Rongeurs
Utilisation de rongeurs pour le maintien des cycles biologiques des schistosomes exposés au polluant chimique
- Protection de l’environnement
Hamsters dorés : 320
Pour entretenir en permanence le cycle de deux espèces de schistosomes et mesurer l'effet des pesticides sur leur virulence, 640 souris et 320 hamsters dorés vont être infestés par ces parasites. Toutes ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et tous les animaux sont tués pour récupérer les vers. L'infestation passe par un bain d'une heure dans un petit volume d'eau contenant les larves, ou par une injection intrapéritonéale quand les larves ne traversent pas la peau, et l'accumulation des œufs provoque ensuite une atteinte chronique du foie et de la rate que le porteur qualifie lui-même de modérée. Il décrit une grille où l'hépatosplénomégalie, la pâleur, la perte de contact social et le dos voûté déclenchent la mise à mort à partir de trois points, et précise qu'aucun traitement n'est donné parce qu'il interférerait avec le développement des parasites.
Objectifs
Les changements climatiques globaux liés aux modifications anthropiques locales sont les principaux facteurs de modification de la répartition géographique des espèces de pathogènes et de leurs vecteurs, élargissant leurs niches écologiques potentielles et leurs évolutions. Depuis 2013, la bilharziose est arrivée en France et des premiers cas humains ont été signalés dans une région fortement fréquentée par des touristes à l’est de la Corse. En général, la bilharziose est une maladie qui touche 230 millions de personnes dans le monde et il s’agit d’une maladie parasitaire transmise par des escargots d’eau douce. Indubitablement, du fait des changements globaux, les conditions environnementales sont désormais favorables à l'expansion des escargots vecteurs dans le nord du bassin méditerranéen. De plus, en raison de leur activité agricole importante, la région Occitanie et l'Europe du Sud sont fortement contaminées par les pesticides et autres contaminants chimiques sur les eaux de surface et les eaux souterraines. Cependant, un aspect négligé est l'effet possible de la pollution sur la virulence des parasites. La virulence du parasite métazoaire n'est pas entièrement déterminée par sa génétique ; certains facteurs environnementaux sont cruciaux pour le contrôle de l'expression des gènes de virulence. En ce sens, des facteurs environnementaux spécifiques, tels que la pollution par les pesticides, telle qu'observée en région Occitanie et en Europe du Sud, peuvent augmenter l'expression de gènes de virulence ayant un impact sur l’expansion de la bilharziose. Cette étude permettra d'analyser l'évolution de la virulence des schistosomes dans un environnement exposé aux polluants chimiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’analyser, pour la première fois, les effets de la qualité de l'eau sur la virulence tout au long du cycle de vie des parasites métazoaires. À l'aide de techniques de pointe, nous caractériserons quels pesticides ou mélanges de pesticides sont responsables de l'expression accrue des gènes de virulence chez les deux espèces de schistosomes.
Procédures
Les rongeurs sont soumis à la phase d'infestation qui se fait de manière naturelle, par pataugeage dans un petit volume d'eau contenant les larves du parasite. Cette étape se fait en une fois et dure une heure. Une fois sous anesthésie les animaux sont soumis à un prélévement sanguin qui conduira à la mort de l'animal. Une deuxième méthode d'exposition des larves aux polluants est prévue, dans laquelle un autre stade larvaire est produit. Cette larve est incapable de pénétrer la peau du rongeur, ce qui nécessite une seconde méthode d'infestation par inoculation intrapéritonéale La méthode d’infestation par voie intrapéritonéale est classée comme légère. Cette méthode prend moins de 3 minutes par rongeur pour le contenter, l'infester et le réintégrer dans la boîte. Une fois sous anesthésie les animaux sont soumis à un prélévement sanguin qui conduira à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
L’infestation des rongeurs se fait par deux méthodes. Le pataugeage dans un bac d’eau contenant les larves est une méthode naturelle, provoquant un stress léger lors du transfert et de l’exposition. L’injection intrapéritonéale, utilisée pour les larves incapables de pénétrer la peau, induit un stress modéré et une légère douleur au moment de l’injection. Le développement des parasites adultes n’entraîne pas de nuisances directes, mais l’accumulation progressive des œufs provoque une atteinte chronique modérée du foie et de la rate. Les animaux sont utilisés avant que ces effets ne deviennent sévères.
Devenir
Euthanasie des rongeurs pour récupération du parasite
Remplacement
À ce jour, il est impossible de réaliser l’intégralité du cycle de Schistosoma in vitro, car le parasite nécessite un hôte vertébré pour son développement. Les rongeurs sont des modèles essentiels, reconnus comme réservoirs naturels pour plusieurs espèces de schistosomes. Toutefois, des recherches sont en cours pour développer des cultures in vitro de certains stades du parasite, afin de réduire l’utilisation des modèles animaux et améliorer l’étude des interactions hôte-parasite.
Réduction
Pour la souche de schistosome utilisant des souris, 40 souris sont infestées tous les trois mois = 160 souris / an. Pour la souche de schistosome utilisant des hamsters, 20 hamsters sont infestés tous les trois mois = 80 hamsters / an. Ceci est le minimum d’individus nécessaires au maintien de l’ensemble de nos expériences en tenant compte de possibles survenues de mortalité.
Raffinement
Pour chaque cycle de schistosome entretenu, l’infestation se fait avec le nombre optimal de parasites permettant à la fois le bien-être de l’animal et le maintien du cycle du parasite. La pénétration des larves de parasite à travers la peau des rongeurs est indolore, et la technique d'infection de larves infectieuses par voie intrapéritonéale est classée comme légère. Une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Afin de maintenir une socialisation, tout rongeur se retrouvant seul dans une cage est placé, après marquage par tatouage sur la queue, dans une autre cage contenant des rongeurs infestés par la même souche de parasite. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, des Aspen bricks (petits bouts de bois à ronger) et des carrés de coton pour la nidification. Ces différents enrichissements permettent d'avoir des activités ludiques et sociales. La mortalité ne survient jamais à l’issue de l’infestation ; nous n’utilisons ni des souris jeunes ni des souris âgées. Jusqu’à 6 mois post-infestation pour les souris et 12 pour les hamsters, les rongeurs ont des comportements d’alimentation et de socialisation normaux. Cependant, durant cette période, tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint un score de 3 dans les points limites, est euthanasié. Les points limites liés au maintien des cycles de schistosomes sont l’hépatosplénomégalie, la pâleur de l’animal, la perte de contact social et le dos vouté. Le nombre de points attribués pour chacun de ces symptômes varie entre 1 ou 2. Chaque animal ayant un score égal ou supérieur à 3 est euthanasié. Aucune médication n’est donnée car l’hépatosplénomégalie n’est pas réversible ; de manière plus générale, aucune médication ne peut être donnée car il y a des interférences avec le développement des parasites. Le point d’arrêt a été fixé à 7 mois pour les souris et 13 pour les hamsters afin d’éviter toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le choix pour les rongeurs s’est porté sur les souris (Mus musculus) SWISS qui présentent la meilleure compatibilité avec l’espèces Schistosoma mansoni et les hamsters dorés (Mesocricetus auratus) pour l’espèce Schistosoma haematobium avec lesquelles la souris n’est pas compatible. Animaux adultes. Les animaux sont infestés entre 6 et 16 semaines. En effet, les infestations par le parasite entraînent de fortes mortalités chez les rongeurs plus jeunes ou plus âgés.
