Rongeurs
Etude de la prévascularisation et la régénération osseuse par bioimpression assistée par laser in situ de nouvelles formulations de bioencres organo-minérales au niveau de défauts osseux de calvaria chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Deux trous sont percés dans le crâne de chaque souris, de part et d'autre de la suture, puis comblés par impression laser de cellules et de matériaux directement sur la plaie. 130 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération pour mesurer la repousse osseuse. Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie s'échelonnent du premier au trente-cinquième jour, cadence que le porteur classe comme non douloureuse. Parmi les bénéfices annoncés figure le dépôt de brevets sur les nouvelles formulations de bioencre, à côté de l'optimisation de la station de bioimpression du laboratoire.
Objectifs
Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. Par ailleurs, l’un des principaux obstacles rencontrés dans un précédent projet concernait l’imagerie et le suivi en temps réel des motifs imprimés in vivo. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.
Procédures
Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).
Devenir
Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).
Remplacement
Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.
Etude de l’hétérogénéité de la réponse musculaire au sepsis entre les muscles de la face et les muscles des membres en fonction du sexe
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Le caecum de chaque souris est ligaturé et perforé pour déclencher une péritonite, après implantation d'une sonde de température. 300 souris vont être utilisées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 120 un niveau modéré. Le porteur écrit que les nuisances attendues tiennent "principalement" au stress de la contention, avant de décrire un quart des animaux mourant du modèle dans les quatre premiers jours, avec perte de poids, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale et agressivité. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les muscles de la face et des membres, l'étude cherchant à comprendre pourquoi les muscles faciaux des patients septiques semblent épargnés.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une défaillance multi-organe causée par une réponse excessive et incontrôlée de l'hôte à l'infection. Le sepsis est l'une des principales causes de mortalité dans les unités de réanimation en soins intensifs avec un taux de mortalité très élevé de 30 %, pouvant atteindre 40 à 50 % en cas de complications. En outre, des séquelles persistent longtemps après leur guérison et les patients survivants développent un handicap physique chronique qui affecte au quotidien leur qualité de vie. La majorité des patients survivants du sepsis présentent une atrophie et une faiblesse musculaires qui surviennent rapidement dès les 10 premiers jours de leur séjour en soins intensifs et qui s’accompagnent d’une fonte musculaire progressive. Chez les patients septiques, l’atteinte musculaire touche principalement les muscles des épaules, des bras et du bassin, tandis que les muscles des membres inférieurs sont moins touchés. L’origine et les mécanismes impliqués dans la faiblesse musculaire associée au sepsis semblent complexes et multifactoriels, et impliquent une inflammation incontrôlée, une augmentation de la dégradation des fibres musculaires ainsi qu’une altération des capacités cicatricielles des cellules souches du muscle. De façon surprenante, chez les patients septiques, les muscles faciaux et extra-oculaires semblent totalement épargnés sans que l’on ne sache pourquoi. Notre hypothèse est que les muscles de la face et les muscles extra-oculaires mettent en place des mécanismes compensatoires intrinsèques leur permettant de résister au choc septique. Dans ce contexte, l’objectif principal de notre projet vise à étudier l’hétérogénéité des réponses biologiques des muscles squelettiques et des cellules souches en réponse au sepsis en fonction de leur localisation anatomique (muscles des membres vs muscles de la face). Nous étudierons également s’il existe une différence entre les mâles et les femelles dans cette réponse hétérogène musculaire au sepsis.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’hétérogénéité de la réponse des muscles squelettiques au sepsis en fonction de leur localisation anatomique. Ce travail permettra d'identifier les mécanismes moléculaire et cellulaires responsables de la résistance de certains muscles au sepsis qui pourront être ciblés dans le futur à visée thérapeutique.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de cinq : 1. Implantation d’une sonde de température sur animal anesthésié (1 fois, durée : 5 min) 2. Modèle de sepsis (1 fois, durée : 10 min) 3. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 4. Prélèvement de sang de façon réitérée (5 fois max, durée : 2 min) 5. Prélèvement de sang sur animal anesthésié au terme de l'étude (1 fois, durée : 2 min). La seule procédure non ou peu invasive sur animal anesthésié ou vigile est le test de force musculaire sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées au stress lors de la contention et de la manipulations sur animal vigile. Les effets indésirables sont ceux liés au modèle murin de sepsis peut être associé à une perte de poids (corrélée avec la gravité de la maladie), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale), un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) avec une surmortalité accrue pour les animaux les plus atteints (25% environ).
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l’impact différentiel direct de la réponse inflammatoire incontrôlée associée au sepsis sur le devenir des cellules souche musculaires isolées de muscles de la face ou des muscles périphériques, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment en incubant les cellules avec un cocktail de cytokines pro-inflammatoires ou du sérum de sujets (souris ou homme) en choc septique. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n’est pas possible. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l’immense complexité des interactions qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un muscle entier, notamment dans un contexte de réponse inflammatoire aigüe. L'utilisation de modèles animaux mimant le sepsis reste essentielle pour étudier l’hétérogénéité de la réponse musculaire au sepsis, notamment entre les muscles de la face et des muscles périphériques. Dans cette étude, notre choix s’est porté sur le modèle de sepsis par ligation et poncture du caecum afin de nous rapprocher au plus près d’une des causes principales de sepsis chez l’Homme, à savoir la péritonite. Par ailleurs, la souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences au laboratoire ainsi que les données préliminaires de nos collaborateurs sur le modèle de sepsis chez la souris ont démontré que des groupes de n=15 animaux sont nécessaires pour les analyses histologique et moléculaire et les analyses fonctionnelles à long terme, compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle de la réponse musculaire au sepsis et de la mortalité importante du modèle dans les 4 premiers jours suivant la chirurgie (25%).
