est attendue et aucune intervention chirurgicale n’est réalisée. Les tests d’odeurs reposent sur l’exploration naturelle des animaux et ne nécessitent ni contention ni privation alimentaire. Ils ne devraient pas provoquer de stress important. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de mal-être dépassant les effets attendus de l’hypothyroïdie, tels qu’une perte de poids supérieure à 15–20 %, une diminution marquée de la prise alimentaire, une prostration ou des troubles de l’équilibre. Si nécessaire, ils seront retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance excessive. La procédure est classée comme modérée, avec un risque limité d’effets indésirables.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre l’analyse de leur cerveau. Les objectifs du projet nécessitent l’étude détaillée des cellules cérébrales impliquées dans le renouvellement des neurones et dans le traitement des odeurs. Ces analyses ne peuvent être réalisées que sur des tissus prélevés après la mise à mort. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. Les tissus prélevés seront utilisés exclusivement dans le cadre des objectifs scientifiques décrits. Ce choix est justifié par la nécessité d’obtenir des données fiables sur l’organisation du cerveau, tout en garantissant que la mise à mort soit réalisée de la manière la plus respectueuse possible du bien-être animal.

Remplacement

Les objectifs du projet nécessitent d’étudier les effets d’une diminution des hormones thyroïdiennes sur le cerveau adulte et sur les capacités à distinguer et mémoriser différentes odeurs (présentées de manière répétée dans des tests comportementaux standardisés). Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre le système hormonal, le renouvellement des neurones et le fonctionnement global du cerveau. À ce jour, aucune méthode alternative (culture de cellules, organoïdes ou modèles informatiques) ne permet de reproduire simultanément l’ensemble de ces mécanismes, ni d’évaluer les conséquences sur le comportement. Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions entre les hormones circulantes, les différentes régions du cerveau et les réponses comportementales. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour analyser de manière intégrée les effets d’une hypothyroïdie de courte ou de longue durée sur le cerveau et la fonction olfactive. Aucune méthode de remplacement complète n’est actuellement disponible pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les tests comportementaux utilisés pour évaluer les capacités olfactives présentent une variabilité naturelle entre individus. Afin de détecter des différences entre les groupes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, un effectif de 10 animaux par groupe a été retenu. Ce nombre est basé sur notre expérience préalable de ces tests comportementaux et correspond aux effectifs habituellement utilisés pour ce type d’étude. Quatre groupes sont constitués : un groupe témoin et un groupe traité pendant 2 semaines, ainsi qu’un groupe témoin et un groupe traité pendant 6 semaines, soit un total de 40 animaux. Chaque animal est utilisé pour plusieurs types d’analyses (comportement et étude du cerveau), ce qui permet de maximiser les informations obtenues sans créer de groupes supplémentaires. La conception expérimentale a été optimisée afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le protocole a été conçu pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux tout au long de l’étude, que l’exposition dure 2 ou 6 semaines. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe de mal-être. Leur poids ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlés chaque semaine. Les tests comportementaux reposent sur l’exploration naturelle des animaux. Les animaux seront hébergés en groupes stables dans un environnement enrichi (abri, matériau pour nid, bâtonnet à ronger) afin de favoriser leurs comportements naturels et de réduire le stress. L’ensemble de ces mesures vise à garantir un niveau élevé de bien-être animal pendant toute la durée du projet.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 est l’un des modèles les plus couramment utilisés en recherche biomédicale. Elle est bien caractérisée sur le plan génétique et physiologique, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables aux données déjà disponibles dans la littérature scientifique. Elle constitue un modèle de référence pour l’étude des hormones thyroïdiennes et de leurs effets sur le cerveau adulte. Les animaux utilisés sont des adultes jeunes (8 à 12 semaines au début de l’étude). À cet âge, le cerveau est mature mais conserve une capacité de renouvellement cellulaire active. Ce choix permet d’étudier les effets d’une hypothyroïdie acquise à l’âge adulte, sans interférence avec les processus du développement ou du vieillissement, qui pourraient fausser l’interprétation des résultats. Seuls des animaux mâles seront utilisés afin de limiter la variabilité hormonale liée au cycle reproducteur.