Rongeurs

L'expérience s'arrête quand une souris perd 20 % de son poids ou quand sa tumeur cutanée dépasse 17 millimètres de diamètre, s'ulcère ou s'infecte. 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes lymphoïdes. Elles reçoivent une à deux injections dans le sinus derrière l'œil, des cellules tumorales sous la peau après rasage, ou une infection par Listeria monocytogenes qui peut provoquer diarrhées et léthargie. Le porteur qualifie ces injections d'actes "ne générant aucun stress", et retient la souris au motif que 99 % de ses gènes sont orthologues à ceux de l'être humain.

Objectifs

Les réponses immunitaires efficaces contre les cellules cancéreuses et les pathogènes sont le résultat de processus cellulaires complexes et hautement coordonnés. Au cours des dernières décennies, d'importants efforts de recherche ont montré que les lymphocytes T jouent un rôle central dans le développement de ces processus. Le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire est apparu comme un mode d'action efficace pour renforcer l'activation des lymphocytes T contre les cellules cancéreuses et à l’inverse pouvant contrôler les réponses auto-immunitaires. Les thérapies basées sur les récepteurs antigéniques chimériques constituent une deuxième approche fructueuse et offrent un moyen unique d'armer les lymphocytes T pour éliminer les tumeurs exprimant des antigènes spécifiques. Cependant, malgré le succès remarquable de l'immunothérapie, tous les patients ne répondent pas aux nouveaux traitements et certains développent des signes cliniques liés à des effets secondaires nocifs. La régulation de l’activation des lymphocytes T implique de nombreux acteurs moléculaires. À cet égard, le ciblage des composants moléculaires impliqués dans la signalisation des cellules T est très prometteur pour contrôler leurs fonctions effectrices. Dernièrement, il a été identifié une molécule appelée Intersectine 2 (ITSN2) qui semble contrôler les niveaux d’expression de récepteurs activateurs présents à la surface des lymphocytes T. L’analyse de la souris déficiente pour l’ITSN2, démontre un phénotype activé des lymphocytes T (mais pas de phénotype dommageable pour la souris). Le but de notre étude est donc d’évaluer dans quelle mesure l’inactivation de l’ITSN2 dans des modèles murins permettent de mieux contrôler le développement de tumeurs, d’infections ou l’apparition de maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôle l’activation des lymphocytes T. Les expériences réalisées avec les modèles murins que nous possédons permettra d’identifier dans quelle mesure l’ITSN2 pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses mais aussi dans l’auto-immunité.

Procédures

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuées par souris, la procédure ne durera que quelques minutes. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront également réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress et ne prendront que quelques minutes également. La contention pour raser les souris le jour précédant l’injection sous cutanée de cellules tumorales pourra générer un stress de courte durée qui sera minimiser la réalisation du geste par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress. Une à deux injections seront effectuée par souris (selon la procédure), la procédure ne durera que quelques minutes. La croissance tumorale pourra conduire à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères. L’infection avec Listeria monocytogenes à des doses sub-léthales, est normalement contrôlé par le système immunitaire des souris de la souche C57BL/6. Les souris pourraient avoir une perte d’appétit, développer des diarrhées et être dans un état léthargique dans les premiers jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, l'analyse des réponses immunitaires nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.

Remplacement

L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte tumoral ou auto-immunitaire ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.

