Rongeurs

Tuées pour qu'on prélève leurs tumeurs et le maximum de sang possible, afin de constituer une banque de sérum censée éviter des expériences ultérieures, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome humain leur sont greffées sur animal vigile, la contention durant de trente secondes à une minute, puis les tumeurs sont mesurées régulièrement au pied à coulisse et les animaux pesés chaque semaine. L'objet est de vérifier si la perte d'expression d'un gène surexprimé dans le mélanome ralentit ou arrête la croissance tumorale. Le porteur précise avoir choisi des souris au système immunitaire en partie défaillant, greffées à sept semaines parce qu'à cet âge la prise tumorale est optimale.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier l'imapct de la perte d'expression d'un gène, dont l'expression est élevée dans un cancer de la peau, le mélanome, sur la croissance tumorale. Dans un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses (mélanome) humaines l'expression de ce gène sera très fortement diminuée et le suivi de la croissance tumorale permettra de mettre en évidence si la perte d'expression de ce gène induit une diminution, voire un arrêt de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à montrer l’impact de la perte d’expression d'un gène sur la croissance tumorale (mélanome). Cela permettra de valider alors le potentiel comme cible thérapeutique de ce gènes, le but étant de proposer ensuite de nouvelles thérapies curatives contre les mélanomes.

Procédures

Greffes de cellules tumorales d'origine humaine en début de procédure, sur souris vigile. La contention pourra durer de 30 secondes à une minute et pourra générer un peu de stress chez l'animal. Les souris seront pesées régulièrement, nécessitant le transfert de la souris sur la balance et le retour dans la cage (15 secondes par souris). Les tumeurs seront mesurées régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse électronique. Cela va nécessiter le maintien de la souris afin d'effectuer les mesures (environ 30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (greffe de cellules tumorales, pesée hebdomadaire, observation). Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de la greffe de cellules tumorales humaines. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort car il faut (1) prélever les tumeurs et (2) prélever un maximum de sang afin de pouvoir obtenir un maximum de sérum (pour pouvoir réaliser des dosages si besoin sur de nombreux marqueurs sériques) et créer ainsi une banque de sérum qui nous évitera de devoir procéder à de nombreuses expériences sur l'animal. Tout cela n'est donc pas compatible avec le maintien en vie de l'animal.

Remplacement

Nos études visent à mettre en évidence des cibles potentielles pour lutter contre le Cancer. Malgré une forte expertise dans les méthodes de criblages cellulaires, d’analyse des bases de données afin d’identifier les gènes impliqués, et une forte connaissance des outils de modification cellulaire et de validation in vitro, la validation de potentielles cibles thérapeutiques chez l'Homme nécessite le passage par des modèles plus complexes comme les modèles murins. Toutefois tout est mis en place pour limiter au maximum le nombre d'animaux nécessaire pour nos études.

Réduction

Pour ce protocole un nombre minimal d’animaux sera utilisé. Après une procédure nécessaire de mise au point des conditions expérimentales (qui servira ultérieurement pour d'autres études) la seconde procédure visera à étudier l'impact de la perte d'expression du gène d'intérêt sur la croissance tumorale de cellules de mélanome. Un logiciel statistique permet de calculer le nombre exact d'animaux nécessaire pour que des statistiques puissent être validés et permettre ainsi de ne pas devoir répéter les expériences inutilement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans l’animalerie, à l’âge de 6 semaines, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs de 7 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 à 5 souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car c'est un modèle classiquement utilisé dans les études de cancérologie, de par son homologie avec le génôme humain. De façon plus spécifique ici les souris possèdent un système immunitaire en partie défaillant. Cela facilite alors la prise de greffes de cellules tumorales d'origine humaine. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte avec une arrivée à l'animalerie à 6 semaines et une greffe de cellules à 7 semaines. A ce stade de développment la prise tumorale est optimale. Avec des souris plus âgées le pourcentage de prise tumorale serait moindre.

Pour renforcer des lymphocytes T et NK contre la leucémie aiguë myéloblastique, 144 souris NSG immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de procédure pour l'étude du sang, de la rate et de la moelle osseuse. Chacune subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, deux à cinq injections intraveineuses de cellules leucémiques ou effectrices, sept injections de luciférine, sept séances de bioluminescence et sept prises de sang par voie rétro-orbitale. La xénogreffe de cellules souches humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte atteignant la peau, le foie et l'intestin, et une leucémie très avancée peut provoquer des douleurs osseuses. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré, puisqu'il interférerait avec le système immunitaire étudié, et que si des morphiniques devenaient discutables, l'animal serait tué plutôt que soulagé.