Evaluation du devenir de la voie cortico-réticulo-spinale dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une ou deux chirurgies d'une heure chacune, espacées de deux semaines, pour injecter des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées, lors d'une chirurgie terminale ou plus tôt lorsque leur génotype ne convient pas. 440 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, une biopsie d'oreille sur animal éveillé servant au génotypage des lignées transgéniques. Le projet cherche à savoir si des neurones de la formation réticulée compensent la perte des neurones moteurs dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur justifie la souris par la disponibilité de plusieurs lignées mutantes et par le fait que la multiplication des modèles est, écrit-il, désormais requise pour convaincre la communauté scientifique.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. La SLA découle de la mort de neurones impliqués dans le contrôle des muscles et présents dans deux régions : 1) la partie supérieure du cerveau (cortex cérébral) et 2) la moelle épinière. Ces neurones qui dégénèrent au cours de la SLA sont en interaction avec une troisième population neuronale impliquée dans le contrôle des muscles et situées entre ces deux populations, dans une région appelée formation réticulée. Malgré ces interactions, on ne connaît ni le devenir au cours de la maladie, ni la contribution à la maladie des neurones de la formation réticulée. Partant de résultats scientifiques obtenus dans d’autres contextes pathologiques, nous émettons l’hypothèse que les neurones de la formation réticulée pourraient compenser les pertes des neurones directement ciblés par la SLA, et représenter une population neuronale d’intérêt thérapeutique. Pour tester cette hypothèse, nous proposons 1) de marquer et quantifier les neurones de la formation réticulée, et 2) de marquer et quantifier les neurones du cortex cérébral (en amont), qui se connectent directement aux neurones de la formation réticulé
Bénéfices attendus
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Histologiquement et cliniquement elle se définit comme la dégénérescence des neurones moteurs du cortex cérébral et de la moelle épinière. Cependant, ceux-ci sont en interaction avec d’autres neurones moteurs, notamment dans la formation réticulée, dont la contribution à la maladie n’a pas encore été évaluée, et qui pourraient compenser, sur le plan fonctionnel, les pertes des autres neurones, et représenter de fait une nouvelle population neuronale d’intérêt thérapeutique. Dans ce contexte, nous nous proposons d’évaluer le devenir des neurones moteurs de la formation réticulée dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique, afin de développer de potentielles nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’intervention : - Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques. - Une chirurgie unique, ou deux chirurgies successives, sur animaux anesthésiés, espacées de deux semaines, d’une durée de 1 heure maximum chacune pour injecter au sein du cerveau ou de la moelle épinière les traceurs permettant d’identifier les neurones d’intérêts et leurs connexions. - Une chirurgie terminale, sur animaux anesthésiés, pour prélever les organes d’intérêt : cerveau et moelle épinière.
Impact sur les animaux
1. Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, une contention douce, et une douleur légère à l’oreille lors de la biopsie requise pour le génotypage des animaux. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. 2. Une partie des animaux pourraient présenter de légères atteintes motrices et une perte de poids inférieure à 10%. 3. Des chirurgies qui peuvent entraîner des douleurs modérées dues à une inflammation transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt (cerveau et moelle épinière), ou en raison d’un génotype non conforme.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer, dans un contexte neurodégénératif, le devenir et le rôle de neurones impliqués dans le contrôle moteurs, et en interaction avec deux populations neuronales situées en amont et en aval et ciblées par la SLA, au sein du système nerveux central de mammifère. Une telle complexité des réseaux neuronaux ne peut pas, à l’heure actuelle, être reproduite in vitro. En effet, les organoïdes ne permettent actuellement que de modéliser deux des trois régions du cerveau qui sont investiguées ici. En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal ne saurait être remplacé par un modèle cellulaire ou in sillico.
Réduction
D’après les travaux préliminaires de notre consortium de recherche (composé d’experts de la moelle épinière, de la formation réticulée et du cortex cérébral), un nombre minimum de 8 animaux (4 femelles et 4 mâles) pourrait suffire pour mettre en évidence une modification statistiquement significative des populations neuronales d’intérêt ou de leur connectivité. Ici, nous proposons des groupes de 10 animaux afin de pouvoir exclure éventuellement un (ou plusieurs) animal(aux) si la qualité de certaines chirurgies s’avérait insuffisante. Nous proposons donc de commencer les expériences avec 8 animaux par groupe, et de n’inclure davantage d’animaux que si nécessaire. Le nombre d'animaux a été évalué pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les femelles et les mâles issus de mêmes portées.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, frisure, tunnels), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Les animaux seront utilisés avant l’apparition de symptômes moteurs sévères. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoires. Enfin, des points limites spécifiques au phénotype des animaux, ou aux chirurgies ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) il existe plusieurs lignées de souris qui, dans leur ensemble, couvrent plusieurs mutations retrouvées chez les patients contrairement aux modèles de primates (très rares) ou de rats (peu fréquents), et la multiplication des modèles est désormais requise pour convaincre la communauté scientifique, et 3) elles permettent davantage de manipulations génétiques, par croisement, qui permettent en outre de répondre également à des questions mécanistiques. Les animaux seront utilisés à partir de 45 jours et jusqu'à 90 jours ou 120 jours maximum selon les lignées, et dans tous les cas avant l’apparition de symptômes moteurs sévères.
Prélèvement unique et terminal de sang et d’organes .
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 360
600 souris et 360 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie gazeuse, chaque animal étant tué environ quatre minutes après le début de l'induction. Ils subissent un unique prélèvement sanguin de large volume, suivi immédiatement de la mise à mort et du recueil des organes. Le porteur écrit que dans ce type de procédure sans réveil l'animal n'est soumis à aucune nuisance, et que le recours à des tissus et cellules fraîchement recueillis n'est "pas remplaçable". Ces 960 animaux ne sont soumis à aucune expérience sur eux-mêmes, ils sont élevés puis tués pour que leur sang et leurs organes alimentent des essais menés ex vivo et in tubo.
Objectifs
Dans de nombreuses situations de développement de méthodes d’analyses ex vivo, ou de réalisation d’essais in tubo qui nécessitent l’utilisation de cellules primaires d’origine animale, il est requis de pouvoir accéder à des animaux sains qui seront donneurs de ce matériel biologique. Des procédures particulières peuvent être mises en place pour utiliser un animal dans ce seul objectif. Elles entrent dans un cadre bien défini prévu dans la réglementation.