Raffinement
Les animaux importés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 7 premières jours afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris mutantes expriment une protéine fluorescente verte dans les cellules satellites, ce qui facilitera leur analyse spatiale en histologie et leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel de réparation en culture ou de leur expression génique différentielle. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Par ailleurs, les données de la littérature montrent que l’incidence de la péritonite est beaucoup importante chez l’adulte que chez l’enfant.
Etude des processus de décision et de la balance excitation inhibition chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois mois de restriction alimentaire, ramenant les rats à dix pour cent en dessous de leur poids pour les motiver à travailler contre une récompense : 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 70 d'entre eux et modéré pour 130, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes, trois séances d'imagerie cérébrale, des enregistrements de vingt-quatre heures et des injections de kétamine destinées à reproduire des symptômes psychotiques. Le projet cherche à modéliser la prise de décision et à tester l'hypothèse d'un déséquilibre entre excitation et inhibition dans la schizophrénie. Le porteur retient le rat Long Evans pour ses capacités cognitives et visuelles, et prévoit d'écarter quinze pour cent des animaux qui n'atteindront pas les critères d'apprentissage.
Objectifs
Les troubles neuropsychiatriques sont aujourd'hui la principale cause d'invalidité et de coûts de santé dans les pays développés. L’objectif de ce projet est de développer une tâche comportementale permettant d’étudier chez l’animal les processus inférentiels et d’explorer l’hypothèse clinique mettant en cause un déséquilibre excitation/inhibition
Bénéfices attendus
Le projet produira de nombreux résultats aux niveaux fondamental, clinique et pratique. Au niveau fondamental, il dévoilera le rôle des systèmes glutamatergique (excitateur) et GABAergique (interneurones parvalbumine inhibiteurs) dans les processus de prise de décision et remettra en question la théorie de l'inférence circulaire, en mettant en lumière la manière dont les croyances/priorités peuvent être créées et propagées au niveau des microcircuits. Sur le plan clinique, cela ouvrira la voie à des traitements pharmacologiques dans le domaine des troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie, visant à rétablir l'équilibre de l'excitation cérébrale.
Procédures
Concernant l’analyse comportementale 200 rats seront soumis à un apprentissage cognitif et une série d’évaluation d’une durée allant de 1 à 3 mois à raison de 30 min à 1h de test quotidien. Pendant ces tests, les animaux seront soumis a une restriction alimentaire de 10% de leur poids sur une période de 3 mois, afin des les motiver à la récompense. Des imageries cérébrales in vivo (imagerie par résonnance magnétique et tomographie par émission de positrons) seront réalisées à 3 temps sans dépasser 1h15 par rat. Afin de mener les enregistrements cérébraux sur une partie des animaux, une chirurgie sera réalisée permettant l’implantation d’électrodes. Celle-ci ne dépassera pas 45min durant 4 sessions d'enregistrement. Les enregistrements seront réalisés sur animaux vigiles au repos (acquisition de 24h) ou en cours de tâche comportementale. Sur certains animaux, des injections (au nombre de 5) seront réalisées pour moduler la balance excitation/inhibition et observer les impacts sur le comportement des rongeurs. Enfin sur l’ensemble des animaux, trois prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie, d’une durée maximale de 10min par rat.
Impact sur les animaux
La kétamine est un agent pharmacologique couramment utilisé pour modéliser les symptômes psychotiques et présente une bonne tolérance à la dose qui sera utilisée dans ce projet. Aucun effet indésirable n’est attendu. Lors des chirurgies (implantation des électrodes) ou durant les acquisitions en imagerie, l’induction et le maintien de l’anesthésie peuvent provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie pouvant conduire à la mort soudaine des animaux. Concernant l’évaluation comportementale, une habituation à la manipulation sera réalisée à l’arrivée des rats pour réduire le stress. La principale nuisance est la restriction alimentaire qui sera maintenue sur une période relativement longue (3 mois maximum) afin de motiver les animaux dans les tâches de conditionnement opérant.
Devenir
L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportemental et d'imagerie du vivant ou Eléctroencéphalographie avant leur mise à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle assurant le lien entre la recherche fondamentale et la recherche clinique et permettant le transfert des connaissances vers des applications thérapeutiques au bénéfice du patient. Cherchant à évaluer le bénéfice comportemental et fonctionnel de stratégies thérapeutiques pro-cognitives, il est indispensable de se reposer sur un modèle intégré et le remplacement des rats par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce contexte. Toutefois l’ensemble des molécules pharmacologiques utilisées dans ce travail ont fait l’objet d’études préalables permettant de valider les propriétés recherchées pour cette étude.
Réduction
Le projet a été conçu avec un nombre minimal d’animaux nécessaire à sa validité scientifique et statistique. Les animaux qui seront utilisés pour effectuer l'évaluation comportementale seront également utilisés pour étudier les marqueurs fonctionnels d’imagerie. En termes de comportement des groupes de 20 animaux par groupe sont nécessaires pour garantir la fiabilité des résultats. Un taux d’exclusion de 15% de l’effectif initial doit toutefois être considéré. Ce chiffre a été défini sur la base de notre expérience dans l’utilisation de la tâche de discrimination visuelle et correspond au pourcentage de rats qui ne parviennent pas à atteindre les critères de validation de l’étape de conditionnement/apprentissage.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la réglementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée.
Choix des espèces
L’espère de rat Long Evans est choisie pour ses capacités cognitives et visuelles adaptées. Les animaux seront utilisés dès 2 mois et suivis jusqu’à 6-7 mois, car il a été montré que c'est pendant cette période du dévelopement que les animaux présentent les meilleures facultés d'apprentissage, nécessaire pour les procédures comportementales.
