Rongeurs

Sept prélèvements de sang à la queue en deux heures, un gavage de glucose et une injection d'insuline, répétés à 20, 60 et 120 jours de vie, plus trois échocardiographies sous anesthésie : 1 350 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvements post-mortem. Les génitrices reçoivent un régime riche en graisses pendant quatre mois, et leur descendance le même régime jusqu'au sevrage, pour reproduire l'effet d'une obésité maternelle sur le cœur des petits. Le porteur indique que la manipulation des ratons peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler, et que certains animaux ne survivent pas à l'anesthésie malgré l'intubation. Il évoque aussi une injection de vecteur viral pouvant provoquer une insuffisance cardiaque, sans la faire figurer parmi les procédures décrites.

Objectifs

L'obésité est un problème majeur de santé publique et sa prévalence croissante contribue à augmenter l’incidence de maladies cardiovasculaires. L'épidémie de surpoids touche les femmes enceintes et des études épidémiologiques rapportent que les enfants nés de mères obèses présentent un risque accru de cardiopathies congénitales et, à l’âge adulte, des taux plus élevés d'événements cardiovasculaires et de mortalité. Cependant, il existe une véritable lacune dans nos connaissances sur l’origine des mécanismes moléculaires conduisant au développement de ces pathologies cardiaques.Notre objectif est d’établir l’impact du dysmétabolisme périnatal sur le développement de l’insuffisance cardiaque d’origine congénitale. Nous proposons une étude longitudinale sur la descendance pour caractériser la chronologie des altérations cardiaques et les défauts d’organisation postnataux des cardiomyocytes. Nous étudierons les voies (moléculaires, métaboliques) impactées (précocement ou plus tardivement) par le dysmétabolisme maternel pouvant expliquer les altérations développementales du cœur et, pour in fine, identifier des signature spécifiques et biomarqueurs potentiels

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhension du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines d'intérêt identifiées au laboratoire dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Une partie des animaux seront mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les génitrices (2 mois avant la reproduction et pendant la durée de reproduction et lactation). Les géniteurs seront sous régime riche en gras uniquement pour la reproduction. Les petits seront sous le régime maternel correspondant (riche en gras ou contrôle) jusqu’au sevrage (20 jours de vie). Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront réalisées sur animaux vigiles. Le gavage de glucose, procédure très rapide (quelques secondes) sera réalisé à 3 stades : 20, 60 et 120 jours de vie pour tester la tolérance au glucose. Le test de tolérance à l'insuline sera réalisé par injection intrapéritonéale aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue (quelques secondes) est effectué sur les animaux vigiles et permet de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte sera répété 7 fois en 2 heures pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le phénotypage cardiaque sera réalisé par échocardiographie (15 minutes), sous anesthésie gazeuse légère, pour d'obtenir de nombreux paramètres morphométriques et hémodynamiques. Les mesures seront effectuées aux 3 temps, 20, 60 et 120 jours de vie (soit 3 fois pour chaque animal). L’électrocardiogramme (ECG) de surface sera réalisé aux mêmes temps à 20, 60 et 120 jours de vie : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie (animaux vigiles) et sera réalisée dans la foule de l'échographie pour réduire le nombre d'interventions. Les animaux sont placés dans un tunnel en plexiglas aéré, les quatre pattes positionnées sur des plaques métalliques permettant de suivre le rythme cardiaque. Une seconde partie des animaux vigiles seront soumis à une injection de virus (AAV) par voie systémique à 1jour de vie (veine jugulaire facilement visible à ce stade). L'intervention est très rapide (quelques secondes). Ils seront phénotypes par ECG de surface et échographie, aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation. Les tests métaboliques peuvent induire : une sensation de faim lors de la mise à jeun des animaux, une irritation de l'oesophage lors des administrations per os, une légère douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang. Les prélèvements peuvent induire également une irritation de la queue de l'animal.

