Rongeurs

Des souris gestantes subissent une chirurgie abdominale d'environ une heure pour que des cellules humaines soient greffées à leurs embryons, et d'autres souris reçoivent ces cellules à la naissance, dans chaque hémisphère du cerveau, ou adultes, par une injection dans le cerveau d'une heure sous anesthésie. 1 010 souris, dont des souris immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les mécanismes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme que ces processus ne peuvent être étudiés que sur des animaux non-humains vivants "présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés", alors qu'aucun test de mémoire ou de comportement ne figure parmi les procédures et que les analyses sont prévues "exclusivement ex-vivo". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, et le cerveau de certaines, opérées puis cicatrisées, est prélevé pour apprendre à réaliser des coupes de tissu.

Objectifs

Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.

Procédures

-Injections sur l’ensemble des animaux des 4 procédures (temps d’injection / animal : 15 secondes). -Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. -Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. -Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. -Greffe de cellules et/ ou de vecteur chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques. Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques. Pour les souris devant subir une chirurgie abdominale, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans l’étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure du fait des analyses prévues exclusivement ex-vivo. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Certains animaux ayant subi une chirururgie et totalement cicatrisés peuvent être utilisées pour prélèvements de cerveaux (apprentissage de coupes tissulaires).

Remplacement

L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en chirurgie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.

Réduction

Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques injectables. En absence d’effet, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.

700 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune opérée une heure à une heure trente pour recevoir un implant optique fixé sur le crâne, puis observée sous microscope jusqu'à dix fois pendant une à deux heures. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées, le cerveau prélevé. Une partie d'entre elles est maintenue éveillée sur un tapis roulant pendant ces séances, et le porteur signale après l'opération une douleur, une perte de poids, un risque d'inflammation et la perte possible de la barre de tête. Les retombées médicales annoncées, un meilleur ciblage des thérapies géniques en cas de maladie visuelle, restent une perspective, l'objet immédiat étant de mettre au point de nouveaux microscopes.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant simultanément de contrôler l’activité des neurones avec des protéines sensibles à la lumière et de les imager dans des régions du cerveau en profondeur en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques pour détecter l’activité des neurones. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes combinant imagerie et activation des neurones du cerveau avec la lumière en combinaison avec des fibres optiques et des microlentilles. Ces outils constituent des techniques sans précédent pour l’étude du cerveau, permettant de contrôler l’activation de cellules choisies dans des circuits neuronaux, selon des schémas mimant des processus physiologiques. Le projet nous permettra d’obtenir la cartographie des connexions interhémisphériques des circuits visuels en profondeur dans le cerveau et de pouvoir démontrer le lien entre circuits neuronaux impliqués dans la vision ainsi que dans les comportements moteurs et sensoriels.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de développer de nouvelles techniques d’optiques pour la manipulation des neurones avec la lumière et l’imagerie en simultanée à travers de microlentilles. Les circuits neuronaux moteurs et visuels en profondeur pourront être étudiés avec ces nouvelles techniques, plus précises par rapport aux méthodes actuellement utilisées. Cette étude nous permettra aussi de comprendre la structure et l’intégration de circuits et connexions interhémisphériques responsable de la perception, navigation et de la vision, afin de cibler au mieux les thérapies géniques en cas de pathologie (par exemple visuelle).

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser un système optique pour étudier l'activité neuronale. (durée de la chirurgie : 1h-1h30). Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant (durée : 1-2h, maximum 10 fois). Une partie des animaux observés au microscope sera injectée sous anesthésie avec un fluorophore. Une partie des animaux observés en microscopie sera libre de bouger (durée : 1-2h, maximum 10 fois). Ces animaux subiront une anesthésie pour la mise en place du support de la fibre (5 minutes).

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants permanents, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire (1 à 3 jours après l’opération). Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Les enregistrements sous le microscope pourront causer un léger stress des animaux. Des rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie ou saignements. Des rares effets pourront se produire après les chirurgies : perte de la barre de tête en post-opératoire ou inflammation. La contention légère de l'animal pour les injections et pour les expériences d’imagerie peut entrainer un léger stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle et motrice ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.

Réduction

Dans cette étude, le nombre total d'animaux impliqués a été rigoureusement déterminé afin de répondre aux objectifs expérimentaux. La taille des effectifs a été établie en se basant sur un calcul de puissance statistique, garantissant ainsi que l'échantillon est suffisamment représentatif pour détecter un effet significatif avec des tests statistiques tout en minimisant l'utilisation d'animaux conformément aux principes éthiques. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 700 animaux.