Rehabilitation locomotrice et visuelle dans des modèles de pathologies vestibulaires
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue parce que les atteintes subies interdisent tout placement ou réutilisation, 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par une première chirurgie de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, une partie d'entre elles subissant une seconde intervention, chirurgicale ou pharmacologique, destinée à détruire par degrés leur appareil vestibulaire. Les souris ainsi rendues déséquilibrées suivent ensuite un programme de rééducation calqué sur celui proposé aux patients humains. Le porteur signale que ces souris peuvent aussi devenir sourdes, précise que ce point n'est pas quantifié parce qu'il sort du sujet, et affirme que la neurophysiologie intégrative ne peut être conduite que sur animal vivant et éveillé.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'étudier à l'aide de modèles précliniques fiables et reproductibles, l'intérêt potentiel de la mise en place de protocoles locomoteurs et visuels. Les objectifs spécifiques seront i) de déterminer les fenêtres d'opportunités thérapeutiques en quantifiant l'intérêt d'une prise en charge précoce, ii) de déterminer en fonction de la sévérité des pathologies vestibulaires, les bénéfices thérapeutiques potentiels des différentes approches locomotrices et visuelles. Dans le cas de pathologies touchant l'équilibre, les patients ressentent des déséquilibres et des flous visuels liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en place des substitutions sensorielles qui permettent progressivement le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. La prise en charge des patients comprend la mise en place d'une rééducation vestibulaire consistant en des séances de sollicitations multi sensorielles, notamment à la marche ou visuelles. Ces protocoles n'ont cependant jamais fait l'objet de validations précliniques, ils sont extrêmement variables et dépendent largement de la pratique des professionels de santé.
Bénéfices attendus
Le projet constitue un projet de recherche fondamental dont les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des capacités plastiques du cerveau dans un contexte de dégradation ou perte totale des infomations sensorielles vestibulaires. En particulier le projet permettra de mieux identifier le potentiel thérapeutique associé à des protocoles de réhabilitations effectués en rééducation vestibulaire. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent donc la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation de patients souffrants de pertes vestibulaires.
Procédures
Tous les animaux (n=492) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Pour générer les modèles de vertiges, une partie des souris seront soumises à une seconde chirurgie afin de causer des pertes vestibulaires gradées par une approche chirurgicale ou pharmacologique. Ces animaux bénéficieront ensuite d'une réhabilitation comparable aux interventions thérapeutiques mises en place chez l'homme dans le cadre de réhabilitation vestibulaire.
Impact sur les animaux
Des chirurgies et interventions pharmacologiques potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Comme les patients, les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés qui ne sont cependant pas l'objet de l'étude et ne sont donc pas quantifiés.
Devenir
L'ensemble des procédures subies ne permettent pas de placer ni réutiliser les animaux qui doivent donc être euthanasiés (n=492 maximum) en fin de protocole.
Remplacement
L’intégration des signaux sensoriels issus de l’oreille interne, de la proprioception, de la vision, et les signaux moteurs issus de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests couvrant la période de réhabilitation. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, il est susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.
Raffinement
Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 16 semaines (4 mois) pour les plus âgées.
2/2 Essais thérapeutiques préventifs et curatifs dans un modèle murin de la maladie génétique du Cavernomatose cérébrale familiale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester trois médicaments contre les angiomes caverneux cérébraux, 1 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 048 d'entre elles et modéré pour 168. Elles subissent des injections quotidiennes pendant trois jours, une séance d'imagerie d'une heure sous anesthésie, puis une chirurgie de quinze minutes destinée à récupérer les tissus. 144 souris de "mauvais génotype" sont réutilisées comme animaux témoins dans d'autres projets, les autres sont tuées. Le porteur annonce une échelle de cotation de la douleur et des points limites adaptés, sans préciser les signes retenus ni les seuils qui déclenchent la mise à mort.
Objectifs
L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) et a pour objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs capacités à arrêter la formation des lésions vasculaires dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux disponible pour les angiomes caverneux et la suppression par chirurgie n'est pas toujours possible. De plus, le risque de nouveaux saignements dans les années suivant la chirurgie est élevé. Ce projet vise à tester des traitements afin de savoir si ces derniers bloquent la formation des lésions vasculaires dans nos modèles atteints de la maladie. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à la découverte d’un traitement thérapeutique efficace sans effet secondaire.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, seule l’élevage et la reproduction des animaux sera réalisée. Dans le second établissement utilisateur, la distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Puis, l’étude impliquera une injection du traitement de 30 secondes, une fois par jour pendant trois jours suivie d’une imagerie d’une durée de 1h maximum, réalisée sous anesthésie, suite, ou non à l’induction d’une inflammation. Et enfin, une chirurgie d’une durée de 15 minutes sera réalisée afin de récupérer les tissus à analyser.
Impact sur les animaux
La distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Ces résultats permettront d’adapter le protocole d’administration sur les animaux présentant la pathologie. Ces derniers recevront un traitement administré pendant 3 jours consécutifs, pouvant induire une légère douleur, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. L’évolution des lésions et la réponse au traitement sont suivies par imagerie, d’une durée de 1h maximum et peuvent engendrer un léger stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés. Les 144 animaux réutilisés correspondent aux souris de mauvais génotype, qui pourront être réutilisées pour des prélèvements ou d'autres projets comme animaux sauvages.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé ou une espèce autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidat pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animaux est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront exportés de L’EU1 à l’EU2 pour les expérimentations. Les animaux seront placés dans des caisses de transport spécialement conçues pour les rongeurs, assurant un espace adéquat, une aération optimale, une sécurité appropriée pour éviter toute blessure ou fuite ainsi qu’une non-rupture de la barrière sanitaire. L’itinéraire le plus court sera choisi afin de minimiser le temps de transport, qui n’excèdera pas 15 minutes. Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Tous les croisements réalisés viseront à obtenir exclusivement des animaux viables ayant les mêmes symptômes que les patients avant déclaration de la pathologie.