Réduction

Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale. Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de 6 animaux, analysés avec un test statistique nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en triplicat pour être publiables.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animale de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subi par les souris afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible par le "mal être" de l'animal. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation de cellules tumorales, injection intraveineuse, immunisation). Suite à l’injection de cellules tumorales, de L. Monocytogenes ou à une immunisation, nous porterons une attention particulière à la taille de la tumeur (cas des tumeurs), au poids de l’animal mais aussi à leur posture et leur comportement en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement post injection par les zootechniciens et un score prenant en compte des paramètres tels que l’apparence physique, la capacité à s’alimenter et à s’abreuver, le comportement et la réponse aux stimuli. Pour une souffrance avérée, un traitement analgésique sera mis en place en plus des mesures précédentes qui seront poursuivis. Dans le cas d'une croissance tumorale, en plus des paramètres suivis, l’aspect de la tumeur sera monitoré et les mesures de raffinement seront adaptés. Une perte de poids supérieure ou égale 20% par rapport au début de l’expérience, une tumeur cutanée de diamètre supérieur à 17mm ou une ulcération et/ou infection de celle-ci sera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Pour toute expérience nécessitant une manipulation de l’animal, ceux-ci seront anesthésiés avec les méthodes autorisées. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2.

Choix des espèces

Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge des souris adultes de 7 à 12 semaines seront utilisées.

Deux injections dans le cerveau, une heure d'opération chacune, puis une chirurgie terminale deux mois plus tard : 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Seize d'entre elles subissent en plus trois prélèvements sanguins alors qu'elles sont éveillées. Le projet teste un vecteur viral censé apporter une copie fonctionnelle d'un gène défectueux, première étape déclarée vers une thérapie génique de certaines formes d'autisme. Toute souris dépassant un score de 15 sur la grille de surveillance est tuée, ce que le porteur présente comme la garantie qu'aucun animal ne subira de "souffrance prolongée".

Objectifs

Certaines maladies du spectre autistique sont des troubles graves qui affectent le développement et le fonctionnement du cerveau. Ces troubles comprennent des problèmes sociaux, des comportements répétitifs et des crises d'épilepsie, qui apparaissent dès l'enfance et affectent grandement la qualité de vie des individus et de leur famille. Aujourd’hui, les traitements ne font que réduire ces symptômes, mais ne réparent pas la cause du problème. Ce projet cherche une nouvelle solution appelée thérapie génique. L’idée est d’ajouter une “bonne copie” d’un gène défectueux pour aider le cerveau à mieux fonctionner. L’étude a trois objectifs : 1.Vérifier que le traitement atteint les bonnes cellules : Nous allons observer quelles cellules du cerveau peuvent recevoir cette nouvelle copie du gène. 2.Tester si le gène fonctionne bien : Nous vérifierons si les neurones traités produisent correctement la protéine dont ils ont besoin. 3.S’assurer que le traitement est sûr : Nous nous assurerons qu’il n’y a pas d’effets secondaires graves ou de dommages au cerveau, pour qu’un jour ce traitement puisse être utilisé chez l’homme. Ce projet pourrait constituer une étape majeure vers un traitement innovant et personnalisé pour les personnes atteintes de ces troubles.

Bénéfices attendus

1. Un nouveau traitement pour l’autisme : ce projet cherche une nouvelle façon de soigner certaines formes d’autisme causées par un problème dans un gène. Il vise à réparer ce dysfonctionnement dans le cerveau pour aider les neurones à mieux fonctionner. Ce traitement pourrait aussi servir pour d’autres maladies du cerveau. 2. Mieux comprendre l’autisme : en étudiant comment un gène défectueux affecte le cerveau, les chercheurs pourront mieux comprendre pourquoi certaines personnes développent de l’autisme ou de l’épilepsie. Ces découvertes aideront à améliorer les traitements et à mieux soigner d’autres troubles du développement cérébral. 3. Un pas vers un véritable remède : si les résultats sont positifs, ce projet pourrait mener à des tests sur l’homme et, à terme, à des traitements personnalisés. En résumé, cette recherche pourrait changer la vie des personnes atteintes d’autisme d’origine génétique et ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour d’autres maladies du cerveau.

Procédures

Toutes les souris recevront deux injections intracérébrales (l'opération dure une heure), et après deux mois, pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Une partie des souris, (16 animaux au total), feront l'objet d'une procédure de prélèvement sanguin (avec les animaux éveillés, cette manœuvre dure 30 secondes par animal), trois fois pendant la durée du projet.

