Rongeurs
Nouveaux traitements pour faciliter l’abstinence aux opiacés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraire leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de douze à vingt-six injections ou gavages et développent des symptômes de dépendance aux opiacés et de sevrage. L'objet est d'identifier des traitements facilitant l'abstinence et limitant les troubles de l'humeur qui accompagnent la dépendance. Le porteur annonce quatre tests comportementaux, d'une durée de six à quarante-cinq minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à identifier de nouveaux traitement pouvant limiter le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur le « système opioïde » dans le cerveau. En conditions normales, ce système neuromodulateur régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en identifiant des traitements pouvant faciliter l'abstinence aux opiacés, en utilisant des modèles murins. Ce projet sera conduit en respectant la règle des 3R (remplacer –réduire –raffiner) visant à remplacer ou réduirechaque fois que possible le nombre d’animaux, ainsi qu’à optimiser les procédures pour minimiser l’inconfort des animaux tout en permettant d’étudier l’effet de l’exposition aux opiacés sur l’état émotionnel des animaux au long court (4 semaines).
Bénéfices attendus
Nous espérons trouver des nouveaux traitements pour faciliter l'abstinence aux opiacés et ainsi limiter les symptômes de désespoir et ainsi éviter la rechute ou re-consommation de substance pouvant mener à la mort par overdose des personnes avec des troubles de consommation.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des injections ou des gavages (de 12 à 26) et à des tests comportementaux (4). La durée d'une injection ou d'un gavage est de 30 secondes et un test comportemental dure de 6 minutes à 45 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Les injections répétées pourront également un stress modéré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d'extraire le cerveau pour des analyses moléculaire.
Remplacement
"Remplacement" : Pour résoudre ce projet, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les réseaux complexes de structures interconnectées dans le système nerveux central chez l’Homme. Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées). Il en va de même pour les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.
Réduction
"Réduction" : Les animaux utilisés étant de même parenté sanguine permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. De plus, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.
Raffinement
"Raffiner" : Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, des papiers absorbants et un dôme pour faire un nid. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations . Les sites d'injections seront alternés (gauche/droite) et des aiguilles à usage unique seront utilisées. Les souris seront laissées un minimum deux semaines d’acclimatation dans leur arrivée dans la zone d’expérimentation. En cas de bagarre importante les animaux seront séparés.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome. Les souris sont un modèle privilégié pour la recherche biomédicale et sont désormais utilisées comme modèles standard pour l'étude de la fonction neuronale et des réponses comportementales associées en conservant une complexité structurelle et intégrative intacte du système nerveux. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés. Les souris seront adultes, car l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures et adultes.
Creation et caractérisation de la lignée PKD2L1KO*SOD1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent deux modifications génétiques combinées, dont celle qui reproduit chez elles la sclérose latérale amyotrophique. 3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 724 d'entre elles et sévère pour 1 056. 1 056 animaux nagent jusqu'à trois fois trente secondes dans un couloir d'eau tous les quinze jours et subissent deux fois par semaine un test de force d'agrippement, à mesure que leurs membres postérieurs s'affaiblissent. Le porteur écarte les modèles invertébrés au motif qu'ils n'ont pas de moelle épinière organisée, et prévoit des tétines de biberon allongées pour les animaux qui n'atteignent plus leur eau.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs – les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles –. En général, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. Malgré la création de plusieurs modèles animaux, aucune cause précise de cette perte des neurones n’a encore été trouvée. Des recherches récentes ont permis d’identifier un type unique de neurones situés autour du canal central de la moelle épinière, appelés neurones de contact avec le liquide cérébrospinal. Ces neurones ont une structure particulière, avec une extension qui atteint directement le liquide. Leur rôle reste encore largement inconnu, mais on sait que dans le cas de la maladie de Charcot, la composition du liquide cérébrospinal devient toxique. Il semblerait que les neurones autour du canal central soient capables de détecter les changements de composition du liquide cérébrospinal grâce à une protéine spécifique. Notre projet vise à étudier l’implication de cette protéine dans la maladie de Charcot en utilisant entre autres des souris dont le gène codant pour cette protéine a été invalidé.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’étudier le rôle des neurones présents autour du canal central de la moelle épinière et l’implication des facteurs qu’ils libèrent dans le développement de la maladie de Charcot. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la vie des patients.
Procédures
1056 animaux seront soumis à des mesures de vitesse de nage dans un couloir de nage (maximum 30 secondes dans l’eau trois fois avec un temps de pause de 2 min entre chaque test) tous les 15 jours à compter de leur 2 mois. 1056 animaux seront soumis à des tests de force d’agrippement (maximum 3 minutes 30), deux fois par semaine à partir de deux mois postnataux. Afin de déterminer le génotype des animaux, une biopsie de 1mm, pouvant entrainer une douleur légère, sera réalisée en quelques secondes durant les 15 premiers jours postnataux au niveau de la queue des animaux.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Les animaux seront aussi soumis à un stress modéré lié aux tests de comportements.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. La SLA est une maladie neurodégérative multifactorielle d’étiologie complexe avec des formes génétiques et sporadiques. L’absence de moelle épinière organisée chez les invertébrés ne permet pas d’utiliser ces modèles animaux lorsqu’on s’intéresse aux processus de dégénérescence des neurones spinaux .
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, nous ferons des études comportementales et des analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par l’expérience que nous avons acquise au laboratoire qui travaille depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Des dispositifs adaptés aux besoins des animaux commençant à présenter des faiblesses motrices seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité. Les mâles étant agressifs entre eux, leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Les intervenants sont formés aux points limites de la maladie et interviennent dès que cela est nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix de la sclérose latérale amyotrophique aujourd’hui dans la communauté scientifique. Il existe des modèles d’invertébrés de la sclérose latérale amyotrophique mais l’absence de moelle épinière organisée ne permet pas du tout les mêmes études surtout lorsqu’on s’intéresse, comme ici, à des neurones hyperspécialisés et à leur rôle chez le mammifère qui est vraisemblablement extrêmement différent de celui qu’ils ont chez les invertébrés. Les tests comportementaux commenceront 60 jours après la naissance, bien avant l’apparition des premiers symptômes moteurs afin d’avoir une période contrôle avant la dégradation progressive des différents paramètres moteurs analysés
Etude des changements de l’immunité innée liés à l’âge dans le contexte des tumeurs pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injection de cellules tumorales au premier jour, puis deux fois par semaine une injection de marqueur et une imagerie du corps entier sous anesthésie, pendant quatre semaines au plus : 894 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs pulmonaires qui se développent peuvent occasionner une gêne respiratoire. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem, l'objet étant de comprendre comment des macrophages vieillissants favorisent le cancer du poumon chez les personnes âgées. Le calcul annoncé, vingt-quatre souris par condition et cinq génotypes comparés, laisse de côté les trente souris consacrées au seul choix de la lignée de cellules tumorales.
