Rongeurs

50 souris âgées de 12 à 18 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde après un prélèvement de sang ou d'organes. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection d'antibiotique puis un gavage de Clostridioides difficile, ou des solutions témoins, et pendant 21 jours un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution, avec neuf prises de sang et neuf prélèvements de selles. Le projet vise à réduire, grâce à la seconde bactérie, la mortalité d'une colite provoquée chez la souris par la première, première cause mondiale de diarrhée contractée à l'hôpital. Parmi les effets attendus, le porteur ne cite pourtant que des réactions au point d'injection, des changements temporaires d'appétit ou de comportement et des effets de l'infection "potentiellement réversibles avec des soins appropriés".

Objectifs

La colite à Clostridioides difficile est la première cause de diarrhée nosocomiale dans le Monde avec une mortalité élevée. Nous avons, au cours de précédents travaux in vitro, observé une capacité inhibitrice de certaines souches de Clostrdidium butyricum sur la croissance de souches toxinogènes de Clostridioides difficile. Le projet consisiterait en l’évaluation de l’efficacité et de la tolérance de l’administration de Clostridium butyricum par voie orale afin de réduire la mortalité sur un modèle murin de colite à Clostridioides difficile.

Bénéfices attendus

- Identification de C. butyricum comme probiotique potentiel pour prévenir ou traiter les infections à C. difficile. - Contribuer à la recherche sur les mécanismes d'action des probiotiques dans le microbiote intestinal. - Fournir des informations sur l'interaction entre les bactéries bénéfiques et pathogènes dans l'intestin.

Procédures

Les souris seront soumises aux prélèvements suivants : neuf prélèvements sanguins seront effectués aux jours J-6, J-1, puis les jours J1 à J3 après le gavage de Clostridioides difficile, et ensuite aux jours J6, J8, J10 et J14. En parallèle, neuf prélèvements de fèces seront effectués aux mêmes dates. Chaque prélèvement prendra moins de 5 minutes. Par ailleurs, les souris recevront un gavage quotidien de Clostridium butyricum ou de solution de dilution (groupe témoin) depuis J-6 jusqu'à J14, d'une durée maximale de 5 minutes par gavage. Un gavage unique de Clostridioides difficile ou de solution de dilution sera administré au jour J0, également pendant 5 minutes maximum. De plus, les souris recevront une injection d'antibiotique (ou de tampon de dilution pour le groupe témoin) au jour J-1. A la fin de la procédure, pour l’acte d’euthanasie, l’animal sera en contention pour une durée de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

- Réactions au site d'injection. - Changements temporaires dans l'appétit ou le comportement. - Effets liés à l'infection, potentiellement réversibles avec des soins appropriés.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il s'agirait ici d'une étude préclinique pour confirmer l'effet probiotique de certaines souches de C. butirycum sur l'infection à C. difficile. Nous avons choisi le modèle murin pour la colite à C. difficile comme décrit dans la littérature. Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie.

Réduction

L'outil statistique approprié, utilisé pour notre étude, suggère qu'il faudrait 50 souris au total pour ce projet comprenant 2 procédures. Une étude pilote sera réalisée en première intention sur 10 souris afin de réduire le nombre d'animaux dans l'ensemble de ce projet.

Raffinement

Lors de nos différentes procédures d’infection, les souris seront immobilisées pour une durée de moins de 5 min. A la fin de nos procédures ou en cas d’atteinte d’un point limite, les souris seront anesthésiées avant euthanasie. Un test de réflexe (pincement extrémité patte) sera effectué afin de valider l’anesthésie. En cas de survenue de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplé à ce projet, la température corporelle sera prise et un analgésique pourra être administré. Une surveillance appropriée sera mise en place par du personnel habilité.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'homme, de leur taille réduite et de la disponibilité de nombreuses souches génétiquement modifiées. Elles permettent d'étudier les interactions bactériennes dans un environnement contrôlé et d'évaluer les effets des traitements sur la physiologie. Nous utiliserons des souris adultes (12 à 18 mois), car elles sont représentatives des conditions humaines en matière de réponse immunitaire et d'infection, ce qui est essentiel pour notre étude sur l'inhibition de C. difficile.