Impact sur les animaux

Douleur et inconfort après l'opération. Les animaux peuvent ressentir une légère douleur au niveau de la tête ou de la mâchoire pendant environ 12 heures après l'opération. Stress associé à la manipulation, risque d'infection. Réactions locales à la plaie. La petite plaie à la tête pourrait s'infecter ou s'enflammer. Risque pour les connexions neuronales. Il existe un très faible risque que l'injection perturbe d'importantes connexions cérébrales, ce qui pourrait affecter certains mouvements.

Devenir

Dans cette étude, tous les animaux seront euthanasiés avec un chirugie terminale sous anesthésie à la fin de la procédure. Cette étape est nécessaire pour permettre l’analyse approfondie de leurs organes, notamment du cerveau, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques étudiés. Ces analyses, réalisées selon des techniques histologiques précises, sont indispensables pour obtenir des résultats fiables et avancés, contribuant ainsi à la recherche scientifique et médicale. Cette approche garantit également que les animaux ne subissent aucune souffrance prolongée, en accord avec les principes de bien-être animal et les réglementations en place.

Remplacement

Malgré les efforts continus pour développer des modèles alternatifs, l'utilisation de souris reste indispensable dans les études sur les maladies neurologiques, en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d'examiner ces mécanismes au sein d'un organisme vivant. Bien que les cultures de cellules souches neurales et les organoïdes cérébraux fournissent des informations précieuses sur les réseaux neuronaux, ils ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement cérébral complexe, en particulier les interactions cruciales entre les différents types de cellules. Ces interactions sont essentielles pour comprendre les altérations des réseaux neuronaux dans des conditions telles que l'épilepsie ou certains comportements associés aux troubles du spectre autistique. Les progrès de la modélisation informatique permettent des simulations utiles de certains aspects des réseaux neuronaux, mais ces modèles sont limités par des données restreintes et la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris, bien qu'elles ne reproduisent que partiellement les comportements et les altérations des réseaux humains, sont particulièrement utiles dans leurs versions génétiquement modifiées pour des gènes spécifiques. Ces modèles constituent une base précieuse pour l'étude du rôle de certaines protéines, permettant aux chercheurs de tester comment moduler ou restaurer l'expression des gènes dans le cadre de pathologies telles que l'épilepsie ou l'autisme, et ainsi de mieux comprendre des mécanismes similaires chez l'homme et de développer des traitements potentiellement plus efficaces. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons d'abord chaque vecteur viral en culture cellulaire pour nous assurer qu'il exprime correctement les protéines. Seuls les vecteurs qui passent ce contrôle de qualité en culture seront ensuite utilisés sur des animaux vivants, ce qui réduira la nécessité d'utiliser des modèles animaux uniquement lors des étapes cruciales de validation.

Réduction

Nous avons analysé les données antérieures de notre laboratoire et examiné la littérature existante afin de déterminer le nombre minimum d'échantillons nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Étant donné que nous incluons des animaux mâles et femelles et que nous comparons trois conditions différentes en utilisant des techniques d'histologie, nous avons soigneusement calculé la taille de l'échantillon nécessaire. Plutôt que de commencer avec un nombre fixe, par exemple 10 par groupe, nous optimisons le nombre d'animaux sur la base de notre expérience antérieure et des études publiées. Cette approche nous permet d'utiliser le moins d'animaux possible tout en maintenant la validité scientifique de nos résultats.

Raffinement

Tout au long du projet, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre pour éviter tout impact négatif sur le bien-être des animaux. L'expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d'hébergement appropriées, l'enrichissement de l'environnement et la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse des animaux. Ils sont placés dans des avec une maison en carton, de la laine de coton et une roue d'exercice, afin de répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera vérifié une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures pour réduire la douleur. Après les procédures, de la nourriture gélifiée et de l'eau seront placées sur le sol pour faciliter l'alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour suivre de près les effets des interventions. Les animaux présentant l'un des points limites ou un score supérieur à 15 dans ce tableau seront systématiquement euthanasiés.