Objectifs
Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement fréquent chez les personnes âgées : 50 % des cas sont diagnostiqués chez des patients de plus de 70 ans. Nous souhaitons donc étudier le développement du cancer du poumon dans le contexte du vieillissement. Les macrophages sont un type de cellules du système immunitaire inné, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir rapidement et immédiatement à des menaces telles que l'invasion d'agents pathogènes. Il est également connu que les macrophages se trouvent souvent à proximité de tumeurs en développement. Récemment, des chercheurs ont découvert que dans le cancer du poumon, les macrophages sénescents s'accumulent et favorisent la croissance de la tumeur et la progression de la maladie. La sénescence est un état souvent observé dans les cellules des personnes et animaux âgées. Les cellules sénescentes cessent de se diviser, accumulent des dommages et changent de morphologie et de fonctionnalité. On ne sait toutefois pas comment ces macrophages "âgés" contribuent au développement des tumeurs pulmonaires. Pour répondre à cette question, nous utiliserons différents modèles génétiques de souris qui provoquent un vieillissement accéléré spécifiquement dans les macrophages pulmonaires, mais pas dans les autres cellules du tissu. Nous étudierons le développement de tumeurs chez ces souris et les caractéristiques différentielles des macrophages jeunes et vieux dans ce contexte. Globalement, ce projet vise à découvrir comment les changements liés à l'âge dans le système immunitaire inné contribuent au développement de tumeurs pulmonaires, ce qui ouvrira la voie à de futurs traitements anticancéreux potentiels adaptés aux personnes âgées.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon est responsable de la plupart des décès liés aux tumeurs dans le monde. L'âge élevé est l'un des principaux facteurs de risque de son développement et de sa progression, 50 % des cas étant diagnostiqués chez des patients âgés de plus de 70 ans. On sait que les macrophages pulmonaires sénescents, qui s'accumulent au cours du vieillissement de l'organisme, jouent un rôle pro-tumorigène dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules, le type de cancer du poumon le plus courant. Mais jusqu'à présent, on ne comprend pas comment ils contribuent au développement de la tumeur. Dans ce projet, nous visons à identifier les caractéristiques des macrophages sénescents qui favorisent la croissance des tumeurs pulmonaires. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les organismes âgés sont plus enclins à développer des tumeurs pulmonaires et quel rôle le système immunitaire inné joue dans ce processus. À long terme, ce projet permettra d'accroître nos connaissances sur la manière de prévenir la progression du cancer dans des conditions de vieillissement du système immunitaire et de développer des options de traitement immunothérapeutique spécifiquement adaptées aux personnes âgées. Étant donné que les macrophages sont des cellules résidentes dans tous les tissus et que le vieillissement est un facteur de risque pour de nombreuses maladies, nous nous attendons à ce que ce travail ait un large impact et soit pertinent au-delà du cancer du poumon.
Procédures
Chaque animal recevra une injection de cellules tumorales au début de l'expérience (durée du geste : environ 10 secondes). À partir du troisième jour après l'injection, la taille de la tumeur sera contrôlée deux fois par semaine, ce qui nécessite l'injection d'un produit de marquage (durée du geste : inf à 10 sec) et la réalisation d'une imagerie non invasive du corps entier sous anesthésie (durée de l’anesthésie :10 minutes). La durée maximale de l'expérience est de 4 semaines.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse de cellules tumorales et l'injection de produits de marquage pour l’imagerie peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d'injection. Les animaux auxquels on a injecté des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires qui pourront occasionner une gêne respiratoire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous nous intéressons à la réponse systémique du système immunitaire au développement de tumeurs pulmonaires. Cette réaction ne peut être étudiée que dans un organisme entier, avec une circulation lymphatique et sanguine intacte, une hématopoïèse active (formation de nouvelles cellules immunitaires par la moelle osseuse) et des poumons fonctionnels. l De nombreuses méthodes requises pour le projet proposé ainsi que des modèles génétiquement modifiés pour nos protéines d'intérêts ne sont disponibles et établis que chez la souris.. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis dans la littérature, ce qui fait de la souris un organisme modèle approprié. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des alternatives in vitro à l'expérimentation animale, telles que la co-culture de macrophages et de cellules tumorales. Nous disposons déjà de premiers résultats utilisant ce système in vitro (sphéroïdes, formés à partir de la co-culture de cellules tumorales et de macrophages), qui renforcent nos hypothèses. Cependant, ce système est trop simplifié pour comprendre pleinement les adaptations que les macrophages du poumon et d'autres composants du système immunitaire subissent in vivo en réponse au développement de tumeurs. En outre, nous prévoyons de remplacer la microscopie in vivo par des approches d'imagerie ex vivo, qui réduisent le nombre de procédures sur les animaux vivants, mais qui nécessitent toujours l'induction et la surveillance de tumeurs in vivo.L'expérimentation animale ne peut donc pas être entièrement remplacée par des alternatives in vitro.
Réduction
Nous avons déterminé, sur la base d'expériences déjà réalisées avec des tests statistiques, que nous avons besoin de 24 souris par condition expérimentale. Nous les répartirons en 3 groupes d'expériences indépendantes de 8 animaux chacune afin d'obtenir des résultats aussi robustes que possible. Nous étudierons 5 génotypes différents ainsi que des souris non modifiées génétiquement, y compris des contrôles correspondants pour chacune de ces conditions. Nous aurons besoin de 3 séries d'expériences pour l'analyse des tissus post-mortem. De plus, nous devons tester trois lignées différentes de cellules tumorales pour trouver celle qui donne le meilleur résultat expérimental. Cela nécessite 30 souris. Pour réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous employons un plan d'étude longitudinal basé sur l'imagerie par bioluminescence pour mesurer la croissance tumorale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Pour l'analyse post-mortem, le tissu pulmonaire sera réparti entre plusieurs méthodes d'analyse afin de permettre une utilisation optimale de chaque animal impliqué dans l'expérimentation animale.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. La lignée cellulaire tumorale qu’on utilisera permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence (mesure non invasive, faite deux fois par semaine, pendant maximum 4 semaines). Nous pèserons également les souris deux fois par semaine pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction d’une grille de score adaptée à notre projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.