Raffinement

Dans cette expérience, les animaux seront logés par groupes de 5 dans des cages spécialement ventilées pour garantir une bonne circulation de l'air. Ils seront examinés chaque jour par des scientifiques et des professionnels qualifiés, et bénéficieront de conditions de vie optimales : ils auront un environnement enrichi pour jouer et se dépenser, ainsi que de la nourriture et de l'eau en continu. Pour les animaux en cours d’expérimentation, un marquage spécial sera utilisé afin de les surveiller de près. Chaque test est encadré par des règles spécifiques visant à s’assurer du bien-être des animaux, et des critères clairs ont été définis pour interrompre l'expérience si nécessaire. À chaque étape, les conditions sont adaptées pour minimiser le stress des animaux. Par exemple, après une intervention chirurgicale, un gel nutritif sera mis à disposition si un animal perd du poids. Selon les procédures, des traitements d’analgésie et anesthésie seront mis en place. Afin de détecter le moindre signe de souffrance le plus tôt possible, une grille d’évaluation sera utilisée, ce qui permettra de prendre des mesures rapides et, si nécessaire, de pratiquer une euthanasie dans les cas où la douleur ne peut être contrôlée. Enfin, avant certaines observations spécifiques (comme l’observation au microscope), les animaux seront progressivement habitués à cet environnement pour réduire leur stress et faciliter le déroulement des expériences.

Choix des espèces

Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 7 semaines et 1 an avec circuits neuronaux matures.

Jusqu'à vingt et une injections, dix-huit séances de radiothérapie sous anesthésie et douze gavages pour un seul animal : 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un des modèles de cancer du sein employés provoque des métastases pulmonaires à partir de trente jours, avec une détresse respiratoire et la mort de l'animal. Le porteur affirme que les séances de radiothérapie n'entraînent aucune douleur et se dispense donc d'antidouleur, et qu'aucune toxicité n'est attendue aux doses employées. Le recours à des souris génétiquement homogènes est présenté comme permettant de travailler avec un nombre d'animaux "relativement réduit", ici 2 500.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des combinaisons de Radiothérapie (RT) avec des médicaments anticancéreux. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association et les fractionnements (dose et nombre de séances de RT) afin de pouvoir développer des essais cliniques avec les schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT guidée par l’image et dédié au petit animal, permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, à la fois par l’évaluation de nouvelles combinaisons à bases de RT mais aussi l’optimisation des schémas de combinaisons (médicaments administrés avant, durant ou après la RT, et optimiser les doses et fractionnement de la RT…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses en termes d’efficacité (évaluée par la croissance des tumeurs) sans induire de toxicités. Celles-ci pourront être sélectionnées pour le développement d’essais cliniques.

Procédures

- Injections: Une seule injection de cellules tumorales durant 5 secondes avec anesthésie des animaux sera nécessaire. Les médicaments anticancéreux seront aussi administrés par injection (3 injections/semaine pendant 1 mois soit 12 injections maximum) durant 5 secondes sur des animaux non anesthésiés ou vigiles suivant le site d'injection. Il y aura également 4 séances d'imagerie maximum par IRM et bioluminescence pour une durée entre 5 et 45 minutes qui nécessitera l'anesthésie des animaux et une injection (durant 5 secondes) par séance soit 8 injections maximum. Chaque animal pourra donc recevoir jusqu'à 21 injections maximum durant une procédure. - Gavage: admnistration durant 30 secondes de médicaments anti-cancéreux par voie orale sur des animaux non anesthésiés (3 gavages/semaine pendant 1 mois soit 12 gavages maximum) - Radiothérapie: Les animaux seront traités sous anesthésie gazeuse. Les séances de radiothérapie (jusqu’à 18 au maximum) pourront durer entre 1 minute et 5 minutes selon la technique utilisée et la dose délivrée. - Des prélèvements de sang durant 30 secondes et au nombre de 4 maximum réparties sur 3 semaines pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La pousse de la tumeur peut engendrer une douleur de faible intensité, des faibles pertes de poids et une légère gêne à la locomotion due à l’encombrement que la tumeur peut créer. Les séances de RT et les molécules thérapeutiques évaluées n’engendrent pas de nuisances aux animaux aux doses testées et à la durée des traitements réalisés. Les injections des médicaments seront réalisées à l’aide d’aiguille induisant une douleur légère de très courte durée. Un des modèles de cancer du sein testé peut entraîner le développement de métastases pulmonaires à partir de 30 jours après l’injection dans la glande mammaire des cellules tumorales pouvant provoquer une détresse respiratoire et donc entraîner une perte de poids et la mort de l’animal.