Choix des espèces

L’objectif principal de ce projet est de développer un nouveau traitement. Avant d’y parvenir, nous devons d’abord tester la sécurité et l’efficacité de notre vecteur viral chez des souris. Nous utilisons de jeunes souris adultes âgées de 2 à 3 mois, car elles offrent plusieurs avantages. À cet âge, leur cerveau est complètement formé et elles sont en bonne santé, ce qui garantit des résultats fiables. Leur crâne est également suffisamment stable pour permettre des injections précises dans les régions spécifiques du cerveau. Cela nous aide à analyser où le vecteur se distribue et quels neurones il cible, ce qui est crucial pour améliorer la précision et la validité des résultats. Ce travail est une étape essentielle pour développer des solutions thérapeutiques innovantes pour des maladies complexes.

Deux séjours de quarante-huit heures seule en cage d'enregistrement pour 292 souris, une chirurgie d'injection intracérébrale de trente minutes pour 242 d'entre elles, puis une chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever le cerveau : 350 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à relier un gène de l'hypothalamus antérieur au sommeil et à la thermorégulation, en s'appuyant sur les troubles du sommeil observés chez les personnes diabétiques. Les atteintes annoncées restent vagues, avec des "perturbations du rythme de sommeil" envisagées et une sensibilité après chirurgie dont les animaux "récupèrent habituellement en quelques heures". Le régime riche en graisses qui rend ces souris obèses et diabétiques figure dans la liste des effets néfastes, sans apparaître parmi les procédures décrites.

Objectifs

Les variations de glycémie liées à un diabète mal contrôlé sont fréquemment associées à des troubles du sommeil (sommeil fragmenté, cauchemars, apnées du sommeil, fatigue diurne) et à des défauts de thermorégulation (sueurs, hypothermie). L’hypothalamus antérieur contrôle plusieurs fonctions telles que le sommeil et la thermorégulation. Nous avons observé qu’un gène connu pour contrôler la synthèse de l’insuline en réponse au glucose dans le pancréas est également présent dans l’hypothalamus antérieur. Ce projet expérimental a pour but : (1) de caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones exprimant ce gène dans l’hypothalamus ; (2) d’étudier le rôle de ce gène dans l’hypothalamus antérieur et sa régulation par le glucose; (3) d’établir dans quelle mesure la régulation de ce gène pourrait être responsable des troubles du sommeil et de la thermorégulation.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce travail apportera une meilleure connaissance des réseaux neuronaux contrôlant le sommeil et la thermorégulation ainsi qu’un éclairage moléculaire nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles pour le traitement des troubles du sommeil associés au diabète, en ciblant par exemple les modifications post-traductionnelles de ce facteur de transcription.

Procédures

enregistrement de l'activite veille/sommeil en cage individuelle ( 2x 48h, n=292 souris ) procédure chirurgicale injection intracerebrale ( n= 242 animaux , durée de l'intervention : 30 minutes + 1h de reveil) chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau (n=242 animaux durée analgesie 30 minutes avant +15 minutes)

Impact sur les animaux

En l’absence de stimulation, aucun phénotype dommageable n’a été rapporté les lignées murines utilisées dans ce projet. L’effet de la stimulation de ces quelques neurones de l'hypothalamus antérieur est transitoire (1h) et son effet sur les animaux sera suivi en continu. Des perturbations du rythme de sommeil sont envisagées. Les chirurgies sont susceptibles d’entrainer une sensibilité post chirurgie. Les animaux récupèrent habituellement en quelques heures. Le sommeil des animaux est enregistré en en cages individuelles. Le régime alimentaire riche en graisse induit une obésité et un diabète.