Objectifs

Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour renforcer l’efficacité des cellules immunitaires contre les cancers du sang, en particulier la leucémie aiguë myéloblastique. Cette maladie est agressive et présente un fort risque de rechute après une greffe de moelle osseuse. Nous explorons deux stratégies complémentaires : (1) Une modification génétique : Nous modifions les cellules immunitaires pour leur faire exprimer des récepteurs spécifiques leur permettant de reconnaître et d’attaquer plus efficacement les cellules cancéreuses. (2) Une approche biochimique innovante permettant fixer chimiquement des molécules à la surface de cellules immunitaires, afin d’améliorer leur capacité à repérer et détruire les tumeurs. Avant d’envisager une application clinique, il est indispensable de valider ces stratégies dans un modèle préclinique. In vitro, ces deux stratégies se sont déjà révélées hautement efficaces. L’expérimentation animale, en particulier sur des souris immunodéficientes, est essentielle pour évaluer leur efficacité et leur sécurité dans un organisme vivant. Cette étape permettra de mieux comprendre comment ces cellules modifiées interagissent avec leur environnement et d’identifier d’éventuels verrous empêchant nos stratégies de fonctionner in vivo.

Bénéfices attendus

Les approches développées dans ce projet pourraient améliorer les traitements des cancers du sang en rendant les cellules immunitaires plus efficaces et mieux ciblées. Les bénéfices attendus incluent : (1) Une meilleure efficacité des thérapies cellulaires : Grâce aux modifications génétiques et biochimiques, les cellules immunes seront capables de reconnaître et d’éliminer plus efficacement les cellules cancéreuses, réduisant ainsi le risque de rechute. (2) Des alternatives aux traitements actuels (3) Un impact potentiel au-delà des cancers du sang : Ces innovations pourraient être adaptées à d’autres types de cancers, comme les lymphomes B ou les tumeurs solides, en ciblant des récepteurs spécifiques. (4) Des avancées pour les greffes de moelle osseuse : En exploitant les différences génétiques entre donneur et receveur, il serait possible d’optimiser l’effet anti-leucémique. Si ces stratégies se révèlent efficaces et sûres, elles pourraient être testées dans des essais cliniques chez l’homme, avec pour objectif final d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteints de cancers hématologiques agressifs.

Procédures

Irradiation corporelle totale sous anesthésie générale : 1 fois ; Injection intraveineuse de cellules génétiquement modifiées, sous anesthésie générale (lignées leucémiques, effecteurs) : 2 à 5 injections selon les procédures ; Injection intrapéritonéale de luciférine : hebdomadaire, 7 fois ; Bioluminescence : hebdomadaire, non invasif, sous anesthésie générale, 7 fois ; prise de sang sous anesthésie générale + locale: hebdomadaire, 7 fois

Impact sur les animaux

La gravité attendue des diverses procédures est faible à modérée (irradiation, injection intraveineuse (IV) de cellules leucémiques / lymphomateuses / ou de cellules souches hématopoïétiques, injection IV des cellules effectrices, bioluminescence et prise de sang hebdomadaire sous anesthésie par voie retro-orbitale). Nuisances prévues : - le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress modéré et transitoire - l’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux - les injections intraveineuses (cellules) et intrapéritonéales (luciférine) peuvent provoquer un stress transitoire - l’enregistrement de la bioluminescence peut provoquer un stress - les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur - le développement de cancer du sang (leucémie et lymphome) chez la souris peut entrainer, dans de rares cas de maladie très avancée, des douleurs osseuses - la xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut entrainer une réaction de type maladie du greffon contre l’hôte avec atteinte cutanée, hépatique et intestinale

Devenir

La totalité des animaux ayant reçu l’injection d’une lignée leucémique ou une xénogreffe de CSH seront euthanasiés en fin de procédure, pour étude tissulaire (sang total / rate / moelle osseuse).

Remplacement

Nos travaux de recherche s’inscrivent dans une dynamique de transfert des connaissances vers la clinique avec le développement de nouvelles immunothérapies basées sur les lymphocytes pour soigner des hémopathies. La validation de nos modèles nécessite d’être éprouvée dans un modèle animal. La souris NSG immuno-déprimée est un modèle adapté qui permettra de répondre sur le gain en efficacité anti-tumorale de ces immunothérapies. Nous avons déjà validé l’efficacité de ces immunothérapies contre de nombreuses lignées leucémiques et des bastes primaires in vitro. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de leur efficacité une fois injectées dans un organisme.

Réduction

Dans le cadre de notre engagement éthique à réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales, la détermination a priori de l'effectif des lots n'est pas réalisable compte tenu du caractère novateur et exploratoire de notre étude pilote. L'effectif des groupes sera déterminé de manière à maintenir une puissance statistique suffisante tout en minimisant strictement le nombre d'animaux utilisés. Des analyses statistiques seront effectuées a posteriori, en privilégiant des méthodes adaptées aux très petits échantillons.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Par ailleurs, chez l’humain, le développement d’une leucémie aiguë n’est généralement pas source de douleur, sauf en cas de maladie très avancée où des douleurs osseuses peuvent apparaitre. La xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut se compliquer de maladie du greffon contre l’hôte, avec une atteinte possible cutanée, digestive ou hépatique. Enfin, la transplantation de cellules NK humaines ne se complique pas de maladie du greffon contre l’hôte. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. L’échelle de points limite utilisée sera une échelle habituellement utilisée dans les modèles de xénogreffes. En cas d’atteinte d’un signe clinique sévère, ou de deux signes cliniques notables, l’animal sera euthanasié. L’administration d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce protocole car ce traitement interagirait avec le système immunitaire des souris, qui est l’objet de la présente étude. Si l’administration d’antalgiques morphiniques était amenée à être discutée (douleur forte sur leucémie aiguë avancée sans possibilité d’amélioration, signifiant l’échec du traitement), l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

L’objectif étant de cibler un antigène humain, l’utilisation de souris immuno-déficientes permettant l’implantation de cellules tumorales humaines est essentielle. Nous avons donc choisi de travailler sur des souris NSG. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines. Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes afin de se placer au plus près des conditions du développement tumoral chez l’humain.

La mise à mort est fixée à huit semaines après l'opération, soit quatre semaines avant l'apparition des douleurs spontanées et handicapantes que le porteur attribue à ses modèles d'arthrose. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. 96 subissent l'ablation d'un ménisque sous anesthésie par injection, 96 reçoivent dans l'articulation une molécule qui déclenche une arthrose inflammatoire, 96 une injection intrapéritonéale supprimant un gène, et les 192 passent un test de sensibilité à la douleur une fois par semaine pendant huit semaines. L'objet est de savoir si la protéine COMT pourrait un jour devenir une cible médicamenteuse contre l'arthrose, dont les mécanismes de la douleur restent, de l'aveu du porteur, largement inconnus.

Objectifs

L’étude proposée vise à examiner le rôle de la catéchol-O-méthyltransférase (COMT), une protéine associée à la régulation des molécules de communication entre les nerfs, dans l’arthrose (OA) et la douleur associée. Nous cherchons à clarifier la relation entre les différentes formes génétiques de COMT existant dans la population (appelées aussi variants) et la physiopathologie de l’arthrose, une maladie chronique et multifactorielle liée au vieillissement, caractérisée par l’altération des tissus articulaires et la douleur. Il est bien établi que les variants de COMT sont associés à la douleur liée à l’arthrose. Cependant, le rôle de COMT dans l’arthrose et les mécanismes responsables de la douleur associée à cette maladie restent encore largement inconnus. Dans ce contexte, l’objectif de l’expérimentation animale dans ce projet est d’élucider le rôle de COMT dans les tissus articulaires au cours de l’arthrose. Les résultats obtenus permettront, à terme, d’évaluer si le ciblage de COMT par des molécules thérapeutiques peut réduire la progression de l’arthrose et la douleur associée. Scientifiquement, nous espérons mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie des articulations et de l’arthrose, et plus particulièrement le rôle de COMT (via l’utilisation de souris dépourvues du gène COMT spécifiquement dans le cartilage) ainsi que celui de ses variants génétiques dans les tissus articulaires (grâce à l’utilisation de lignées murines dans lesquelles le gène COMT de la souris a été remplacé soit par le variant méthionine, soit par le variant valine humain).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours du projet auront sans aucun doute de larges implications pour notre compréhension de la biologie ostéoarticulaire et du processus de la douleur, ainsi que pour le traitement de l'arthrose. Le projet proposé est donc à la fois fondamental et translationnel : il devrait permettre la découverte de nouveaux mécanismes pathologiques, de biomarqueurs utiles en clinique, et de cibles thérapeutiques dans le cadre de l'arthrose. Ces recherches auront des applications en génétique et en pharmacologie.

Procédures

Les 192 souris seront utilisées. Parmi elles, 96 souris génétiquement modifiées recevront une injection intrapéritonéale sous sédation gazeuese (20 secondes) avec une molécule permettant la perte du gène COMT Par ailleurs, 96 souris subiront une ablation du ménisque afin de mimer l’arthrose mécanique ; pour cela, elles seront anesthésiées pendant 15 minutes par injection. En outre, 96 souris recevront une injection intra-articulaire d’une molécule pouvant induire l’arthrose inflammatoire ; ces dernières seront anesthésiées pendant 5 minutes par inhalation gazeuse. L’ensemble des 192 animaux sera soumis à un test de sensibilité à la douleur une fois par semaine pendant 8 semaines. Ce test sollicitera l’animal durant une période de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le marquage des souris provoque une douleur momentanée qui ne nécessite pas de prise en charge antalgique. L’injection intrapéritonéale de la molécule permettant la perte du gène COMT peut également entraîner une douleur localisée et passagère au niveau du site d’injection, ne nécessitant pas non plus de prise en charge antalgique. L’anesthésie par injection peut entraîner une baisse temporaire de la température corporelle durant la période de réveil. L’induction de l’arthrose dans nos différents modèles provoque l’apparition de douleurs spontanées et handicapantes à partir de la douzième semaine suivant les interventions. Une légère perte de poids a été observée 24 heures après l’opération, avec un retour au poids initial attendu dans les 48 heures. Dans nos deux modèles d’arthrose, les souris seront euthanasiées à 8 semaines, soit avant l’apparition des douleurs spontanées. Le test de sensibilité à la douleur provoque un réflexe de retrait de la patte, sans induire de douleur prolongée ou significative.

Devenir

. Mis à mort pour prélèvement d’organes

Remplacement

L'étude des chondrocytes in vitro est un modèle qui revêt un intérêt majeur pour la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires associés à l'arthrose. Il est également possible de réaliser des cultures ex vivo d'explants de cartilage humain, présentant l'avantage de préserver la complexité des différentes couches du cartilage. Cependant, l'arthrose, notre sujet d'étude, est une maladie affectant l'ensemble de l'articulation, englobant ainsi le cartilage, le ménisque, le muscle, la synoviale, le ligament et l'os. Les publications scientifiques bont démontré l'importance de chacun de ces éléments dans la physiopathologie de l'arthrose. Actuellement, que ce soit dans le développement d'organoïdes ou de puces biologiques, ces approches reproduisent de manière très lacunaire la complexité de ces interactions tissulaires, rendant ainsi leur utilisation peu pertinente. De plus, le développement de l'arthrose implique des mécanismes complexes tels que l'inflammation et les forces biomécaniques (pression, tension et cisaillement), difficiles à modéliser. C'est pour l'ensemble de ces raisons qu'à l'heure actuelle, l'utilisation du modèle animal, notamment le modèle murin, malgré ses imperfections, demeure la plus complète.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé afin d'assurer une puissance suffisante dans la détection de différences attendue de l’ordre de 20% (seuil de pertinence clinique). Dans cette perspective, il a été décidé de garantir une puissance d'au moins 80% pour détecter des différences lorsqu'elles sont attendues, correspondant à une taille d'effet estimée pour chaque expérience grâce aux études préliminaires réalisées. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Ce calcul de puissance permet d'obtenir le nombre minimal d'animaux nécessaire pour que nos tests statistiques soient exploitables et que nos expérimentations soient concluantes.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des cages transparentes, nourris ad libitum, dans un environnement enrichi. Les souris seront systématiquement acclimatées à la chambre d’expérimentation 60 minutes avant chaque expérience. Concernant les procédures chirurgicales : dans un premier temps un antalgique sera administré par injection sous cutanée une heure avant l’anesthésie générale. Celle-ci sera administré par injection intrapéritonéale. Ce type d'anesthésie permet une ventilation spontanée de l’animal. Un test du réflexe de retrait de la patte sera effectué pour s’assurer de l’endormissement des animaux. Nous supposons que la douleur postopératoire peut persister jusqu'à 24 heures, avec un pic entre 6 et 8 heures après l'intervention, ce qui justifie une deuxième injection d’antalgique 6 heures après l’intervention. Seuls les animaux présentant des signes de douleur le lendemain recevront une dose supplémentaire d’antalgique. Les souris seront placées dans une couveuse et observées jusqu’à leur réveil complet. Notre expérience, ainsi que les données de la littérature, montrent que la douleur directement associée à l'arthrose apparaît, quel que soit le modèle, 12 semaines après les procédures. Notre protocole prévoit une mise à mort 8 semaines après l'intervention, évitant ainsi l'apparition de cette douleur.

Choix des espèces

Les expériences in vitro de cultures cellulaires ne permettent pas de mimer la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein de l’articulation. De plus, l’influence de la composante mécanique est fondamentale dans cette pathologie. Le modèle murin combine les avantages d’intégrer les différents tissus de l’articulation avec les possibilités de modification génétique, est accéder à une évaluation de la douleur. Les données in vivo sont donc indispensables à la compréhension des mécanismes physiopathologiques. L’ensemble des souris seront méniscectomisées ou injectées MIA à l’âge de 10 semaines, âge à partir duquel la maturité osseuse est atteinte

160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie à l'issue pour analyse des tissus. Des cellules cancéreuses murines leur sont injectées dans la glande mammaire pour les femelles, ou par voie intraveineuse dans la queue pour former des métastases pulmonaires, puis elles reçoivent trois injections d'immunoliposomes et trois injections d'un anticorps d'immunothérapie. Le porteur reconnaît que le développement tumoral peut gêner le déplacement des souris porteuses de tumeurs mammaires et provoquer une gêne respiratoire chez celles dont les poumons sont atteints. Il indique avoir déjà validé ces immunoliposomes in vitro, et juge le passage in vivo essentiel parce que leur efficacité repose sur le système immunitaire d'un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde, avec environ 1,8 million de nouveaux cas par an en 2016, dont 50 000 en France. Une femme sur huit recevra un diagnostic au cours de sa vie. Bien que les avancées thérapeutiques aient amélioré la prise en charge, les rechutes restent fréquentes. Le cancer du poumon, avec 1,3 million de décès annuels, représente également un défi majeur. Les traitements actuels, bien que plus efficaces, montrent encore des limites, en particulier chez les patients en rechute. Afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques, nous avons développé et validé un traitement efficace dans un modèle de lymphome murin appelé immunoliposomes. L’objectif de ce projet est d’évaluer leur efficacité dans des modèles précliniques de cancer du sein et du poumon. Nous utiliserons des souris de deux souches différentes, dans lesquelles nous implanterons des cellules cancéreuses issues également de souris. Elles recevront ensuite un traitement combinant des immunoliposomes et des anticorps destinés à stimuler le système immunitaire contre la tumeur. Cette étude s’appuie sur nos recherches précédentes et a pour but d’améliorer les traitements des cancers qui ne répondent pas aux thérapies classiques.

Bénéfices attendus

Nos premiers essais sur les modèles murins de cancer du sein et du poumon ont montré que l’administration d’immunoliposomes permettait une diminution significative de la croissance tumorale, voire une régression complète des tumeurs dans certains cas. Ces résultats prometteurs suggèrent un fort potentiel thérapeutique de notre approche. Dans cette nouvelle étude, nous souhaitons approfondir nos investigations afin d’évaluer l’impact des immunoliposomes sur la formation et la progression des métastases. L’objectif est de déterminer si notre traitement peut limiter efficacement la dissémination tumorale, un enjeu majeur dans la prise en charge des cancers avancés. Par ailleurs, nous comparerons l’efficacité des immunoliposomes avec celle d’une immunothérapie, actuellement utilisée en clinique. Si nos immunoliposomes s’avèrent plus efficaces ou permettent une meilleure activation du système immunitaire, ils pourraient représenter une alternative innovante aux traitements existants, réduisant potentiellement les effets secondaires liés aux immunothérapies classiques. A terme, ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers du sein et du poumon, en particulier ceux en rechutes ou résistants aux traitements actuels.

Procédures

L’injection des cellules cancéreuses se fera sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 minutes. Une seconde injection sera effectuée au jour 40 uniquement chez les souris présentant une régression tumorale. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera trois fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances indésirables attendues sont d’abord au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, et par l’injection par voie intraveineuse au niveau de la queue pour le modèle du cancer du poumon, à l’aide d’un tube de contention. Parmi les autres nuisances attendues, les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection mammaire, pour le modèle du cancer du sein, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastase. Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie à l’issue des expériences afin de permettre l’analyse des effets du traitement sur les tissus et cellules d’intérêt.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire et qu’il y aura donc une efficacité thérapeutique. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour chaque modèle de cancers (sein et poumon), nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.

Raffinement

Pour minimiser la douleur et le stress des animaux, les protocoles expérimentaux sont soigneusement planifiés, avec des critères d’arrêt anticipé définis afin d’éviter toute souffrance excessive. Les souris sont hébergées en groupes de 5 à 10 dans des cages enrichies de structures en carton ou en plastique, leur permettant de se cacher et de se regrouper, favorisant ainsi leur bien-être. Les manipulations, y compris les injections et les mesures de la tumeur, sont réalisées par du personnel formé afin de réduire au maximum la contrainte et le stress. Pour les injections intraveineuses, les animaux sont placés sous une lampe chauffante pour faciliter la dilatation des vaisseaux, ce qui permet une manipulation plus rapide et moins invasive. La contention est limitée au strict nécessaire et ne dépasse pas deux minutes. Les souris sont surveillées régulièrement pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de souffrance excessive. Des critères stricts sont mis en place, notamment une perte de poids excessive, une altération du comportement, une détresse respiratoire ou une difficulté à se déplacer, déclenchant l'arrêt anticipé de l’expérimentation pour l’animal concerné. Afin d’assurer un suivi optimal, le personnel de l’animalerie est informé des critères d’arrêt et des signes de détresse à surveiller. Toute anomalie détectée entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, une mise à mort de l’animal est réalisée.

Choix des espèces

Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel. Nous utilisons des lignées cellulaires murines établies et reconnues, injectées dans des souris immunocompétentes pour garantir une réponse immunitaire fonctionnelle. Le modèle murin femelle est indispensable pour le cancer du sein, car la tumeur se développe au site d’injection dans la glande mammaire, reproduisant ainsi la progression tumorale observée chez l’humain. Pour le cancer du poumon, les cellules cancéreuses murines sont injectées par voie intraveineuse, permettant leur implantation dans les poumons, conformément aux protocoles validés dans la littérature. Ce modèle reproduit la dissémination métastatique et l’évolution tumorale observées chez les patients. Le système immunitaire des souris est similaire à celui de l’homme en termes de réponse antitumorale, rendant ces modèles pertinents pour évaluer l’efficacité des immunoliposomes et leur potentiel en thérapie anticancéreuse. Ils sont couramment utilisés en recherche préclinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Produire des sérums sur commande, un par animal, pour équiper en anticorps polyclonaux les services de diagnostic de l'établissement : 300 souris, 75 cobayes et 50 lapins vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intrapéritonéales d'antigènes inactivés avec adjuvants, deux prélèvements sanguins à la lancette au niveau de la jugulaire pour les souris et les cobayes, puis une injection létale avant les prélèvements post-mortem. Aucun n'est gardé vivant ni placé, le porteur invoquant l'immunisation avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3, même inactivés. Il indique que les méthodes existantes, phage display, fusion cellulaire, puces, in vitro, servent la production d'anticorps monoclonaux et ne visent pas "l'ensemble des anticorps ciblant le maximum d'épitopes d'un antigène ou d'un organisme entier", d'où le caractère "incontournable" du recours aux animaux.

Objectifs

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire. Nous avons besoin pour cela de produire des anticorps dirigés contre ces agents biologiques après une immunisation effectuée soit chez la souris soit chez le lapin ou le cobaye. Le choix de l’espèce se fait en fonction de l’affinité et de la quantité souhaité ainsi que de l’agent biologique étudié. Tout agent pathogène sera inactivé avant injection afin de préserver l’animal. Des adjuvants pourront être utilisés pour favoriser les réponses immunitaires. Le nombre de sérum obtenu dépendra du nombre d’antigène à tester dans l’année. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an et autant de sérum. On peut ainsi produire 300 sérums avec les 300 souris pour 60 à 100 Antigènes qui nous seraient fournis. Pour les cobayes, 75 sérums pour 25 à 75 antigènes et pour le lapin : 50 sérums pour 25 à 50 antigènes, le tout sur 5 ans.

Bénéfices attendus

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront les 3 injections en IP pour l'immunisation, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant avant les 2 prélèvements (préimmuns et intermédiaires). Puis, in fine, l'injection en IP d'anesthésiant/euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. La durée de chaque injection contenant des adjuvants est d'environ 2 minutes maximum par animal. Pour les prélèvements intermédiaires à l'aide des lancettes au niveau des jugulaires pour les souris et les cobayes, le geste est rapide (1 minute environ par animal). Pour les lapins, une attente de 20-30 minutes pour s'assurer de l'effet de la crème lidocaïne avant le prélèvement dont la durée variera en fonction du débit sanguin (soit 2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles potentiellement dûes aux injections en IP pour les immunisations puis des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements finaux.

Devenir

Euthanasie. Les animaux sont majoritairement immunisés avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3 qui même inactivés ne sont pas compatibles avec la possibilité de réutiliser ces animaux dans une autre procédure ou d’envisager un placement.

Remplacement

A ce jour, seul l’utilisation d’animaux permet la production d’anticorps polyclonaux sur la totalité de l'antigène afin d'obtenir des tests de diagnostic et des outils de recherches efficaces et fiables (Immunofluorescence en particulier) utilisés dans les services concernés dans notre établissement sur des microorganismes identifiés ou pas encore, pathogènes ou non. Les méthodes alternatives existantes à ce jour telles que Phage display ou fusion cellulaire, puces, in-vitro ou ex vivo, sont des méthodes développées et utilisées à des fins de production d’anticorps monoclonaux ou test thérapeutiques ou pharmacologiques. Ils ne sont pas adaptés à nos besoins qui sont de viser l’ensemble des anticorps ciblant le maximum d’épitopes d’un antigène ou d’un organisme entier. L’utilisation des animaux reste alors incontournable pour nous.

Réduction

Un minimum d’animaux est utilisé pour des productions polyclonales ciblant la totalité de l’antigène. Chaque animal est son propre témoin : avant l’immunisation, du sérum pré-immun est prélevé pour s’assurer de la réponse immunitaire attendue. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an. Au total nous aurions au maximum : 300 souris, 50 lapins et 75 cobayes sur 5 ans.

Raffinement

Chaque groupe ou animal sera stabulé dans une cage dans un même portoir ou armoire ventilé durant la totalité de l’expérimentation. Chaque groupe ou animal sera suivi de manière quotidienne, un enrichissement approprié (en fonction de l’espèce : igloos, matériel de nidification) sera disposé dans chaque cage. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) et pesés (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. Une grille de Morton et Griffits adaptée sera utilisée pour suivre les animaux immunisés. Tout signe de douleur et/ou souffrance entraînera l’arrêt de la procédure et les animaux seront euthanasiés par injection de surdosage de produit létal précédée d’une sédation profonde. Lors de procédures de prélèvements des anesthésies générales et/ou locales seront réalisées en fonction de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces choisies (souris, lapin et cobaye) sont celles retenues pour la production d'anticorps avec un titre relativement élevé en fonction de l'affinité du microorganime pour son hôte. Des souris âgées de 4-6 semaines seront utilisées. Des lapins âgés de 3 mois seront utilisés. Des cobayes âgés de 5-6 semaines seront utilisés. Le jeune âge de chaque espèce est favorable à une bonne réponse immunitaire.

Tués pour prélèvement de tissus, sans autre précision donnée, 286 Arvicanthis ansorgei vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rongeurs diurnes sont hébergés individuellement, soumis à un protocole de stress chronique destiné à provoquer chez eux un état dépressif, puis évalués par sept tests comportementaux en trois semaines, niveau d'activité, intérêt pour l'eau sucrée, construction du nid, réaction à la nouveauté. Ils reçoivent en parallèle vingt et une injections quotidiennes d'antidépresseur, pour vérifier si le traitement atténue les comportements induits. Le porteur affirme que le stress chronique et la réponse aux antidépresseurs ne peuvent pas être reproduits de façon fiable in vitro ou par informatique, et présente le rythme diurne de l'espèce comme un gain de transposabilité réduisant la "nécessité d'expérimentations supplémentaires".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre et à évaluer les signes de dépression et d’anxiété chez un modèle animal qui vit le jour, un rongeur nommé Arvicanthis ansorgei. Contrairement aux modèles habituels de souris ou de rats, qui sont actifs la nuit, ce rongeur est actif le jour, comme les humains, ce qui pourrait rendre ses réactions plus comparables aux nôtres. Pour cela, nous utilisons un protocole de stress léger et prolongé pour induire des comportements ressemblant à la dépression, puis nous administrons un antidépresseur afin d’observer s’il peut atténuer ces comportements. Cela nous permet de vérifier si notre approche pour évaluer les signes de dépression est fiable et de valider l’utilisation du modèle diurne mais également des tests comportementaux sur ce modèle, dans la recherche sur la santé mentale et les comportements anxieux-depressifs.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait améliorer notre capacité à étudier les troubles de l’humeur, comme la dépression, en utilisant un modèle animal actif le jour, ce qui ressemble davantage au rythme de vie humain. En validant ce modèle, nous pourrions mieux comprendre comment les comportements dépressifs se développent et comment les traitements agissent pour les réduire. À terme, cela pourrait aider à concevoir des méthodes de recherche plus précises et mieux adaptées pour tester de nouveaux traitements contre la dépression, contribuant ainsi à des avancées potentielles dans la santé mentale.

