Rongeurs
Etude de l’atteinte des circuits moteurs et cognitifs dans la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour distinguer ce que la perte de dopamine abîme dans la motricité et ce qu'elle abîme dans la prise de décision, 860 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie intracérébrale d'une heure trente, puis des tests quotidiens de 45 minutes pendant 21 jours, répétés trois fois à quatre semaines d'intervalle, avec une restriction alimentaire à 15 ou 16 grammes de croquettes par jour sur toute la durée du test. 172 rats sont opérés une dernière fois sous anesthésie sans réveil, pour prélever leur cerveau. Le RNT annonce 200 rats rendus à l'élevage dans son champ chiffré et 20 animaux replacés vers d'autres projets dans sa narration, sans expliquer l'écart.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie qui affecte le système nerveux, entraînant la perte de cellules responsables de la production de dopamine, une substance chimique essentielle pour contrôler les mouvements et certaines fonctions cognitives. Des recherches précédentes sur des rats ont montré que la perte de ces cellules peut nuire à leur capacité à s'adapter à des changements, appelée flexibilité comportementale, ce qui affecte à la fois leurs mouvements et leurs décisions. Ce projet vise à explorer comment la maladie de Parkinson impacte différents circuits neuronaux dans le cerveau, en se concentrant sur deux fonctions principales : la motricité (comment nous bougeons) et les fonctions exécutives (comment nous prenons des décisions). Plus précisément, ce projet cherche à déterminer si la perte de dopamine, selon la flexibilité comportementale initiale des animaux, entraîne des problèmes dans ces deux domaines.
Bénéfices attendus
En comprenant mieux les déficits cognitifs et moteurs, des interventions plus efficaces pourraient être mises en place, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. Ces expériences devraient aider à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la maladie de Parkinson et comment ces mécanismes se traduisent par des difficultés à la fois dans les mouvements et la prise de décision. Ce projet pourrait non seulement enrichir notre connaissance de la maladie, mais aussi avoir sur le long terme des retombées concrètes sur la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux vigiles réaliseront 2 tests comportementaux : 1 test d'une durée de 3 minutes tous les jours pendant 3 jours et 1 autre test d'une durée de 45 minutes tous les jours pendant 21 jours avec 3 répétitions espacées de 4 semaines. Tous les animaux, anesthésiés et sous couverture antalgique, auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure et 30 minutes. En amont et après la chirurgie, tous les animaux vigiles recevront au total 2 injections sous cutanée d'antalgique (durée de l'intervention : 15 secondes). 172 animaux anesthésiés avec antalgie auront 1 chirurgie sans réveil pour le prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test 2 et à la légère contention au cours du test 1. La chirurgie peut induire un léger stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical qui sont minimisés par une couverture antalgique. L’induction de la maladie va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. Inconfort transitoire de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire (15-16g de croquettes/ animaux/jour) durant 21 jours lors de la phase du test 2 peut induire un léger stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse 20 animaux seront replacés pour être utilisés dans d’autres projets. La décision est prise par le porteur de projet.
Remplacement
Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48h de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour la modélisation de la maladie de Parkinson. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme et permettant d’obtenir des groupes présentant des flexibilités comportementales différentes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (11 semaines au moment de la chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés
Manipulation de cellules immunitaires pour améliorer la réponse antitumorale et les immunothérapies par inhibiteurs de points de contrôle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 524 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc, puis viennent des injections dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant trois semaines, et pour un groupe une irradiation de sept minutes trente sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur écrit que les traitements ne provoquent pas d'effets indésirables, et indique par ailleurs que l'irradiation entraîne diarrhée et perte de poids pendant plusieurs semaines et qu'une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Aucun antalgique n'est prévu pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur s'appuyant sur des recommandations internationales en cancérologie expérimentale pour leur substituer un suivi rapproché et des points limites précoces.
Objectifs
Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.
Devenir
Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.
Caractérisations de nouvelles molécules pour le traitement des troubles de l’usage des opiacés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rendues dépendantes aux opiacés par auto-administration puis observées en sevrage, 2 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Avant cela, chacune subit une biopsie de l'oreille sur animal vigile pour identification, une chirurgie d'une heure sous anesthésie, et jusqu'à quarante tests comportementaux de six minutes à une heure. Le porteur indique que les symptômes d'addiction et de sevrage entraînent une douleur qu'il qualifie de modérée, et que les souriceaux séparés de leur mère subissent un stress. Le traitement espéré en est au stade de la recherche de molécule, quand la dépendance, elle, est provoquée chez chacune des 2 120 souris.
Objectifs
Ce projet vise à tester des nouvelles molécules ciblant un récepteur spécifique dans le cerveau, GPR88, dans des modèles animaux de dépendance aux opioïdes. GPR88 est un récepteur dit orphelin, c'est à dire qui n'a pas de ligand endogène connu. Récemment, nous avons développé un modèle d'auto administration pour évaluer les effets de ces molécules sur les comportements liés à la dépendance aux drogues d’abus. Ainsi, nous souhaitons trouver une nouvelle molécule ciblant GPR88 pour diminuer les troubles liés à l'usage des drogues d’abus.
Bénéfices attendus
À l'issue de ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle de GPR88 dans les comportements de type addictif. Nous souhaitons identifier une molécule capable de réduire de manière significative les comportements addictifs. Les molécules ciblant GPR88 peuvent être bénéfiques pour plusieurs drogues d'abus telles que les opiacés, cocaïne, l'alcool et la nicotine. Ce programme de recherche permettera de découvrir un nouvel agent thérapeutique pour le traitement des troubles de l'usage de drogue d’abus.
Procédures
Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre l’identification des animaux transgéniques (30 secondes). Une chirurgie unique sur animaux anesthésiés, d’une durée de 1 heure maximum chacune. De un à 40 tests comportementaux de 6 minutes à une heures (avec un minimum de 24 heures entre chqaue test). Une injection sur animal vigile de molécules qui dure 30 secondes.
Impact sur les animaux
-Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, et une douleur légère due à la biopsie. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. -Chirurgie : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. -Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Une inflammation due aux injections répétées est possible.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de verifier l'emplacement des implants quand cela est nécéssaire et pour faire des analyses moléculaire sur les cerveaux.
Remplacement
"Remplacement" Ce projet consiste à valider et caractériser des agonistes de GPR88 dans le cadre de troubles de l'usage des opiacés. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées et réseaux neuronaux). L'addiction affectant en particulier les réseaux neuronaux, il est malheureusement jusqu'à présent impossible de modéliser l'addiction avec des modèles cellulaires et in silico.
Réduction
"Réduction" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 12 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.
Raffinement
"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome . De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre, agées de 8 semaines, permettront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.
Gestion de la production de lignées de souris transgéniques immunodéficientes à des fins de recherche sur le système immunitaire dans la lutte contre le cancer
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
490 souris seront tuées parce qu'elles n'exprimeront pas les caractéristiques recherchées, dix autres parce qu'elles auront développé des abcès. Sur les 1 125 souris que cet élevage fera naître en cinq ans, 500 seront ainsi mises à mort et 625 gardées en vie, 160 comme reproductrices, 330 pour la gestion des lignées et 135 pour des expériences. Chaque animal subit un unique prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse à l'âge de deux mois pour vérifier son génotype, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur dimensionne cette production à partir d'un historique d'élevage, pour des lignées de souris immunodéficientes destinées à des travaux sur les lymphocytes T dans les tumeurs.
Objectifs
Dans le cadre des approches développées par notre équipe pour comprendre la biologie des lymphocytes T et identifier des facteurs qui bloquent l'activité des cellules T dans un environnement immunosuppresseur in vivo, nous utilisons un ensemble de 3 lignées de souris génétiquement modifiées dont certaines trangéniques pour le récepteur T c'est à dire capable de reconnaître un antigène et un seul. La biologie des lymphocytes T est très étudiée dans la lutte contre le cancer mais trouve bien d'autres applications.
Bénéfices attendus
Les outils de la génomique permettent aujourd'hui de caractériser les gènes améliorant la persistance des cellules T dans des environnements tumoraux et de là, identifier les facteurs qui bloquent l'activité des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. La connaissance des résultats provenant des projets utilisant les modèles animaux objets de cette DAP permettra de mieux comprendre la biologie des cellules T et de développer de nouveaux outils à visée thérapeutique dans la lutte contre le cancer.
Procédures
Les animaux subiront un seul prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse. Cette intervention ne dure que 3-4 minutes maximum par animal.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de sang pratiqué sous anesthésie pour l'identification phénotypique des animaux peut provoquer une douleur légère au réveil et le cas échéant un hématome qui ne dureront pas. Concernant le phénotype immunodéficient des animaux, ceux-ci jouissent d'un environnement exempt de pathogène qui fait que le phénotype délétaire ne s'exprime pas ou très peu. En effet, nos études ont montré que moins de 2% des animaux immunodéficients pouvaient développer des abcès à Staphylocoque doré ; un agent bactérien que nous savons à portage humain au sein de nos installations.
Devenir
Sur les 1125 animaux à produire durant toute la durée du projet (5 ans) et à partir des données historiques cumulées, on peut estimer que : 490 animaux n'exprimeront pas un phénotype avec les caractères d'intérêt et seront donc mis à mort, 135 animaux seront utilisés pour les projets scientifiques expérimentaux, 10 animaux seront suceptibles de développer des abcès et seront mis à mort pour cette raison, 160 animaux seront utilisés comme reproducteurs et mis en accouplement, 330 animaux seront conservés pour la gestion des lignées. Au final, 500 animaux seront mis à mort et 625 seront gardés en vie.
Remplacement
Les projets scientifiques qui peuvent être réalisés avec ces élevages s'inscrivent trypiquement dans des études de réponse immunitaire nécessitant un animal entier et immunodéprimé tels que les modèles animaux objets de cette demande. Ceci n'enlève rien au fait que des études in vitro et in silico sont réalisées préalablement aux études vivo dans le cadre de l'évaluation de molécules candidates d'intérêt bio- ou immunothérapeutiques dans la lutte contre le cancer.
Réduction
Afin d'adapter la production aux besoins expérimentaux des projets scientifiques qui pourront être réalisés avec ces élevages de manière à obtenir le juste nécessaire d'animaux d'étude, le nombre d'accouplements nécessaires et les besoins en reproducteurs ont été dimensionnés à partir d'un historique de données d'élevage cumulé depuis plusieurs années. Ces données sont recueillies chaque année par les états membres dans le cadre d'enquêtes statistiques européennes.
Raffinement
Le prélèvement de sang effectué pour permettre l'identification phénotypique des animaux est pratiqué sous anesthésie une seule fois à l'âge de 2 mois. Il s'agit d'un petit volume de sang qui est prélevé avec anticoagulant. Pour les animaux présentant un statut immunologique déficient de part leurs caractéristiques génétiques, une surveillance particulière a été mise en place pour surveiller l'apparition éventuelle d'infections sous forme d'abscès mais les conditions sanitaires exemptes de pathogène rendent l'apparition de ces abscès très occasionnelle et jamais avant l'âge de 3 mois.
Choix des espèces
La très bonne connaissance du génome de la souris et la maitrise des outils de la transgénèse ont permis d'établir ces souris immunodéprimées pour étudier les lymphocytes T dans un contexte tumoral. Ajoutée à l'expertise mondialement reconnue de notre Laboratoire spécialisé dans l'immunologie des tumeurs et l'immunothérapie, cette espèce constitue un modèle de choix pour nos recherches et leurs applications précliniques. Si les animaux d'étude peuvent être utilisés à des âges différents selon les projets scientifiques, entre 3-4 semaines d'âge post-natal et 25 semaines, les animaux sont prélevés à des fins d'identification génétique à l'âge de 2 mois et l'apparition d'abcès chez quelques très rares animaux de part leur statut immunologique déficient n'intervient pas avant 3 mois.
Prélèvement d’échantillons de peau et de sang sur le rat taupe nu
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Peau et sang de rats-taupes nus sont mis à la disposition des équipes de recherche qui en font la demande, sur validation d'un comité de direction. 300 rats-taupes nus vont être utilisés à cette fin dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés en vie et prélevés à répétition. Chaque individu subit jusqu'à six prélèvements par an, biopsie cutanée de deux secondes ou prise de sang sur animal vigile, avec un mois d'intervalle minimum, et se retrouve retiré de sa colonie moins d'une heure à chaque fois. Le porteur indique que la prise de sang peut provoquer une perte de sang abondante, la biopsie une infection et la réintroduction un rejet par le groupe, et écrit vouloir "préserver ces animaux exceptionnels" en évitant leur mise à mort.
Objectifs
Le rat-taupe nu est un petit rongeur originaire d’Afrique de l’Est, connu pour ses caractéristiques exceptionnelles. Il vit en colonie d’une centaine d’individus et peut atteindre une longévité remarquable en captivité. Dans le cadre du réseau national et international « Rats-taupes nus », l’animalerie souhaite mettre à disposition de la communauté scientifique des prélèvements de tissus et de sang afin de soutenir les recherches sur ce rongeur. Toutes les demandes de prélèvements formulées par les chercheurs seront examinées et validées par le Comité de Direction des rats-taupes nus de la structure. Cette demande d’autorisation de projet vise ainsi à répondre aux besoins des équipes de recherche en matière de prélèvements issus de rats-taupes nus pour les deux années à venir. Afin de préserver ces animaux exceptionnels, les prélèvements seront réalisés "sur animal vigile" sans euthanasie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont multiples, tant pour la recherche scientifique que pour les avancées médicales : Le rat-taupe nu est un modèle unique pour l'étude du vieillissement en raison de sa longévité exceptionnelle (plus de 30 ans). La compréhension de sa longévité et de sa résistance aux maladies pourrait contribuer au développement de nouvelles thérapies anti-âge. Il présente une résistance aux cancers et aux maladies cardiovasculaires, ce qui peut aider à mieux comprendre ces pathologies et à développer de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Son métabolisme et sa résistance à la privation d'oxygène peuvent être étudiés pour améliorer les soins en cas d'accident vasculaire cérébral (AVC) ou de maladies respiratoires
Procédures
Ils seront soumis à des prélèvements de peau et/ou de sang sur animal vigiles en 1 minute maximum en respectant 1 mois minimum entre 2 prélèvements (6 prélèvements par an maximum) - Un prélèvement cutané de 2 secondes maximum par individu. Repos jusqu'à cicatrisation complète (6 prélèvements par an maximum)
Impact sur les animaux
Le retrait de l'individu de la colonie, puis sa remise en contact peut entrainer un risque de rejet ou interactions modifiées du fait du retrait. Le prélèvement sanguin peut induire une perte de sang abondante La biopsie de peau peut engendrer une infection
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie.
Remplacement
La collecte de tissus frais de peau ou de sang ne peuvent être remplacées par des techniques n'utilisant pas d'animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, les protocoles expérimentaux seront optimisés en réalisant une planification statistique rigoureuse pour s’assurer que le nombre de prélèvement est suffisant mais pas excessif, en regroupant les prélèvements de plusieurs études pour limiter le nombre total d’animaux impliqués. Par exemple, si un échantillon de sang peut être utilisé pour plusieurs analyses, cela évite de multiplier les prélèvements. Nous pourrons mettre en place également une biobanque de tissus et de sang accessible aux chercheurs, réduisant ainsi le besoin de nouveaux prélèvements.
Raffinement
Les animaux vivent en colonies en terrariums reliés entre eux par des tunnels. Nos animaux vivent en colonies de 13 à 71 individus, avec une proportion males/femelles et des ages variables par colonies. Nos individus ont actuellement entre 3 et 17 ans. Les hébergements sont maintenus entre 25°C et 30°C, avec une faible intensité lumineuse. Ils sont nourris quotidiennement avec des fruits et légumes frais (patates douce, radis, tomate, concombre, pomme, …). Leur environnement est enrichi d'éléments en liège ou argile pour leur permettre d’exprimer leurs comportements de terrier, des balles et buchettes en bois sont placés dans les hébergements. Afin de réduire l'impact du stress sur les animaux, lors des prélèvements, les animaux ne seront pas séparés du groupe pour une durée supérieure à une heure. Même si ces animaux cicatrisent bien, de l'antiseptique ou du cicatrisant à effet aseptisant auquel les animaux ont été habitués à l'odeur sera utilisé en application pour limiter tout risque d'infection. L'habituation à l'odeur a été réalisée par du placement de petites pulvérisations de cicatrisant à effet aseptisant ou d'antiseptique sur des cotons disposés dans le circuit de terrarium à différents temps. Avant sa remise en groupe, l'individu sera "frotté" avec de la litière de sa colonie pour retrouver ses odeurs et limiter le risque de rejet de la part de la colonie.
Choix des espèces
Le rat-taupe nu est un petit rongeur originaire d’Afrique de l'est et qui possède plusieurs particularités remarquables : - Sa longévité peut dépasser 30 ans en captivité, contrairement aux autres rongeurs comme la souris qui vivent entre 3 et 4 ans, c’est l’espèce de rongeur qui vit le plus longtemps ; - Il a une résistance unique face à de nombreuses maladies liées à l'âge, y compris les maladies cardiovasculaires ou les cancers. En fonction des projets, les animaux pourront être utilisés à tous âges ,du sevrage (1 an) à leur mort naturelle (Approximativement 35 ans) et les deux sexes seront utilisés
Effets de l’activité physique sur les déficits sociaux induits par l’isolement social et un régime obésogène péri-adolescent chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Environ la moitié est hébergée seule dès le sevrage, à trois semaines, et pour le reste de sa vie, soit une quinzaine de semaines, avec un régime obésogène pendant douze à seize semaines, jusqu'à trois prélèvements de sang à la veine faciale et pour certaines une chirurgie du crâne d'une heure. Elles passent cinq tests, anxiété, reconnaissance d'objets, reconnaissance sociale, et transmission sociale de la préférence alimentaire précédée de seize heures sans nourriture. Le porteur qualifie ces tests de peu stressants au motif qu'ils font appel à des comportements naturels, et affirme qu'il est "primordial" de comprendre pourquoi la mise à l'écart aggrave les troubles de mémoire des adolescents en surpoids.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d’approfondir notre compréhension des effets de l’hébergement en cage individuelle et de la consommation d'une nourriture obésogène pendant l'adolescence sur les fonctions hippocampiques et la mémoire chez la souris. Nous étudierons plus précisément différents types de mémoire dont la mémoire sociale chez la souris et les effets de l’activité physique volontaire dans ces contextes. Nous étudierons en particulier les mécanismes neurobiologiques sous-tendant ces fonctions cognitives (notamment l'implication de l'ocytocine et des endocannabinoides) et nous ciblerons une structure cérébrale connue pour son rôle dans différents types de mémoire, l'hippocampe. Il est aujourd’hui nécessaire d’évaluer l’influence de ces différents facteurs aussi bien chez les mâles que chez les souris femelles car nous ne savons pas si les individus des deux sexes se comportent de la même manière en impliquant les mêmes structures cérébrales.
Bénéfices attendus
Etant donné la forte hausse de l’obésité juvénile dans les sociétés industrialisées, il s'avère primordial de mieux comprendre pourquoi la consommation d’une alimentation obésogène à l’adolescence entraîne des perturbations de mémoire à l’âge adulte et si l'ostracisation (mise à l'écart, l'isolement social) dont sont victimes les enfants/adolescents en surpoids est un facteur aggravant. En effet, avoir une vue d’ensemble des modifications physiologiques et neurologiques que cette alimentation et que l'isolement social entraînent permettra à terme de mieux encadrer les jeunes sujets en surpoids ou obèses afin de limiter les conséquences délétères sur les fonctions cognitives. Le cerveau étant vulnérable au cours de l’adolescence, tout changement environnemental comme une consommation obésogène excessive ou l’hébergement en cage individuelle est particulièrement susceptible d’altérer la maturation et par conséquent, le bon fonctionnement cognitif. Cette étude permettra en outre de souligner l’enfance et l’adolescence comme périodes clés et critiques du développement cérébral, et de fournir des données pour les campagnes de prévention de l’obésité juvénile. Notre étude permettra aussi de mieux comprendre l'importance de l'exercice dans le comportement social, notamment chez la souris et son lien avec l'alimentation, équilibrée ou non et d'approfondir nos connaissances par des approches pharmacologiques sur l'activité d'une sous-région de l'hippocampe. Par ailleurs, les relations sociales faisant intervenir différents systèmes neurobiologiques, il est important d’évaluer l’influence potentiellement différentielle du type d'hébergement, de l’alimentation obésogène et de l’activité physique chez les deux sexes.
