Rongeurs

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.

80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée en cage individuelle jusqu'à vingt-quatre jours, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ouvre le protocole, suivie de quatre séances d'imagerie, de quatre prélèvements de sang à la queue et de deux périodes de quatre jours en cage de mesure de la dépense énergétique. L'objet est de relier la croissance d'une tumeur à l'hypermétabolisme observé chez les patients, et de tester une molécule qui réduit la dépense énergétique. Le poids et la prise alimentaire sont surveillés chaque jour pour que la perte de poids n'excède pas 20 % du poids initial, le protocole devant être arrêté dès qu'une dégradation apparaît.

Objectifs

La perte de masse est une cause majeure de décès en cancérologie et aggrave la toxicité des traitements. Elle résulte de la fonte des graisses et des muscles, d’une augmentation de la dépense énergétique au repos et d’une plus grande fatigabilité, entraînant un déficit énergétique appelé hypermétabolisme. Ce phénomène apparaît avant les premiers signes visibles de perte de masse chez les patients atteints de tumeurs. L’étude de la dépense énergétique et des marqueurs cliniques et biologiques des patients montre un impact négatif et une moindre réponse aux traitements. Pourtant, le lien entre le développement tumoral et l’hypermétabolisme reste inexploré. Cette étude chez l’animal vise à : -caractériser les paramètres métaboliques liés à l’hypermétabolisme à différents stades du développement tumoral grâce à des cages d'enregistrement de la dépense énergétique ; -évaluer ces paramètres chez des souris atteintes de tumeurs en présence d’une molécule réduisant la dépense énergétique. L’objectif est de mieux comprendre le lien entre hypermétabolisme et cancer et d’explorer une nouvelle piste thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes responsables de l’hypermétabolisme, c’est-à-dire l’augmentation de la dépense énergétique au repos, chez les animaux porteurs d’une tumeur. L’objectif est d’identifier les principaux facteurs impliqués, comme la dépense d'énergie au repos et ou issue de l’activité physique afin de mieux expliquer ce phénomène chez les patients. En analysant le métabolisme des animaux atteints de tumeurs et en testant un médicament qui réduit la dépense énergétique, nous pourrons évaluer le lien entre l’hypermétabolisme et la progression du cancer observée chez les patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée dans la veine caudale (moins d'une minute). Les mesures par imagerie se feront 4 fois, chaque mesure ne dépassant pas 10 minutes, cela inclut également un prélèvement sanguin (donc 4 prélèvements de 50 microlitres) chaque prélèvement prenant 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique sera effectuée 2 fois, sur une période de 4 jours à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée maximum de l'isolement des animaux est de 24 jours. Les prélèvements à la queue induisent une douleur légére. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux seront surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. La croissance tumorale peut induire un dysconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire, car il est impossible de reproduire sans animaux les interactions entre la croissance d’une tumeur, le système immunitaire et l’équilibre énergétique de l’organisme. L’étude de la dépense énergétique et des comportements associés doit se faire sur un organisme entier, car les tissus impliqués fonctionnent ensemble. La souris est un modèle adapté, car ses mécanismes de régulation énergétique sont similaires à ceux de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats.

Réduction

Dans les procédures 1 et 2, nous utiliserons 10 souris par groupe, un nombre suffisant pour détecter des différences significatives de perte de poids liée à la tumeur. Le suivi du poids, de la composition corporelle et de la croissance tumorale par imagerie permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires aux analyses de l’équilibre énergétique. Pour réduire encore leur utilisation, nous étudierons l’alimentation, la dépense énergétique et la composition corporelle sur les mêmes animaux. Les données issues d’études précédentes indiquent que 10 souris par groupe sont suffisantes malgré la variabilité des mesures. L’évaluation métabolique sur 4 jours aidera à réduire cette variabilité, optimisant ainsi le nombre d’animaux requis. Enfin, des outils statistiques adaptés permettront d’analyser l’impact de la tumeur, du traitement et du sexe sur ces paramètres.

Raffinement

Les interventions (imagerie, injections et échocardiographies) seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Une technique d’imagerie non invasive sera utilisée pour suivre l’évolution de la tumeur au fil du temps et la mettre en relation avec la balance énergétique, le poids et la composition corporelle. Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. Les analyses de la balance énergétique et de la composition corporelle, totalement non invasives, se dérouleront dans des cages classiques équipées de capteurs intégrés, sans perturber les animaux. L’hébergement inclura un enrichissement avec un abri en plastique rouge, du coton et une nacelle pour favoriser le bien-être des souris. Les mesures de la dépense énergétique seront automatisées, effectuées en continu de jour comme de nuit, sans intervention humaine. Une surveillance quotidienne permettra de détecter tout changement de comportement ou de santé (observation, suivi du poids et de la prise alimentaire et hydrique). Des points limites stricts ont été définis : en cas de signe de souffrance ou de dégradation de l’état des souris, le protocole sera immédiatement arrêté.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Elle est particulièrement adaptée à l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la souris est le modèle de référence pour l'étude du développement tumoral, de la réponse immunitaire et du métabolisme énergétique. Pour les deux procédures, les souris seront utilisées à l’âge adulte (12 semaines). Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.