Choix des espèces
Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Les animaux auront entre 6 et 12 semaines lors des expérimentations afin d’être en conditions semblables à la pathologie humaine étudiée.
Maintien de lignées de souris non dommageables d’intérêt pour l’étude de l’épilepsie focale, avec prélèvement invasif pour génotypage
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un morceau de l'extrémité de la queue est coupé sur chaque souriceau âgé de sept à dix jours, geste réalisé sur animal vigile pour lire son patrimoine génétique. 9 408 souris au total, que le porteur appelle sa "production", vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet ne génère aucune donnée par lui-même : il entretient des lignées porteuses de mutations liées à l'épilepsie focale, destinées à alimenter trois autres projets. Les souriceaux nés sans la mutation recherchée sont tués faute de pouvoir être replacés, les autres restant en élevage ou transférés vers d'autres protocoles.
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies corticales focales. Les dysplasies corticales focales sont caractérisées par une désorganisation locale d’une zone du cerveau (cortex cérébral) et la présence de cellules anormales et de taille anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux et sont associées à des déficits cognitifs et des pathologies psychiatriques précoces. Plusieurs modèles animaux d’épilepsie corticales focales seront utilisés pour des projets de recherche nécessaires à la validation de nouvelles cibles thérapeutiques et à l’évaluation de traitements innovants. Ces modèles sont créés à partir de l’accouplement de souris porteuses de mutations mais ne les exprimant pas (n’ayant aucun symptôme les différenciant des souris non modifiées génétiquement). Le but de ce projet sera de maintenir les élevages de ces souris mutantes mais non malades afin de générées les souris utiles à ces différents projets de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de conserver les lignées de souris porteuses de modification génétique mais n’entrainant aucun symptôme. Elles permettront dans un deuxième temps de réaliser différents projets. Les bénéfices de ce projet sont donc indirects. L’un des projets permettra de générer et valider de nouveaux modèles de pathologies génétiques induisant des crises épileptiques et reproduisant les mutations observées chez les patients. Un deuxième projet permettra d’évaluer et valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre des épilepsies génétiques. Et enfin, un autre projet portera sur l’évaluation de l’efficacité et des effets indésirables de nouveaux traitements. Ainsi à court terme, l’ensemble de ces projets pourraient permettre d’améliorer nos connaissances sur l’épilepsie et plus particulièrement les formes associées aux dysplasies corticales focales. A plus long terme ceci pourrait amener à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients et donc une amélioration de leur prise en charge.
Procédures
Afin de connaitre le patrimoine génétique de nos animaux, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé une fois sur les jeunes animaux produits dans ce projet (vigile, durée quelques secondes, une fois).
Impact sur les animaux
L’animal pourra ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement pour connaitre son patrimoine génétique. Il existe un risque de saignement suite à ce prélèvement.
Devenir
Les animaux générés non porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer du fait de leur modification génétique. Si cela est possible ils pourront être proposés en don à d’autres équipes de recherche. Les animaux au génotype d’intérêt seront utilisés pour le maintien des lignées ou seront en utilisation continue dans d’autres projets.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car : Premièrement, les modifications cérébrales nécessaires ne peuvent être étudiées chez l’humain. Nous avons grâce à des collaborations avec des cliniciens accès à un nombre restreint de tissus cérébral de patients. En effet, les FCD restent des maladies rares. Nous faisons un maximum d’études sur ces tissus. Cependant, ceux-ci sont obtenus postérieurement à l’apparition des crises épileptiques et ne permettent donc pas d’étudier le développement de la maladie qui aboutieaboutit à ces crises. Deuxièmement, la culture cellulaire seule ne reproduit pas certaines propriétés des crises d'épilepsie dans un cerveau entier. Si la culture cellulaire a permis de nombreuses avancées dans l’étude de ces pathologies (validation de mutations découvertes chez les patients, étude de pathways impliqués dans la pathologie, ...), elle ne permet pas la création de modèles suffisamment complexes, avec notamment des réseaux neuronaux matures et une interaction entre différents types cellulaires. Enfin, la modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes.
Réduction
Nous veillerons à avoir un pilotage raisonné de nos lignées afin de ne produire que les effectifs d’animaux strictement nécessaires. Pour cela, le nombre d’accouplement nécessaire a été évalué en amont et pourra être réévalué an cas de divergence avec nos estimations. De même, nous avons prévu les mesures nécessaires à la prévention de la dérive génétique (accumulation de mutation due à une trop forte consanguinité des animaux) tout en limitant au maximum le nombre d’animaux impliqués dans le projet. Nous estimons notre production totale à 9408 animaux. Les males pourront être utilisés simultanément dans plusieurs accouplements pour limiter au maximum le nombre d’animaux impliqués dans le projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée selon les normes en vigueurs. Ils seront hébergés dans des cages enrichies d’un nid de coton, d’un bâtonnet de bois à ronger et d’une maison en cas d’inconfort ou pour les femelles gestantes. Ils auront accès à la nourriture et à l’eau à volonté. La nourriture sera adaptée à leur stade physiologique. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d'anomalie un suivi journalier sera mis en place. Les animaux provenant d’un fournisseur agréé externe bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 1 semaine avant d’être mises en accouplement. De plus nous nous assurerons de la bonne santé de nos animaux avant de les mettre en accouplement. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des souriceaux, nous réaliserons le geste dans une pièce dédiée et au calme. Nous utiliserons du matériel propre et désinfecté entre chaque animal et nous nous assurerons que les petits soient bien repris en charge par leur mère à la suite du geste. Des points limites ont été établis et seront respectés afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Nous travaillerons sur une espèce animale : la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques : (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux. (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Cette espèce est majoritairement utilisée pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les animaux seront génotypés par biopsie d’un bout de queue à l’âge de 7 à 10 jours, donc sur un animal très jeune où l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite.
Rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un modèle de choc septique (1/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de toxines bactériennes provoque une chute de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience allant jusqu'au coma, suivie d'une IRM de trente minutes sous anesthésie. Le porteur présente ce coma comme limitant l'inconfort, tout en indiquant que les doses employées ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant son installation. Les essais préliminaires sur cellules sont écartés, le porteur concluant à la "nécessité" d'un modèle animal pour intégrer les voies physiologiques du choc septique.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.
Impact sur les animaux
L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.
Raffinement
À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.
Etude du microenvironnement tumoral dans les métastases hépatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Opérées d'une splénectomie partielle sous anesthésie générale pour recevoir une injection de cellules tumorales, les souris de ce projet développent des métastases hépatiques. 787 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour analyse des cellules du foie. Certaines subissent en plus trois injections d'un inducteur sous anesthésie locale, deux gavages par sonde œsophagienne et un prélèvement de sang, le porteur reconnaissant que les métastases peuvent provoquer douleurs et perte de poids modérées. Le bénéfice annoncé reste une meilleure compréhension de la biologie des macrophages et l'espoir d'identifier des cibles thérapeutiques, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates et certaines.
Objectifs
Chaque année 1,4 million de nouveaux cas de cancer colorectal sont diagnostiqués dans le monde et 700 000 en meurs chaque année faisant de celui-ci la 2e cause de mort cancer. Environ 25% des patients présentent des métastases hépatiques, la résection des tumeurs est la meilleure option pour traiter ses métastases cependant seul 10 à 20% des patients y sont éligibles. Pour les patients atteints de métastases non-résécables, la survie ne dépasse pas les 2% à 5 ans. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour de meilleures options thérapeutiques pour ces patients. Les tumeurs sont formées d’un ensemble de cellules cancéreuses et non-cancéreuses composant le microenvironnement tumoral (TME) telles que des cellules immunitaires. Parmi celles-ci, les macrophages associés aux tumeurs sont présents en abondance et sont associés à un mauvais pronostic. Notre laboratoire a démontré que les macrophages émergent lors de plusieurs vagues consécutives au cours du développement. En plus de ses particularités, l’effet du temps passé dans le tissu contribue à l’acquisition d’une signature unique. A Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier avec précision les interactions locales et les fonctions de ce mélange hétérogène de macrophages d’ontogénie différentes dans le microenvironnement métastatique afin d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a le potentiel d'améliorer de manière significative notre compréhension de la biologie des macrophages dans le contexte des métastases hépatiques. Nous espérons que ce projet offre de nouvelles perspectives et stratégies concernant l'exploitation des macrophages à des fins thérapeutiques dans le cancer. Les découvertes liées à ce projet pourraient également avoir des portées plus larges applicables à d'autres maladies. Ce projet pourra apporter alors des avances majeures en termes de recherche fondamentale et translationnelle.
Procédures
Les animaux auront une injection de cellules tumorales après splénectomie partielle chirurgicale (n=1, durée 15 minutes sous analgésie et anesthésie générale). Certains animaux subiront également un prélèvement de sang (n=1, anesthésie locale, durée 1 minute maximum). Certains animaux auront 3 injections d'un inducteur (durée 15 secondes, anesthésie locale). Des animaux auront deux gavages (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
L'opération chirurgicale permettant l'injection de cellules cancéreuses dans la rate sous anesthésie et analgésie occasiionnera en elle-même une contrainte légère et temporaire. Le développement des métastases hépatiques représente une nuisance pour l'animal qui peut se manifester par des douleurs ou une perte de poids modérés. Les injections sous anesthésie locale représentent des contraintes légères liée à la contention. Le gavage représente une contrainte moyenne de courte durée liée à la contention et à l'introduction de la sonde dans l'œsophage: risque de douleur locale légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude pour analyses sur les cellules hépatiques.
Remplacement
Ce projet nécessite l'établissement des métastases dans des conditions réelles pour pouvoir étudier l'hétérogénéité des macrophages au cours du temps et en fonction de leur origine. Nous développons en parallèle des modèles types organoïdes pour récréer les tumeurs in vitro cependant cette approche ne permet pas actuellement de récapituler la complexité du microenvironnement tumoral qui est un paramètre fondamental de notre étude. De plus, notre stratégie est entre autres basée sur le suivi temporel de la différentiation des macrophages ayant colonisé le tissu métastatique à différents moments avant et durant le developpement de métastases. Si les organoïdes nous permettent d'étudier l'évolution tumorale sur quelques semaines, ils ne nous offrent pas la possibilité de l'étudier sur un lapse de temps comparable à nos modèles murins. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux est indispensable à notre étude.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit a son minimum en suivant la littérature ou en utilisant des outils statistiques pour le calcul des effectifs. De nombreuses cellules dont certaines rares seront collectées après mise à mort pour pouvoir étudier l'implication de nos cellules d'interêt dans les métastases hépatiques au niveau cellulaire, moléculaire et transcriptomique. Chaque individu permettra de générer de très nombreuses informations.