Bénéfices attendus
L’accès a des échantillons biologiques obtenus dans les meilleures conditions de prélèvement et de stockage permet de produire des échantillons de qualité supérieure. Cela contribue donc à la réalisation d’expérimentation ex vivo des travaux plus fiables et reproductibles, et qui nécessitent moins de répétitions.
Procédures
Les animaux ne subiront qu'un seul prélèvement sanguin terminal puis seront mis à mort, ensuite les organes seront prélevés. L'induction de l'anesthésie à l'isoflurane (3%) dans la boite prend environ 2-3 minutes, la technique du prélèvement sanguin n'excèdera pas 30 secondes ( sous anesthésie), la mise à mort est réalisée à l'issue du prélèvement. Il s'écoule environ 4 minutes entre le débute de l'anesthésie et lamise à mort du l'animal.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure sans réveil, l’animal n’est soumis à aucune nuisance ou effet indésirable, seule l’anesthésie gazeuse est appliquée.
Devenir
L'objectif de chaque procédure est de rélaiser un prélvement de sang terminal (de large volume ) , et des recueillir les organes. Les prélèvements sont destinés à être utilisés lors d'expériences ex vivo.
Remplacement
Le recours à des échantillons biologiques animaux fraichement recueillis notamment les tissus ou cellules (en opposition au sérum/plasma) n’est pas remplaçable.
Réduction
Le recours à des échantillons biologiques animaux fraichement recueillis notamment les tissus ou cellules (en opposition au sérum/plasma) n’est pas remplaçable. • Réduction Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques. La contrainte est de synchroniser les évènements.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant leur période d’acclimatation ou d’hébergement dans l’animalerie. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Les animaux sont anesthésiés par voie aérienne ( induction gazeuse en boite) pour permettre la réalisation du prélèvement sanguin. Aucun geste ni action douloureuse n'est appliqué qui justifierait l'application de méthodes analgésiques. .Si au cours de l'induction de l'anesthésie ou du prélèvement sanguin , l'expérimentateur constatait une attitude anormale de l'animal, il appliquerait immédiatement l'arrêt anticipé . Dans ce type de procédure expérimentale, ces observations anormales ou inattendues sont considérées comme des points limites à ne pas atteindre
Choix des espèces
Nos travaux de recherche (développement de modèles d’évaluation de propriétés thérapeutiques de médicaments, protocoles de pharmacologie etc ) sont réalisés chez les rongeurs (rat et souris). Ces espèces sont largement employées dans notre domaine d’étude qui concerne les troubles métaboliques car elles sont bonnes répondeuses à des stimuli et à des actions pharmacologiques. La nécessité d’avoir accès à des échantillons biologiques frais de ces mêmes espèces est donc évidente. Les animaux utilisés seront des anaimaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Étude des mécanismes de modification de la réponse immunitaire par l’influence de cellules mémoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.
Procédures
Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).
Impact sur les animaux
Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées
Remplacement
Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.
Réduction
Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.
Raffinement
Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Rôle d’une protéine des vaisseaux sanguins dans une pathologie rénale, la glomérulonéphrite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux injections intraveineuses de sérum déclenchent une maladie rénale chez 480 souris, dont l'évolution est ensuite suivie pendant cinq à quatorze jours. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin pour analyser leurs reins. Une partie subit en plus une chirurgie de trente minutes pour une injection directe dans le rein, une autre reçoit un anticoagulant mélangé à sa nourriture, et le prélèvement final d'urine se fait par incision abdominale. Le porteur ramène l'œdème et la présence de protéines dans les urines à "une certaine gêne", et affirme que les conditions de la circulation sanguine ne peuvent pas être reproduites "en dehors d'un organisme complet".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de déterminer comment notre protéine d'interêt, qui bloque des enzymes dans les vaisseaux sanguins, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Des résultats précédents indiquent que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. Nous voulons déterminer son mécanisme d'action et quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.
Procédures
La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 5 à 14 jours. Un groupe de souris aura auparavant une procédure chirurgicale de 30 minutes environ pour une injection dans le rein qui permet d'augmenter la production de notre protéine d'intêret. Pour savoir si le mécanisme d'action de notre protéine est lié à la coagulation, un autre groupe de souris aura un traitement anticoagulant ajouté à la nourriture. A la fin des procédures, un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie, ainsi qu'un prelevement d'urine directement dans la vessie après une petite incision abdominale, puis les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses pour déclencher la maladie rénale peuvent provoquer une petite gène de courte durée. La maladie rénale elle même est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal) qui peut également provoquer une certaine gène. Certains animaux auront également une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée transitoire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.
Remplacement
L'étude de la fonction de la protéine étudiée et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites en dehors d'un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique et celle d'une étude précédente. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés et la production de ces animaux est basée sur ce nombre. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt, de l'injection dans le rein, ou du traitement anticoagulant, nous ne ferons pas de deuxième groupe.
Raffinement
Les souris ont à disposition des cotons et du papier kraft leur permettant d’exprimer un comportement naturel de mise en place d’un nid, ainsi que de batonnets de bois. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les injections est traitée préventivement par l'administration d'un antidouleur. La prise en charge d’une éventuelle douleur au cour de la procédure s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 2 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.
Optimisation des stratégies de vaccination thérapeutique anti-tumorales par association à des traitements visant les vaisseaux sanguins chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
960 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Chacune peut recevoir dix-huit gavages en neuf jours, quatre injections intrapéritonéales, trois injections sous-cutanées, et pour certaines une incision cutanée permettant d'injecter des cellules tumorales dans le foie ou dans le rein, suivie d'une imagerie hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids, s'immobiliser ou s'isoler. Il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduit en dehors d'un organisme vivant, et fait de ces modèles un "prérequis nécessaire" avant tout essai clinique.
Objectifs
La vaccination thérapeutique demeure la seule immunothérapie capable d'induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique. Cependant la vaccination thérapeutique lorsqu’elle est utilisée en monothérapie s’avère peu efficace. Lors de la progression du cancer, la tumeur développe de nombreux mécanismes d’échappement au système immunitaire tels que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins anormaux (appelée angiogenèse tumorale). Cette angiogenèse empêche l’arrivée des lymphocytes T au sein de la tumeur et favorise un environnement hostile au système immunitaire. Il peut donc être intéressant d’associer la vaccination thérapeutique à des traitements ciblant ces vaisseaux sanguins (appelés traitements antiangiogéniques) afin d’améliorer son efficacité. Des travaux ont montré une forte synergie d’action entre ces deux traitements, et cela, uniquement lorsque la vaccination est initiée à l’arrêt du traitement antiangiogénique. L’objectif de ce projet est à présent de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeux qui pourraient expliquer le bénéfice d’une combinaison administrée de façon séquentielle entre un traitement antiangiogénique et la vaccination thérapeutique. Les bénéfices possible d’une trithérapie en associant cette combinaison thérapeutique à d’autres immunothérapies seront également évalués. Ce projet apportera de meilleures connaissances sur la séquence d’administration de plusieurs traitements thérapeutiques et pourra aider aux développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’impact des traitements antiangiogéniques lors d’une réponse vaccinale. Notre approche longitudinale nous permettra de déterminer la cinétique d’apparition des modifications angiogéniques et immunitaires associées à cette combinaison thérapeutique. Ces résultats pourraient orienter sur le choix des anti-angiogéniques à utiliser en combinaison dans les essais cliniques. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques telle que des combinaisons entre traitement antiangiogénique et vaccin en association à des immunothérapies.
