Rongeurs

La lignée de souris utilisée développe un pelage rêche, une posture voûtée, une baisse d'activité, parfois une opacité de la cornée et une paralysie des pattes arrière vers sept mois, avant une mort prématurée entre sept et dix mois. 420 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 330 et modéré pour 90. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue vers sept à dix jours, une partie recevant ensuite une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, puis jusqu'à sept séries de trois tests moteurs espacées de deux mois. Sur les 420, 90 seulement sont utilisées pour l'évaluation thérapeutique et l'étude de survie, les autres étant tuées comme animaux d'élevage ou parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni replacées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.

Objectifs

La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPSIIIA), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances chez l’Homme en Europe. Elle se caractérise par une atteinte sévère du système nerveux central. Elle débute le plus souvent aux âges de 2 à 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. L'espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. L’objectif du projet sera d’élever une lignée de souris génétiquement modifiée, modèle de la maladie MPSIIIA, afin dans un deuxième temps d’évaluer les effets d’une approche de thérapie génique pour lutter contre cette maladie chez ce modèle animal.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de prouver la non-toxicité et l’efficacité d’une thérapie génique pour le traitement de la mucopolysaccharidose de type IIIA chez un modèle murin. A plus long terme cela pourrait permettre d’identifier et proposer une nouvelle piste de traitement chez l’Homme pour cette pathologie actuellement incurable.

Procédures

Dans le cadre de l’élevage pour obtenir nos lots expérimentaux il sera nécessaire de réaliser un prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux. Cet acte sera fait une fois sur de jeunes animaux vigiles (durée 1 minute par animal environ). Une partie des animaux auront une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie générale (durée 5 min, une fois). Tous les animaux utilisés dans l’évaluation thérapeutique participeront à trois tests comportementaux différents pour mesurer leurs capacités motrices et évaluer l’effet du traitement sur ces capacités motrices (20 min test 1, 3x5 min test 2 et 2 minutes test 3). Cette série de 3 tests sera réalisée au maximum 7 fois avec un minimum de 2 mois entre chaque série. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare cardio-respiratoire et un risque d’hypothermie durant l’anesthésie. L’animal pourra ressentir un stress lors des contentions et manipulations mais également lors de l’induction de l’anesthésie. L’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort lié à la piqure de l’aiguille suite à l’injection intraveineuse La lignée de souris utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable en lien avec sa modification génétique se traduisant par un pelage rêche, une réduction d’activité et une posture voutée. Une opacité cornéenne et une paralysie des pattes arrières pourront également intervenir vers le 7ème mois de vie. Ces animaux décèderont de manière prématurée entre le 7ème et le 10ème mois d’âge.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux qui auront reçu la thérapie génique seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage et les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés dans d’autres projets du fait de leur modification génétique spécifique.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la mucopolysaccharidose de type IIIA incurable chez l’Homme à ce jour. Les modèles in vitro ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire et cellulaire de l’approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un premier contexte physiologique chez un mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez un modèle pertinent de la pathologie, dans notre cas la souris.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats statistiquement fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre maximal de 12 souris par groupe a été défini pour évaluer l’effet thérapeutique de notre approche, et 6 pour l’étude de survie, afin de réaliser des tests statistiques fiables. Au total nous utiliserons 72 souris pour l’évaluation de l’effet thérapeutique et 18 souris pour l’étude de survie. Nos résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Afin d’obtenir ces animaux des lots expérimentaux nous produirons au total 420 animaux au cours de ce projet en pilotant de manière raisonnée notre élevage et en ne produisant que le nombre d’animaux strictement nécessaires.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne apportée par l’équipe de zootechnie, la mise en place de points limites et de soins adaptés. Pour l'évaluation de l'effet de notre thérapie nous inclurons uniquement des animaux qui font plus de 10g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention. Lors de l'anesthésie pour injection nous maintiendrons la température de l'animal en le plaçant sur un tapis chauffant thermorégulé à 37 degrés Celsius et en assurant son réveil dans une chambre de réveil chauffée. Un gel ophtalmique sera appliqué au niveau des yeux pour prévenir tout inconfort suite à l'injection. Cette injection est faite avec le plus petit diamètre d'aiguille possible. Un suivi rapproché est effectué au réveil et dans les jours suivants l'injection. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux est réalisé sur de jeunes animaux (moins de sensibilité à la douleur et cicatrisation rapide) et de la plus petite taille possible. C’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Nous adapterons nos accouplements pour produire nos lots expérimentaux de la manière la plus optimisée possible. Le suivi du phénotype dommageable sera pris en charge (observation, assistance nutritionnelle), les tests de comportements sont raffinés avec un test par jour. Pour l'euthanasie médicamenteuse nous réaliserons une pré-sédation des animaux afin de faciliter l'injection de l'euthanasiant et limiter la douleur associée.