Injectées sous anesthésie de cellules tumorales humaines dans la glande mammaire, gavées une fois par jour pendant quatre jours d'une molécule qui active les récepteurs aux œstrogènes, des souris femelles immunodéprimées passent aux neuvième et onzième jours deux examens d'imagerie TEP sous anesthésie, le second après une nuit de jeûne et une prise de sang. 30 souris vont être utilisées sur deux établissements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour vérifier si un traceur radioactif qui imite les œstrogènes peut repérer sans biopsie des mutations rendant inefficaces les traitements hormonaux du cancer du sein. Le porteur cite la douleur de l'injection mammaire et du développement tumoral, une irritation de l'œsophage, une hypoglycémie liée au jeûne et une vulnérabilité accrue aux infections. Toutes sont tuées après les examens, pour l'analyse de leurs tumeurs.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

Greffées sous anesthésie de cellules cancéreuses humaines dans un premier établissement, des souris nude immunodéprimées sont transportées au bout d'une vingtaine de jours dans un second, où ont lieu les irradiations et les injections des anticorps couplés à des médicaments testés. 674 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après une ponction du cœur sous anesthésie. Les injections se font dans une veine, une fois par semaine pendant deux à six semaines selon la progression des tumeurs, et les effets de l'irradiation ne figurent pas parmi les nuisances listées. Sur le remplacement, le porteur affirme que ses résultats in vitro lui permettent "d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique", et juge les xénogreffes requises pour "prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats".

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des ptahologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules senecentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules senescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules senescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environs).

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etand donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contröler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

Placés jusqu'à vingt-quatre heures dans des chambres en plexiglas après administration d'une substance, 500 souris, 3 000 rats et 2 000 cobayes subissent un enregistrement de leur fonction respiratoire, certains après une heure de chirurgie de cathétérisme. Les 5 500 animaux sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène les effets à un "léger stress" lié à la contention et à l'isolement, tout en énumérant bronchospasmes, bronchoconstrictions, toux, hyperventilation et douleurs après l'opération. Quatre cents cobayes seront réutilisés, les 5 100 autres tués, ces tests servant à établir le profil de sécurité de candidats médicaments avant leur passage chez l'humain, conformément aux exigences réglementaires européennes, américaines et japonaises.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer les effets de substances en cours de développement sur la fonction respiratoire et de collecter des données précises pour répondre à des questions essentielles liées à la sécurité, l'efficacité, et le mécanisme d'action de la substance. Ces tests permettent de vérifier si une substance améliore la fonction respiratoire dans des maladies comme l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive,... et permettent également de déterminer si une substance est en mesure de réduire les symptômes respiratoires tels que la dyspnée ou la toux. Les substances, même non destinées à traiter directement les maladies pulmonaires, peuvent avoir des effets sur le système respiratoire (bronchospasmes, hypoxie, etc.). Tester leur impact est donc crucial pour garantir la sécurité du patient et établir le profil de sécurité du candidat médicament avant son passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).

Bénéfices attendus

Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus chez les patients traités pour des affections respiratoires. Ils entrent également comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. La mesure des paramètres ventilatoires (fréquence respiratoire, volume courant, minute volume, temps d’inspiration, d’expiration et de relaxation, débits aux pics d’inspiration et d’expiration) ou dynamiques (résistance ou pause augmentée) permet de différencier les substances affectant le contrôle de la respiration de celles agissant sur la dynamique du poumon (obstruction ou dilatation des voies aériennes, resistance pulmonaire).

Procédures

Les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas pour une période de 30 min à 3 h de stabilisation jusqu’à 24h après l’administration selon le modèle pour évaluer la fonction respiratoire. Le traitement unique avec les candidats médicaments se fait par différentes voies (administration quelques secondes) ou par aérosols (administration pendant quelques minutes). Pour certaines administrations, les animaux subissent une chirurgie de courte durée (1 heure) quelques jours avant le test. A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang (quelques secondes), d’organes ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. La phase d’enregistrement peut engendrer un stress léger chez l’animal dû fait de l'isolement. Certaines conditions d’enregistrement et/ou substances de références peuvent entrainer du bronchospasme, de la bronchoconstriction, de la bronchodilatation, de la toux, de l’hyperventilation. La phase de chirurgie par cathétérisme peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous euthanasiés. S’il n’y a pas de prélèvement, les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont euthanasiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.