Devenir

A l'issue de cette étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Ces prélèvements sont nécessaires pour les analyses et pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (1350) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 20 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablement frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont agrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, bâton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anesthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anesthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anesthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont très rapides et peu douloureux. Un analgésique est administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, déshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du cardiomyocyte, qui se fait en postnatal (d'où les stades 5, 20, 60 et 120 jours de vie). - Afin d'étudier le rôle de la protéine d’intérêt sur le développement myocardique (d'où l'injection à 1 jour postnatal). Les rats sont utilisés dès le premier jour après la naissance, et euthanasiés à 4 mois maximum. Ce stade correspond au stade suffisant du développement du remodelage cardiaque. C'est également le stade de maturité totale du myocarde.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois administrations de molécules fluorescentes dans la veine de la queue ou sous la nuque, subit jusqu'à quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie sous anesthésie générale, avant une dernière injection au moment de sa mise à mort. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée sans délai. Le projet sert à mettre au point les vecteurs d'une société privée qui répond à ce qu'elle décrit comme une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique".

Objectifs

A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluorescentes permet de suivre leur localisation.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. L'imagerie prend quelques minutes (entre 2 et 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection de morphinique. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dit « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Deux plaies de pleine épaisseur dans le dos, sous anesthésie, pour caler la taille des lésions et la durée d'observation d'un projet ultérieur de pansement : 87 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est tondue et ses griffes arrière coupées avant l'intervention, puis ses pansements sont changés tous les trois jours, chaque fois sous anesthésie. Aucun pansement fonctionnalisé n'est testé ici, cette étape sert à préparer celle qui le fera. Le porteur affirme que les modèles de peau in vitro comportent "trop de lacunes" et qualifie le modèle animal d'"incontournable", puis annonce que les 87 souris seront gardées en vie et proposées à l'adoption.

Objectifs

Le projet présenté ici est une étude pilote qui a vocation à mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée. Il est le pré-requis d’une étude sur le développement d’un pansement pour la libération locale et prolongée d’agents pro-cicatrisants type vitamine E en utilisant des pansements fonctionnalisés avec des polymères thermo-répondants. En effet, la cicatrisation des plaies est un processus complexe visant à maintenir la fonction de barrière de la peau. Faute de cicatrisation suffisante, les plaies chroniques entraînent des infections persistantes et l'incapacité des cellules cutanées à se réparer, entraînant une gêne et une détresse importantes chez le patient. Dans notre projet l’idée est qu’après élimination des débris et tissus inertes, le pansement appliqué peut être exploité comme une plateforme pour délivrer des molécules bioactives afin de prévenir l'infection bactérienne et de favoriser la cicatrisation. Le projet a pour objectif de développer des revêtements de polyarginine thermorépondants pour la fonctionnalisation de pansement. Les revêtements développés posséderont trois propriétés : (i) bactéricide à la fois par contact grâce à la polyarginine, (ii) antioxydante et (iii) favorisant la cicatrisation par la libération d'un agent cicatrisant naturel.

Bénéfices attendus

Le projet présenté ici est un projet pilote pour le développement d’un dispositif médical favorisant la cicatrisation de plaies chroniques. L’étude pilote en elle-même doit permettre de mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée sur lésion de pleine épaisseur. Il permettra de déterminer avec précision la taille des lésions à réaliser ainsi que le temps d’observation. Ainsi nous pourrons raffiner au mieux nos expériences pour la validation de l’effet des recouvrements de surface en cours d’élaboration en assurant plus de reproductibilité.

Procédures

Tonte et coupe des ongles des pattes arrières sur animaux anesthésiés d'une durée de 10 minutes Réalisation de plaies cutanées et mise en place des pansements sous anesthésie d'une durée de 30 minutes Changement des pansements et observation des plaies sous anesthésie d'une durée de 10 minutes tous les trois jours.

Impact sur les animaux

Au cours de l’expérimentation deux plaies cutanées seront réalisées sur le dos de l’animal. La nuisance générée sera de deux ordres. Le premier est la douleur associée à la procédure chirurgicale. La seconde nuisance est l’application de pansement sur les plaies.

Devenir

Animaux gardés en vie et proposés à l'adoption.

Remplacement

Il existe des modèles de peau in vitro. Ces derniers sont plus ou moins complexes. Le plus simple est un modèle en deux couches, une couche épithéliale constituée à partir de kératinocytes et une couche mimant le tissu conjonctif sous jacent sous la forme d’une matrice (biologique ou synthétique) ensemencée avec des fibroblastes. Dans les modèles plus complexes, des cellules immunitaires sont ajoutées dans le succédané de tissu conjonctif. Certains modèles testent également l’incorporation de cellules endothéliales. Ces modèles sont intéressants mais ne permettent pas de recréer les différentes phases de la lésion cutanée et de sa cicatrisation : création d’un caillot sanguin, formation d’un tissu de granulation à partir du tissu conjonctif, ré-épithélialisation. Il manque également les éléments propres à la réaction immunitaire locale qui peut être pertubée par un matériau ou encore un élément essentiel qu’est le mouvement de la plaie. En effet les plaies cutanées par essence sont soumises à des contraintes mécaniques. Ceci doit être pris en compte dans l’évaluation de nos stratégies. En effet pour un pansement l’application de ce dernier sur la plaie est un facteur qui va modifier potentiellement la libération locale du principe actif. Les modèles in vitro comportent donc trop de lacunes qui ne leur permettent pas de représenter fidèlement la situation clinique à traiter et qui nous oblige donc a utiliser un modèle animal.Le modèle animale est également incontournable car les éléments qui seront testés après établissement de ce modèle sont de nouvelles molécules qui nécessiteront avant leur emplois chez l'homme un validation de leur sécurité et de leur efficacité.

Réduction

Il s'agit ici d'une étude pilote, nous allons donc réaliser une étude descriptive. Nous utilisons une approche incrémentale analysant un paramètre du modèle l'un après l'autre. Pour chaque paramètre, il y aura également une approche progressive permettant de limiter le nombre d'animaux lorsque la variable testée a atteint l'objectif. On travaillera donc avec des petits lots d'animaux (4 à 6).

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées en groupe. Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie locale sur le site de l’incision. L’analgésie post-opératoire sera réalisée pour assurer le bien-être des souris avec une surveillance journalière. La chirurgie sera privilégiée le matin. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, coton, tunnel…) afin de permettre la fabrication de nids. L'évaluation du bien-être des animaux se fera au cours d'évaluations journalières à partir d'un tableau de référence (en annexe).

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris car c’est un modèle de cicatrisation décrit dans la littérature qui permettra de diminuer le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. La cicatrisation chez le rongeur est légèrement différente du processus chez l’humain (Chez l’homme, il y a d’abord la ré-épithelialisation puis la granulation avant la contraction alors que chez les rongeurs le processus débute par la contraction, mais la stabilisation de la plaie permet d’éviter le phenomène de contraction. Les souris seront âgées de 10 semaines, il s’agira donc de jeunes adultes. A cet âge la capacité des animaux à supporter des chirurgies est optimale et le système immunitaire est pleinement mature.

Après des essais menés sur des souris privées de système immunitaire, 50 souris immunocompétentes reçoivent sous la peau des cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues chaque semaine dans un cône de contention en inox pour recevoir en intraveineuse un placebo, un anticorps médicamenteux, une immunothérapie ou les deux traitements associés. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'être humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé chez la souris lors des études précédentes, la gravité déclarée restant pourtant modérée. Toutes seront tuées pour peser les tumeurs, mesurer l'infiltration immunitaire et chercher la toxicité sur les organes, en vue d'un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Le carcinome à petites cellules du poumon (SCLC), est la forme de cancer du poumon la plus aggressive, avec une survie à 5 ans de seulement 7% avec très peu d'options thérapeutiques actuellement disponibles. L'approbation de nouvelles immunothérapies en association avec un traitement de chimiothérapie conventionnel en première ligne a représenté une nouvelle étape thérapeutique en 2018 avec une diminution du risque de décès d'environ 30% grâce aux réponses prolongées. Cependant, la survie globale à 3 ans reste inférieure à 20 %, dus aux résistances innées et acquises, les options de traitement actuelles restent limitées. Dans ce contexte, notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs mais également in vivo sur un modèle murin immunodéficient (sans système immunitaire fonctionnel). L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité du produit étudié seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle murin immunocompétent avant de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est l’évaluation du nouveau anticorps médicamenteux Adcitmer utilisé seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle de souris immunocompétentes utilisant une lignée murine de carcinome à petites cellules du poumon. La validation de ce modèle nous permettra d’évaluer le bénéfice d’une bithérapie biomédicament/immunothérapie. L’objectif plus global etant donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés une fois par semaine en intraveineuse avec le placebo, le biomédicament Adcitmer, l'immunothérapie Avelumab ou la combinaison des deux traitements. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée et une contention hebdomadaire en cône de contention pour l'injection en intraveineuse. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intraveineux. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs, de l'infiltration immunitaire des tumeurs et l'évalution de la toxicité sur les organes impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité d'Adcitmer a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de SCLC humaines et sur la lignée murine KP11. L'obtention de données préliminaires in vitro sur ces différentes lignées a permis de limiter le nombre de doses testées dans la recherche d'optimisation des schémas thérapeutiques dans le modèle de xénogreffes de la lignée humaine de SCLC, en modèle souris immundéficient. Grâce à ces expériences préliminaires, nous proposons dans ce projet, d'évaluer la plus-value apportée par une combinaison biomédicament/immunothérapie en testant une dose optimale du biomédicament et non plusieurs.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et la dose testée sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Pour limiter toute souffrance des animaux, une grille décisionnelle a été élaborée afin de monitorer l'état de santé des animaux, si l'un des critères de souffrance est atteint, la décision de sacrifier l'animal sera prise. De plus, afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.

Choix des espèces

La génération d'une lignée carcinomateuse murine présentant l'ensemble des marqueurs caractérisant les lignées de SCLC humaines, nous permet d'utiliser un modèle de souris immunocompétente pour évaluer notre traitement. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et l'effet des traitements caractérisé, 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à neuf injections de vaccin, de traitement associé et d'immunothérapie étalées sur trois semaines. Les tumeurs implantées dans le poumon peuvent provoquer des difficultés respiratoires, des douleurs modérées et une perte d'appétit. Le porteur écrit ne pas pouvoir envisager le remplacement des animaux, tout en indiquant que l'intelligence artificielle permettrait d'étudier l'interaction entre cellules immunitaires et cellules tumorales et qu'elle n'est "pas actuellement utilisée".

Objectifs

Le pronostic global des patients atteints de cancer du poumon est mauvais, et dans ce contexte l’immunothérapie suscite un grand intérêt, néanmoins, bien que ces traitements aient permis d’améliorer la survie de certains patients, les taux de réponse restent limités. Nous avons identifié des lymphocytes infiltrant les tumeurs et appelées lymphocytes T résidents capables d’éliminer les cellules tumorales et associés à une meilleure survie des patients dans plusieurs pathologies cancéreuses. Ce projet permettra : 1) d’élucider le rôle des lymphocytes T résidant dans les tumeurs dans la réponse aux immunothérapies in vivo dans un modèle de souris, 2) de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les améliorer et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous utiliserons deux modèles de souris portant une pathologie cancéreuse, et des traitements anti-cancéreux in vivo. Jusqu’à ce jour, aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité du système immunitaire dans un environnement tumoral.

Bénéfices attendus

Afin de comprendre pourquoi les taux de réponse à l’immunothérapie restent limités chez la majorité des patients atteints de cancer, notre objectif est de mieux comprendre le rôle d’une nouvelle classe de globules blancs, les lymphocytes T résidents, présents dans la tumeur. Grâce à des modèles in vivo, nous chercherons à comprendre quels sont les mécanismes permettant l’obtention de ces lymphocytes dans la tumeur. Notre but est de faire avancer les connaissances sur les causes de l’efficacité limitée du système immunitaire dans les tumeurs et ainsi contribuer à l’amélioration de la réponse aux immunothérapies et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris seront greffées avec une lignée cellulaire tumorale avec une seule injection (durée 1 minute, anesthésie locale). L'injection du vaccin sera répétée 2 fois tous les 7 jours pendant 20 jours (durée 1 minute, sous anesthésie locale). Le vaccin sera combiné à un autre traitement appliqué par injection répétée 3 fois tous les 4 jours pendant 20 jours (durée 1 minte, anesthésie locale). L’immunothérapie est une solution injectée 4 fois tous les 4 ou 5 jours pendant 16 à 22 jours (durée 1 minute, anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections causent un stress et douleur légère de courte durée. Les tumeurs greffées en sous-cutanée peuvent entraîner une gêne mécanique légère, une douleur modérée. Les tumeurs induisant un ou plusieurs foyers tumoraux dans le poumon, peuvent causer des problèmes respiratoires et des douleurs modérées. Parmi les nuisances possibles de ces tumeurs il y a aussi la perte d'appétit et de poids.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever certains organes pour caractériser l’effet des traitements, les effets anti-tumoraux et les cellules immunitaires.

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique ou des anticorps thérapeutiques dans un contexte cancéreux relève d’une grande complexité où les modèles in vitro seuls n’apporteraient pas tous les éléments et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs. Nous ne pouvons pas envisager le remplacement des animaux pour nos études. Cependant nos hypothèses de travail se basent sur nos expériences in vitro avec des cellules humaines et sur la littérature. Certaines approches expérimentales in vitro pourront aussi être réalisés afin de confirmer une partie des résultats obtenus grâce aux expérimentations in vivo. Le nombre de souris pour cette étude a été calculé mathématiquement afin d'utiliser le plus petit nombre de souris tout en restant statistiquement significatif. L'intelligence artificielle pourrait permettre d'étudier l'interaction potentielle entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales mais n'est pas actuellement utilisée.

Réduction

Les expérimentations seront réalisées toutes les 6 semaines pour nous permettre d’analyser les résultats et de modifier le protocole suivant les résultats précédents obtenus in vivo. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience pour réduire le nombre d’expériences et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en tant que lot contrôle. Nous utiliserons le plus petit nombre de souris tout en respectant la validité statistique de l'étude. Afin de calculer à priori le nombre d’animaux pour répondre à nos hypothèses, un logiciel de statistique a été utilisé. Pour chaque procédure, le test statistique sera adapté et tiendra compte des résultats de nos expérimentations antérieures et de nos connaissances sur les modèles murins en cancérologie, ce qui nous permettra de réaliser des conditions de traitement cohérentes et ainsi réduire le nombre de groupes/animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les deux jours puis tous les jours à partir de J8 pour les souris avec tumeurs pulmonaires et une grille de score sera réalisée. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le toilettage = grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. En cas de changement de comportement, de l’enrichissement sera ajouté dans la cage ou les souris seront séparées. Un examen clinique sera réalisé avec l'utilisation d'une grille de score et en cas de gênes ou douleur dues à la progression des tumeurs, en particulier les tumeurs pulmonaires, un anti-inflammatoire sera administré pour minimiser les douleurs et un aliment adapté sera donné. Un anti-inflammatoire sera administré pour les douleurs légères. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle in-vivo le plus adéquat pour l’étude des interactions entre le système immunitaire et le microenvironnement tumoral complexe. De plus, le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, et les modèles tumoraux sont les plus appropriés pour notre étude et comparables aux cancers humains. L’invalidation génétique de la molécule d'intérêt spécifiquement dans les lymphocytes T a été généré seulement dans cette espèce. Cependant, une étude sera réalisée en parallèle sur des échantillons tumoraux humains afin de renforcer les résultats obtenus dans le modèle murin. Les animaux, âgées de 5 à 8 semaines seront réceptionnées par l’animalerie et utilisés après une période d’acclimatation de 7 jours minimum. Les greffes de tumeurs seront réalisées sur des animaux âgés de 6 à 9 semaines afin d’obtenir une meilleure prise de greffe et avoir une grande quantité d’infiltrat lymphocytaires.