Choix des espèces

Le modèle murin est particulièrement adapté pour reproduire et étudier des maladies humaines (modification génétique possible, outils moléculaire disponible...). Nous utilisons pour ce projet le modèle de souris génétiquement modifiées qui reproduit le phénotype de la maladie MPSIIIA présent chez l’Homme. Cela nous permettra donc d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Les animaux seront prélevés à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Ils seront ensuite utilisés soit entre 3 semaines et 6 mois pour l’étude de l’effet thérapeutique soit jusqu’à ce qu’ils présentent des signes spécifiques ou à maximum 18 mois pour l’étude de survie.

Le lendemain de leur naissance, des souriceaux vigiles reçoivent une injection dans le cerveau, une crème anesthésiante ayant été posée trente minutes plus tôt sur le crâne. Une semaine après, l'extrémité de leur queue est prélevée pour savoir s'ils portent la mutation, puis viennent sept pesées, sept mesures de taille, cinq mesures de tête et des tests de redressement répétés. 150 souris au maximum vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur relevant chez les souriceaux modèles de la maladie de Prader-Willi une mortalité accrue de 10 à 15 % dans la première semaine de vie. Les souriceaux porteurs de la maladie sont tués au sevrage, tandis que 57 animaux, dont 18 femelles reproductrices, seront réutilisés dans d'autres projets et trois mâles gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

La maladie de Prader-Willi est due à la perte de certains gènes et se manifeste dès la naissance. Pour compenser ce manque, un traitement administré au plus tôt chez le nouveau né malade pourrait contrecarrer le développement de la maladie. Ainsi, dans ce projet, nous voulons mettre en lumière les effets positifs sur le développement de jeunes souriceaux, d’un nouveau médicament validé précédemment sur des cellules en culture et qui sera administré un jour après la naissance. Nous testerons trois doses différentes afin de déterminer la plus efficace, qui pourra alors être utilisée comme valeur de référence dans les thérapies contre la maladie de Prader Willi chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette phase du projet va tester la capacité d'un médicament à corriger certains symptômes de la maladie de Prader-Willi chez des souris nouveau-nées. Nous veillerons à déterminer la dose la plus efficace pour traiter les enfants atteints par cette maladie qui touche environ 250 nouveau-nés par an en France. Nous espérons observer chez les animaux malades traités une diminution de la faiblesse de leurs mouvements, un poids et une taille générale semblables ou se rapprochant de ceux des animaux témoins, ainsi qu’une vitesse de développement des mouvements équivalente. En outre, nous espérons observer chez les animaux traités un intérêt envers l’environnement identique à celui de nos animaux témoins. De même nous évaluerons la réduction des comportements répétitifs chez ces groupes traités.

Procédures

L’ensemble des souriceaux subira une injection unique du médicament dans le cerveau le lendemain de leur naissance (environ 10 secondes), puis, au terme d’une semaine d’existence, un prélèvement de l’extrémité de la queue afin de savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal (environ 5 secondes). Les juvéniles subiront un ensemble de mesures du développement incluant suivi pondéral (7 pesées de 10 secondes espacées de 3 jours), 7 mesures de taille de 10 secondes (espacées de 3 jours), 5 mesures de la longueur de la tête de 10 secondes (espacées de 3 jours), ainsi que 2 tests d’évaluation du neurodéveloppement de durées inférieures ou égales à 120 secondes, réalisés 4 fois aux âges précoces et séparés de 1 journée chaque.

Impact sur les animaux

Les animaux modèles de la maladie de Prader-Willi sont généralement plus petits que les animaux témoins et ont des comportements modérément affectés. Ils ne montrent pas de signes de douleur ou de difficultés à survivre, mais une mortalité accrue de 10-15% la première semaine après la naissance est néanmoins relevée. Le retrait transitoire (de 20s à 2min30s environ) des souriceaux nouveau-nés de la portée pour les expérimentations comportementales, les pesées et les mesures de taille peuvent entrainer un stress léger de courte durée et sans douleur. L'injection unique du médicament dans le cerveau chez souriceaux vigiles peut entrainer un inconfort transitoire lié à la contention des souris, tandis que l'injection peut entrainer un stress léger et une douleur modérée de courte durée. L'inconfort lié à la position du corps au début du test de redressement est limitée temporellement par le comportement de l'animal qui va naturellement chercher à redresser sa position ; si un animal échoue en cela, le test sera arrêté au bout de 2 minutes ce qui bornera ses effets à un stress léger et de durée limitée. Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal peut entraîner un stress léger sans douleur.