Remplacement

Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif, et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites).

Raffinement

Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements. Dans le cas de mesures sur plusieurs heures ou jours, les animaux sont regroupés dans leur cage d'hébergement suite aux premières mesures et seront remis dans les chambres de pléthysmographie pour effectuer la mesure. De l'eau de boisson est à disposition et une poche de complément alimentaire est mis à disposition pour des mesures dépassant 12h. Les animaux peuvent se voir d’une chambre à l’autre. Dès la fin de l’expérience, les animaux sont regroupés ou immédiatement euthanasiés. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints (détresse respiratoire). Par ailleurs et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement litiére, objets de nidification et à ronger, présence de congénéres. Losque nécéssaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. le progarme d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétériniare afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit). Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur).

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en oeuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique

Quarante-cinq minutes de chirurgie du cerveau, puis deux heures d'enregistrement de l'activité neuronale : 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en huit groupes de douze, ils reçoivent d'une à quatre injections de kétamine avant l'enregistrement. L'objet déclaré est de comprendre comment la kétamine module l'activité du cortex préfrontal, dans l'espoir d'ouvrir des pistes contre la dépression résistante aux traitements. Le porteur retient le rat parce que son usage est "généralisé" en neurosciences et que les résultats pourront être comparés à la littérature existante.

Objectifs

La découverte des effets antidépresseurs rapides de la kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et éveillé l’espoir de nouveaux traitements à efficacité accélérée. En effet, alors que les antidépresseurs classiques mettent plusieurs semaines à agir et sont inefficaces chez plus de 30% des patients, l’injection d’une seule dose de kétamine provoque des effets antidépresseurs rapides et robustes chez les patients atteints de dépression pharmaco-résistante. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine du pouvoir antidépresseur de la kétamine est donc une étape clé pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles dépressifs majeurs. En effet, la kétamine pourrait soulager les symptômes de la dépression en modulant l'activité cérébrale contrôlant l’humeur. Les objectifs du projet sont donc de tester l'effet d'une dose unique ou de doses multiples de ketamine sur la modulation de l'activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Ces expérience permettront de mieux comprendre le rôle modulateur exercée par la kétamine sur l'activité du cerveau contrôlant l'humeur et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitements des troubles dépressifs.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau qui dure 45 minutes. Deux groupes de 12 rats sont soumis à une injection du composé (5 min) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à deux injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à trois injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à quatre injections du composé (5 min per injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Tous les animaux sont hébergés en cage collective ée (2 rats par cage) pour une dureé maximum de 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à une chirurgie et traitements successifs dont le degré de gravité va de léger à modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie , en effet l'animal est anesthésié puis opéré. Bien que toutes les mesures soient prisent pour réduire douleur et risque d’infections, cette procédure représente la plus importante nuisance pour l'animal. Les autres types de nuisances envisagées sont l'euthanasie même si l'animal est sédaté au préalable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer des analyses imunohistochimiques sur ce dernier.

Remplacement

La procédures décrite a recours exclusivement à des rats de laboratoire (Sprague Dawley) pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n ’existe pas encore de modélisation mathématique (pharmacologiques) des effets que nous cherchons à comprendre. Pour comprendre les mécanismes de la plasticité in vivo, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Des outils statistiques sont utilisés pour calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires à la validation de l'expérience. Ce nombre s'élève à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Le confort de l’animal est pris en compte tout au long de sa vie au moyen d’une grille d’évaluation et la définition de points limites et critères d’arrêt de l'expérience. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour qu'ils sachent détecter tout signe de mal-être et ne soient pas eux-mêmes source de mal-être par une manipulation inadaptée. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par ou sont eux-mêmes des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les expériences se déroulent quand les animaux sont actifs et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main...) pour éviter la sensation du vide]. L’anesthésie pour les chirurgies et la douleur post -opératoire sont gérées avec des molécules adaptées comme des antidouleurs. Une pommade cicatrisante est appliquée sur les sutures. Pour prévenir l’hypothermie, les chirurgies sont pratiquées sur couverture chauffante puis l’animal est placé dans une chambre post-opératoire jusqu’à ce qu’il se redresse sur ses pattes. Les animaux sont hébergés collectivement tout au long de l'expérience. Pour enrichir l’environnement, des nids végétaux sont placés dans chaque cage et renouvelés systématiquement lors du change.