Procédures
Injection par voie sous-cutanée de cellules ou produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Gavage 2 fois par jour tous les jours pendant 9 jours, sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Chirurgie (incision cutanée latérale) : Injection de cellules tumorales dans le foie (1 fois) ou dans le rein (1fois) sur animaux sous anesthésie gazeuse ; durée du geste : 5 min. Imagerie : Injection en intra-péritonéale (i.p) du produit et Imagerie sous anesthésie gazeuse : 1fois/semaine, durée 30 min. Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min. Chirurgie terminale sans réveil sur animaux sous anesthésie, durée 20 min.
Impact sur les animaux
L’injection par voie sous-cutanée cause un stress de courte durée et n’est pas connue pour engendrer des nuisances ou douleurs. Le gavage cause un stress et une gêne transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires, risques d’infection et problème de cicatrisation. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la réponse immunitaire et de l’angiogenèse
Remplacement
L’implication du système immunitaire dans la lutte anti-tumorale et le microenvironnement tumoral sont extrêmement complexes, et ne peuvent être reproduits en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux qui développent des pathologies qui se rapprochent le plus physiologiquement possible de ceux retrouvés chez l’homme. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs a été déterminé. Ainsi pour les procédures n’impliquant pas de chirurgie, des groupes de 10 souris par point d’étude sont nécessaires. Pour les procédures impliquant de la chirurgie, des groupes de 12 souris par point d’étude sont nécessaires pour palier une éventuelle hétérogénéité de la réponse immunitaire après chirurgie et/ou d'éventuelles complications post-chirurgie. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les expérimentateurs effectuent un suivi bihebdomadaire des souris. Le vaccin et les différents traitements sont préparés dans des diluants compatibles pour des applications chez l’animal et ne sont pas connus pour être toxiques aux doses utilisées. Les prélèvements de sang et la chirurgie sont réalisés sur animaux sous anesthésie générale. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pré et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. L’alimentation des souris sera adaptée si besoin afin d’assurer leur hydratation et une prise alimentation: croquettes humidifiées, gel hydratant renouvelée 2 fois/semaine. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal idéal pour l’étude du système immunitaire au sein d’un organisme vivant. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car à cet âge là, le système immunitaire est entièrement développé et mature.
Développement de thérapies anti-cancéreuses CAR-Macrophages
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris immunodéficientes d'abord, puis des souris dont le système immunitaire a été remplacé par un système humain, reçoivent des tumeurs mammaires ou des tumeurs du cerveau. 280 souris au total vont être utilisées, 140 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 140 d'un niveau sévère. Une partie subit une chirurgie d'implantation dans un coussinet mammaire, l'autre une injection stéréotaxique dans le cerveau créant un gliome, avant de recevoir des macrophages génétiquement modifiés censés attaquer la tumeur. Le porteur décrit une échelle allant de la faiblesse de la queue à la paralysie complète et prévoit de tuer les animaux dès la paralysie des pattes arrière, les tumeurs étant ensuite prélevées pour analyse.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie pour le traitement des tumeurs solides, en utilisant des cellules immunitaires appelées macrophages. L’objectif est de surmonter les limitations actuelles des immunothérapies anticancéreuses, telles que la faible pénétration des cellules immunitaires dans la tumeur et l’immunosuppression induite par la tumeur elle-même. Les cancers sont souvent difficiles à traiter car les cellules cancéreuses peuvent échapper à l’attaque du système immunitaire. Ce projet propose d’utiliser des macrophages, un type de cellule immunitaire, qui seront modifiés pour mieux combattre les tumeurs. Ces macrophages modifiés seront capables de cibler et de détruire les cellules cancéreuses tout en résistant aux mécanismes de défense de la tumeur. Les macrophages seront modifiés pour exprimer un récepteur spécifique (CAR) qui leur permet de reconnaître et de cibler les cellules tumorales. Les macrophages seront reprogrammés pour adopter un comportement pro-inflammatoire, ce qui les rendra plus efficaces pour combattre les tumeurs et résistants à l’immunosuppression induite par les cellules tumorales. Nous nous appuyons sur nos travaux précédents qui ont démontré que l’inhibition des proprotéines convertases permettait de polariser les macrophages vers un profil pro-inflammatoire. Les souris seront utilisées pour tester cette nouvelle approche. Des souris immunodéficientes seront utilisées dans un premier temps, puis des souris avec un système immunitaire humanisé seront ensuite utilisées pour étudier les interactions entre les macrophages et les autres cellules immunitaires. Les souris recevront, sous anesthésie, des injections de cellules tumorales dans les régions mammaires et cérébrales afin de modéliser la croissance des tumeurs. La croissance des tumeurs sera suivie deux fois par semaine et tout signe de détresse ou de souffrance seront surveillés. Ensuite, nous allons introduire des macrophages modifiés, appelés macrophages CAR, qui sont conçus pour cibler spécifiquement les cellules tumorales et améliorer la réponse immunitaire grâce à leur reprogrammation pro-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait représenter une avancée majeure dans le traitement des tumeurs solides, offrant une nouvelle option thérapeutique aux patients. En améliorant la capacité des macrophages à pénétrer les tumeurs et à rester actifs malgré l'environnement immunosuppresseur, cette recherche pourrait conduire à des traitements plus efficaces et moins invasifs.
Procédures
Les animaux de la procédure expérimentale 1 seront soumis à une seule chirurgie au niveau de la zone d'implantation tumorale (4° coussinet adipeux), cette chirurgie permettant l'implantation des cellules tumorales. Les animaux de la procédure expérimentale 2 seront soumis à une seule neurochirugie par voie stéréaotaxique au niveau de la zone d'implantation tumorale. Les macrophages modifiés seront injectés dans les souris pour cibler les tumeurs.
Impact sur les animaux
Les symptômes attendus sur les animaux sont les symptômes neurologiques qui ont été évalués avant par des scores neurologiques modifiés comme suit : grade 0, absence de symptômes; grade 1 (légers),faiblesse de la queue ou paralysie de la queue; grade 2 (modérés), paraparésie des pattes postérieures ou hémiparésie; grade 3 (sévères), paralysie des pattes postérieures ou hémiparalysie; et grade 4 (très sévères), paralysie complète (tétraplégie), stade moribond ou décès. Mais dans notre projet, tous les animaux seront euthanasiés dès l’apparition de symptômes de grade 3. Les animaux seront observés tous les jours pour l’apparition des symptômes. Les symptômes tels que la douleur et la détresse seront atténués par l’anesthésie et l’administration d’analgésiques. Pour les deux modèles (mammaires et cérébrales), tout signe de souffrance (prostration, isolement, perte de poids supérieure à 20% du poids corporel initial) sera scruté et fera l’objet d’un suivi scoré, tout animal présentant un de ces signes sera mis à mort. Les injections de macrophages peuvent induire des réactions inflammatoires locales au site d'injection et des effets systémiques modérées liés à l'activation immunitaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement pour détecter ces effets, et une euthanasie sera pratiquée dès l'apparition de symptômes sévères.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les souris seront soumises à une euthanasie, et des prélèvements des tumeurs mammaires et des gliomes seront ensuite réalisés pour des analyses par cytométrie en flux et immunofluorescence.
Remplacement
Avant d’envisager toute expérimentation in vivo, nous avons exploré les alternatives non animales disponibles et évalué leur pertinence par rapport aux objectifs du projet. L'efficacité des macrophages CAR a d'abord été testée in vitro sur des lignées cellulaires en 2D, puis ex vivo sur des modèles organoïdes 3D, reproduisant plus fidèlement l’environnement tumoral. Ces expériences ont permis de déterminer que la furine est l'enzyme la plus efficace pour réactiver les macrophages et ont optimisé le multiplicity of infection (MOI) nécessaire pour générer des macrophages CAR fonctionnels, capables de reconnaître et d’éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats valident la pertinence de poursuivre par des études in vivo, indispensables pour évaluer l’efficacité et la sécurité des macrophages CAR dans un microenvironnement tumoral complexe,et pour affiner le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Réduction
Au cours de la rédaction des protocoles in-vivo, une analyse biostatistique a été effectuée afin de définir le nombre idéal des animaux, qui sera utilisé en conjonction avec la crédibilité des résultats obtenus. Le nombre de souris sera réduit le plus possible afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs (lots de 10 animaux par condition). Le projet fait appel à différents modèles expérimentaux, dont des modèles cellulaires en trois dimensions qui ont permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. La validation de ces conditions expérimentales ne peut se faire qu’in vivo pour rendre compte de l’efficacité du traitement dans un système biologique complexe.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront optimisées pour minimiser le stress et la douleur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et des analgésiques seront administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Les animaux seront surveillés de près pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance, et des critères stricts d'euthanasie seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile. Les techniques et protocoles utilisés seront continuellement évalués et améliorés pour assurer le bien-être maximal des animaux. Les conditions de vie seront améliorées au maximum.
Choix des espèces
C’est une espèce classiquement utilisée en cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. Des tests de macrophages CAR sur les modèles souris ont déjà été publiés précédemment. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 8 semaines. Pour les souris humanisées, nous utiliserons des souris âgées de 21 semaines (16 semaines après humanisation).
Étude préclinique des anticorps anti-PD1 sur les lymphomes T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 079 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Greffées avec des cellules tumorales prélevées sur des patients atteints d'un lymphome cutané, elles subissent une prise de sang par semaine sous anesthésie jusqu'à leur mort, une injection de cellules immunitaires humaines, puis un anticorps anti-PD1 chaque semaine pendant un mois. La mise à mort intervient quand la tumeur atteint le volume maximal toléré, ou six semaines après le traitement si la tumeur ne se développe pas. Le porteur écrit que la croissance tumorale "ne semble pas induire de souffrance pour l'animal" jusqu'à cette limite.
Objectifs
Les lymphomes T périphériques représentent un large groupe d’hémopathies malignes issus de lymphocytes mature T. Nous nous intéressons particulièrement au syndrome de Sézary, un lymphome T lymphome cutané rare, caractérisé par une prolifération maligne des lymphocytes T dans la peau. Il représente environ 3 % des lymphomes cutanés des cellules T. Cependant, le pronostic est généralement défavorable, avec un taux de survie moyen de 2 à 4 ans après le diagnostic. Des tests préliminaires in vitro ont démontré que des anticorps anti-PD1 sont capables de recruter les cellules immunitaires pour induire la mort des cellules tumorales. Cette preuve de concept in vitro nous a permis de conclure que l’anticorps anti-PD1 permet de détruire les cellules tumorales par un recrutement des cellules immunitaires. Pour passer en phase préclinique, nous devons tester cet anticorps anti-PD1 sur des souris. Nous utilisons un modèle de souris immunodéficientes, sans système immunitaires pour permettre la prise des greffes de tumeurs. Ensuite, nous allons injecter l’anticorps anti-PD1 et des cellules immunitaires humaines. Ce duo nous permettra de tuer les cellules immunitaires. Ce projet permettra de montrer l’efficacité de ce nouveau traitement contre les lymphomes T exprimant la cible PD1 et d’ainsi obtenir un traitement possible contre les lymphomes T.
Bénéfices attendus
Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes à cellules T dont le syndrome de Sézary. Les lymphomes à cellules T sont des maladies rares avec peu de traitements efficaces sur le marché. Ce projet nous permettra de démontrer la preuve de concept des anticorps thérapeutiques anti-PD1 sur un modèle de souris patient-derived-xenograft (PDX). Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Procédures
Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous ferons des prises de sang toutes les semaines sur des souris anesthésiées (conformément aux recommandations) pour réduire leur souffrance. Les souris auront des prélevments de sang jusqu'à la mort de la souris une fois par semaine. De plus, les souris subiront une injection de cellules immunitaires au dès qu'elles auront des cellules tumorales dans le sang. Elles seront alors traitées une fois par semaine par injection intraveineuse d'anti PD1 pendant 1 mois sur souris endormie. Ainsi une fois par semaine, pendant la phase traitement (1mois) , les souris seront anesthésiées et auront un prélevement de sang et un traitement anti-PD1 par semaine.
Impact sur les animaux
Nous allons injecter des cellules tumorales et des cellules immunitaires en intrapéritoénale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous mettrons à mort les souris sous anesthésie.
Devenir
Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de souffrance pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.
Remplacement
Il a été démontré en culture cellulaire, que l’anticorps anti-PD1 pouvaient induire la mort de cellules tumorales en recrutant les cellules immunitaires. Nous devons donc maintenant tester cet anticorps dans notre modèle PDX in vivo. Cela nous permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de cet anticorps et sa capacité à induire une forte régression tumorale. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet de l’anticorps anti-PD1. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests. De plus, nous voudrions tester cet anticorps anti-PD1 sur 7 modèles de PDX pour voir l’efficacité de ce traitement sur différents profils mutationnels de lymphome T.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur , perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation des PDX, les souris seront anesthésiées. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.
Génération de lignées transgéniques de Cryptosporidium spp. sur souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Gavées une fois avec du bicarbonate de sodium, puis une fois avec une solution de parasites, 320 souris immunodéprimées voient leurs selles récoltées jusqu'au terme de la procédure, déclarée d'un niveau de souffrance léger. Certaines développent une diarrhée, un amaigrissement, une déshydratation et de la fatigue, au point d'être tuées avant la fin prévue. Le porteur juge le cas peu fréquent, les parasites transgéniques étant selon lui difficiles à générer et produits en nombre insuffisant pour déclencher des symptômes marqués. Il justifie le recours aux souris par une seule phrase, l'absence d'"alternative crédible", et toutes sont tuées après récolte des oocystes du parasite modifié.
Objectifs
Cryptosporidium spp. est un parasite qui provoque des maladies diarrhéiques chez les humains et les animaux, en particulier chez les jeunes enfants et le bétail. Cette infection, appelée cryptosporidiose, est un gros problème de santé publique et animale parce qu’elle rend beaucoup de jeunes enfants malades et réduit la productivité des élevages, notamment des ruminants comme les vaches. Malheureusement, il n’existe actuellement ni traitement spécifique ni vaccin efficace contre cette maladie. Nous comprenons encore mal comment ce parasite fonctionne. De nombreuses protéines et parties de ce parasite ne sont pas bien étudiées, ce qui rend difficile la découverte de nouveaux traitements. Pour mieux comprendre ces protéines, les chercheurs essaient de modifier génétiquement le parasite en laboratoire. Cela permet de mieux comprendre où ces protéines se trouvent dans le parasite, comment elles interagissent avec d’autres molécules, et quel rôle elles jouent dans l’infection. Cependant, il est difficile de modifier génétiquement ce parasite parce que son cycle de vie est complexe. Une partie de ce cycle inclut une phase de reproduction sexuelle, qui est nécessaire pour intégrer les modifications génétiques. Malheureusement, les modèles de laboratoire actuels ne permettent pas à ce parasite de se reproduire sexuellement de manière efficace, ce qui complique la création de parasites génétiquement modifiés. Le projet en question vise à surmonter ces obstacles en créant des parasites transgéniques, c’est-à-dire des parasites dont les gènes ont été spécifiquement modifiés pour mieux comprendre le rôle des protéines qu’ils produisent. En identifiant les protéines essentielles à la survie et à la virulence du parasite, les chercheurs espèrent découvrir de nouvelles cibles pour des traitements ou des vaccins contre la cryptosporidiose, ce qui pourrait conduire à des stratégies de prévention et de traitement plus efficaces.
Bénéfices attendus
Beaucoup de choses restent a élucider concernant la biologie de Cryptosporidium spp., un parasite responsable de maladies graves. Ces questions concernent des aspects très basiques, comme le rôle de certaines parties du parasite, la façon dont il choisit ses hôtes qu’il s’agisse d’humains ou d’animaux), comment il parvient à entrer dans les cellules, et les effets à long terme de la maladie, notamment chez les enfants. On ne connaît pas non plus la fonction de la plupart des protéines que produit ce parasite. Étant donné que la cryptosporidiose touche à la fois les humains et les animaux, avec des conséquences importantes sur la santé et l’économie, et qu’il n’existe actuellement ni traitement ni vaccin efficace, il est essentiel de faire avancer la recherche sur ces sujets. Le but est de découvrir des cibles potentielles pour développer de nouveaux traitements ou vaccins. Ce projet vise donc à identifier des protéines et des mécanismes clés dans la biologie du parasite et dans le développement de la maladie, afin de trouver de bonnes cibles pour de futurs vaccins et traitements.
Procédures
Les animaux serons gavés avec un petit volume, de bicarbonate de sodium une fois, puis une solution de parasites une fois. Le reste de la procédure consiste a récupérer les selles. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent développer de la diarrhée, avec amaigrissement, déshydratation et fatigue, pouvant mener à la nécessité de sacrifier l’animal avant la fin de la procédure. Néanmoins, il n’est pas attendu que ceci arrive dans une majorité de cas, les parasites transgéniques étant en général difficiles à générer et en un nombre insuffisant pour provoquer des symptômes importants.
Devenir
Animaux infectés avec des pathogènes animaux et humains transgéniques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative crédible a l’utilisation d’animaux pour la génération de Cryptosporidium transgénique en l’état actuel des connaissances.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu sur 5 ans correspond au minimum envisageable pour la génération d’un nombre suffisant de parasites transgéniques si le nombre de souches transgéniques générées est atteint.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies correspondant au standard recommandé pour l’espèce. La procédure en tant que telle n’a qu’un impacte très limité sur le confort des animaux pendant de courtes périodes.
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont les modèles les plus petits et les plus pratiques sur lesquels il a été possible de générer expérimentalement des souches de Cryptosporidium transgéniques à ce jour. Il n’existe par ailleurs pas d’alternative aux modèles animaux dans ce but. Pour la génération d’oocystes : les animaux seront utilisés à plus de 3 semaines d’age. Il n’a pas été démontré qu’un age était plus favorable à la génération d’oocystes qu’un autre, et lever toute limite d’âge permet de d’éviter d’avoir a sacrifier des animaux n’ayant pas généré de parasites transgéniques. Pour l’élevage : L’âge minimal pour l’accouplement est de 6 semaines pour les femelles et de 7 semaines pour les mâles. L’âge maximal suggéré avant le premier accouplement est de 10 semaines, dépassé cet âge la capacité reproductrice diminue. Les mâles seront utilisés jusqu’à l’âge de 7 mois, après quoi leur capacité reproductrice diminue. Les femelles seront retirées après 6 portées ou à l’âge de 8 mois (le 1er critère atteint) ou après une baisse significative de production.
Evaluation par imagerie de l’état de la barrière sang-cerveau après traitement par un anticorps chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Issues d'un élevage de souris génétiquement modifiées dont la totalité des naissances est utilisée, y compris celles qui ne portent pas la mutation et deviennent des témoins, 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, jusqu'à trois injections intraveineuses et deux séances d'anesthésie gazeuse d'une heure. L'objet est de suivre par imagerie l'ouverture puis la refermeture de la barrière sang-cerveau provoquée par un anticorps. Le porteur affirme que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro, sans dire ce qui a été tenté.
Objectifs
Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et leur paroi forme une véritable barrière. D'un autre côté cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau, comme les maladies neurodégénératives ou les cancers du cerveau. Certaines stratégies thérapeutiques, bien qu'efficaces pour les organes périphériques, échouent pour les maladies du cerveau car les médicaments ne peuvent atteindre leur cible intracérébrale. L'ouverture de la barrière sang-cerveau de manière ciblée, contrôlée et temporaire, pourrait ouvrir des perspectives énormes pour des maladies jusqu'ici incurables. Un anticorps thérapeutique a été développé récemment le permettant. Son développement nécessite cependant des méthodes précliniques pouvant être utilsées dans le futur chez les patients de manière à suivre précisément l'ouverture et la bonne refermeture de cette barrière. L'imagerie médicale non invasive permet ce suivi. Le but de ce projet est l’étude par imagerie médicale chez la souris de l’ouverture de la barrière sang-cerveau induite par un anticorps thérapeutique.
Bénéfices attendus
De nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces sur cellules ex vivo ou in vivo sur les organes périphériques sont impossibles pour le traitement de maladies cérébrales, telle que alzeihmer ou les cancer du cerveau à cause de la barrière sang-cerveau. Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le fonctionnement de cette barrière, valideront la stratégie permettant de l'ouvrir temporairement et de façon contrôlée et permettrons la mise au point d'une méthode d'imagerie médicale pouvant être, en cas de succès, utilisée en clinique. Ce projet et ces études sur la barrière sang-cerveau pourront permettre à plus long terme de comprendre comment soigner des maladies cérébrales jusqu'ici incurables.
Procédures
Un premier groupe de souris subira : Anesthésie gazeuse (maximum 1h) 1X par animal, Injection intraveineuse anesthésié (
Impact sur les animaux
Au cours des injections, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort à cause de la manipulation, ainsi qu'une douleur légère et de courte durée lors des injections. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale qui nécessitent manipulation et anesthésie. Les biopsies caudales pour génotypage, c'est à dire identification des animaux porteurs d'une mutation nécessaire à cette étude, entraînent une nuisance légère et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
La complexité de la barrière sang-cerveau et les effets globaux que son ouverture entraine ne peuvent pas être totalement répliqués in vitro. De plus, la procédure d'ouverture de la barrière sang-cerveau et les méthodes d'imagerie non invasive testées dans ce projet sont des méthodes thérapeutiques et d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été determinés et les resultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, mais sera suffisant pour conclure de manière robuste au succès ou non de notre étude. En ce qui concerne les animaux transgéniques élevés, nous utiliserons tous les animaux de l'élevage car les souris ne portant pas la mutation d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs.
Raffinement
Pour le génotypage, c’est-à-dire l’identification, des souris génétiquement altérées modèles, nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les méthodes d'imagerie que utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Durant les anesthésies, les souris seront chauffées, leur rythme respiratoire surveillé et du gel oculaire leur sera appliqué pour éviter le déssèchement des yeux. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Cette étude de l'ouverture de la barrière sang-cerveau par imagerie médicale non invasive a pour but d'améliorer l'administration de médicament au cerveau. Cette barrière est contrôlée par les mêmes protéines chez l'homme et la souris. Par ailleurs il existe chez la souris des lignées transgéniques avec des mutations impliquées dans le contrôle de la barrière sang-cerveau permettant de mieux comprendre ce phénomène. Les souris transgéniques seront identifiées à 3 semaines. Pour les procédures expérimentales, des souris adultes seront utilisées.
Evaluation d’une thérapie génique dans un modèle murin du syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une souris dont l'état se dégrade est retirée du protocole et tuée avant le test. 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral par voie intraveineuse ou rétro-orbitale, puis passent trente-deux heures d'enregistrement de leur activité, deux sessions de rotarod, un test de barre crantée, un test de reconnaissance d'objet, et une injection d'agent convulsivant dont la latence et la sévérité des crises sont mesurées. Le porteur cherche à montrer qu'une thérapie génique corrige les signes du syndrome de Rett chez la souris, preuve de concept qu'il présente comme l'étape "indispensable" avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. La pathologie touche essentiellement les filles, rarement les garçons qui eux meurent d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par édition du génome pour corriger le gène muté responsable de la pathologie. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous avons caractérisé au préalable trois modèles de souris portant des mutations dans ce gène, représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous a permis de sélectionner le modèle le plus pertinent pour évaluer une approche de thérapie génique. En parallèle, nous avons développé un vecteur viral AAV (Adeno-Associated Virus) pouvant être injecté par voie intraveineuse périphérique et capable de passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace afin de cibler les cellules portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie, et ainsi aboutir à leur correction par édition du génome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept in vivo qu'une approche thérapeutique par thérapie génique permet de corriger les signes cliniques du syndrome de Rett dans un modèle murin, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de cette pathologie, contre laquelle il n'existe aucun traitement curatif à ce jour.
Procédures
Injection par voie intraveineuse caudale AMENDEMENT: par voie rétro-orbitale (durée 2-3 minutes) ; activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (durée du test: 20 minutes), après injection par voie intrapéritonéale d'un agent convulsivant( durée d'injection: 5 sec); le suivi du poids des animaux (1X/semaine, à partir de 3 semaines jusqu'en fin d'étude à 7 semaines d'âge).
Impact sur les animaux
La mutation dans le gène responsable de la pathologie induit une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 9 semaines chez les males porteurs de la mutation. Ceux-ci peuvent notamment présenter les symptomes suivants à 6-8 semaines d'âge: hypoactivité, diminution du poids, diminution de la température corporelle, déficit dans la coordination motrice, démarche anormale, déficits cognitifs, et susceptibilité accrue aux crises épileptiques. Les femelles qui portent la mutation ne manifestent des défauts que vers l'âge de 9 mois (déficits moteurs, faible capacité à construire des nids) et peuvent survivre au-delà de l'âge de 1 an. Dans le cadre de notre projet, les femelles seront euthanasiées avant l'âge de 9 mois où commencent à apparaitre les symptomes. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises convulsives peuvent survenir à différents degrés de sévérité; la durée, la latence et la sévérité sont enregistrées. Des effets indésirables sont également liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences, avant l'apparition du phénotype dommageable.
Remplacement
L'objectif de cette étude est d'évaluer une approche thérapeutique dans un modèle de souris portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett, représentative de la clinique humaine. Il s'agit en particulier d'étudier la correction des phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des études in vitro ont été réalisées au préalable afin d'évaluer cette approche dans des modèles de cellules neuronales en culture, ainsi que dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes de patients et dans des organoides cérébraux, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser la correction des symptômes de la maladie de Rett, et ainsi de valider l'effet thérapeutique par la correction du gène, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 60 mâles portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett représentative de la clinique humaine: 30 seront traités par injection d'un vecteur viral permettant de corriger le gène muté pour évaluer l'approche thérapeutique, 30 ne seront pas traités. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à la mutation, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Pour pallier au risque de diminution de la température corporelle, nous augmenterons le nombre de "nestlets"dans les cages. En cas de difficultés motrices, de la nourriture en gel sera ajoutée dans les cages. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Les manipulations et gestes brusques seront limités pour éviter de déclencher des crises d'épilpesie. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal. Le type de croisement choisi pour monter les cohortes expérimentales (femelles hétérozygotes X mâles qui ne portent pas la mutation) permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer les cohortes et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs, ceux-ci développant des symptômes pathologiques à 6-8 semaines, avec une survie limitée à environ 9-10 semaines. Les femelles hétérozygotes ne présentent, quant à elles, des symptômes qu'à partir de l'âge de 9 mois; elles seront euthanasiées avant cet âge afin de ne pas maintenir des animaux avec un potentiel phénotype dommageable.
Choix des espèces
Le modèle souris portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie permet de reproduire les symptômes de la maladie de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Les études précédentes nous ont permis de définir un âge maximum de 8 semaines pour réaliser les tests comportementaux, avant que les animaux n'expriment un phénotype dommageable entrainant leur mort. Par ailleurs, nous savons qu'il faut un délai de 3-4 semaines entre l'injection des vecteurs AAV et une expression efficace des transgènes. Nous utiliserons ainsi des animaux âgés de 3 semaines pour réaliser les injections par voie intraveineuse du vecteur AAV, suivi de l'évaluation de la correction du phénotype à l'aide de tests comportementaux et de cognition à 6-7 semaines d'âge (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptômes du syndrome de Rett).
Rôle des protéines de la membrane basale et des récepteurs transmembranaires dans le développement et la maturation de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent jusqu'à dix administrations par gavage ou par piqûre au cours de leurs quatre premières semaines de vie, avant d'être tués à des âges échelonnés de deux à vingt-huit jours. 3 155 souris vont être utilisées, 2 995 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 160 d'un niveau sévère. Le porteur qualifie chacun des produits administrés de "non toxique et non irritant" et ramène la nuisance à "une gêne d'une courte durée", tout en attendant diarrhées, déshydratation et variations de poids. Une partie des animaux appartient à une lignée qui développe une dystrophie musculaire congénitale et perd l'usage des pattes arrière, et toutes sont tuées pour analyses post-mortem.
Objectifs
L’intestin est composé de plusieurs couches : l’épithélium, la membrane basale et le tissu conjonctif. L'épithélium est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile qui se trouve à l’intérieur de l’intestin. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets, tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité de l’organe, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en une semaine (ce qui en fait l’organe le plus régénératif du corps). L'épithélium recouvre des protubérances en forme de doigts qui s'étendent à l’intérieur de l’intestin (appelées villosités) et des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif (appelées cryptes). Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire (avant la naissance), les principaux changements morphologiques, tels que l'invagination des cryptes ou le début de la migration cellulaire, ne se produisent qu'au cours de la période postnatale (après la naissance), de même que la maturation des cellules épithéliales, qui est cruciale pour la capacité à digérer des aliments solides après le sevrage. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM) par l'intermédiaire de récepteurs spéciaux (intégrines). Celle-ci est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un soutien structurel à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient leur orientation. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme et change au cours de la vie et également lors de la survenue de maladies. Le rôle joué par la composition de la BM dans le comportement et la maturation des cellules épithéliales reste inexploré. Dans ce projet, nous visons à évaluer comment certaines des protéines qui composent la membrane basale, et les récepteurs que les cellules utilisent pour se fixer à celle-ci, influencent le comportement et la maturation des cellules au cours du développement.
Bénéfices attendus
Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.
Procédures
Une première cohorte d’animaux sera divisée en 5 groupes à des stades précoces du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 4 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 2 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un cinquième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis Une seconde cohorte d’animaux sera divisée en 4 groupes à des stades avancés du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 8 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 2 temps différents - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous utiliserons plusieurs modèles de souris dont la lignée Lama2-dyw (perte de la protéine Lama2 dans la membrane basale). Un modèle inductible qui limiterait la mutation au système gastro-intestinal n’existe pas actuellement. Les animaux Lama2-dyw développent une dystrophie musculaire congénitale lors des premières semaines après la naissance. L’espérance de vie pour ce modèle est de 8 à 14 semaines, ici nous l’utiliserons seulement jusqu’à 4 semaines maximum. Jusqu’à cet âge, les animaux sont attendus plus petits que les animaux témoins (qui ne développent pas la maladie) mais ne subissent aucune perte de poids. Ils peuvent montrer des difficultés à se mouvoir dû à une faiblesse musculaire au niveau des membres postérieurs. Lorsque c’est possible, nous utiliserons un modèle de souris inductible où la mutation peut être limitée au système gastro-intestinal. Dans ce cas là, les animaux vont recevoir différents traitements (produits non toxiques et non irritants) par gavage orale ou par une piqûre. Les nuisances attendues sont donc une gêne d’une courte durée au point d’injection ou dans la gorge. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphe, neurones, muscles, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L’objectif principal de ce projet étant d’identifier la régulation de la membrane basale (BM) sur l’homéostasie et le développement de l’intestin, la réduction au système in vitro seulement pourrait nous empêcher d’identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l’intestin. L’objectif du projet est d’identifier le rôle des protéines dans la régulation de la BM et de déterminer comment la BM est impliquée dans les problèmes digestifs (maladie ou cancer). Cependant, le rôle de la BM dans l’intestin pourrait être secondaire à son effet sur le système musculaire ou sur le système neuronal. Nous aurions besoin d’un modèle murin pour identifier les différents composants affectés par l’absence de protéines, et comment ces autres systèmes affectent le petit intestin. Nous utiliserons des organoïdes et des explants de tissus en supplément, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n’existe aucun moyen de reproduire la membrane basale (sa composition et sa structure) in vitro, mais seulement certains de ses composants de base (en fonction de notre protéine d’intérêt elle est ou non présentes dans la culture in vitro). Pour l’utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d’organoïdes provenant des mêmes souris d’intérêts et contrôles pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour diminuer le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l’échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée aux caractéristiques similaires. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d’animaux de tous les génotypes d’intérêts. Plusieurs types d’analyses seront effectués sur la même souris. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les femelles gestantes seront séparées 2 à 3 jours avant la mise à bas pour le bon déroulement de la procédure Pour réduire et limiter le stress, aucun changement de cage ne sera effectué pendant la première semaine suivant la naissance. De plus, la mère sera manipulée avant les jeunes, afin d’incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon de la part de la mère. La bonne manipulation des jeunes par la mère sera vérifiée. Pour les animaux développant la dystrophie, ils seront monitorés tous les jours (week-end compris) et auront à disposition de la nourriture et de l’eau accessible directement au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire. L’espérance de vie des animaux atteints de cette maladie est de 8 à 14 semaines, ici nous les utiliseront maximum à 4 semaines (P28) donc nous n’effectuerons pas de sevrage (normalement à P21) afin de faciliter le développement jusqu’à la mise à mort. Pour tous les animaux, une grille de score est établie pour évaluer l’état des animaux de façon objective.
Choix des espèces
Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen approprié reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l’Homme, tant au niveau génétique qu’au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l’organe, font qu’il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l’Homme. Enfin, la disponibilité d’une variété d’outils génétiques, ainsi qu’un assemblage complet et annoté du génome, de même qu’une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet et même le seul modèle animal disponible puisqu’il n’existe pas encore d’autres modèles utilisables pour cette étude. Nous utiliserons des souris âgées de P2, P7, P14, P21 et P28 (P = jour après naissance) pour évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change radicalement, et nous testerons l'implication de la membrane basale dans la régulation de ces changements. De plus, nous utiliserons des stades précoces du développement pour déterminer le rôle de la protéine durant l’embryogénèse à E13,5, E15,5 et E18,5 (E = jour après fécondation) en utilisant des souris adultes gestantes. Enfin nous utiliserons des souris adultes pour étudier le rôle de nos protéines d’intérêts, soit entre 8 et 16 semaines pour avoir un système gastrointestinal mature.