Choix des espèces
Les souris sont le modèle de choix pour les expériences dans le domaine de l'immunologie des tumeurs. Cette recherche nécessite un contexte génétique bien défini et des modèles génétiquement modifiés, qui ne sont disponibles que chez cette espèce. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis. Tous ces éléments font de la souris le seul organisme modèle approprié pour notre projet. Des souris adultes seront utilisées pour toutes les expériences, ce qui est nécessaire pour étudier un système immunitaire mature. Comme nous étudions les effets du vieillissement sur le développement des tumeurs, nous utiliserons des souris dont l'âge se situe entre 8 semaines (jeunes adultes) et 24 mois (adultes âgés).
Travaux pratiques : « Formation à l’expérimentation animale niveau praticien chez le rat et la souris»
- Enseignement supérieur
Rats : 285
Déjà utilisés dans une précédente séance de travaux pratiques, 370 souris et 285 rats vont servir à deux séances supplémentaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent de l'eau par sonde gastrique et du sérum physiologique par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale, à raison de deux gestes par animal espacés d'une semaine. Aucune connaissance n'est produite ici, il s'agit de former des étudiants de deuxième année aux gestes techniques et de valider leur aptitude pratique. Une troisième réutilisation étant exclue, les 655 animaux sont tués à la fin des travaux pratiques.
Objectifs
Cette formation s'adresse aux étudiants de deuxième année après le baccalauréat, destinés à la profession de technicien ou assistant-ingénieur de laboratoire. Dans une structure de recherche publique ou privée, ils peuvent donc être amenés à travailler sur des animaux vivants. Par conséquent, ces étudiants doivent être formés aux techniques utilisées en expérimentation animale et obtenir un diplôme d’expérimentation animale de niveau praticien. Depuis plus de 25 ans, notre établissement propose une formation d’habilitation animale de niveau praticien, intégrée à la formation initiale. Ce projet a pour objectif de former ces étudiants aux techniques peu invasives et d’évaluer leurs aptitudes pratiques. Ces deux objectifs sont déjà intégrés dans l'autorisation à délivrer la formation à l'expérimentation animale niveau praticien en cours dans l'établissement.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de notre formation à l’expérimentation animale, il est nécessaire de former nos étudiants à des gestes techniques couramment utilisés dans les structures utilisant des animaux de laboratoires, mais également de renforcer leurs compétences en contention des animaux. En parallèle lors de cette formation nous inssistons particulièrement sur le respect des règles de bien-être animal lors du travail avec des animaux de laboratoire. Un personnel formé travaillera dans le respect de l’animal. Nous savons que les étudiants issus de notre formation sont capables d’intégrer un projet sur le rongeur et d’y être rapidement autonomes et efficaces (stage ou apprentissage dans la suite de leur formation, emploi en fin de formation…).
Procédures
Certains rats recevront une administration d'eau par voie orale (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie intrapéritonéale la semaine suivante (durée 0,5-1 min); les autres rats recevront une injection de sérum physiologique par voie intramusculaire dans chaque cuisse (0,5 min/injection) deux fois, à une semaine d'intervalle. Certaines souris recevront une injection de sérum physiologique par voie intraveineuse (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie sous cutanée (durée 0,5-1 min) la semaine suivante; les autres souris recevront une injection de sérum physiologique par voie sous cutanée (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie intrapéritonéale la semaine suivante (durée 0,5-1 min).
Impact sur les animaux
Seul du sérum physiologique ou seule de l'eau est administré aux animaux. Les contentions génèrent du stress chez l’animal et les injections provoquent une légère douleur lors de l’introduction de l’aiguille. L'insertion de la sonde dans la gorge de l'animal provoque un inconfort lors de l'administration par voie orale.
Devenir
Les animaux seront utilisés lors de deux séances de travaux pratiques (apprentissage et évaluation), mais ils auront préalablement déjà été utilisés dans une autre séance de travaux pratiques (TP) avec d'autres procédures. Ainsi il n'est pas possible de pouvoir réutiliser ces animaux dans une troisième procédure et les animaux seront mis à mort à la fin de ces travaux pratiques.
Remplacement
Notre établissement est détenteur d’une autorisation à délivrer une formation à l’expérimentation animale niveau praticien spécialité rongeurs et ce depuis plus de 25 ans. Dans ce cadre, il est nécessaire que nos étudiants soient familiarisés avec ces techniques d’administration de produits chez le rat et la souris. De plus, les compétences pratiques des étudiants sur ces espèces doivent obligatoirement être validées lors d’une épreuve pratique pour pouvoir attribuer cette autorisation. Ce projet, dont nous demandons ici le renouvellement, fait partie de l'autorisation à délivrer l'expérimentation animale délivrée par la Commission Nationale pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Il n’est donc pas possible dans ce cadre de remplacer l’utilisation d’animaux par des méthodes alternatives.