Choix des espèces

Cette espèce est un bon modèle pour les études pharmacoloqiques. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences. Nous utiliserons des rats jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi afin de correspondre aux données de la littérature afin de pouvoir comparer nos données.

Tuées à l'issue pour prélever leur sang et leur foie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent l'injection d'une molécule choisie pour sa toxicité hépatique, qui peut provoquer des douleurs abdominales. Quatre cents d'entre elles subissent en plus l'ablation des ovaires, dont la moitié avec la pose d'une capsule hormonale sous la peau, pour modéliser la ménopause et les traitements hormonaux. Le porteur reconnaît que le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisé, et affirme dans le même temps qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement".

Objectifs

De nombreuses études ont montré que la toxicité de nombreux médicaments dépends des rythmes circadiens c'est-à-dire que leur toxicité est dépendante de l'heure de la journée. Cette approche de la pharmocologie, appellée chronothérapie, permet de diminuer la toxicité et/ou augmenter l'efficacité des médicaments. Cependant, l'effet du sexe sur différentes chronothérapies n'a été étudié que très brièvement dans la littérature alors qu'on sait que de nombreux paramètres pharmacologiques (absorption, métabolisation, excrétion) sont régulés de manière sexe-dépendante et circadienne. L'objectif de ce projet est donc de tester la chronotoxicité de 5 molécules utilisées en clinique et connues pour présenter une pharmacocinétique circadienne et dont nous avons identifié que les voies de métabolisation hépatique dépendent du sexe et du statut oestrogénique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer et comparer la chronotoxicité de ces 5 molécules entre les femelles et les mâles ainsi qu'entre des femelles intactes modélisant des femmes en période reproductive et des femelles ovariectomisées modélisant des femmes ménopausées. Ces résultats seront déterminants pour optimiser la chronothérapie de ces 5 molécules chez les femmes en période reproductive, les femmes ménopausées et les hommes sachant que ces molécules sont fréquement utilisées en clinique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 200 animaux seront soumis à une chirurgie de classe modérée (ovariectomie) et 200 animaux seront soumis aux deux chirurgie de classe légère (pose de pellet sous-cutanné) et modérée (ovariectomie). Tous les animaux de ce projet (800 animaux au total) seront soumis à l'injection de molécule induisant une toxicité hépatique pouvant induire des douleurs abdominales et est donc considérée comme une procédure de classe modérée.

Impact sur les animaux

L'étude de la toxicité hépatique nécessite par définition d'utiliser des doses toxiques des différents composés testés pouvant induire des douleurs (douleurs abdominales). Si le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisée, la toxicité hépatique aigue est généralement considérée comme une procédure de classe légère ou modérée. Ce protocole peut donc engendrer chez les animaux des douleurs abdominales et un stress lié à la manipulation.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélevements (sang, foie) et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets de sexe et circadiens font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du sexe et des rythmes circadiens sur la métabolisation et la toxicité hépatique. De même, l'étude de la toxicité hépatique ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet. Cependant, une veille bibliographique régulière sera réalisée afin d’identifier de nouvelles méthodes alternatives pertinentes pour remplacer ce protocole.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages. L'étude de l’horloge biologique nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur propre horloge car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, les animaux utilisés dans ce projet seront manipulés dans la phase de nuit. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie et d’analgésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce s'est orienté vers la souris car c'est le modèle utilisé dans les études précedentes qui ont généré les résultats préliminaires aboutissant à ce projet. De plus, afin de pouvoir appliquer les conclusions de ce projet à l'humain, le modèle murin est le modèle expérimental qui permet de modéliser au mieux la pharmacocinétique des molécules testées. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.

Injectées de toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle puis les plongent dans le coma, 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi une IRM de trente minutes sous anesthésie générale. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre la fuite capillaire du choc septique, à partir de protéines repérées chez dix-neuf patients. Le porteur présente le coma comme une limitation de l'inconfort, tout en indiquant que les doses plus importantes retenues ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant qu'il ne survienne.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.