Devenir

Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utilisés pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules, combinés à la RT, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques (distribution, métabolisme, système immunitaire…) et donc d’étude sur animaux. De plus, l’étude de combinaisons avec des immunothérapies, nécessite de travailler sur des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la RT dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral (composé de différents types de cellules). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études.

Réduction

Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison, il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux : 1) Contrôle ; 2) Molécule évaluée seule (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…); 3) RT seule; 4) Combinaison molécule + RT. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 10 souris par groupe. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, l’état des souris sera observé quotidiennement. Les injections des cellules cancéreuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse, afin de réduire le stress et la souffrance de l’animal. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur évolution. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie afin de maintenir les animaux immobiles et de réduire leur niveau de stress. Les animaux seront réveillés sous lampe chauffante pour éviter toute hypothermie puis replacés dans leur cage après chaque séance de RT d’une durée maximale de 5 minutes. La température moyenne dans la cabine d’irradiation est d’environ 25°c. Les séances de RT n’entrainent pas de douleur chez l’animal, elles ne nécessiteront donc pas l’emploi d’anti douleur. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée et les doses utilisées des médicaments associés seront celles utilisées usuellement en préclinique, commue pour ne pas induire de toxicité. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. Le groupe s’occupant du bien-être animal de notre établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Si besoin, les animaux recevront de l’alimentation gélifiée (pour limiter la déshydrations et/ou perte de poids. Un placement sous lampe chauffante sera mis en place en cas de diminution de la température corporelle des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur cellules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeurs dans des souris de même type permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire fonctionnel et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une efficacité homogène des médicaments.

Tuées à la fin de chaque procédure, y compris celles dont la tumeur est jugée trop grosse, trop petite ou mal formée au moment de constituer les groupes, 7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que la présence d'une tumeur, même petite, exclut toute réutilisation, tout replacement et toute adoption. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, trois injections de traitement et une de produit de contraste sur animal éveillé, jusqu'à six prises de sang réparties sur trois mois, des séances d'imagerie sous anesthésie et des mesures de tumeur deux à trois fois par semaine. Il s'agit d'occuper temporairement le foie avec une nanoparticule lipidique pour que les médicaments anticancéreux restent plus longtemps dans le sang, sans que la répartition de ces près de huit mille animaux soit détaillée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité périphérique en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La biodisponibilité systémique des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une biodisponibilité faible ou suboptimale, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été conçue pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique utilisée dans ce projet, est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Dans ce projet, la pharmacodynamie, la biodisponibilité, l’innocuité, la biodistribution tumorale et l’efficacité anti-tumorale des compositions thérapeutiques (nanoparticule lipidique + agent thérapeutique) seront comparées à celles de l’agent thérapeutique seul. Le but est d’améliorer le ratio bénéfice – risque des médicaments.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la biodistribution, l’efficacité et l’innocuité de plusieurs thérapies anti-cancéreuses. A court terme ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur le design des nanomédecines. Il permettra d’optimiser les propriétés physico-chimiques des agents thérapeutiques et de cette nanoparticule lipidique pour obtenir un meilleur ratio bénéfice - risque des traitements associés. A plus long terme, cette nanoparticule pourrait permettre d'éliminer l'une des barrières biologiques majeures limitant l'accès à la clinique de certaines agents thérapeutiques prometteurs. De plus, en réglant le problème de la clairance dans le foie, il serait permis d’avoir une action plus efficace des médicaments déjà autorisés, et donc assurer de meilleurs résultats thérapeutiques pour les patients. Le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale. Selon les données les plus récentes, le cancer représente environ 1 décès sur 6 dans le monde. En 2020, environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués dans le monde, et 10 millions de personnes sont décédées des suites du cancer. Ce nombre est en constante augmentation et devrait continuer à croître dans les prochaines décennies, principalement en raison du vieillissement de la population mondiale et de l'adoption croissante de modes de vie associés à des facteurs de risque. Ainsi, développer une stratégie qui permet d’augmenter l’efficacité des thérapies administrées par voie IV offrirait de nouvelles perspectives aux patients.