Raffinement
Les souris sont sous surveillance clinique quotidienne pour une évaluation précise et stricte de leur état de santé. Des points limites précoces adaptés ont été définis et seront strictement appliqués. Nous avons adapté nos procédures pour limiter les nuisances et effets indésirables. Pour la chirurgie, les souris reçoivent une analgésie et sont sous anesthésie générale. Pour les injections, les souris recoivent une anesthésie locale ou générale en fonction du site d'injection et nous utilisons des aiguilles très fines . Pour les gavages nous utiliserons des sondes souples.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en terme de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans la tumorogénèse dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle entre 8 et 12 semaines, âge minimum de la maladie chez les patients.
Etude de l’homéostasie de l’épithélium intestinal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
9 720 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs intestins et leurs fèces, 6 210 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 3 510 un niveau modéré. Elles sont génotypées, gavées, injectées cinq jours de suite avec des agents inducteurs, traitées par un agent de chimiothérapie et irradiées cinq minutes, le porteur ne retenant comme effets qu'un stress lié à la contention et une perte de poids temporaire possible. L'objectif déclaré porte sur les mécanismes de renouvellement de l'épithélium intestinal et la prolifération des cellules souches, les perspectives thérapeutiques pour les maladies inflammatoires intestinales étant renvoyées au long terme. Le porteur indique qu'il tirera des organoïdes de ces souris, alternative qu'il qualifie d'éthique et efficace, sans expliquer comment il aboutit à 9 720 animaux.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour objectif d'élucider les mécanismes régulant le renouvellement de l’intestin, en mettant particulièrement l'accent sur la prolifération des cellules souches intestinales. Il vise à identifier, à l'aide de modèles de souris, les voies de signalisation essentielles à la physiologie intestinale et à la régénération de ce tissu face à divers stress, tels que l'irradiation, l'inflammation, et les traitements chimiothérapeutiques. En outre, l'impact de la flore intestinale sur le maintien et la fonction de ce tissu seront analysés.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans la physiologie intestinale et la protection de l'intestin contre divers stress. Ces recherches devraient non seulement enrichir la compréhension de la biologie des cellules souches intestinales et de la régénération épithéliale, mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires intestinales et des effets secondaires des thérapies chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques.
Procédures
Pour les animaux vigiles : • génotypage : 10 secondes. • Contention pour gavage (1X) : 20 secondes • Contention pour injection intrapéritonéale d’agents inducteurs: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours) • Contention pour injection agent chimiothérapeuthique : 20 sec (1X) • Irradiation : 5 minutes. Pour les animaux sous anesthésie générale : • Prélèvement sanguin : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors de la contention, de l’injection intrapéritonéale et du gavage. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et fèces, nécessaires aux différentes analyses.
Remplacement
L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires. Nos modèles de souris seront également utilisés pour générer des organoïdes intestinaux. Les organoïdes dérivés de ces modèles fournissent une alternative éthique et efficace tout en permettant une analyse détaillée des effets épithéliaux des mutations.
Réduction
Un nombre minimal d’animaux sera inclus dans chaque groupe, tout en étant suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et permettre l’application de tests statistiques entre les différentes conditions. Certaines études pourront être réalisées sur des organoïdes issus de ces animaux, permettant ainsi de tester plusieurs drogues à partir d’une seule souris.
Raffinement
Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement. Des grilles de points limites spécifiques sont établies. Le raffinement comprend l’utilisation d’anesthésiques avant le prélèvement sanguin. Pour les gavages, des canules en inox adaptées à l'âge des souris sont utilisées.
Choix des espèces
Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris (Mus musculus). En effet, les manipulations génétiques chez cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines seront utilisées, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de vecteurs viraux administrés en topique ou par injection intra-neurale, chez le rongeur.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 685
Jusqu'à dix acquisitions d'imagerie par jour le premier jour, puis trois par jour pendant trois jours, puis une par jour jusqu'au dixième : 1 370 rongeurs, 685 souris et 685 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 450 d'entre eux, modéré pour 900 et léger pour 20. Les animaux subissent des abrasions ou scarifications de la voûte plantaire, de la lèvre ou de la cornée et des injections dans le nerf sciatique sous anesthésie pouvant durer une heure, avec douleurs, inflammation, gêne pour s'alimenter, difficultés locomotrices et troubles visuels annoncés. Le projet sert à établir le profil pharmacologique de vecteurs de thérapie génique, données destinées à un dossier européen de médicament expérimental puis à une éventuelle demande d'essai clinique. Dix animaux seront réutilisés et les témoins pourront être gardés en vie pour la formation continue du personnel ou servir de contrôles dans d'autres études, tous les autres étant tués pour prélèvement des ganglions.