Réduction
Rats : Lors de la séance d'apprentissage, pour la voie intramusculaire (IM), un rat sera utilisé pour deux étudiants (une injection dans chaque cuisse) et chaque étudiant utilisera également un rat pour réaliser la voie orale (VO) lors de cette séance d’apprentissage. Quatre animaux supplémentaires seront prévus, dont deux serviront pour la démonstration des gestes techniques par l'enseignant. Les animaux seront réutilisés pour la séance d'évaluation : le rat ayant reçu la VO recevra une injection intrapéritonéale (IP) lors de l’évaluation pratique, l’IM sera réalisée sur le même rat dans les mêmes conditions. Ainsi, 35 rats seront nécessaires pour la VO et l'IP et 18 rats pour l'IM pour 35 étudiants, plus 4 animaux, soit 57 animaux pour 35 étudiants maximum par an et 285 rats pour 5 ans. Souris : deux souris par étudiant seront nécessaires pour la séance d'apprentissage, une pour la voie intraveineuse (IV) et une pour la voie sous-cutanée (SC). Les souris seront réutilisées pour la séance d'évaluation, la semaine suivante: celles ayant servi pour l’IV recevront une SC et les souris ayant reçu la SC recevront une IP. De plus, 2 souris surnuméraires seront prévues en cas de problème pour chaque procédure (animal malade ou stressé avant le TP par exemple), dont l'une servira pour la démonstration des gestes techniques par l'enseignant. Ainsi 74 souris seront nécessaires pour 35 étudiants maximum par an et 370 souris pour 5 ans. Ce chiffre sera bien évidemment indexé sur le nombre réel d'étudiants inscrits dans la formation. Nous souhaitons que tous ces animaux soient réutilisés depuis des protocoles de TP de pharmacologie ou de physiologie peu invasifs réalisés précédemment dans notre établissement, afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Afin de garantir une formation efficace de nos étudiants il n'est pas possible de diminuer plus le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (rat: tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois, noix à ronger; souris: tunnel/maison en plastique, morceaux de boîte à oeufs, lanières de papier kraft servant à la création de nids par les animaux) et en groupes socialement harmonieux dans des cages appropriées à l’espèce et en nombre adapté. Afin de limiter le stress des animaux lors des manipulations, les animaux seront habitués à la préhension/contention pendant la semaine précédant le début des TP. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché…). Préalablement aux séances, une observation clinique des animaux permettra d’exclure du TP tout animal stressé ou malade (poils hérissés, prostration …). Les TP seront réalisés avec de petits groupes d’étudiants. Les étudiants seront incités à ne pas faire trop de bruit pour ne pas effrayer les animaux. Un soin particulier sera apporté à la démonstration du respect des règles de bien être animal lors de chaque TP, afin que les étudiants soient parfaitement formés à l’éthique en expérimentation animale. Par ailleurs les plus gros rats (280 à 380 g) seront préférentiellement utilisés pour l’administration par voie IM, leur masse musculaire plus importante diminuant l’inconfort des animaux. Les animaux seront récompensés après chaque manipulation (pesée, contention, administration de produit). De plus, les souris auront été habituées par notre personnel à être prises en préhension dans le creux de la main et non par la queue afin de diminuer leur stress.
Choix des espèces
Notre établissement est habilité à délivrer une formation à l’expérimentation animale niveau praticien, spécialité rongeurs. En effet, les souris et les rats constituent les espèces les plus fréquemment ultilisées à des fins scientifiques en France et également en Europe, pays où nos étudiants peuvent poursuivre leur carrière professionnelle. Ainsi, les rats et les souris sont des modèles de choix pour ces travaux pratiques destinés à former aux techniques d’administration et de prélèvement les plus courantes chez les rongeurs. Rats : Les manipulations se feront sur des rats adultes (plus de 7 semaines) correspondant au stade d’utilisation classique de ces animaux pour ce type de formation. En général, le poids des rats variera de 200 à 380 g en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les plus gros rats (280 à 380 g) seront préférentiellement utilisés pour l’administration par voie IM, leur masse musculaire plus importante diminuant l’inconfort des animaux. De plus, cette pratique étant réalisée par 2 étudiants, la maîtrise de la seule contention par l’étudiant d’un rat d’environ 380 g est ainsi facilitée. Souris : les manipulations auront lieu sur des souris adultes, pesant entre 25 et 50 grammes. Ce poids correspond au poids des souris classiquement utilisées en expérimentation et permet une manipulation aisée pour les étudiants, diminuant ainsi le stress des animaux.
Etude du rôle des récepteurs CB1 dans la mémoire de peur pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq semaines avant le premier test, 57 % des animaux subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes destinée à permettre l'enregistrement de leur activité neuronale. 1 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de provoquer une mémoire de peur pathologique, analogue à celle des états de stress post-traumatique, puis de mesurer le rôle des récepteurs cannabinoïdes de type 1 dans son acquisition. Le porteur retient la souris parce que le modèle d'altération de la mémoire traumatique a été établi chez elle et que le matériel comportemental est dimensionné pour cette espèce.
Objectifs
Les états de stress post-traumatiques (EPST) ont une prévalence importante dans le monde et sont extrêmement invalidant pour les patients en souffrant. Une des caractéristiques majeures de ces troubles correspond à une altération qualitative de la mémoire associant (i) une hypermnésie émotionnelle, i.e. intrusion des souvenirs traumatiques dans un contexte ordinaire et sûr de la vie quotidienne, et (ii) une amnésie contextuelle, i.e. impossibilité du patient à précisément décrire le contexte péri-traumatique. De plus, les stratégies thérapeutiques pour ces troubles ne sont que très limitées avec un fort taux de rechute, cela étant en grande partie dû à une grande méconnaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacent. Le système endocannabinoïde, et plus particulièrement les récepteurs cannabinoïdes de type 1 , sont un des systèmes majeurs régulant les comportements de stress. L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication des récepteurs CB1 dans l’acquisition et l’expression de cette mémoire, ce qui pourrait permettre de proposer un potentiel mécanisme neurobiologique sous-tendant ces pathologies, ainsi qu’une éventuelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Par la caractérisation d’un mécanisme neurobiologique sous tendant la mémoire traumatique, ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1.
Procédures
Les animaux de ce projet seront tous soumis à un test de mémoire d'une durée comprise entre 2.5 et 6min par jour sur 4 jours, ainsi qu’à des injections (1 ou 2 selon le groupe expérimental, réalisées au jour 2 du test de mémoire). Parmi l’ensemble des animaux du projet, 57% subiront en plus au préalable (minimum 5 semaines avant le test comportemental) une intervention chirurgicale d’environ 30 à 45 minutes sous anesthésie avec pré, péri- et post médication permettant de minimiser le stress et la douleur qui permettra l’étude de l’activité neuronale.
Impact sur les animaux
Notre étude repose sur l’utilisation d’un test de mémoire associé à des injections permettant d’étudier le développement d’une forme de mémoire émotionnelle ce qui peut générer un stress temporaire chez l’animal. Aussi, l’étude de l’activité neuronales requiert une intervention chirurgicale préalable pouvant engendrer de la douleur et du stress, qui seront pris en charge par l’utilisation de médication avant, pendant et après l’acte chirurgical associées à un suivi méticuleux de la récupération post-opératoire. Ces nuisances entrainent une classe de sévérité « modérée ».