Procédures

Trois injections d’agents thérapeutiques et une injection de réhausseur de contraste sont effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Les souris sont également soumises à un exmaen d'imagerie médicale non invaif sous anesthésie générale (20-30 min). Au maximum 6 prélèvements de sang étalés sur 3 mois seront réalisés sur animaux vigiles (1-2 minutes par prélèvement). Une administration unique de cellules de cellules tumorales par voie sous-cutanée sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes). Une mesure de la taille de la tumeur sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes) 2 à 3 fois par semaine pendant maximum 3 mois.

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sanguins peuvent entrainer un léger inconfort transitoire et un bref stress. Dans certains cas, un hématome transitoire peut apparaitre à l’endroit de la ponction. Lors de la croissance des tumeurs, des blessures ou nécrose peuvent apparaître au niveau de la tumeur. L’anesthésie peut induire dans de très rares cas une dépression cardiorespiratoire de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes. Les animaux dont le volume tumoral ne correspondra pas aux prérequis seront mis à mort à la constitution des groupes d’animaux sélectionnés pour le traitement. Ils ne pourront pas être réutilisés car ils porteront une tumeur soit ne correspondant pas aux critères d’acceptabilité (nécrose/ulcération/bilobée/envahissant les tissus autour), soit déjà trop grosse pour l’étude avec un risque d’échappement thérapeutique, soit trop petite mais en cours de croissance. La présence d’une tumeur, même petite, exclut l’inclusion des animaux dans une autre étude, leur replacement ou leur adoption.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle cellulaire existant ne permet de reproduire de manière exhaustive les caractéristiques complexes liées à la progression tumorale et aux interactions avec le système immunitaire. Parmi les modèles disponibles, les modèles de greffes de cellules tumorales se distinguent par leur pertinence scientifique et leur capacité à fournir des informations détaillées, ce qui explique leur utilisation extensive et leur documentation dans la littérature. Dans le cadre de ce projet, où l’un des principaux objectifs est d’évaluer l’efficacité de traitements innovants sur la croissance tumorale, le choix du modèle de souris greffées s’avère essentiel et incontournable. Ce modèle offre un environnement expérimental qui permet d'étudier à la fois les mécanismes d'action des nanoparticules lipidiques ainsi que leurs effets sur la dynamique tumorale. L’utilisation de souris est également essentielle pour explorer les mécanismes de biodisponibilité, de métabolisation, de pharmacodynamie, de tolérance des agents thérapeutiques testés, ainsi que leur distribution tumorale fournissant des données cruciales sur leur comportement in vivo et leur potentiel thérapeutique. Seuls les agents thérapeutiques ayant montré une innocuité et une bonne biodistribution seront testées dans les modèles d’efficacité.

Réduction

Pour minimiser le recours aux animaux dans les procédures expérimentales, les agents thérapeutiques candidats sont d'abord testées in vitro afin de ne retenir que ceux ne présentant aucune toxicité cellulaire. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour garantir une analyse statistique pertinente des résultats. Par ailleurs, certaines nanoparticules lipidiques peuvent être couplées à des molécules fluorescentes ou bioluminescentes, permettant un suivi longitudinal de leur biodistribution par imagerie in vivo. Un animal peut ainsi être étudié au cours du temps. Cette approche réduit la nécessité de mettre à mort des animaux à différentes étapes intermédiaires de l’étude.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec un environnement contrôlé (hygrométrie, température, renouvellement d’air, cycle jour/nuit) et relié à un système d’alarme. Les animaux sont cinq par cage, et les groupes constitués pendant l’acclimatation seront autant que possible maintenus tout au long de l’étude. Un enrichissement adapté à l’espèce sera fourni dans toutes les cages, depuis l’arrivée des animaux jusqu’à la fin de l’étude (ex. : maisons en carton, coton). Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Un vétérinaire sera présent à l’animalerie plusieurs jours par semaine, et des soins vétérinaires d’urgence seront disponibles en dehors des horaires classiques, y compris les week-ends et jours fériés. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris greffées avec des cellules cancéreuses murines ou humaines sont les modèles de référence pour l’étude des traitements dans la recherche en oncologie. La souris est l’espèce la plus documentée dans la littérature pour des modèles de greffes tumorales. C’est une espèce qui permet d’obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles, d’où son intérêt pour ce projet. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin d’évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques sur des animaux ayant un système immunitaire et des organes matures et développés.