Objectifs
Les aires thérapeutiques majeures (oncologie, neurologie, cardiologie, urologie…) demeurent sans solution thérapeutique satisfaisante. Elles constituent les principales causes de mortalité et de handicap dans le monde, et provoquent de véritables drames humains, sociaux et économiques. Mais au cours des deux dernières décennies, la thérapie génique est devenue un outil thérapeutique clé qui constitue un véritable espoir pour les patients. Actuellement, les vecteurs viraux sont devenus le principal système d'administration de gènes pour la médecine génétique. L’objectif est d’introduire des gènes dans des cellules pour soigner une maladie. Au départ, cette approche a été conçue pour suppléer un gène défectueux en cas de dysfonction. Mais au cours des deux dernières décennies, l’évolution rapide des connaissances et des technologies a permis de démultiplier les stratégies possibles et d’élargir leur utilisation à de très nombreuses indications. L’objectif de ces vecteurs est de traiter les maladies neurologiques grâce à la thérapie génique. En fonction de la voie d’administration, les vecteurs vont coloniser différents ganglions puis exprimer le transgène d’intérêt pour la maladie cible. Dans ce projet, différentes voies vont être testés afin de déterminer la voie la plus pertinente et la plus efficace dans la colonisation des neurones sensoriels cibles. Les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique chez l’animal sont nécessaires pour caractériser le potentiel thérapeutique d’une molécule. Dans ce contexte les administrations topiques (cutanées et cornéennes) et intra-nerveuse avec suivi de la molécule par imagerie, permettront d’étudier l’absorption et la distribution de ces vecteurs. L’objectif sera d’aider à la détermination de la voie d’administration optimale et du régime posologique le plus adapté. Ce projet a pour objectif de caractériser l’absorption, la distribution et l’excrétion de vecteurs viraux chez le rongeur. Il se décompose en 2 phases : l’administration de composés en topique et intra-neurales et l’évaluation de la bio-distribution.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil pharmacologique d’un composé. A plus long terme, les données obtenues au travers ces études précliniques feront partie intégrante du dossier Européen IMPD (Investigational Medicinal Product Dossier), lequel permettra de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera peut-être sur la mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Procédures
Les abrasions/scarifications et la chirurgie du nerf sciatique seront faites sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra durer jusqu’à 1h du fait du temps de pénétration/séchage des produits administrées (sur les zones scarifiées/abrasées) ou de la chirurgie du nerf sciatique. Des examens scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu’au 30e jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le stress est inhérent à toute manipulation d’animaux. Les méthodes d’administration topiques par abrasion et scarification, et les administrations intra-neurales peuvent induire des douleurs et une inflammation. La scarification de la lèvre peut entrainer une douleur entrainant une gêne pour s’alimenter. Des difficultés locomotrices pourront être observées chez les animaux ayant eu une scarification/abrasion de la voute plantaire ou une injection intra-neurales. La scarification peut entrainer une douleur et des troubles visuels.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Tout organe pertinent pourra être prélevé après mise à mort de l’animal afin de réaliser une quantification des produits par imagerie ex-vivo (micro-scanner ou imagerie optique) ou par d’autres techniques in-vitro. Les ganglions de la racine dorsale ou les ganglions trijumeaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Les animaux contrôles pourront être gardés en vie et utilisés pour de la formation continue du personnel ou, dans la mesure du possible et en fonction des projets, ils pourront être réutilisés pour des études comme animaux contrôle.
Remplacement
La pharmacologie étudie les interactions entre un xénobiotique et une ou plusieurs cibles endogènes. Ces interactions recouvrent les effets du xénobiotique, ou ses produits de dégradation, sur la ou les cibles, mais aussi l’action de la ou les cibles sur l’agent toxique. Une bonne compréhension des mécanismes est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à un effet pharmacologique ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela qu’il est impératif d’évaluer les effets potentiels d’un composé thérapeutique sur des modèles animaux avant tout essais chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • en cas de doute, des études pilotes pourront être réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement les composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué in-vivo par exemple.
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse: une période d’acclimatation de minimum 5 ou 7 jours (si les animaux sont transportés par avion) sera respectée. Ils seront également hébergés collectivement durant toute la durée de l'étude pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, réchauffement, injection d’analgésie, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. • des évaluations cliniques quotidiennes (état général des animaux, détection d’état moribond) et régulières (pesée et scoring des signes cliniques au moins 1 fois par semaine, fréquence augmentée en fonction de l’état clinique des animaux et de la sévérité des actes réalisés), • des soins vétérinaires adaptés aux voies d’administrations des vecteus viraux et en fonction de l’état clinique des animaux, • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation des signes cliniques généraux et spécifiques à la voie d’administration sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour les études de pharmacocinétique et pharmacodynamique du fait de leur prédictivité. Étant fond génétique international, ces souches permettent de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (6 à 8 semaines) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal. Cet âge est également en accord avec les lignes directrices pour garantir une homogénéité entre les phases précliniques.
Caractérisation de l’évolution de l’hypercalcémie secondaire à des taux élevés de vitamine D, une maladie rare
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
972 souris vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à trois séjours de 96 heures isolée en cage métabolique sur trois mois, à jeun seize heures avant chaque expérimentation. Elles reçoivent quinze administrations par voie orale en un mois, jusqu'à six anesthésies et jusqu'à trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les animaux homozygotes développent l'hypercalcémie recherchée, et le porteur affirme sur la base d'expériences antérieures qu'aucune nuisance n'est attendue, ne retenant comme stress que l'isolement en cage métabolique. Les points limites prévus décrivent pourtant une absence de gain de poids à la puberté, une incapacité à s'alimenter, un poids inférieur de plus de 15 % et des poils hérissés, autant de signes qui déclenchent la mise à mort.
Objectifs
Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.
Procédures
isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois), mise à jeun 16H avant l’expérimentation, administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise). Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats
Impact sur les animaux
Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule. Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats
Devenir
Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.
Remplacement
L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.
Réduction
L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.
Raffinement
Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient etre administres selon les recommendations veterinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques avec mise à jeun, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée. Le jeûne (mise à jeun) avant la récolte d'urine et de sang est nécessaire pour garantir des résultats précis. Il permet d'éviter les fluctuations biochimiques sanguins tel que glycémie, des lipides et des hormones causées par l'alimentation, qui pourraient fausser les analyses. Cela assure une meilleure interprétation des résultats et une reproductibilité.
Choix des espèces
L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.