Devenir

La mise à mort des 30 à 150 juvéniles d’intérêt sera réalisée au sevrage. Les animaux des trois groupes constitués d’individus sains injectés par le traitement test aux doses D1 à D3 pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche une fois leur sevrage atteint. Les trois mâles reproducteurs seront gardés en vie pour le maintien de cette lignée dans notre structure. Les 18 femelles reproductrices seront réutilisées pour d'autres projets de recherche.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l'effet d'un traitement de thérapie génique chez de jeunes souris modèles de la maladie de Prader-Willi. Ce traitement a déjà été étudié et validé par des expérimentations préliminaires menées sur des lignées cellulaires humaines, sans utilisation d’animaux. L'efficacité du traitement selon 3 doses testées sera maintenant étudiée sur un modèle animal et ce, via plusieurs critères biologiques qui ne peuvent être évalués sans l’utilisation d’animaux tels que la croissance des individus, leur métabolisme et leur comportement.

Réduction

Ce projet utilisera 30 souriceaux (au minimum), effectif qui pourra s’étendre à 150 au maximum. Les effectifs les plus faibles permettant d’obtenir un effet statistique significatif ont été calculés et retenus pour les expériences ; pour ce faire, nous avons utilisé un logiciel informatique afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données issues de précédentes recherches.

Raffinement

Les souris porteuses de la maladie de Prader-Willi présentent 0 à 15% de mortalitéle jour de leur naissance. A partir du second jour de vie, il n’est pas reporté d’excès de mortalité chez ces souris en condition classique d’élevage et d'hébergement : les animaux sont en mesure de se déplacer et de se nourrir correctement, les petits ne sont pas rejetés par les mères et, hormis une petite taile, ils ne montrent pas d’incapacité fonctionnelle justifiant de mesures de raffinement spécifiques. Les mâles porteurs de la maladie de Prader-Willi seront d'abord acclimatés avec des éléments d’enrichissement simples. Après deux semaines, ils seront mis en accouplement à raison de deux femelles par mâle. Ensuite, les femelles gestantes seront hébergées seules jusqu’à la mise bas. Pour les souriceaux nouveau-nés injectés, de la crème anesthésiante sera appliquée sur le crâne 30 minutes avant l’injection. Après l'injection, les petits seront roulés dans la litière de leur cage d’origine et un suivi de l'absence de rejet par la mère sera opéré lors de son replacement dans sa portée d’origine. Si un petit était rejeté par sa mère, une démarche de ré-adoption par une autre femelle sera alors mis en place. Tous les animaux de ce projet seront surveillés quotidiennement ainsi que lors des tests réalisés afin de surveiller si les points limites établis sont atteints.

Choix des espèces

La souris est le seul animal pour lequel un modèle de la maladie de Prader Willi existe. Le développement de la maladie chez la souris est proche de celui observé chez l’humain. Dans notre projet, le traitement dès le lendemain de la naissance est choisi afin de mimer le traitement en bas-âge des patients Prader Willi.

Un cathéter posé dans la veine de la queue, une heure d'IRM sous anesthésie, puis deux nouvelles séances d'imagerie à quatre et vingt-quatre heures : 62 souris suivent ce protocole, dont une partie après avoir reçu sous la peau une injection de cellules tumorales. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger pour 42 souris et modéré pour 20. L'objet du projet est de tester si trois enrobages polymères rendent des nanoparticules assez discrètes vis-à-vis du foie et du système immunitaire pour circuler plusieurs heures dans le sang et atteindre une tumeur. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement des organes et de la tumeur, celles dont la tumeur dépasse 10 % du poids corporel ou qui perdent plus de 20 % de leur poids étant sorties de l'étude et mises à mort avant terme.

Objectifs

Après une étude préalable réalisée in vitro sur des cellules en culture, l’objectif de ce projet est l’évaluation in vivo de nouveaux composés issues des nanotechnologies comme agents de contraste pour l’imagerie médicale. Ces composés sont prometteurs pour l'amélioration du diagnostic et la thérapie du cancer. Ils permettent notamment une augmentation de contraste des images obtenues par résonance magnétique nucléaire (IRM). La difficulté majeure rencontrée pour l'utilisation de ces composés est qu'ils sont très rapidement captés en quelques minutes par les systèmes de défense de l'organisme comme le foie et les cellules du système immunitaire. Si les composés ne restent pas suffisamment longtemps dans la circulation sanguine, ils n'ont pas le temps de passer dans le tissu tumoral. Des modifications de la surface de ces composés par greffage de polymères particuliers permet de les rendre relativement invisibles du système de défense. Ainsi, leur temps de présence dans le sang s'allonge, augmentant la probabilité de passage du composé dans le tissu tumoral. Pour ce projet nous allons tout d'abord évaluer avec pour critère principal de sélection, l’invisibilité biologique pour 3 types de polymères à 3 concentrations différentes. Le temps de présence dans la circulation attendu est de plusieurs heures avec nos composés Puis sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur, nous testerons les 2 meilleurs agents à 2 concentrations différentes. L’imagerie sera réalisée avec un IRM dédié au petit animal sous anesthésie pour éviter les mouvements durant les acquisitions.