Devenir

les animaux sont mis a mort pour permettre l'analyse post-mortem de leur cerveau (expression de gènes et de protéines d'interêt)

Remplacement

Il n’est pas possible d’étudier une fonction physiologique complexe comme la régulation du sommeil hors d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est optimisé pour permettre de mettre en évidence le résultat de façon statistiquement significative (puissance du test 80% risque alpha 5%) tout en minimisant le nombre d’animaux requis . La taille des groupes est donc calculée dans chacune des procédures en fonction des effets attendus. Dans le cas de l'étude anatomique, uniquement descriptive, le nombre retenu (n=10) est celui généralement mentionné dans les publication anatomiques comparables. La séquence expérimentale est optimisée (ex : étude anatomique suivant les test de sommeil) de façon a minimiser le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.

Raffinement

Les modèles conditionnels dans lesquels les modifications génétiques sont restreintes à quelques neurones de l’hypothalamus antérieur permettront d’éviter des phénotypes plus dommageables. Pour les enregistrements (48h), les animaux sont placés avec les memes elements d'enrichissement en cages individuelles où ils gardent un contact visuel entre eux. Les approches non invasives sont systématiquement privilégiées. L’administration par voie orale se fera, après habituation, en proposant le principe actif dans un petit volume de gélatine aromatisé aux fruits rouges. Lorsqu’une expérimentation nécessite une intervention chirurgicale, en plus de l’anesthésie générale, des anesthésiques locaux et des analgésiques seront systématiquement administrés en péri-opératoire.

Choix des espèces

L’existence et la disponibilité de souris génétiquement modifiées qui n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes (dont la température est régulée) nous permet d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveaux-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes, mais pas âgées, entre 2 et 6 mois.

1 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, elles passent trois séances d'imagerie par semaine, subissent une irradiation localisée de la tumeur et, pour certaines, l'ablation chirurgicale de la tumeur primaire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale et les traitements réduisent la mobilité et affaiblissent les animaux, et espère montrer que des modulateurs du système immunitaire rendent le cancer du sein triple négatif sensible à la radiothérapie. Cet effectif de 1 660 souris n'est adossé à aucune donnée publique, le porteur indiquant qu'un "outil informatique" a servi à le calculer.

Objectifs

Le cancer du sein est la principale cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde. En raison du manque de cibles thérapeutiques, le cancer du sein triple négatif (TNBC) est le sous-type le plus agressif et résistant aux thérapies standard. L'un des traitements courants du TNBC est la radiothérapie, mais la radiorésistance est un obstacle majeur dans cette malignité. Parmi tous les composants du microenvironnement tumoral, les cellules du système immunitaire sont hautement recrutés lors de la radiothérapie et des données antérieures suggèrent qu'ils sont associés à la résistance des cellules tumorales. Ici, nous prévoyons de comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans la modulation de la radiorésistance du cancer du sein et de valider les mécanismes associés. L'objectif principal de ce projet est donc d'identifier de nouvelles cibles (comme récepteurs sur les cellules) pour le développement de thérapies de sensibilisation à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Dans ce projet et à court terme, nous évaluerons l'efficacité antitumorale des modulateurs du système immunitaire dans la sensibilisation à la radiothérapie. Nous espérons démontrer la bonne efficacité de l'association de modulateurs du système immunitaire et de la radiothérapie pour obtenir des effets antitumoraux. À long terme, cette combinaison représente un modèle original et novateur de coopération thérapeutique dans la lutte contre le cancer du sein.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes) par semaine. Les animaux subiront une irradiation localisée sur la tumeur par animal sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Au cours de chaque injection de cellules et radiotherapie, les souris seront anesthésiées (anesthésie générale). Certaines souris auront des injections de médicament (n=2, anesthésie locale, durée 1 minute). Les tumeurs primaires seront retirées de certains animaux sous anesthésie générale (n=1, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la mobilité de la souris et affaiblir la souris, avec des retentissements locaux ou systémiques modérés. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections sous anesthésie générale et des séances d'imagerie, qui leur occasionneront un stress ou une douleur légers et temporaires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem pour étudier les modifications/mécanismes biologiques induits par les différents traitements.