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue du protocole comportemental afin d’éviter tout stress/souffrance supplémentaire. Les animaux ayant subit une intervention chirurgicale seront mis à mort à l’issue de la procédure comportementales afin de s’assurer de la réussite de la chirurgie et d’étudier l’activité du cerveau.
Remplacement
L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par (i) l’absence de modèle in vitro permettant l’étude des processus de mémorisation et (ii) la nécessité de manipuler l’expression et/ou l’activité des récepteurs CB1 lors de ces processus. L’organisation du système nerveux des souris est suffisamment proche de l’espèce humaine pour pouvoir raisonnablement extrapoler les observations faites sur ces animaux.
Réduction
Le nombre de souris se justifie de par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux pour permettre des analyses statistiques concluantes. Un nombre inférieur pourrait impliquer une réplication de l’expérience ce qui induit l’utilisation d’un nombre encore plus important d’animaux.
Raffinement
Toutes les souris du projet seront hébergées dans une animalerie agréée disposant d’une régulation de température, d’hygrométrie et du cycle jour/nuit (12h/12h). Les animaux seront tous hébergés collectivement avec du matériel de nidification adapté au nombre d’animaux, ainsi que de l’eau de boisson et de la nourriture ad libitum. Les cages seront changées une fois par semaine tout en maintenant le plus possible le matériel de nidification lors du changement afin de conserver l’empreinte olfactive et ainsi diminuer le stress. Toutes les souris seront quotidiennement observées permettant ainsi de détecter précocement tout changement. Si besoin, l’animal sera soigné et/ou surveillé, avec consultation du vétérinaire. Pour les animaux subissant une intervention chirurgicale, le stress et la douleur potentielle seront pris en charge par la mise en place de pré-, péri- et post-médication adaptée associées à un suivi méticuleux de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce animale est la souris adulte. Cela se justifie par sa proximité phylogénétique avec l’Homme et la présence de comportement similaires notamment concernant les processus de mémoire, d’intérêt pour le présent projet. En effet, la plupart des études sur les mécanismes de la mémoire émotionnelle ont été obtenu chez cette espèce. De plus l’utilisation de souris permet l’étude au niveau (sub)cellulaire via des techniques histologiques. Enfin le modèle central à ce projet, i.e. l’altération qualitative de la mémoire de type EPST, a été établi chez la souris. Aussi, l’ensemble du matériel comportemental utilisé est dimensionné pour cette espèce. Les souris utilisées seront toutes à l’âge adultes (8-16 semaines) le modèle ayant été validé à ces âges. De plus, l’expression et la distribution des récepteurs CB1 varie au cours du développement ce qui pourrait altérer les conclusions du présent projet.
Role de l’oxygène dans le processus de pathogénicité de Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage unique de Clostridioides difficile et une à deux injections intrapéritonéales, puis leurs selles sont recueillies chaque jour. Le porteur décrit des diarrhées de deux à trois jours et une perte de poids de 5 à 15 %, avec un retour au poids initial généralement observé trois jours après l'infection. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider in vivo ce que des tests in vitro ont déjà montré sur l'effet de l'oxygène sur la croissance de cette bactérie.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas des infections associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Il est donc urgent de mieux comprendre les différentes étapes de développement de la bactérie dans le tube digestif. Ces dommages intestinaux causés par C. difficile peuvent varier en fonction du niveau d'oxygène disponible dans le tube digestif. Dans ce projet, notre but est d’étudier l’influence de l’oxygène sur C. difficile et les troubles intestinaux induits par cette bactérie pathogène.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de pathogénicité de cette bactérie permettrait de développer et de proposer des stratégies thérapeutiques plus adaptées aux patients et limiter le risque de récidives et de dissémination de bactéries dans l'environnement.
Procédures
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile (un gavage unique durant la procédure qui dure moins de 10 secondespar animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum) ce recueil dure moins d'une minute, sur la durée de l'essai.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile et 1 ou 2 injections intrapéritonéales (une automatique d’antibiotique et éventuellement une autre 2h avant l'euthanasie des souris prévue à J-7, J0 et J2). Cette 2ème injection intra-péritonéale est dépendante du kit commercial qui sera utilisé pour l'analyse des coupes histologiques. Dans la mesure du possible, nous privilégierons le protocole ne nécessitant pas cette injection. Les nuisances induites par ces injections sont qualifiées de légères. Suite à l’infection, le modèle peut induit des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui vairent entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection.
Devenir
Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro ont permis d'évaluer l'impact de l'oxygène sur la croissance de C. difficile. L'étape de vérification de ces résultats obtenus in vitro par un modèle in vivo est indispensable afin de tenir compte de l'environnement complexe du tube digestif et notamment le microbiote impliqué dans le taux d'oxygène présent. Le recours à l'animal est indispensable pour valider les résultats obtenus in vitro. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre maximun d'animaux utilisés au nombre de 384 , tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites définis éthiquement non acceptables.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Evaluation thérapeutique de virus oncolytiques seuls ou en combinaison avec une thérapie antitumorale dans des modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules tumorales, injectées jusqu'à trois fois d'un virus puis traitées cinq jours par semaine pendant trois semaines par une substance antitumorale, 7 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 848 d'entre elles et sévère pour 4 160. Le porteur décrit des ulcérations ou nécroses des tumeurs sur le flanc, des métastases pulmonaires entraînant des difficultés respiratoires et de l'ascite liée aux nodules abdominaux. Il s'agit d'évaluer des virus oncolytiques, seuls ou combinés à d'autres traitements, dans des modèles de greffe tumorale. Il affirme pourtant que seuls les virus ne risquant pas d'induire une souffrance seront testés, et prévoit de réutiliser jusqu'à 200 souris pour la formation de ses techniciens, les autres étant tuées.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.
Bénéfices attendus
Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.
Devenir
Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.
Réduction
La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux).
Raffinement
Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. Les injections se feront sur animal vigile ou sous anesthésie et l'imagerie sur animal anesthésié. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.
Choix des espèces
Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).
Maintien d’une lignée murine exprimant dans les neurones inhibiteurs une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de l'oreille de dix secondes, une seule fois dans la vie de l'animal : c'est le seul acte technique infligé aux souris de ce projet. 470 souris vont pourtant être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère, et toutes seront tuées pour prélèvements. La souffrance tient à la lignée elle-même, maintenue par accouplements pour reproduire une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique. Un quart des souriceaux naissent avec un poids et une taille réduits et une force musculaire diminuée aux quatre membres, et la moitié d'entre eux meurent trois semaines après la naissance. Le porteur indique que ces symptômes ne sont pas encore complètement caractérisés et annonce des raffinements à évaluer au fur et à mesure, dont le nourrissage des souriceaux à la main.
Objectifs
Le gène qui nous intéresse est impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale. Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones, acteurs primordiaux des fonctions exercés par notre cerveau. Il existe une lignée de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation du gène d’intérêt. Ces souris, comme les humains, présentent des défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont des cellules dont le rôle est de réduire (inhiber) l’activité des neurones environnants. Ils sont importants car ils contrôlent l’activité électrique du cerveau en l’empêchant d’être trop élevée. Actuellement, l'implication des neurones inhibiteurs dans le développement de ces maladies est trop peu comprise. Pour y remédier nous étudierons une lignée de souris dans laquelle le gène est muté spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Dans cette lignée, un quart des souris adultes présente des symptômes ressemblant à ceux observés chez les personnes atteintes de démence frontotemporale. En revanche, un quart des souriceaux a des symptômes qui ressemblent à ceux observés chez les personnes atteintes de sclérose latérale amyotrophique. Avec ce projet nous souhaitons maintenir cette lignée, c’est-à-dire réaliser des accouplements et nous occuper des petits qui naissent. Cela nous permettra de mieux caractériser et prendre en charge les symptômes des souriceaux. C’est particulièrement important puisqu’il n’existe toujours pas de traitement efficace contre la sclérose latérale amyotrophique. Cela est dû, notamment, à un manque de compréhension des mécanismes pathologiques. Ainsi, maintenir une lignée dont les souris présentent des symptômes similaires à ceux des humains nous permettra d’étudier les mécanismes impliqués.
Bénéfices attendus
Nous voulons tirer profit de ce projet pour mieux comprendre, caractériser et prendre en charge les symptômes des souriceaux. A court terme, maintenir la lignée permettra d’étudier les mécanismes impliqués dans l’apparition des symptômes, qui ressemblent à ceux observés chez les personnes atteintes de sclérose latérale amyotrophique. A long terme, l’étude de ces souris permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la pathologie et pourrait permettre d’identifier des pistes thérapeutiques chez l’humain.
Procédures
Un prélèvement de tissus (petit bout d’oreille pour le génotypage) sera réalisé sur animal vigile une seule fois dans la vie de l'animal et durant très peu de temps (10 secondes).
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement du bout d’oreille pour le génotypage, une légère et brève douleur pourra être ressentie par l’animal. Par ailleurs, dans cette lignée de souris, un quart des souriceaux présente un phénotype dommageable. Ils ont un poids et une taille inférieurs à ceux des souriceaux contrôles (c’est-à-dire n’ayant pas de phénotype dommageable). Ils ont également une force musculaire réduite au niveau de leurs quatre membres. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont de courtes et transitoires baisses d’activité. Enfin, la moitié de ces souriceaux mutés décèdent trois semaines après la naissance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Avec ce projet nous souhaitons maintenir une lignée de souris dont une partie des animaux présentent des symptômes suite à la mutation d’un gène d’intérêt dans les neurones inhibiteurs. Cela nous permettra d’étudier l’implication de la protéine mutée et des neurones inhibiteurs dans le développement post-natal et, plus précisément, d’étudier les conséquences moléculaires, cellulaires et comportementales de la mutation d’intérêt. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduiraient pas la complexité comportementale nécessaire pour étudier, notamment, la croissance et la prise de poids. La modélisation informatique nécessiterait des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à nos questions scientifiques. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est alors nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait étudier des stades très précoces où les patients ne sont pas encore diagnostiqués tout en s’assurant que le gène est muté uniquement dans les neurones inhibiteurs (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem). Finalement, aucune alternative ne permettrait de répondre aux questions posées dans ce projet. C’est pourquoi un modèle animal est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité structurelle du système nerveux et la complexité comportementale.
Réduction
Tous les animaux ayant un phénotype dommageable et naissant dans le cadre de ce maintien de lignée seront inclus dans des groupes expérimentaux et seront comparés à des souris contrôles (c’est-à-dire n’ayant pas de phénotype dommageable). Nous veillerons alors à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution de ces groupes tout en produisant des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Nous aurons 470 animaux inclus dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à l’expertise développée dans notre laboratoire, et en fonction des besoins techniques. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d’animaux par cage, la température ambiante et les cycles de lumière. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et de bâtonnets à ronger. Sur conseils vétérinaires, nous ne mettrons pas de maison en carton afin de pouvoir suivre les animaux sans forcément avoir besoin d’ouvrir la cage. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentatrices. Plus précisément, nous ferons attention au poids, à l'apparence physique (état de la peau et de la fourrure, position du dos) et aux éventuels changements de comportement (mobilité, sociabilité, motricité, respiration, prise alimentaire). Des points limites ont été établis afin de soustraite les animaux à la souffrance. Par ailleurs, nous mettrons en place des raffinements au niveau de la prise alimentaire, dont nous évaluerons l’efficacité et la pertinence au fur et à mesure du maintien de la lignée. Cela pourra inclure, mais ne se limite pas à, l’ajout d’aliments solides et humides placés directement sur le sol des cages, le nourrissage des souriceaux à la main pour s’assurer de la quantité ingérée.
Choix des espèces
Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1/ Ce maintien de lignée permettra l’étude d’un modèle génétique de maladies neurodégénératives, ce qui nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’un gène d’intérêt uniquement dans les neurones inhibiteurs). Or la séquence de ce gène est bien conversée entre les humains et rongeurs. 2/ Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. 3/ Les rongeurs présentent à la fois une complexité structurelle du système nerveux et une complexité comportementale ce qui nous permettra de comparer nos résultats à ce qui est observé chez les humains. L’étude commencera à partir du jour de la naissance de l’animal jusqu’à l’âge adulte.
Rôle de la mort cellulaire programmée dans le développement des circuits corticaux normaux et pathologiques du cerveau de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les animaux utilisés sont pour partie des embryons encore dans l'utérus, des souriceaux de cinq à dix jours et des femelles gestantes. 2 952 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 820 d'entre elles et modéré pour 132. Les femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau des embryons et de leur appliquer un courant électrique d'une seconde. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et analyses génétiques, y compris les mères, et le bénéfice avancé se limite à mieux connaître une population de neurones qui disparaît normalement au cours du développement.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement du cerveau. Nous voulons également explorer les conséquences de la survie anormale de ces cellules sur la formation du cerveau.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la génération et la mort de nos neurones d’intérêt et quel est leur rôle dans le développement du cerveau.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes et l'application d'un courant électrique de 1 seconde. Des animaux subiront une chirurgie terminale sans réveil.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur légère. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance qui est minorée ou évitée par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Pour le maintient des lignées génétiquement modifiées, nous nous limiterons à la production des animaux nécéssaires en limitant les accouplements au maximum. Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une administration d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un cerveau organisé en 6 couches inversées. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire où interviennent les phénomènes étudiés.
Procédures terminales dans le cadre d’études caractérisant les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les maladies métaboliques et cardio-vasculaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
10 325 souris vont être utilisées, chacune pour un prélèvement de sang de dix à trente secondes ou une chirurgie de quinze minutes sans réveil. 1 460 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 8 865 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger, et toutes finissent tuées pour prélèvement d'organes. Ce projet ne produit aucune donnée propre, il déclare des mises à mort transférées depuis un autre établissement, celui-ci disposant des équipements d'analyse des tissus. Les bénéfices annoncés, de nouvelles perspectives de diagnostic et de traitement du diabète, de l'obésité et des troubles cardio-vasculaires, appartiennent aux projets d'origine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de décrire les procédures génériques terminales ayant lieu dans cet Etablissement Utilisateur (EU), afin de transférer la mise à mort des projets déjà déclarés dans l’EU d'origine dans le présent EU. Ce dernier bénéficie de divers équipements indispensables à l’analyse des tissus prélevés et la sécurité des utilisateurs face aux risques chimiques. Les analyses de sang, tissus et cellules issus des prélèvements terminaux répondent aux problématiques décrites dans les différentes saisines. Ces problématiques visent, de façon imbriquée ou non, à étudier le rôle du système lymphatique, vasculaire, hépatique et du tissu adipeux dans les pathologies métaboliques.
Bénéfices attendus
Les procédures terminales définies dans ce projet vont permettre, à l’échelle des tissus adipeux, lymphatique, vasculaire et hépatique, la caractérisation des mécanismes physiopathologiques à l’origine de maladies métaboliques et cardiovasculaires telles que diabète, obésité, hépatopathies métaboliques, troubles cardio-vasculaires… Ces pathologies ont une prévalence élevée dans la population mondiale et ces travaux permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives médicales en terme de diagnostic et traitement.
Procédures
Un prélèvement de sang unique peut être réalisé avant la mise à mort des animaux (10 à 30 secondes), sur animal vigile ou anesthésié. Ils peuvent également subir une chirurgie sans réveil d’une durée de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins sur animaux vigiles peuvent provoquer un léger stress et de l’inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
La stratégie de remplacement est décrite dans chaque saisine rattachée à ce projet générique. Certains projets utilisent des analyses bioinformatiques pour remplacer l’utilisation des animaux. Des études in vitro sur lignées cellulaires sont également réalisées pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués et limiter l’utilisation des animaux. Cependant, ces approches ne suffisent pas à reproduire la complexité des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires des contextes physiologiques ou physiopathologiques étudiés, nécessitant l’utilisation d’animaux comme modèle intégré. Malgré les efforts pour promouvoir la substitution, la souris demeure un modèle essentiel en raison de sa physiologie proche de celle de l'Homme et de sa similitude génétique, permettant la reproduction moléculaire et phénotypique de nombreuses pathologies humaines.
Réduction
Les méthodes de réduction propres à ces projets sont décrites dans ceux-ci. De manière générale, des tests biostatistiques sont réalisés en amont pour limiter le nombre d’animaux en déterminant le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes. Pour ce faire ainsi que pour l’analyse des résultats, des tests statistiques sont utilisés. L’utilisation d’un même animal comme étant son propre contrôle est également un facteur de réduction fréquemment utilisé dans ces projets. Lors des mises à mort des animaux, les tissus n’étant pas d’intérêt peuvent aussi être récoltés pour les banques de données ou utilisation ultérieure.
Raffinement
Les animaux, gardés dans leur cage d’origine, sont transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Une période d’acclimation propre à chaque projet est définie en accord avec la SBEA (Structure du Bien-Etre Animal). Les animaux en attente/acclimatation sont dans une pièce attenante à la pièce d’expérimentation, contrôlée en lumière et température. Pour les prélèvements sanguins, les animaux peuvent être anesthésiés afin de réduire leur stress, et reçoivent un anesthésique local en cas de besoin. Pour les prélèvements sur animal vigile, les animaux sont laissés au maximum libres de leurs mouvements afin de minimiser le stress. La chirurgie est réalisée sur tapis chauffant, sous protocole anesthésique et analgésique optimisé afin d’éviter toute sensation de douleur jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les personnels sont parfaitement formés aux techniques de prélèvement (tissu et sang) et de perfusion qui, procédurées avec du matériel de chirurgie entretenu et désinfecté, permettent de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. Bien que toutes les procédures soient terminales, toutes les précautions sont prises pour que l’animal ait une bonne couverture analgésique afin de ne subir aucune douleur au cours des procédures.
Choix des espèces
Avec une homologie génique dépassant 90% entre l'Homme et la souris, la plupart des gènes humains ont leurs homologues chez la souris, et les voies métaboliques sont largement conservées entre ces deux espèces. La souris représente ainsi un modèle expérimental particulièrement intéressant en tant qu'animal génétiquement modifié. De nombreux modèles murins, qu'ils soient porteurs ou non de mutations sur des gènes qui nous intéressent, offrent la possibilité d'étudier la physiopathologie de diverses maladies. Dans la littérature et/ou les études publiées par les différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques). Ce modèle intégré permet de rendre compte de la complexité des voies impliquées dans la physiologie et la physiopathologie, avec une transposabilité à l'Homme. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour les équipes de recherche. Les animaux sont utilisés pour les procédures terminales dès l’âge de 7 semaines, jusqu’à 24 mois (études de vieillissement).
Etude de l’implication des protéases à serine du microbiote intestinal dans l’induction et la progression des maladies inflammatoires digestives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 240. Elles sont gavées chaque jour pendant quatorze jours, et une colite leur est provoquée chimiquement sans aucun anti-inflammatoire, l'inflammation étant l'objet même de l'étude. Il s'agit de vérifier si neuf enzymes du microbiote intestinal aggravent les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, hypothèse déjà testée in vitro sur les selles de patients. Le porteur conclut que le recours aux animaux non-humains est "indispensable", une approche in vitro excluant selon lui les interactions survenant chez l'hôte.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) constituent l’un des désordres les plus courants du tube digestif et représentent un véritable problème de santé publique. Leur incidence est en augmentation dans le monde entier. Ces maladies provoquent une inflammation continue du système digestif, associée à des douleurs abdominales récurrentes, fatigue, diarrhée et altèrent la qualité de vie des patients. Bien que les traitements actuels réduisent les symptômes de la maladie, aucun d’entre eux n’est curatif et tous présentent plusieurs limites liées à des problèmes d’intolérance, de perte de réponse et des effets secondaires souvent graves. D’autres voies thérapeutiques font donc l’objet de recherches. Plusieurs études ont démontré que l'activité des protéases à sérine augmente chez les patients et qu’elle participe à la dégradation de la paroi intestinale et au maintien de l'inflammation. Notre équipe a récemment démontré qu’en plus de l’hôte, le microbiote intestinal représente un véritable réservoir de protéases à sérine qui pourraient également contribuer à l’apparition de la maladie. Dans le cadre de ce projet, notre intérêt s'est porté sur le rôle des enzymes venant du microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. L’analyse in silico du métagénome intestinal (génome du microbiote intestinal) a montré qu’il contient des gènes codant pour des protéases à serine, et que ces gènes sont sur-représentés dans le métagénome intestinal de patients souffrant de MICI. Les protéases bactériennes dont les gènes sont plus abondants chez les patients ont déjà fait l'objet d’analyse in vitro. Les résultats obtenus ont révélé que l’activité protéolytique de neuf protéases est détectable dans les fèces des patients et que ces activités augmentent significativement en cas d’inflammation digestive. Ces observations suggèrent que les protéases à sérine bactériennes auraient un effet pro-inflammatoire jusqu’à maintenant inexploré. Le but de ce projet est de valider, chez un modèle de souris le potentiel effet de neuf nouvelles protéases à sérine codées par le microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. En fonction des résultats i) les mécanismes d’action de ces protéases dans la pathogénie seront proposés et ii) de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les protéases à serine bactérienne pourraient être adoptées pour traiter les MICI.
Bénéfices attendus
La compréhension du rôle des protéases à serine codées par le microbiote intestinal dans l’inflammation et leur mécanisme d’action pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces protéases.
Procédures
- Gavage des animaux vigiles (300 souris) tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14). Les souris seront gavées le J14 matin après une mise à jeun de 4 heures. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Prélèvements fécaux (2 ou 3 fèces) pour les 300 souris tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14) . Les fèces seront émis naturellement à l’occasion de la pesée des animaux et de l’examen clinique. La durée du geste pour est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Mise à jeun des 300 souris à J14 matin pendant 4 heures, Un prélèvement de sang sur les souris vigiles sera effectué à J14. La durée du geste pour la prise de sang est minimisée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris) afin de limiter au maximum le stress de l’animal. Un prélèvement de sang sera effectué à la fin de la procédure. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Comme une colite expérimentale sera induite, de la douleur est attendue. Aucun anti-inflammatoire n'est prévu, puisque l'inflammation sera l'objet de l'étude. Cependant, l’administration de DSS sera limitée à 7 jours.La souffrance et le stress liée à la manipulation sera (essentiellement lors du gavage (fausse route) et de la prise de sang (douleur), et de la pesée (léger stress).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes.
Remplacement
Préalablement aux essais sur les animaux, nos tests in vitro ont démontré que l’activité des protéases à serine codées par le microbiote intestinal augmente chez les sujets malades comparativement aux sujets sains. De plus, les analyses métagénomiques suggèrent que le déséquilibre de ces activités protéolytiques est associé à l’état de dysbiose observé chez les patients souffrant de MICI. Sur la base des tests préliminaires in vitro, nous avons sélectionné les neuf protéases les plus abondantes et les plus actives chez les patients atteints de MICI comparativement aux sujets sains. L’ensemble de ces tests préliminaires suggèrent que les protéases à sérine codées par le microbiote intestinale semblent avoir un effet pro-inflammatoire qui reste jusqu’à maintenant inexploré. Les mécanismes impliqués dans le développement des MICI mettent en jeu des interactions complexes entre l’hôte et le microbiote, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. Le recours aux animaux est alors indispensable.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été défini en se basant sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin d’incorporer un nombre minimum d’animaux tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques significatifs.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 5 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée d'administration du produit chimique qui induit l’inflammation sera courte (7 jours) afin de révéler l’effet de la protéase sur l’inflammation tout en limitant au strict nécessaire le développement des lésions. Au cours de l’étude, les souris seront examinées individuellement de façon quotidienne ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’inflammation trop invalidante. Un léger stress est anticipé suite à la pesée des animaux. De plus, des points limites seront définis et un examen clinique individuel quotidien sera réalisé. Cela permettrait d'intervenir de façon appropriée si un problème survenait et de décider l’euthanasie des souris atteignant les points limites définis.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour étudier la physiologie intestinale ainsi que ses maladies. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place). La colite expérimentale provoquée par le produit chimique utilisé dans ce projet chez la souris est un modèle reconnu des maladies inflammatoires chroniques intestinales humaines. Il reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de l’inflammation intestinale développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’impact des enzymes produites par le microbiote intestinal dans le contexte de MICI. Au commencement de l’expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-7 semaines), ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’être humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies inflammatoires de l'intestin.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Prélever un fragment d'oreille, un bout de queue ou du sang pour lire le patrimoine génétique de chaque animal : la finalité de ce projet est l'intendance d'un élevage de lignées transgéniques. 88 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les prélèvements se font sur animal vigile, à l'emporte-pièce métallique pour l'oreille, en moins de trente secondes. Une partie des souris est tuée pour analyses post-mortem ou parce que son génotype ne présente pas d'intérêt, les autres restent en vie pour d'autres expériences ou comme géniteurs, et le porteur qualifie ces lignées de modèles "indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage .
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.