Jusqu'à vingt prélèvements sanguins, douze injections sous-cutanées, quinze injections intramusculaires et dix injections intraveineuses par animal, puis une exsanguination par ponction cardiaque sous anesthésie : 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'immunisation dure de 90 à 365 jours et sert à fabriquer des anticorps monoclonaux et polyclonaux. Le porteur ramène les nuisances à un "léger stress" de préhension et à une boule inflammatoire de moins de quatre millimètres dans moins de la moitié des cas. Le nombre d'animaux, écrit-il, dépend de la quantité d'anticorps demandée par le client.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de générer des anticorps à partir de souris L’immunisation des souris est réalisé par voie sous-cutanée, intra-veineuse ou par intra-musculaire sur une période de 90 à 365 jours. Cette immunisation va nous permettre de générer des anticorps spécifiques de l’antigène d’intérêt. Ces nouveaux anticorps ainsi produit sont des outils essentiels pour le monde de la recherche et développement. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés que nous avons générés ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la création de nouveaux anticorps monoclonaux et polyclonaux. Les anticorps jouent un rôle crucial dans la recherche scientifique et les applications thérapeutiques. Recherche Scientifique 1- Détection des protéines : Les anticorps permettent d’identifier et de mesurer certaines protéines dans des échantillons biologiques. 2- Analyse des cellules : Grâce à un marquage, les anticorps aident à reconnaître et à trier différents types de cellules. 3- Observation au microscope : Ils sont utilisés pour repérer des structures cellulaires. 4- Purification des protéines : Les anticorps permettent d’isoler des protéines d’intérêt à partir d’un mélange complexe. Applications Thérapeutiques 1- Traitements avec des anticorps monoclonaux : Utilisés contre le cancer, les maladies auto-immunes et certaines infections. 2- Thérapies ciblées : Les anticorps peuvent transporter des médicaments directement vers les cellules malades. 3- Neutralisation des microbes : Ils peuvent bloquer l’action de virus ou de toxines bactériennes pour protéger l’organisme. 4- Stimulation du système immunitaire : Les anticorps peuvent renforcer ou réguler la défense immunitaire pour traiter certaines maladies, notamment le cancer. 5- Outils de diagnostic : Présents dans de nombreux tests médicaux, ils permettent la détection de différentes maladies. 1. . Les anticorps sont des outils puissants en recherche et en thérapeutique en raison de leur spécificité et de leur capacité à se lier à des cibles moléculaires précises. Leur utilisation continue de se développer, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour la recherche fondamentale et pour le traitement de maladies.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Injection en sous-cutané sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 12 injections. - Injection en intra-musculaire sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection intra-veineuse sur animaux anesthésiés, environ 20 seconde, maximum 10 injections. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil.

Impact sur les animaux

Il existe plusieurs effet indésirable pouvant toucher les souris au cours de ces programmes de recherche : La préhension de l’animal lors des prélèvements et des injections pouvant lui entrainer un léger stress. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une petite boule inflammatoire dont le diamètre ne dépasse pas 4 mm au maximum dans moins de 50% des cas l’apparition Pour les injections intra-musculaires, une très légère douleur pourrait avoir lieu lors de l’injection avec un adjuvant, une analgésie sera mise en place dans ce cas (buprénorphine dose 0,05 mg/kg)

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

À ce jour, il n'est pas envisageable de remplacer le modèle in vivo chez la souris pour la génération des anticorps. En effet, la réponse immunitaire est un phénomène complexe qui implique la coopération de multiples types cellulaires, pour lequel il n'existe pas d'équivalent in vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, émergent, elles ne permettent pas d'obtenir des anticorps de qualité équivalente. Ces technologies de développement d'anticorps in vitro ne sont pas encore matures. Elles nécessitent un équipement spécifique et des réactifs adaptés, et les chances de succès sont limitées, comme le démontre le faible nombre d'anticorps cliniques généré par ces approches alternatives.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérimentation est réduit au minimum. Le nombre d’animaux à utiliser est l dépend de la quantité d'anticorps demandé par le client Pour les anticorps polyclonaux, la purification des anticorps requiert une quantité conséquente de sérum, c'est pourquoi nous utilisons généralement 4 souris par immunogène. Pour les anticorps monoclonaux, nous immunisons entre 3 et 6 souris par immunogène. La réponse immunitaire variant d'une souris à l'autre et selon la nature des immunogènes, plusieurs souris sont nécessaires pour générer des anticorps monoclonaux de qualité.