Remplacement

Les modèles animaux sont également necessaires pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte incluant le environnement tumoral, permettant aux cellules tumorales d'interagir avec l'environnement (incluant les cellules immunitaires dépendantes des médiateurs de type cytokine ou les cellules du reste de l'organisme). Ceci est important dans le contexte de la radiothérapie (par exemple, l'effet « bystander » de l'irradiation, c'est-à-dire les effets que les cellules irradiées peuvent exercer sur les cellules non irradiées à proximité ou à distance). Il n'existe pas de modèles de remplacement pour une telle étude.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum tout en gardant un effet statistique significatif. Un outil informatique a été utilisé pour calculer le nombre d'animaux nécessaires tout en prenant en compte des données préliminaires.

Raffinement

Toutes les interventions seront menées sous anesthésie locale ou générale. Un suivi quotidien clinique sera effectué. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi. De plus, en cas de perte de poids ou de sign d'affaiblissement, les animaux auront un aliment énergétique adapté, plus préhensile.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: -La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. -Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue -Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 6 à 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. En effet, le cancer du sein apparaisse durant l'age adulte, l'utilisation de souris adulte permet donc de mimer au mieux l'environnement dans lequel se développe le cancer.

Les souris dont la prise de poids finit par gêner la locomotion sont retirées du projet et mises à mort. 88 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes, la moitié après un transfert vers un second établissement. Chacune est pesée quinze ou seize fois, mise à jeun quatre ou quinze heures, gavée deux à trois fois, saignée à la queue trois ou quatre fois, injectée dans l'abdomen puis dans le sinus derrière l'œil, et passe quarante-huit heures seule en cage de mesure. Le porteur décrit ses lignées génétiquement modifiées comme des souris qui "se portent bien", et retient l'espèce pour la ressemblance de son métabolisme oro-intestinal avec celui de l'être humain.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un apport énergétique et une inflammation élevés. CD36 est un récepteur présent notamment au niveau des membranes des cellules intestinales qui contrôle la formation des lipoprotéines synthétisées par l’intestin au cours de la digestion. Ces lipoprotéines véhiculent les lipides alimentaires mais aussi des molécules pro-inflammatoires issues du microbiote intestinal. Le premier objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal sur la régulation de la dépense énergétique de souris rendues obèses par un régime de type occidental (riche en graisses et en sucres). Nos précédents travaux de recherche laissent envisager que le CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies telles que l’obésité. Pour ce faire nous utiliserons des souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau des cellules intestinales comparées à des souris contrôles. 32 souris contrôles et 32 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime standard, soit avec un régime occidental durant 15 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Le deuxième objectif de ce projet consiste à évaluer les conséquences d’une sur-activation de CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité. De précédents travaux ont permis de montrer que des leurres lipidiques, c’est-à-dire des molécules mimant les lipides mais n’apportant pas de calorie, diminuaient la consommation de lipides chez la souris obèse, en activant CD36 au niveau des papilles gustatives. Dans ce projet, nous étudierons à présent l’effet d’un leurre lipidique au niveau intestinal sur la mise en place de l’obésité induite par une régime occidental chez la souris. Pour cela, 24 souris contrôles seront nourries avec ce régime durant 8 semaines (temps nécessaire pour observer des effets dans ce cas). 12 souris recevront chaque jour le leurre lipidique en complément de leur alimentation et seront comparées à 12 souris recevant un placebo. Au total, 88 souris seront utilisées dans ce projet, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le CD36 intestinal modifie-t-il la dépense énergétique en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 2. Le CD36 intestinal modifie-t-il les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et la perméabilité intestinale lors d’un régime riche en acides gras saturés ? 3. La suractivation de CD36 intestinal par des leurres lipidiques affecte t-elle la mise en place de l’obésité ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaires.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire pour la procédure 1 (15 pesées sur 15 semaines de régime) et bi-hebdomadaire pour la procédure 2 (16 pesées sur 8 semaines de régime), ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par une technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 0, 2, 4 , 9 ou 10, et 15 pour la procédure 1(5 mesures par souris au cours du régime), et en semaines 0, 2, 4, et 8 (4 mesures par souris au cours du régime) Dans la procédure 1, 2 gavages seront réalisés : en S12 avec de l’huile et une molécule fluorescente en solution aqueuse, et en S14 avec une solution aqueuse contenant la molécule fluorescente. Dans la procédure 2, 3 gavages seront réalisés (durée de moins de 10 secondes à chaque fois) : en S5 avec du glucose, en S7 avec une solution aqueuse contenant une molécule fluorescente et en S8 avec de l’huile. Dans la procédure 2 uniquement, une injection intrapéritonale sera réalisée en S4 avec de l’insuline. L’injection intrapéritonéale est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé et habitué à le réaliser. Une injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous anesthésie générale sera réalisée avec une molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme (en S14 dans la procédure 1 et en S8 dans la procédure 2). Cette injection rapide (moins de 10 secondes) est effectuée sous anesthésie par du personnel formé. Des prélèvements sanguins au niveau caudal par simple pression après une légère incision du bout de la queue (0,5mm) et sous anesthésie locale seront également réalisés en semaines 11, 12, et 14 pour la procédure 1 et en semaines 5, 6, 7 et 8(environ 1min par souris par prélèvement). Dans la procédure 1, une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 9 ou 10. Cette mesure indolore et non invasive s’effectue dans des cages spécifiques. Elle nécessite 2 jours d’isolement dans cette cage. Dans la procédure 1, toutes les interventions se dérouleront dans l’EU1 jusqu’à la semaine 15. En semaine 16, la moitié de l’effectif (32 souris) sera transféré dans l’EU2 dans des boites de transports adaptées et y restera 48H. Les animaux seront alors soumis à un jeûne court de 4H avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale. La procédure 2 se déroulera exclusivement dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux en régime WD peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’est jamais observé après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris lors des mesures de dépense énergétique pendant 48h, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les tests de tolérance orale au glucose et à l’insuline, et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent des mises à jeun de 4 ou 15h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact. La mise à jeun nécessaire de 15h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Le test de tolérance orale au glucose et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être stressant pour les souris. Le test de tolérance à l’insuline nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale qui peut également être invasive. L’analyse de la composition corporelle nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène. L’injection de la molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme sera réalisée par voie intra-veineuse sous anesthésie à l’isoflurane par un personnel formé maitrisant ce geste.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, la moitié de l’effectif (32 souris) sera mis à mort dans l’EU1 sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. L’autre moitié (32 souris) sera transféré dans l’EU2 puis mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides.

Raffinement

Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale (application au bout de la queue pour les prélèvements sanguins à la queue), soit sous anesthésie générale (pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids, prise de poids pouvant gêner la locomotion). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet (mise à mort sous anesthésie générale). Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Le transport des animaux dans l’EU2 sera effectué au moyen de boites opaques spécifiquement prévues pour les rongeurs, dans lesquelles seront disposées de la nourriture et de l’eau gélifiée, ainsi qu’un enrichissement supplémentaire afin de limiter le stress lié au transport. De plus, les 2 EU étant très proches, le temps de transport sera très court (environ 15minutes).

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie locale, puis une irradiation sous anesthésie générale, à des doses variables, pour comparer la radiothérapie flash à la radiothérapie conventionnelle sur trois tissus sains : poumon, intestin, peau. Les atteintes annoncées vont de la perte d'appétit à une perte de poids "légère à sévère", avec difficultés respiratoires, isolement, diarrhée et lésions cutanées inflammées. Le porteur présente la technique testée comme "l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie" et une "véritable révolution", et juge "urgent" de lancer ces programmes précliniques.