Procédures

Les animaux seront exposés à plusieurs sources de stress légers et variés, comme des modifications de leur environnement, dans le cadre d’un protocole visant à induire progressivement un état de stress chronique, avec pour objectif d'étudier des comportements liés à l’anxiété et à la dépression. Afin d’évaluer leurs réponses, ils passeront des tests visant à observer leur niveau d’activité, leur intérêt pour des récompenses et leur réactivité face à des situations nouvelles. Ces tests permettent d’analyser des comportements comparables à ceux observés dans les états dépressifs ou anxieux. 7 tests seront réalisés sur une période de 3 semaines, avec 2 jours d'intervalle entre chaque test. Les tests durent entre 10min et plusieurs jours pour certains (évaluation d'un score de construction du nid, ou de consommation d'eau sucrée toutes les 24h). De plus, les animaux recevront des injections quotidiennes d’un traitement antidépresseur pendant 3 semaines (soit 21 injections), afin de mesurer les effets potentiels du traitement sur leur comportement. Cette injection a une durée d'environ 2min maximum par animal. Ces interventions seront réalisées sur une période de plusieurs semaines, avec des tests courts et espacés pour limiter le stress supplémentaire

Impact sur les animaux

Les interventions prévues peuvent entraîner des effets de stress modéré chez les animaux, tels que des changements temporaires dans leur niveau d’activité ou dans leurs comportements d’exploration et d’interaction avec leur environnement. Le protocole de stress chronique, bien que conçu pour être léger, peut induire des signes de comportement dépressif ou anxieux. Les injections quotidiennes peuvent aussi entraîner un léger inconfort momentané au point d’injection.

Devenir

mise à mort pour prélèvement de tissus

Remplacement

Les comportements complexes liés aux états d’anxiété et de dépression, ainsi que la réponse physiologique aux antidépresseurs, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec des modèles in vitro ou informatiques. L'utilisation d'un modèle animal est donc nécessaire pour obtenir des informations précises et pertinentes sur les interactions entre le stress chronique, les comportements associés aux troubles de l’humeur, et les effets des traitements. Nous utilisons comme modèle animal le rongeur Arvicanthis ansorgei, pour son cycle d’activité diurne, qui est plus proche de celui des humains par rapport aux modèles nocturnes plus couramment utilisés. Cette similitude rend les résultats plus transposables aux études sur l’humain, réduisant ainsi la nécessité d’expérimentations supplémentaires.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé pour garantir des résultats fiables tout en respectant les règles en vigueur pour limiter leur utilisation. Certains animaux ne stabilisent pas leur consommation de sucre ou sont résistants à la dépression, donc nous en incluons un peu plus au départ pour former des groupes adaptés. Cela tient compte de notre expérience, des techniques utilisées et des études existantes.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude. Les animaux seront hébergés individuellement mais pourront maintenir un contact visuel et olfactif avec leurs congénères grâce à leur placement dans la même pièce. Un enrichissement (nid, tunnel, bâton à ronger) est également prévu pourtous les animaux en procédure. Un suivi hebdomadaire rigoureux, incluant l’évaluation de l’état général et la pesée, permettra d’assurer leur bien-être. Des points limites ont été établis pour soustraire immédiatement un animal à la souffrance.

Choix des espèces

Dans notre étude, nous avons choisi d'utiliser le rongeur Arvicanthis ansorgei car il c'est un rongeur diurne plus proche du rythme de vie humain que les modèles nocturnes habituels, ce qui permet d'obtenir des résultats plus pertinents et transposables à la condition humaine. Concernant les stades de développement, nous nous concentrons sur des animaux adultes (3mois), car c'est à ce moment que les comportements liés à l'anxiété et à la dépression sont plus stables et plus susceptibles d'être influencés par des stress chroniques. En exposant ces animaux adultes à des stress légers de manière contrôlée, nous pouvons observer comment ces expériences affectent leur comportement et leur réponse aux traitements, tels que les antidépresseurs.