Raffinement

Les souris sont logées dans des cages standard, avec un maximum de 10 animaux par cage et un minimum de 2. Elles bénéficient d'un enrichissement sous forme de tunnels pour améliorer leur environnement. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des souris pour limiter le stress au maximum. De plus, ils sont anesthésiés à l'isoflurane lors de chaque intervention pour minimiser la douleur et le stress.

Choix des espèces

La souris montre une très bonne réponse immunitaire basée sur les anticorps. De plus de nombreux outils existent déjà pour l’utilisation des anticorps générés dans la recherche et le diagnostic. Nous utilisons des jeunes adultes (environ 7-8 semaines) car c'est à cet âge que la réponse immunitaire est optimale.

Les souris de ce projet sont porteuses de mutations qui détruisent progressivement leur rétine et les rendent aveugles. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit, entre neuf et quinze jours de vie, une injection sous la rétine de chaque œil, cinq minutes par œil, avec un risque de décollement de rétine et de cataracte, puis passe un électrorétinogramme de quinze minutes. Le porteur évalue ainsi une thérapie génique, et les organes sont collectés après la mort pour analyses histologiques et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie génique dans le traitement de la dégénérescence de la rétine dans deux modèles de souris génétiquement modifiés

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de tester l’efficacité d’une thérapie génique pour traiter la dégénérescence de la rétine liée à des mutations génétiques bien précises.

Procédures

- Contention et anesthésie (injection intrapéritonéale): 5 secondes, 2 fois/animal. - Injection intraoculaire sous-rétinienne : œil droit+œil gauche, 5 minutes/oeil, 1 fois/animal - Electrorétinogramme (ERG) : 15 minutes, 1 fois/animal

Impact sur les animaux

Cécité Contention : peut causer un stress léger de courte durée. Injection intraoculaire sous-rétinienne : risque de décollement rétinien et de cataracte transitoire Injection intra-péritonéale de l’anesthésie : douleur légère

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des recherches préliminaires in vitro ont validé le potentiel thérapeutique de la surexpression du gène d’intérêt, réduisant ainsi le recours à l’expérimentation animale. Cependant, ces travaux sont limités par la spécificité de l’expression du gène aux photorécepteurs, l’absence de protocoles pour leur culture, et la très grande complexité pour produire des organoïdes rétiniens, nécessitant l’utilisation des modèles murins développés pour ce projet thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, du coton, des maisonnettes en carton et des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger seront ajoutés dans la cage. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les injections de composé sont réalisées sous anesthésie et analgésie sur une surface chauffante. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sur une surface chauffante, sous anesthésie générale. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet conduira à prendre en charge la douleur et la souffrance éventuelle des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce privilégiée pour ses facilités d’élevage et de reproduction ainsi que de modifications génétiques à façon permettant de modéliser les défauts génétiques identifiées chez l’homme pour en comprendre les mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’œil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’Homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée entre 9 et 15 jours de vie (avant le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 4 semaines pour le modèle présentant une atteinte rétinienne précoce et 6 semaines pour celui présentant une atteinte rétinienne progressive.

Jusqu'à une administration par jour pendant dix semaines, par injection ou par gavage : 269 souris, dont des porteuses d'une mutation de la progéria, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à terme. Celles qui portent la mutation sur un seul chromosome perdent du poids à partir de 41 à 42 semaines, avec une baisse de leur force musculaire et de leur rythme cardiaque, et vivent en moyenne 47 semaines. Elles passent aussi des prises de sang et trois électrocardiogrammes sous anesthésie et trois tests d'agrippement, pour évaluer une molécule déjà testée sur des souris porteuses de la mutation sur les deux chromosomes. Le porteur écarte un porc génétiquement modifié, dont l'étude serait "plus complexe". Les souris des expériences sont tuées pour analyser leurs tissus, et celles des croisements, gardées en vie pour la reproduction, sont tuées à six mois au plus.

Objectifs

Ce projet fait suite à une étude qui visait à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-42 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule Prodrug et de comparer les résultats obtenus ceux obtenus dans la modèle portant la mutation sur les 2 chromosomes, étudié précédemment. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 2X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par électrocardiographie ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-42 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 42 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte également 8 animaux par groupe. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique, 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours). En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 7 semaines dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de protéine toxique. Nous utiliserons des animaux de 32-42 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-42 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines. Nous utiliserons des animaux hétérozygotes agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales.