Rongeurs
Effet d’un composé en développement sur les fonctions musculaires chez un modèle de myopathie de Duchenne chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour évaluer un composé développé par un client industriel contre les atteintes musculaires de la myopathie de Duchenne, 57 souris mâles porteuses d'une mutation spontanée vont être utilisées. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les animaux sont tués pour le prélèvement des muscles des pattes, du cœur et du diaphragme. Chaque souris passe vingt-neuf pesées, quatre mesures de composition corporelle, deux mesures de force musculaire sous anesthésie, un rotarod, un grip test, un hanging test, deux tests d'endurance, une mesure de pression artérielle, cinq prises de sang et quarante-huit heures de mesure de l'activité spontanée. Le porteur reconnaît que la souris mdx ne présente ni espérance de vie réduite ni activité spontanée diminuée, contrairement aux patients, et qualifie l'étape in vivo d'incontournable pour le dossier réglementaire ouvrant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie positionnée sur le chromosome X, responsable dans la perte de fonctionnalité des fibres musculaires. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à plus de 99% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne. Le modèle employé est un modèle de souris qui possède une mutation génétique spontanée et qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien qu'ils soient beaucoup moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament (Composé X) sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament permettant d'améliorer ou de traiter la maladie de Duchenne. Il s'agit donc une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (29 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes); 4) Mesures de la locomotion par Rotarod (1 mesure; Durée de la mesure : 10 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des pattes avant par grip test (1 mesure, durée de la mesure 5 minutes); 5) Mesure de la force de préhension des 4 membres par hanging test (1 mesure; Durée de la mesure: 3 minutes); 6) Tests d'endurance (2 tests, Durée de la mesure : 45 min); 7) Mesures de pression arterielle (1 mesure; Durée de la mesure: 15 minutes); 8) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de l'activité spontanée totale et de dépenses énergétiques (1 session de mesures de 48h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests de mesure de composition corporelle et de pression artèrielle pourront être source de stress du fait de la manipulation et d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les tests d'activité locomotrice pourront également être source de stress. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les prélèvements sanguin pouront être source de douleur légères. Enfin, bien que considéré comme un modèle de maladie de Duchenne d'intérêt, la souris mdx présente un phénotype bien plus léger que l'humain. Ainsi, bien que présentant une moindre force musculaire que les souris sauvages malgré une hypertrophie musculaire, les souris mdx ne présentent pas de réduction de leur espérance de vie, ni de différence dans l'activité spontanée, à la différence de l'humain. En effet, les défauts musculaires des souris mdx n'apparaissent que lors de tests impliquant un effort assez soutenu. Le phénotype de ces souris mdx n'est ainsi pas dommageable.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire ex-vivo), histologiques et pour comptage des mitochondries.
Remplacement
Le programme global dans lequel s'insère le présent projet implique un industriel pharmaceutique qui développe un composé d'intérêt dans le domaine de la Myopathie de Duchenne et deux Sociétés de Recherche sous contrat, l'une in vitro et l'autre in vivo. L'objectif du projet est de permettre de mener le développement du composé X au stade clinique. La première phase d'étude sera réalisée in vitro par le partenaire suédois. Le présent projet in vivo ne sera mené qu'uniquement en cas de résultats convainquants sur les modèles in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, dans un second temps, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés sur système in vitro se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre de 15 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle de souris utilisé. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 12 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés via la nourriture. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs (50μL de sang par prélèvement) et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
La modèle de souris que nous avons sélectionné pour le présent projet est un modèle classiquement utilisé pour étudier la Myopathie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie, tout en n'exhibant qu'une forme légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion non affectée par la mutation). Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez le modèle de souris employé. En effet, à partir de 12 semaines, ces souris commencent à présenter un développement musculaire exagéré par hyperactivation des cellules souches du muscle. Bien que la force musculaire des souris pathologiques reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Une biopsie d'oreille à l'emporte-pièce, l'amputation de l'extrémité de la queue ou un prélèvement de sang sur animal éveillé : 9 600 souris vont subir ces gestes de génotypage dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces gestes ne produisent aucune donnée expérimentale par eux-mêmes, ils servent à connaître les caractéristiques génétiques des lignées transgéniques entretenues par l'établissement pour ses équipes de recherche. Le porteur compare la douleur provoquée à celle d'une injection avec une aiguille. Les souris dont le génotype se révèle sans intérêt sont mises à mort, les autres restant en vie comme géniteurs ou pour être engagées dans des expériences ultérieures.
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.
Evaluation des effets d’une supplémentation en graines de chia sur la descendance de rates obèses pendant la gestation et lactation.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 020 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 840 tués aux temps de prélèvement prévus et 180 rates non gestantes transférées vers d'autres protocoles de l'animalerie. La moitié des rates est rendue obèse par six semaines de régime gras et sucré avant la gestation, les fœtus sont tués au vingtième jour de gestation pour prélever placenta, cerveau, foie et cœur, et une partie de la descendance passe un mois de tests comportementaux, dont un test de reconnaissance d'objet nouveau, avec réduction de la ration alimentaire. L'étude porte sur l'effet d'une supplémentation en graines de chia, riches en oméga-3, pendant la gestation et la lactation de rates obèses. Le porteur écrit lui-même qu'aucune transposition directe des résultats ne pourra être faite chez la femme et que seule une étude clinique permettrait de le prouver.
Objectifs
L’obésité est un problème de santé publique majeur. En France, une femme sur 3 est en surpoids ou obèse. L’obésité maternelle peut augmenter le risque de pathologies de la grossesse, altérer la croissance du fœtus, et engendrer des retards psychomoteurs et des maladies métaboliques chez l’enfant et l’adulte. Ces altérations de la programmation du développement fœtal pourraient être dues à des défauts d’apport en nutriments au fœtus comme les acides gras oméga-3 aussi appelé lipides. Ces lipides jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau du fœtus pendant la grossesse mais aussi dans son développement futur. Il existe plusieurs types d’acides gras oméga-3, une première catégorie d’oméga-3 essentiels qui doit être apportée par l’alimentation car elle n’est pas fabriquée par le corps humain et une deuxième catégorie, nécessaire pour le développement du cerveau fabriquée à partir de la première mais en quantité plus faible, insuffisante pour répondre au besoin de l’organisme. Ainsi, dans des situations vulnérables comme la grossesse ou l’allaitement, une couverture de ce besoin est vitale pour la mère comme pour le fœtus et les futures enfants. Quelques études ont montré des effets bénéfiques d’une supplémentation en acides gras oméga-3 essentiels sur la santé de l’enfant. Selon une étude, 75% des femmes enceintes sont en dessous des apports satisfaisants en acides gras oméga-3 essentiels qui sont de 2g/j. La graine de chia est connue pour être très riche en acides gras oméga-3 essentiels. Les résultats des études chez l’animal et des essais cliniques suggèrent que l’ajout des graines de chia dans l’alimentation de l’adulte augmente la concentration en ces deux catégories d’oméga 3. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée au transfert des oméga-3 au foetus à travers le placenta après une supplémentation en graines de chia pendant la gestation et/ou la lactation et l’effet de cette supplémentation sur le développement neurologique ainsi que sur le développement de maladies cardiovasculaires chez la progéniture née de mères obèses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une supplémentation en graines de chia riche en oméga-3 pendant la gestation et ou la lactation, 1) sur la santé des mères en situation d’obésité, en termes d’inflammation, comparée à des mères non obèses, 2) sur la santé de la descendance, à court terme et jusqu’à l’âge adulte, en termes de neurodéveloppement et de prévention de maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
L’effet de la supplémentation en graine de chia de la mère sera testé pendant la gestation et/ou la lactation de façon à étudier l’impact sur le statut inflammatoire de la mère et les conséquences sur le développement du fœtus et de la progéniture. Les bénéfices attendus de la supplémentation en chia sont une augmentation du stockage des acides gras oméga-3 dans le tissu adipeux maternel et de la transformation des oméga-3 essentiels en oméga-3 de deuxième catégorie dans le foie maternel résultant à une amélioration du rapport oméga-6/oméga-3 dans la circulation sanguine de la mère et du fœtus. Une supplémentation en graines de chia pendant la lactation permettrait une meilleure composition du laits maternels des rates. Les bienfaits attendus d’une supplémentation en graines de chia sont aussi une amélioration des altérations potentielles du développement cérébral avec pour objectif une meilleure capacité d’apprentissage et de mémoire des progénitures. Si les bénéfices en termes d’amélioration des oméga-3 sont positifs chez la rate, aucune transposition directe des résultats ne pourra être réalisée chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime alimentaire des femmes enceintes avec de la graine de chia, dès le début de la grossesse, serait envisageable puisque les doses utilisées chez la rate, sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérabilité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer. Les résultats de cette étude préclinique nous permettront de proposer une étude clinique avec supplémentation en graines de chia chez la femme enceinte et allaitante, dans le but de réduire les risques de pathologies obstétricale et fœtale et d’améliorer la santé de leurs enfants à plus long terme.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras et sucré « Western Diet ») (n=150) tandis que les autres rates seront sous régime « Contrôle » (n=150), puis durant la gestation (graine de chia) (20 jours) ou pendant la fin de lactation (J21), et à un seul prélèvement de sang (2 min/animal). Les progénitures réaliseront des tests comportementaux avec pour objectifs d’évaluer leur capacité d’apprentissage/ de mémoire/ de stress pendant une durée de 1 mois. Leur comportement alimentaire sera aussi évalué dans le but d’étudier leur préférence aux gouts ; pour cela une diminution de leur quantité de nourriture sera nécessaire.
Impact sur les animaux
Les rates pour la moitié seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras et sucré « Western Diet »), qui peut engendrer une prise de poids modérée sans conséquence sur la posture et la mobilité de l'animal. Un léger stress de courte durée pourra être perçu lors du prélèvement de sang au niveau de la queue, intervention effectuée par une personne habilitée, avec un risque minimal d’infection. Au moment de l’accouplement, nous nous assurerons que la rate est en période d’ovulation avant de la mettre au contact du mâle pour éviter tout stress. Pour minimiser le risque d'infection vaginale lié aux traces d'urines, la zone sera nettoyée par des compresses stériles au moment du prélèvement. Les progénitures pourront être soumises à un stress au moment du prélèvement du lait chez leur mère au dixième jour de lactation du fait de leur éloignement (J10). Les rats pourront aussi être soumises à une diminution de quantité de nourriture pour certains tests comportementaux (comportement alimentaire) réalisés après sevrage. Pour terminer un test de reconnaissance « Novel Object Recognition » (NOR), sera réalisé chez les progénitures après sevrage et nécessitera des périodes d’habituation qui pourront provoquer un certain stress chez les rats.
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié l’euthanasie prématurée des animaux, ils seront euthanasiés aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Les rates sont suivies jusqu’à un jour avant la naissance (G20) ou à la fin de leur période de lactation (J21), temps auquel elles sont euthanasiées, notamment pour un prélèvement de Sang, Lait maternel, Foie, Tissu adipeux et glande mammaire. Les fœtus seront euthanasiés soit à G20 pour prélever placenta, cerveau, foie et cœur. Les progénitures seront euthanasiées pour la moitié à la fin de la période de lactation (J21) ou à la fin de leur 3 mois de vie (3M) pour prélever sang, cerveau, foie et cœur. Les femelles non gestantes (180 rates) seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur le transfert des lipides oméga-3 entre la mère, les fœtus et les progénitures. Il n’existe donc pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 20 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 fœtus mâles et 2 fœtus/progénitures femelles par mère pour étudier l’effet sexe. Des tests statistiques seront réalisés pour tester l’effet de la supplémentation en chia sur la concentration en acide docosahexaénoïque (DHA) chez la mère et l’effet de la supplémentation, du sexe et de l’effet croisé des 2 sur la concentration de DHA chez les fœtus/progénitures. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 10 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 fœtus mâles et 2 fœtus/progénitures femelles par mère pour étudier l’effet sexe.
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors du seul prélèvement de sang au niveau de la queue, avec une analgésie locale qui sera appliquée 15 min avant l’incision. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mâles seront commandés à l’âge de 6 semaines et les femelles à l’âge de 4 semaines auprès du fournisseur. Les rates seront acclimatées pendant une dizaine de jours avant d’être mis sous régime gras et sucré « Western Diet » afin de les rendre obèses ; ou sous régime « Contrôle » pendant 6 semaines. Nous effectuerons ensuite des frottis vaginaux sur 4 jours afin de mettre uniquement les femelles en oestrus en accouplement. La supplémentation du régime alimentaire en graine de chia sera testée sur deux périodes : - Au 20ème jour de la gestation (G20) qui correspond à une période importante dans la croissance fœtale et particulièrement dans le développement du cerveau du fœtus - A la fin de la période de lactation (J21) qui est une période cruciale dans le développement des progénitures puisque le lait est rempli de nutriments indispensables pour la croissance du nouveau-né. Afin de déterminer l’impact de la supplémentation sur le métabolisme de la descendance, 2 fœtus mâles et 2 fœtus femelles par mère seront prélevés à G20 et 4 progénitures mâles et 4 progénitures femelles par mère seront prélevés à J21. A J21 une partie des petits (2 progénitures mâles et 2 progénitures femelles) seront sacrifiés tandis que l’autre moitié réalisera des tests comportementaux (2 fœtus mâles et 2 fœtus femelles) avant d’être sacrifiées à 3 mois de vie (3M).
Rôle de l’hormone cholécystokinine dans l’hypersensibilité viscérale liée à la malabsorption du fructose chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
240 souris axéniques, élevées sans aucun microbiote, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour le prélèvement de tissus. Les femelles gestantes reçoivent deux gavages destinés à leur transférer un microbiote issu d'autres souris ou de personnes atteintes du syndrome de l'intestin irritable, et l'ensemble des animaux subit un prélèvement de sang et une collecte de fèces. L'équipe cherche à relier l'augmentation d'une hormone intestinale, la cholécystokinine, aux modifications du microbiote observées en cas de malabsorption du fructose. Les gestes sont décrits comme durant quelques secondes et le stress comme léger, tandis que le porteur écrit dans le même passage que les nuisances subies par les souris seront "au-dessus du seuil réglementaire".
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est une affection digestive fréquente, souvent liée à une hypersensibilité de l’intestin, qui joue un rôle central dans les symptômes. Le fructose, un type de sucre très présent dans l’alimentation occidentale, est un facteur déclencheur important, et environ 15 à 22 % des personnes atteintes de SII en France rencontrent des difficultés à absorber ce sucre. Dans une étude précédente, des souris présentant une incapacité génétique à métaboliser le fructose ont montré des symptômes similaires au SII, comme une hypersensibilité intestinale et des modifications du microbiote intestinal. Ces symptômes étaient accompagnés d’une augmentation d’une hormone intestinale, qui pourrait être impliquée dans ces troubles. Cette nouvelle étude cherche à comprendre si les changements dans le microbiote expliquent l’augmentation de l’hormone intestinale impliquée et les mécanismes responsables de ces effets. Pour cela, des souris sans microbiote (axéniques) seront exposées à des microbiotes provenant soit d’autres souris avec ou sans malabsorption du fructose, soit d’êtres humains atteints ou non de SII, avec ou sans hypersensibilité intestinale. Les chercheurs analyseront la composition bactérienne, les substances produites par les bactéries, les caractéristiques de l’intestin et la production de l’hormone d’intérêt en fonction du microbiote donné
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier un lien direct entre l’augmentation de l’hormone d’intérêt et les changements du microbiote observés dans un contexte de malabsorption du fructose et d’hypersensibilité viscérale, notamment chez les patients souffrant du syndrome de l’intestin irritable. De plus, il s’agira de déterminer le mécanisme de régulation de l’hormone intestinale d’intérêt par d’éventuels métabolites bactériens dans certaines régions spécifiques de l’intestin. Ces travaux permettront d’identifier de nouvelles voies de régulation de cette hormone, avec la perspective de les exploiter comme cibles thérapeutiques pertinentes. Compte tenu de la forte prévalence du SII, il est crucial de décrypter les mécanismes sous-jacents aux symptômes physiologiques de ce syndrome.
Procédures
Les femelles gestantes vigiles seront soumis à deux gavages oraux. L’ensemble des animaux auront un prélèvement sanguin et une collecte de fecès. Ces interventions sont de l’ordre de quelques secondes et seront effectuées sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des deux gavages (moins de 5 secondes) et des prélèvements de sang. Douleur légère au point du prélèvement de sang. Les animaux pourraient ressentir un stress modéré lorsqu’ils seront déplacés de leur isolateur d’élevage à leur isolateur expérimental et un léger stress lors de la collecte de féces. Ces nuisances liées à l'ensemble des gestes réalisés sur les souris seront au-dessus du seuil réglementaire.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’intestin. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, du microbiote, de l’alimentation, ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux.
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par sexe (mâles et femelles) afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité connue des réponses liées au microbiote, à son adaptation au fructose, et aux différences attendues entre mâles et femelles. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Habituation à la contention : Avant le démarrage des gavages, les animaux seront habitués à la contention afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales. • Surveillance et suivi : Les souris seront surveillées visuellement chaque jour, et leur poids sera mesuré une fois par semaine. • Des points limites seront définis et en cas de dépassement de ceux-ci, les animaux concernés seront exclus de la procédure et euthanasiés. • Vie en groupe : Les souris seront maintenues en groupe.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires solides sur ce modèle, ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Les femelles gestantes seront âgées d'environ 11 semaines, car elles sont mises en reproduction lorsqu'elles sont matures sexuellement (~7-8 semaines). Les descendants étudiés seront âgés de 7 semaines au moment de l'analyse, ce qui correspond à l'âge adulte jeune chez la souris. Ce groupe de souris a suivi un régime riche en fructose à partir du sevrage, ce qui mime la consommation de fructose observée chez les adolescents/jeunes adultes humains (environ 10-25 ans), groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.
Validation de molécules anti diabétique par voie orale chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Gavage quotidien pendant jusqu'à 84 jours, jusqu'à 84 mesures de glycémie par piqûre du bout de la queue, jusqu'à 84 injections d'insuline et jusqu'à 14 prélèvements sanguins : 690 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par une injection pharmacologique, et tous sont tués en fin d'étude après un prélèvement de sang total sous anesthésie. Le porteur liste parmi les effets attendus l'infection et la nécrose de l'extrémité de la queue, liées à la répétition quotidienne des mesures de glycémie et des prises de sang. Les molécules antidiabétiques orales évaluées ne sont désignées que comme des molécules d'intérêt, sans indication de leur nature ni du nombre de composés testés.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique grave qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (hormone hypoglycémiante), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit. De nombreux traitement des patients diabétiques consistent en des injections par voie sous-cutanée, douloureuses et inconfortables (Insuline etc…). Ces traitements sont la plupart du temps combiné à des traitements oraux tel que la metformine afin d’avoir des résultats plus ou moins efficace selon les patients. Enfin ces traitements actuels sont souvent associés à des effets secondaires indésirable. L’objectif du projet est de développer et valider de nouvelles molécules orales pour le traitement du diabète. Le projet se déroulera pour chaque molécule d’intérêt en 2 phases : - Validation de la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt sur un modèle de rat sain - Si nous validons la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt, une étude de bio efficacité serra réalisé sur un modèle de rat diabétique.
Bénéfices attendus
Les médicaments oraux sont souvent perçus comme plus pratiques et moins contraignants à prendre que les injections. Cela améliore ainsi la compliance des patients ce qui est un point fondamentale pour une prise en charge efficace et optimale du patient vivant avec un diabète. De plus, les médicaments oraux sont plus faciles à stocker, à transporter et à administrer dans de nombreux contextes, y compris dans des environnements ruraux ou éloignés où l'accès à des soins médicaux spécialisés peut être limité. Enfin, l’un des bénéfices important que le projet apportera sera la découverte de nouvelles molécules efficaces présentant peu ou pas d’effet secondaire chez le patient atteint de diabète.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Des molécules seront administrés aux rats (sains ou diabétiques) par voie orale (gavage 1 fois par jour sur maximum 84 jours, acte de 30 secondes par rat).Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre à l'aide d'une micro goutte de sang obtenue par piqûre de l'extrémité de la queue (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de nos molécules (84 fois/animal maximum). De plus, les animaux diabétiques recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après traitement (durée quelques secondes). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement, au maximum 14 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (1 minute par prélèvement). En fin de procédure, le sang totale des rats sera prélevé sous anesthésie, analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : • Peur de courte durée en lien avec le gavage quotidien et les prises de sang au cours du suivi. • Douleur légère de courte durée de l’incision de la pointe de la queue pour le prélèvement sanguin. • Détérioration (infection ; nécrose) de l’extrémité de la queue en lien avec les mesures glycémiques quotidienne et les prises de sang • Saignement post incision de la queue • Douleur légère de courte durée en lien avec l’injection d'une molécule induisant le diabète • Perte de poids en lien avec l’induction du diabète • Hyperglycémie en lien avec le développement du diabète au cours de l’étude • Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (mesure de glycémie, gavage, prise de sang).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons évaluer l’efficacité de nos traitement oraux dans le cadre du diabète. Or, Il est largement démontré aujourd’hui que la régulation glycémique et la physiopathologie du diabète font intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, pour valider l’efficacité de notre traitement anti diabétique, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à les cellule insuline isolée, mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent (pancréas, foie muscle….). Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux total nécessaire pour obtenir des résultats statistiques a été déterminé en utilisant un logiciel adapté. De plus, que ce soit avant les tests sur l’animal (étude in vitro de toxicité…) et après l’étude de bio disponibilité (PE1), le nombre de groupes (et donc le nombre total d’animaux) sera réévalué afin de ne tester que les concentrations présentant un intérêt thérapeutique. Par conséquent au maximum cette étude nécessitera 690 rats. Enfin, la réalisation de ces procédures par du personnel formé et habitué à ces manipulations, et la standardisation du protocole, garantiront une bonne reproductibilité et une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de réduire au maximum le stress, les rats seront maintenus en groupe sociaux tout en respectant la règlementation en vigueur concernant le nombre de rat par cage. Le raffinement intervient également au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Afin de limiter au maximum le stress lors du suivi, une habituation à la manipulation et au gavage est réalisée 2x/semaine pendant la période de quarantaine. Le bien-être des animaux sera pris en compte durant l’ensemble de l’étude avec un suivi journalier de ceux-ci avec une surveillance accrue après administration oral de nos molécules. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. Les animaux diabétiques recevront une insulinothérapie en fonction de leur glycémie. Les posologies appliquées seront celles couramment utilisée au laboratoire et validée par notre vétérinaire référent. Le cas échant, la cétonémie sera mesurée afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Enfin, les prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie et analgésie profonde.
Choix des espèces
Le rat est la principale espèce utilisée dans les études sur le diabète car les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, notre laboratoire possède une grande expertise sur la sensibilité à la molécule induisant le diabète chez le rat, du pourcentage de réussite d’induction du diabète et son suivi. Enfin, le volume de sang pouvant être récolté nous permet de réaliser l’ensemble de nos dosages biologiques/biochimiques. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès avec un risque de mortalité faible.
Etude pharmacologique de vecteurs médicaments après implantation et administration intrathécale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par injection létale pour le prélèvement du sang, des tissus et des organes. Chacune est tondue, opérée sous anesthésie gazeuse pour l'implantation d'un dispositif, puis subit une douleur que le porteur qualifie lui-même de significative pendant les vingt-quatre premières heures, des réouvertures de cicatrice pour l'administration des molécules et jusqu'à quatre micro-incisions du bout de la queue par semaine pour les prises de sang. L'objet est de comparer, pour une société développant des vecteurs qui acheminent des médicaments vers le système nerveux central, une perfusion intrathécale de vingt-quatre heures à une injection unique. Le porteur écrit que le recours à l'animal est "indispensable" faute de modèle prédictif, et que ce même recours constitue "le principal désavantage" de sa demande.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration intraveineuse ou sous-cutanée. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a également permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou encore chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations galéniques, Il s’agira de contourner les problématiques de demi-vie sanguine (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de systèmes implantatoires à délivrances prolongées et maîtrisées. Nous pourrons ainsi proposer de meilleurs pharmacologies, optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces. Dans ce projet nous chercherons donc à démontrer au niveau intrathécale (c'est à dire dans le liquide méningé de la Moelle épinière et du cerveau) les effets bénéfiques d'une infusion sur 24 heures de nos molécules par rapport à une simple injection standard. A terme, une fois le schéma validé, nous chercherons à réduire les doses, tout en gardant la même efficacité pharmacologique.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher de meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces. De plus, en proposant une administration en intrathécale, nous chercherons à mettre en place une voie d’administration directement transposable à l’homme, voie qui est de plus en plus utilisée pour le développement de traitements contre les neuropathies, notamment par l’administration de molécules complexes ou qui ne passent pas bien la Barrière Hématoencéphalique du cerveau.
Procédures
-Tonte des animaux : Sur animal anesthésié, une seule fois (durée 30 secondes). -Injection anti-douleur pré-opératoire : Sur animal vigile, une fois, durée quelques secondes sur animal éveillé (10 secondes). -Chirurgie implantatoire : Sous Anesthésie gazeuse, une seule fois (Induction anesthésie 3 minutes, stabilisation et maintien 15 minutes). - Réveil : Avant réveil, injection d’un antidouleur (Une fois, quelques secondes). -Suivi post-opératoire : Sur animal vigile, injection d’un antidouleur longue durée (minimum 3 fois), une toutes les 24h pendant 72h (ou plus si besoin), (Durée injection quelques secondes). - Administration des molécules : Sur animal anesthésié, en une seule fois (durée bolus ou pose pompe ALZET 30 secondes). - Prélèvements sanguins intermédiaires : Sur animaux vigiles (≤2min), une seule fois/24h et maximum 4 fois/semaine. - Mise à mort (Point final étude) : Sur animal vigile, administration rapide d’une dose létale anesthésique (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées. -TRANSPORT ET ADAPTATION : Sources stress et angoisse non négligeable due au transport -TONTE : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et lors du réveil, mais pas de douleur. - ANTALGIE PRE-OPERATOIRE : Stress et angoisse notables (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - CHIRURGIE IMPLANTATOIRE : Rapide stress et présence d’angoisse (quelques secondes) le temps d’induction à l’anesthésie, douleur significative lors de la chirurgie, se poursuivant après le réveil. - SUIVI POST-OPERATOIRE : Douleur significative les 24 premières heures. Stress et angoisse non négligeables à l’administration de l’anti-douleur (30 secondes) lors de la contention manuelle, et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - ADMINISTRATIONS DES MOLECULES : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et douleur non significative à la réouverture de la cicatrice au niveau cutanée. Douleur notable au réveil et lors de l’injection de l’anti-douleur (pénétration aiguille à travers la peau). - PRELEVEMENTS SANGUINS INTERMEDIAIRES : Stress et angoisse transitoire lors de la mise en contention (≤10 secondes), puis douleur notable lors de la micro-incision de l’extrémité de la queue pour réaliser le prélèvement sanguin (quelques secondes). - MISE A MORT (en fin d’incubation) : Léger stress (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur notable (légère et rapide) lors de l’injection par la pénétration cutanée de l’aiguille.
Devenir
Dans les deux procédures de cette demande, les animaux seront tous mis à mort en point final de l'étude afin de collecter en post-mortem le sang total, les tissus et organes d’intérêts.
Remplacement
Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués et validés sur des études in vitro (sur cellules) et in vivo sur de récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cibles, mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pour de l’infusion médicamenteuse au niveau intrathécale, nous devrons absolument envisager de réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel, tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.
Réduction
La totalité des animaux (n=512) sera implantée en début de chaque procédure, soit pour une administration par bolus ou par une infusion longue durée (autonome). Réalisation de groupes de n=4 individus par test (1 cage de 2 mâles/1 cage de 2 femelles), à raison de 4 tests par étude et 4 études par an, ce qui représente 64 individus/an et par procédure. Ce qui représente pour la voie bolus, 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans et pour l’infusion, également 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans. Par soucis de comparaisons à l’historique des différentes pharmacocinétiques, nous poursuivrons nos expérimentations sur la même lignée de souris. Ce modèle sera également utilisé par la suite, pour humaniser la cible, en vue d’une transposition de nos tests à l’Homme. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le « n=4 » sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée des tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. 2 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une autre pièce également cyclée (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en carton et bandelettes de carton). Les opérations chirurgicales, implantations et administrations bolus se feront sur animaux anesthésiés, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se poursuivra une fois l’animal éveillé, au cours de sa stabulation post-implantation. Les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (ici souris), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) avec une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge correspond à un poids moyen de 27-30g environ. Cet âge s’avère particulièrement intéressant en termes pratique, économique et risques de toxicité par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risque immunogène).
Etude du rôle d’une nouvelle protéine importante pour le maintien de l’homéostasie rénale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Jusqu'à huit séjours de six heures en cage métabolique individuelle pour recueillir les urines, une injection rétro-orbitaire par jour pendant trois jours et une injection intrapéritonéale par jour pendant dix jours : 1 000 souris vont être utilisées dans ce projet sur les maladies rénales chroniques. 672 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 328 un niveau léger, toutes étant tuées pour le prélèvement des reins. Le porteur reconnaît que les signes de mal-être liés à l'insuffisance rénale provoquée par les traitements sont difficiles à détecter autrement que par une altération du comportement et la présence de sang dans les urines. L'effectif de 1 000 souris est présenté comme le produit d'un plan expérimental donnant la puissance statistique voulue, sans qu'aucun chiffre intermédiaire ne vienne l'étayer.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques représentent un véritable enjeu de santé publique. Tout particulièrement, les glomérules ont une importance capitale car ils représentent le siège de la filtration du plasma sanguin. Les options thérapeutiques restent limitées, et aucune stratégie thérapeutique n’a été approuvée pour les principales causes de ces maladies. L’objectif principal de ce projet est donc d’identifier le rôle d'une protéine que nous avons récemment identifié dans le développement et progression de certaines formes sévères de maladie rénales chroniques.
Bénéfices attendus
A terme, ces travaux permettront une meilleure compréhension du rôle de cette nouvelle protéine dans le contexte des maladies rénales. Il est essentiel de mieux comprendre le rôle physiopathologique de molécules d’intérêt pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées pour les maladies rénales sévères.
Procédures
Un prélèvement d'un morceau de queue
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension, douleur de courte durée lors de la biopsie de queue pour le génotypage (< 2mm), douleur de courte durée au point d’injection et stress lié aux cages métaboliques. Les signes de mal-être résultant de l'insuffisance rénale provoquée par les traitements sont difficiles à détecter autrement que par l'altération du comportement et l'hématurie.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les reins.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour identifier les mécanismes physiopathologiques des maladies rénales incluant les cultures cellulaires (in vitro). Cependant, les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu dans le développement de l’insuffisance rénale chronique. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales glomérulaires comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons. Nous travaillons néanmoins au développement de nouveaux modèles d'organe sur puce qui permettront à l'avenir de remplacer partiellement le recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les accouplements sont optimisés pour permettre d'obtenir les animaux d'intérêt avec le meilleur rendement possible. Les lignées sont cryoconservées lorsque le recours aux animaux n'est plus nécesssaire afin d'éviter les élevages inutiles.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal- être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été́ établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3. Des litières doubles sont utilisées dans les cages contenant des animaux diabétiques pour limiter le nombre de changes. Des biberons de 300mL sont mis dans les cages d'animaux diabétiques pour s'assurer qu'ils ne manquent pas d'eau. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifères en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes pour l'étude des lésions rénales car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les animaux sont utilisés de la naissance à l’âge adulte car nous avons un élevage mais seuls les adultes agés de plus de 8 semaines (arrivés à leur maturité sexuelle et donc fin de leur développement) sont utilisés pour les modèles expérimentaux de maladies rénales.
Détection par imagerie médicale de la fibrose cardiaque dans un modèle d’infarctus du myocarde chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectés sous la peau, intubés jusqu'à trente minutes, puis opérés du thorax pour reproduire un infarctus du myocarde, 180 rats de huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent trois à cinq anesthésies générales d'une heure pour les séances d'imagerie, deux à quatre injections intraveineuses et une injection intrapéritonéale par animal. Le porteur indique que l'opération peut induire une insuffisance cardiaque, une perte de poids et un affaiblissement, et que les examens d'imagerie génèrent eux aussi du stress. Tous sont tués à l'issue pour que leurs tissus soient analysés ex vivo.
Objectifs
Après la phase aiguë d'un infarctus du myocarde, un processus de réparation et de formation de tissu cicatriciel, appelé fibrose, est déclenché pour combler la région endommagée et éviter la rupture du coeur. Cependant la fibrose peut se développer au delà de la zone atteinte par l'infarctus, entraînant une diminution de la force contractile du coeur et conduire à de l'insuffisance cardiaque, source de morbidité et de mortalité. La détection le plus précocement possible de la fibrose, sa localisation et sa quantification précise sont donc essentielles dans la prise en charge des patients post infarctus. Le but de ce projet est la détection précoce par imagerie médicale non invasive de la fibrose cardiaque dans l'infarctus chez le rat.
Bénéfices attendus
Les méthodes testées dans ce projet pourraient émerger comme outils de diagnostique précoce pour le suivi de la fibrose cardiaque et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans l'infarctus du myocarde, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques.
Procédures
Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée (
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent être attendus suite aux actes chirurgicaux, telle qu’une douleur modérée et de courte durée liée à l’opération et aux points de suture, bien que ces actes soient menés sous anesthésie générale gazeuse. Suite à l'opération, une insuffisance cardiaque peut être induite et entrainer des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Au cours des injections intraveineuses, intrapéritonéales et sous cutanées les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et une douleur légère et de courte durée au niveau du lieu d’injection. Un stress peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale, qui nécessitent manipulation et anesthésie.
Devenir
A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasives de détection et de quantification du développement de la fibrose cardiaque suite à un infarctus. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, dont certains issues de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre maximal d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par des méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec les expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels des résultats statistiquement significatifs et reproductibles ont pu être obtenus. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance post-opératoire accrue et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques et par une mise à mort anticipée dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. L'ensemble des chirurgies de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire. Les méthodes d'imagerie utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le rongeur qui est le modèle le plus courant pour les études de l’ischémie du myocarde. Le rat a été choisi pour la comparaison des études en scintigraphie de la littérature. De plus, la taille du rat et son rythme cardiaque plus lent par rapport à la souris facilitent le succès des études en imagerie cardiaque non invasive. Les infarctus du myorcade affectent principalement les êtres humains à l'âge adulte. Des rats de 8 semaines seront utilisés car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteint la maturité.
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 1/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Transportées entre deux établissements utilisateurs selon une charte de transport, 4 200 souris vont être utilisées dans ce projet sur la production de chaleur par le tissu adipeux brun. 3 520 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 440 un niveau léger et 240 un niveau sévère, aucune n'étant réutilisée et toutes étant tuées pour le prélèvement des dépôts adipeux, du foie, des muscles, du pancréas, du cœur et des reins. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, des chirurgies, un isolement pouvant durer cinq jours et des hébergements à 4 °C ou 30 °C, l'exposition aiguë au froid pouvant provoquer une hypothermie sévère. Le porteur indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer les animaux pour une partie des questions posées, et conclut que les échanges entre le cœur et le tissu adipeux brun rendent le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Intérêt thérapeutique la prise en charge de l’hépatocarcinome via un traitement par anticorps humain-spécifique dans un modèle murin de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
La tumeur greffée sous la peau peut s'ulcérer au point d'implantation, effet que le porteur signale et que ses points limites précoces doivent permettre d'anticiper. 160 souris immunodéprimées vont être utilisées, 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 64 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de la tumeur, du plasma et du foie. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses hépatiques humaines, cinq prélèvements sanguins en une semaine sous anesthésie, des injections intrapéritonéales d'anticorps sur animal éveillé et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le bénéfice annoncé, une thérapie contre le carcinome hépatocellulaire et d'autres cancers surexprimant la protéine SR-B1, reste au conditionnel, quand la greffe et les prélèvements sont, eux, programmés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’intérêt thérapeutique de l’utilisation d’anticorps dirigés contre la protéine SR-B1 (Scavenger receptor class B type 1), pour une meilleure prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Ce cancer est le cancer du foie le plus fréquent car il concerne 90% des cancers hépatiques primitifs. Actuellement, les options de traitement pour le carcinome hépatocellulaire avancé restent insatisfaisantes en raison de taux de réponse limités, soulignant un besoin urgent de développer de nouvelles thérapies. SR-B1 est un récepteur impliqué dans le transport du cholestérol. Son expression est très largement augmentée dans les carcinomes hépatocellulaires, par rapport au tissu sain. De plus, une forte expression de SR-B1 chez les patients est associée à une baisse de la survie à 5 ans, ce qui en fait un candidat intéressant dans la prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Ces données montrent l’intérêt de cibler les cellules cancéreuses avec des anticorps anti-SR-B1 pour développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement des carcinomes hépatocellulaires. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de plusieurs anticorps anti-SR-B1 dans la prise en charge des carcinomes hépatocellulaires. Les résultats de ce projet permettront dans un 1er temps, de caractériser la pharmacocinétique des trois anticorps, et dans un 2ème temps d’évaluer leur effet antitumoral dans un modèle murin de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires humaines.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra le développement clinique d'une nouvelle thérapie et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir pour le traitement du carcinome hépatocellulaire, mais également d’autres cancers où la protéine SR-B1 est surexprimée. C’est le cas notamment des cancers du sein ou de la prostate, très largement représentés, et où la surexpression de SR-B1 est aussi associée à un mauvais pronostic vital.
Procédures
Pour l’étude de pharmacocinétique, les animaux recevront une injection unique d’anticorps sur animaux vigiles. Cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront 5 prélèvements de sang en une semaine. Chaque prélèvement est réalisé sur animaux anesthésiés et prend environ une minute à être réalisé. Pour étudier l’effet des anticorps, les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront un traitement par injection d’un anticorps ou véhicule par injection intrapéritonéale. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Simultanément à l’injection de l’anticorps, les tumeurs seront mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, et cette mesure prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection des anticorps en intrapéritonéal entraîne une douleur légère de courte durée. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules, entraînant une douleur modérée de courte durée.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus (tumeurs, plasma et foie) qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Plusieurs stratégies de remplacement ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Nous utilisons également en parallèle des modèles in vitro afin de confirmer notre hypothèse avant de passer sur le modèle animal. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels. Également, les modèles cellulaires ne permettent pas de reconstituer l’effet de l’angiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux qui peuvent influencer la réponse thérapeutique en entrainant l’activation de certaines voies de signalisation) ou toute la complexité biologique (interaction des éléments du microenvironnement tumoral avec le système biologique de la souris ou modélisation de l’hétérogénéité cellulaire et génétique d’une tumeur) d’un être vivant sur l’efficacité d’un traitement. La validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa grande complexité. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe du carcinome hépatocellulaire.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, pour améliorer au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, et des tunnels kraft pour leur permettre de se cacher. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées en zone exempt d'organismes pathogènes spécifiques, ce qui permet que les animaux immunodéprimés ne développent pas d'infection. Les animaux seront manipulés à l’aide de tubes de manipulation afin d’éviter toute préhension stressante par la queue de l’animal. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Une méthode anesthésique sera appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 1 semaine sans manipulation puis habituées à la contention au cours de la 2ème semaine afin de diminuer le stress lié aux injections. Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie afin de minimiser le stress que pourrait induire la contention.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables lors d’un traitement anti-cancéreux. Ces modèles ont contribué dans le passé à établir le potentiel curatif de combinaisons thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les anticorps que nous nous proposons d’étudier sont spécifiques de la protéine humaine que nous souhaitons cibler, le modèle de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires nous permet d’utiliser des lignées cellulaires humaines qui expriment fortement cette protéine. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum, afin de mimer la pathologie qui touche principalement les adultes. De plus, il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.
Décryptage des changements de transmission astrocytaire sur les neurones induits par l’ocytocine dans l’amygdale centrale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq chocs électriques de 0,6 milliampère en dix minutes : c'est le protocole de stress aigu appliqué à une partie des souris de ce projet sur les mécanismes cérébraux du trouble de stress post-traumatique. 1 100 souris au total vont être utilisées, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, chacune subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau et, pour certaines, une biopsie de queue vers le sixième jour après la naissance. Le porteur annonce vouloir modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale sur simulateur informatique pour diminuer à l'avenir le nombre d'animaux utilisés, sans que cette perspective n'entame les 1 100 souris engagées ici. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé ex vivo.
Objectifs
Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle." (INSERM). Ces troubles surviennent suivant des épisodes de peur intense, où le souvenir de cet évènement est ensuite revécu par la personne. Ainsi, les TSPT ont pour cause le souvenir anormalement fort de l'événement traumatisant. Leur encodage nait de l'interaction de plusieurs régions cérébrales, parmi lesquelles l'amygdale centrale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Nous nous intéressons tout particulièrement à un type de cellulaire : les astrocytes. Ces cellules ont pour rôle principale d’assurer le bon fonctionnement des neurones à proximité, fonction dont dépend leur morphologie. Aujourd’hui, il est établi que l’ocytocine (OT) via son récepteur (OTR) présent sur les astrocytes de l’amygdale centrale permet la modulation de la réponse émotionnelle lors d’une anxiété, d’une peur ou d’un stress aigu. Ce projet vise à comprendre comment l’OTR, via les astrocytes, module l’activité neuronale. Pour cela, nous couplerons pharmacologie et pharmacogénétique à des enregistrements d’activité des neurones et d’imagerie de fluorescence des astrocytes. Cette étude apportera de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, via une meilleure compréhension des interactions neurone-astrocyte.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place notamment l’impact de la gliotransmission sur le réseau neuronale au cours d’un stress aigu ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.
Procédures
La totalité des souris subiront une procédure chirurgicale d'injection cerebrale et une chirurgie terminale pour perfusion avec prélèvement sur animal anesthésié. Certains animaux subiront une biopsie de queue sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Enfin, des souris subiront en plus un protocole de stress pendant 10min.
Impact sur les animaux
Pour les expériences sans protocole de stress, la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter les anesthésiques. Les injections virales peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision ainsi qu’une perte de poids sont attendues après l'opération. Le protocole de stress aigu est un protocole qui provoque un stress, une angoisse ainsi qu'une douleur courte et transitoire ne pouvant être evités etant l'essence même de notre étude.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo.
Remplacement
Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Lors de notre étude, nous allons modéliser les réseaux neuronaux avec les astrocytes au niveau de notre structure nous permettant à l'avenir de diminuer le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages enrichies. Les souris seront observées quotidiennement (aspect du pelage, mobilité, absence de prostration). Une attention particulière sera portée aux signes de stress, qui sera limité au maximum par une manipulation des animaux au moyen d’un tunnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux tout au long de la chirurgie. Un gel hydratatnt sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, de la nourriture hydratée et des croquettes seront déposés dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites précoces et spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le protocole de stress, des tests préalables ont déjà été réalisés dans nos études précédentes sur : 1) le nombre de choc (5) et 2) la l'intensité de ces derniers (0,6mA) qui correspondent à la bibliographie du domaine.
Choix des espèces
Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. De plus, nos différentes procédures ont besoin de modèles génétiquement modifiés qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.
Impact des acides biliaires sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, le métabolisme, l’immunité anti-tumorale et la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux séances d'irradiation locale du thymus, des injections pratiquées directement dans le thymus ou les ganglions mésentériques après incision de la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries : 9 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour le prélèvement de la tumeur, du foie, des intestins, des ganglions, de la rate et du thymus, le porteur indiquant vouloir obtenir le maximum de prélèvements au cours d'une seule expérimentation. L'équipe veut savoir si des acides biliaires administrés par voie orale rétablissent l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez des patients dont le microbiote a été déséquilibré par des antibiotiques. Elle justifie la souris par des lignées tumorales murines dont l'implantation serait "indispensable" pour étudier l'immunité antitumorale sur un animal vivant et entier.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur. De plus, nous avons montré que les antibiotiques diminuaient le nombre de cellules du thymus (organe d'activation des cellules immunitaires) et que les récepteurs aux acides biliaires étaient exprimés dans cet organe. Nous nous demandons donc si les acides biliaires pourraient restaurer la formation de thymocytes et ainsi améliorer la réponse aux immunothérapies chez les patients.
Bénéfices attendus
Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs sous anesthésie locale (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute). Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois :utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire ou intrathymique. Certains animaux auront un prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min). Le thymus des souris sera irradié 2 fois localement (durée 7 minutes et 40 secondes), à 5 jours d'intervalle. Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne mécanique modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau. L'irradiation locale n'entraîne aucune conséquence pour les animaux dans les conditions où elles sont hébergées. Les injections dans les ganglions ou le thymus entraîneront une douleur légère et transitoire au réveil due à la plaie occasionnée par la section de la peau pour donner accès à ces tissus.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, thymus ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Un médicament analgésique sera administré en cas de douleur. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.