Un virus est inoculé par inhalation, trente secondes par narine, sur des souris placées sous anesthésie profonde. 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un quart d'entre elles subit jusqu'à quinze prélèvements sanguins, à raison d'un par mois, certaines étant gardées jusqu'à quinze mois après l'infection. Le virus utilisé n'est jamais nommé, et le porteur range parmi les effets attendus les blessures de bagarre qui cicatrisent mal chez les animaux âgés.

Objectifs

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la vaccination permet, en moyenne, d’éviter chaque année 3,5 à 5 millions de décès par an. La vaccination est basée sur la persistance d’une protection immunitaire contre un pathogène donné mais les mécanismes qui assurent le maintien d’une telle protection sur le long terme ne sont pas encore totalement compris. De même, la persistance d'une protection immunitaire est à la base de la réussite, sur le long terme, des immunothérapies anti-cancéreuses actuelles. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui assurent la préservation d’une protection immunitaire, en fonction du temps.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant la persistance de l'immunité après une infection virale, et d’identifier potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques pour la favoriser et améliorer les vaccins. Ces résultats serviront également à l’amélioration des immunothérapies anti-cancéreuses, afin d’éviter les rechutes chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par animal – durée 30 secondes ; - Injection (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes; - Infection par inhalation (sous anesthésie profonde) - 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine; Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par mois pendant toute la durée de la procédure (jusqu’à 15 prélèvements pour ¼ des animaux) - durée 30 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: i) une douleur modérée et un stress généré par les prélèvements sanguins; ii) une légère douleur générée par les injections (pour l’anesthésie profonde); iii) le stress généré par la procédure d’inoculation du virus par inhalation; iv) une perte de poids transitoire générée par l'infection virale qui sera contrôlée; v) un léger délai de cicatrisation en cas de blessure sur des animaux agés, qui pourrait survenir suite à une bagarre; vi) des signes cliniques liés à l’âge tel que une perte de poids et/ou une diminution de la température corporelle

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes et effectuer des analyses cellulaires et moléculaires dans le but de comprendre les mécanismes qui assurent le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme.

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme dépend de signaux reçus dans différents endroits de l’organismes qui ne peuvent être récapitulés in vitro.

Réduction

Nous avons calculé par des approches statistiques, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans toutefois compromettre une analyse robuste des résultats. De plus, une optimisation des protocoles a été réalisée in vitro en amont, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour les analyses moléculaires (qui demandent beaucoup de matériel cellulaire).

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal; ii) les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse après application d’un anestésique local; iv) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux; v) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. En cas d'apparition de signes de douleur modérée, les animaux recevront un traitement anti-douleur pour les soulager (par exemple le doliprane).

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur le maintien d’une protection immunitaire à long terme. De plus, la souris est une espèce dans laquelle un grand nombre d'outils sont disponibles, permettant des analyses précises. Les animaux utilisés dans le projet sont des adultes de 6 semaines à 18 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (entre 6 et 12 semaines, le système immunitaire des souris est stable, selon nos expériences antérieures) et certains animaux seront gardés jusque 15 mois après infection.

Des cellules cancéreuses humaines sont implantées sous la peau du flanc droit de souris anesthésiées, qui reçoivent ensuite une injection intraveineuse par semaine pendant deux à six semaines, avant une ponction intracardiaque terminale. 674 souris NMRI nude, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles changent d'établissement entre la greffe et les irradiations. Le porteur écrit vouloir s'assurer que les animaux ne subissent aucune souffrance, dans un protocole qui repose sur la croissance d'une tumeur greffée, des injections hebdomadaires et une irradiation.

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des pathologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules sénescentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules sénescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules sénescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environ).

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etant donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contrôler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.

480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant jusqu'à douze séances hebdomadaires d'enregistrement cardiaque d'une heure, deux chirurgies et jusqu'à six séries d'injections. La première opération, de soixante minutes, sert à administrer un produit qui provoque l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cœur, et les injections répétées détruisent la fonction des nerfs vagues, ce dont le porteur affirme que cela reste sans impact sur l'état général des animaux dans les conditions de l'étude. La seconde chirurgie, de quatre-vingt-dix minutes, est menée sans réveil, tous les rats étant tués pour l'analyse histologique des cœurs et des cerveaux. L'effectif repose sur des groupes de 15 animaux, le porteur reconnaissant que la moitié pourrait suffire si aucune différence n'apparaît entre mâles et femelles à mi-parcours.