Formation aux techniques in vivo standards en Recherche et Développement (R&D)
- Formation professionnelle
Rats : 80
Cochons d'Inde : 80
Hamsters dorés : 70
Hamsters de Chine : 10
Lapins : 80
Cochons : 20
Former le personnel aux gestes techniques d'une activité de recherche et développement, sur des animaux vivants, constitue l'objet de ce projet. 1 340 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 souris, 80 lapins, 80 rats, 80 cochons d'Inde, 70 hamsters dorés, 10 hamsters de Chine et 20 cochons. Chaque séance comporte une à trois interventions par animal sur trente minutes, injections, prises de sang, anesthésies parfois répétées, lavages broncho-alvéolaires avec chute de la saturation en oxygène, le porteur reconnaissant que les personnes à former ne maîtrisent pas les gestes et peuvent provoquer saignements et douleurs par erreur technique. Quarante animaux seront réutilisés et vingt lapins ou cochons placés en adoption quand les conditions le permettent, les 1 280 autres étant tués, et le porteur justifie l'ensemble par une obligation réglementaire de formation qu'il qualifie d'"indispensable".
Objectifs
- Educatif : La formation sur animaux est indispensable pour la qualification du personnel et la maitrise des gestes techniques et ainsi pouvoir observer que ceux-ci correspondent bien aux règles de l’art et qu’aucun impact clinique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. - Réglementaire : La formation du personnel avec démonstration de la compétence est une obligation réglementaire (décret 2013-118, section 6, sous-section 4, paragraphe 2).
Bénéfices attendus
La formation du personnel aux gestes techniques permet d’avoir des personnes parfaitement formées et compétentes, et travaillant de façon harmonisée avec du matériel optimisé. Les bénéfices sont principalement éthiques : pour le bien-être de l’animal manipulé (raffinement), ainsi que pour consolider la reproductibilité du geste et donc éviter d’avoir à refaire l’étude (réduction). Des gestes maitrisés permettent également de limiter le risque de blessure pour l’opérateur
Procédures
Les animaux sont soumis à des sessions de formation à l’administration de produits non irritants et/ou de prélèvements de sang. Par séance de formation, ils vivront entre 1 et 3 interventions ; pour une durée totale de 30 minutes
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : - la sensation de piqûre de l’aiguille pour les injections et prélèvements. - l’anesthésie potentiellement répétée notamment pour certains types de prélèvements sanguins - la chute de la saturation en oxygène du sang pendant quelques minutes dans le cas des lavages broncho-alvéolaires. Par définition, les personnes à former ne maitrisent pas complètement les gestes techniques. Bien qu’une formation théorique préalable et un accompagnement par une personne compétente soit assurés, il est possible que des erreurs techniques surviennent induisant des effets indésirables comme des saignements de faible intensité et de courte durée lors des prélèvements sanguins, ou de légères douleurs induites par une injection dans un compartiment non adéquate (péri-veineux ou intra-intestinal par exemple).
Devenir
Lorsque cela est possible (pas de formation au prélèvement terminal, pas de procédure invasive, bon état de santé de l’animal, pas d’hébergement dans un milieu bioconfiné, statut sanitaire compatible, structure d’accueil identifiée et disponible), des démarches de réutilisation, de replacement et/ou d’adoption sont enclenchées. Lorsque toutes les conditions ne sont pas réunies, les animaux sont euthanasiés en fin de procédures expérimentales.
Remplacement
Lorsque cela est possible, les gestes sont réalisés sur des matières non vivantes (plastique, textile, tissus morts, ou composition diverse) afin de s’entrainer au geste avant de pratiquer sur animal vivant. Des dispositifs ont déjà été testés, tous n’ont pas été retenus (ex : des animaux en plastique trop rigides pour s’entrainer à de la contention). Une veille scientifique est assurée par notre équipe (vétérinaires, managers, techniciens) via les publications, le réseau, la visite d’un centre de formation aux gestes techniques sans animaux, les formations (ex : ComEd), etc. afin de ne rater aucune opportunité à la formation sans animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est raisonné selon le nombre de personnes à former, l’expérience de ces personnes, le nombre de techniques à apprendre, la difficulté technique, le nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer qu’une personne maîtrise un geste technique. Aucune approche statistique n'est envisageable pour ce projet, le nombre d'animaux utilisé étant tributaire du nombre de personnes à former et de leur niveau initial. Dans la mesure du possible, des animaux d’autres procédures pourront être utilisés pour cette formation. Pour qu’ils soient réutilisés, il faut que la procédure précédente soit considérée comme « légère ou modéré» et qu’ils soient en bon état de santé. Aucun animal ayant subi une procédure sévère ou ne présentant pas un bon état général ne pourra être utilisé pour la formation. Enfin, un effort de réduction est appliqué chez les rongeurs par l’utilisation d’un appareil d’imagerie qui permet de visualiser la localisation de l’injection (IC, IP, IM, ICe ou SC) -et donc valider le geste technique sans avoir à euthanasier l’animal - permettant ainsi de réutiliser l’animal par la suite.
Raffinement
Moyens entrepris au niveau du projet ou de la procédure pour réduire le niveau de souffrance : une formation théorique est dispensée à l’arrivée des personnes avec du texte, des supports visuels (photos, vidéos). Avant maitrise des gestes de prélèvements et d’administration (hors IP), les animaux sont anesthésiés.
Choix des espèces
La formation du personnel doit prendre en compte toutes les espèces sur lesquelles il est amené à réaliser des gestes techniques dans le cadre des projets de recherche. Ces espèces sont définies et justifiées dans les protocoles des procédures de R&D. Le programme est développé en lien avec le responsable du suivi des compétences et le manager. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement,…). Ces espèces correspondent aux espèces déclarées et validées dans l’agrément d’établissement utilisateur, ainsi qu’aux espèces déclarées dans les projets de recherche et développement. Ce sont donc les espèces pour lesquelles le personnel doit être formé s’il ne l’est pas déjà Les animaux utilisés sont ceux demandés dans les protocoles d’étude de la R&D. Les souris peuvent être utilisées nouveau-nés dans le cadre de besoin projet (ex : développement de candidat vaccin pour des nouveau-nés). Si des souriceaux âgés entre 24h et