Objectifs

Les traitements par radiothérapie conventionnelle ont la difficulté d'arriver à délivrer une irradiation localisée avec une dose suffisante pour l’éradication de la tumeur tout en préservant les tissus sains environnants. Actuellement, les techniques d’irradiation médicale permettent de limiter l’atteinte des tissus sains sans toutefois l’éviter et les combinaisons de r&diothérapie avec les médicaments de chimiothérapie tendent à exacerber les effets secondaires. La raduithérapie flash est une nouvelle technique qui consiste à délivrer une forte dose à un très haut débit de dose (4500 à 9000 fois plus élevé, et beaucoup plus rapide) permettant une réponse anti-tumorale efficace tout en épargnant les tissus sains, limitant ainsi les toxicités liées à l’irradiation. À l'heure actuelle, elle est reconnue comme l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie, à la croisée des chemins entre technologie, physique, chimie et biologie, et considérée comme une véritable révolution dans le domaine de l’oncologie. Cette nouvelle modalité d’irradiation prévoit de remplacer d’ici à 4-5 ans les séances de radiothérapieconventionnelles par un ou quelques séances d’irradiations flashs de moins d’une seconde, beaucoup plus précises et efficaces mais surtout avec une moindre toxicité sur le tissu sain. Cependant, les mécanismes biologiques restent mal compris et les limites de l’effet flash (en dose par séance, en débit de dose…) mal définis et il devient donc urgent de lancer des programmes de recherche pré-clinique et translationnelle visant à mieux comprendre et optimiser le transfert en clinique de cette nouvelle technique. Dans ce projet nous avons fixé deux objectifs: 1-Valider l'effet flash sur plusieurs modèles de toxicité radio-induite, à savoir, la toxicité pulmonaire, la toxicités intestinale et la toxicité cutanée. 2-Etudier les mécanismes biologiques impliqués dans cet effet flash.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme consistent à fournir un rationnel préclinique et une preuve de concept pour la validation de l'utilisation de la radiothérapie flash en clinique. A travers ce projet nous visons à assurer un meilleur transfert en clinique de la radiothérapie flash et en toute sécurité pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une injection (durée 1 minute, anesthésie locale) et un prélèvement de sang (durée 1 minutes, anesthésie locale). Ils auront aussi des irradiations à des doses différentes (une fois par animal, durée de 1 à 10 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort et ou un stress léger lié à la manipulation des animaux pour les préparer au traitement de radiothérapie. En raison des effets secondaires de la radiothérapie, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social. De plus une perte de poids légère à sévère peut être observée chez les animaux ayant reçu le traitement de radiothérapie. Les nuisances induites peuvent être différentes en fonction de l’organe/tissu irradié. Certains animaux pourront perdre présenter une perte de poids modérée après irradiation. De plus, une difficulté respiratoire peut être observée chez ces animaux, associée à un comportement d’isolement. Une diarrhée peut (rarement) survenir chez les animaux irradiés. Certains animaux pourront développer une toxicité cutanée qui se manifeste sous forme de lésions inflammées de garde léger à modéré comme celles observées chez les patients.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour analyses des effets de la radiothérapie flash sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie flash sur les tumeurs et sur les tissus sains, en comparaison avec la radiothérapie conventionnelle. Ceci exige donc un système biologique dynamique complet en interaction direct avec le microenvironnement de la tumeur. L’étude du recrutement des cellules immunitaires dans le site irradié ainsi que leurs interactions complexes nécessitent le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire et suffisant.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie locale ou générale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes. Les études des mécanismes biologiques, impliquant des voies de signalisation moléculaires et cellulaires différentes, nécessite d’avoir recours à un organisme adulte présentant des tissus/organes matures.