Objectifs

La maladie de Parkinson est liée à la dégénérescence de certains neurones dans le cerveau, associée à l’accumulation de la protéine alpha-synucléine. En plus des symptômes moteurs caractéristiques de la maladie, il existe de nombreux symptômes non-moteurs qui sont très invalidants. Parmi ces symptômes non-moteurs, l’hypotension orthostatique (baisse soudaine de la pression artérielle lors du passage d’une position couchée ou assise à une position debout) est fréquente chez les patients, provoquant des étourdissements et vertiges qui augmentent le risque de chute. On observe également une diminution de la variabilité de la fréquence cardiaque et d’autres troubles de la régulation du rythme cardiaque dont la fréquence et l’intensité varient d’un patient à l’autre. Cependant, il existe des preuves que l’accumulation d’alpha-synucléine ne se restreint pas au cerveau et touche également des organes périphériques dont le cœur. En effet, il existe des neurones situés dans le cœur qui constituent le système nerveux intracardiaque et qui jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cardiaque. Les neurones cardiaques intègrent les informations en provenance des systèmes nerveux sympathique et parasympathique, permettant ainsi d’assurer le contrôle de l’activité du cœur. Ils pourraient être affectés dans la maladie de Parkinson et ainsi contribuer directement aux troubles cardiaques. Le rôle potentiel de ces neurones cardiaques dans la maladie de Parkinson reste inconnu à ce jour et c'est ce que nous cherchons à mettre en évidence dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques retrouvés dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alphasynucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent. L'évaluation des troubles cardiaques permettrait de mettre en évidence l'intérêt probable de modifier la prise en charge thérapeutique des patients en incluant de nouvelles molécules permettant de limiter ces dysfonctionnement.

Procédures

Tous les animaux (n=480) seront soumis à deux tests comportementaux moteurs (un spontané et un nécessitant une légère contention de quelques secondes) puis à une anesthésie gazeuse de moins de 10 minutes permettant de raser l'animal et de poser des électrodes au niveau du thorax pour mesurer pendant 1 heure l'activité cardiaque sur l'animal vigile. La mesure se fait par télémétrie ; l'animal est libre de ses mouvements pendant la mesure. Cette mesure est répétée une fois par semaine soit 6 fois pour la moitié des animaux et 12 fois pour les animaux restants. Une chirurgie d'une durée de 60 minutes sera réalisée sous anesthésie et couverture médicamenteuses anti-douleurs. Cette chirurgie permet d'administrer un produit qui provoque une accumulation d'alpha synucleine aun niveau cardiaque. Les animaux vigiles recevront une injection 1 fois par jour pendant 3 jours, à deux semaines d'intervalle (3 fois pour la moitié des animaux (n=240) et six fois pour la seconde moitié (n=240)) permettant la perte de fonction des nerfs vagues. Puis après six et/ou douze semaines, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux. 240 animaux seront soumis à une seconde chirurgie de 90 minutes permettant de faire des mesures de l'activité cardiaque et de la pression artérielle. Les animaux seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable (pour prélèvements). 240 animaux auront une seconde chirurgie sans réveil et sous couverture anesthésique et analgésique (pour d'autres prélèvements).

Impact sur les animaux

Léger stress transitoire lors des pesées, injections, inductions et réveil d'anesthésie, et tests comportementaux. Légère douleur transitoire lors des injections. Légère gêne pendant l'heure de port des électrodes. Léger inconfort transitoire lors du réveil après anesthésie. Pendant les jours suivant la chirurgie, douleur et inconfort minimisés par les antalgiques et légère perte de poids transitoire. Dans les conditions de vie des animaux dans ce projet, la perte de fonction des nerfs vagues n'a pas d'impact sur l'état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux (n=480) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de plusieurs paramètres physiologiques tels que l'activité électrique du coeur et la pression artérielle, ainsi que la réalisation des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.

Remplacement

Des approches in silico ou in vitro ou des données obtenues chez les patients existent et donnent de l'information mais ces approches ont des limites et à ce stade d'avancée des connaissances, il est nécessaire de passer au modèle in vivo pour avoir un système entier et intégré.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance statistique. Ces critères prenent en compte le risque de possibles décès expérimentaux ou d'origine non contrôlée et impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par lot soit 480 rats mâles et femelles. Des analyses statistiques à plusieurs variables seront effectuées. Les deux sexes seront étudiés en parallèle. Après avoir expérimenté la moitié des animaux mâles et femelles, si une différence est mise en évidence, l'intégralité des animaux du projet seront nécessaires, en revanche si aucune différence n'apparait, nous pourrons grouper les résultats sur les deux sexes et ainsi n'utiliser que la moitié de l'effectif total des animaux de ce projet.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec contrôle de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale et sans délai de ceux-ci. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson puisque les réseaux neuronaux sont similaires à ceux de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment de la première chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.