Bénéfices attendus

Ces nouveaux agents de contraste sont développés dans le but de limiter les doses à injecter chez les patients, et pour pallier le fait qu’une seule technique d’imagerie se révèle souvent insuffisante pour poser un diagnostic précis. La mise au point d’agents de contraste bimodaux (combinant deux types d’imagerie complémentaires) et vectorisés (aptes à cibler sélectivement la zone d’intérêt), devient une nécessité en matière de santé. Leur utilisation permettrait d’accéder rapidement à un diagnostic plus précis et de définir le traitement le plus approprié, limitant ainsi les effets secondaires, améliorant la prise en charge des patients, et réduisant les coûts de santé. Des études menées auprès de professionnels du secteur montrent qu’un intérêt particulier se dégage pour une sonde associant la précision spatiale de l’IRM à la grande sensibilité de l’imagerie nucléaire, du fait de leur complémentarité et du développement d’appareils combinant IRM et imagerie nucléaire. Pour autant, et même si de nombreuses publications rapportent la synthèse de sondes associant IRM et imagerie nucléaire, aucune sonde duale adaptée n’est actuellement disponible sur le marché. Les nanomatériaux sont de bons candidats pour le développement de tels outils bimodaux, notamment par les possibilités de vectorisation/modification qu’ils apportent.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions dans ce projet : (1) une imagerie par IRM sous anesthésie in vivo non invasive et non traumatique, 3 sessions : la première dure 1 h, la seconde dure 10 min et est réalisée après 4h suivant l’injection de l’agent de contraste, enfin la dernière est réalisée 24h après la première. (2) pose d’un cathéter réalisé en moins de 10 minutes pour injection par voie intraveineuse à la première session d’imagerie, le cathéter est enlevé à la fin de la première session d’imagerie, l’animal étant toujours sous l’effet de l’anesthésie gazeuse. (3) pour certains animaux, une injection sous-cutanée de cellules tumorales, durée incluant la préparation 10 min.

Impact sur les animaux

- La pose d’un cathéter : le cathéter est posé dans la veine caudale , il peut induire un hématome et une altération temporelle de la veine. -Induction tumorale : la génération d'une tumeur peut entrainer une perte de poids de l’animal, des souffrances et éventuellement des troubles fonctionnels.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux sont mis à mort car les organes sont prélevés pour analyse. A l'issue de la procédure 2 sur les animaux porteurs d’une tumeur solide, tous les animaux sont mis à mort car les organes et la tumeur sont prélevés pour analyse.

Remplacement

Certaines phases d'optimisation des nano-particules (vérification de la stabilité, toxicité cellulaire) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité à intégrer la tumeur.

Réduction

L'imagerie, par opposition aux bio-distributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en œuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session après 4h et après 24h suivant l’injection de l’agent de contraste). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique paramétrique ou non paramétrique selon la distribution des données. Pour la première phase de caractérisation de nos nano-sondes, des animaux non inclus dans un protocole dont la mise à mort était programmée pourront être utilisés.

Raffinement

La première phase de caractérisation in vivo des nano-sondes sera menées sur des souris saines pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de tumeur sous-cutanée. Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur dépassant 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une injection sous-cutanée de cellule tumorales, l'anesthésie sera réalisée classiquement par induction à l'isoflurane. Les animaux sont maintenus dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une dose d’analgésique sera administrée, si l’état général de l’animal ne s’améliore pas dans les 48h et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle de la souris est reconnu comme pertinent pour l'évaluation préclinique des caractéristiques des agents de contraste en imagerie. La souris possède comme l’homme une vésicule biliaire ce qui permet de visualiser la voie d’élimination hépatique. Le modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris est bien maitrisé. Les animaux pour la phase d’évaluation de la furtivité seront utilisés au stade de jeunes adultes à adulte (de 7 à 16 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Des animaux jeunes de 4 à 6 semaines seront utilisés pour la génération d’une tumeur sous-cutanée. Ce stade est optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses. Ces animaux seront explorés par IRM (entre 7 et 10 semaines).

Les souris dont l'état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l'élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l'abdomen d'un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d'induction produisant des symptômes "modérés", sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées "devraient sans nul doute" ouvrir des pistes thérapeutiques chez l'humain.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l'activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d'identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.

Bénéfices attendus

Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n'a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.

Procédures

Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l'extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d'un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d'une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l'animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l'animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l'évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.

Remplacement

Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l'échelle de l'organisme. L'inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l'animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d'expériences : 1). - pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) - pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l'élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l'humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris, car c'est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l'état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d'inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l'une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l'inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l'être humain adulte.