Procédures
Chaque animal sera soumis à maximum trois prélèvements sanguins à la veine faciale et certains animaux seront également soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une heure max sous anesthésie générale. La composition corporelle des animaux sera analysée par résonance magnétique nucléaire (2 minutes) au cours de l’étude (3 fois à environ 6 semaines d’intervalle). Les injections péritonéales (3 injections maximum de 15 secondes) ou focales (3 injections maximum de 2 minutes) se feront au cours de 5 tests comportementaux qui évaluent leur niveau d'anxiété (5 minutes) et différents types de mémoire (trois sessions de 10 minutes pour la reconnaissance sociale et la reconnaissance d'objets) et la qualité de leurs interactions sociales (transmission sociale de la préférence alimentaire: 16h max de privation alimentaire suivie de 30 minutes d'interaction sociale suivies de 2h de suivi de consommation alimentaire). Le test de reconnaissance sociale ou d'objets pourra être répété une fois avec un délai différent si nécessaire. De plus, environ la moitié des animaux sera hébergée en cage individuelle pour modéliser un isolement physique des congénères de leur arrivée à 3 semaines d'âge jusqu'à la fin de leur vie (environ 15 semaines d'expérimentation) .
Impact sur les animaux
Le régime obésogène donné pendant 12 à 16 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme c’est le cas dans nos études précédentes. L'hébergement en cage individuelle peut certes engendrer des effets néfastes sur les comportements mais c’est justement pour mettre en évidence l’accentuation éventuelle des dérèglements neurobiologiques et comportementaux engendrés par cette situation particulière que nous voulons travailler exceptionnellement dans ces conditions. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période péri-chirurgicale; même si les souris présentent un comportement normal à leur réveil, elles bénéficieront d'au moins 5 jours de "repos" avant les tests comportementaux. Ces derniers génèrent très peu de stress car ils font appel à des situations adaptées à leur comportement naturel et la restriction alimentaire utilisée dans un des tests (transmission sociale de la préférence alimentaire) est limitée à 16h maximum. Les injections (péritonéale ou intracérébrale) peuvent induire un stress qui sera limité par une maitrise des manipulations par les expérimentateurs. Les prélèvements sanguins seront aussi effectués par des expérimentateurs expérimentés afin de limiter le stress de cette manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau ou certaines structures cérébrales doivent être récupérés pour analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène, à un hébergement en cage individuelle et à l’activité physique. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. Cependant, si certains tests peuvent influencer le comportement ultérieur des animaux, des groupes différents seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables (tests paramétriques), 2260 souris seront nécessaires afin de mener à bien le projet. Cela correspond à une durée de 5 ans.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective (sauf les souris hébergées en cage individuelle pour modéliser l’isolement social) avec un environnement ayant un enrichissement minimal (igloo ou roue d’activité) dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être, il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post- opératoire pour limiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. Nous avons particulièrement choisi la souris car les effets de notre régime sont bien caractérisés dans cette espèce. De plus, notre approche pharmacologique pourra éventuellement être complétée/ ultérieurement en utilisant des souris transgéniques existantes. Nous utiliserons un premier lot de souris maintenues en cage collective (2 à 6 par cage) dès le sevrage ainsi qu’un second lot de souris maintenues en cage individuelle. Les souris seront exposées au régime obésogène ou contrôle, avec ou non accès à une roue d'activité, dès le sevrage (3 semaines) et ce pendant 12 à 16 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Après 12 semaines de régime obésogène, les souris seront intégrées dans les différentes procédures expérimentales. Les animaux soumis à un aliment contrôle seront également testés à l'âge adulte afin de garantir la comparatibilité des résultats.
Etude des bases neurobiologiques de la résilience/vulnérabilité au stress prénatal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Immobilisées 45 minutes trois fois par jour pendant sept jours au cours de leur gestation, des souris femelles transmettent un stress prénatal à leur descendance. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les petits devenus adultes sont hébergés seuls deux à quatre semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours et passent jusqu'à six tests de trente minutes par jour, le porteur annonçant des tests de réactivité au stress sans préciser lesquels, pour séparer les individus résilients de ceux qui développent un profil comportemental anormal. 54 souris seront réutilisées dans d'autres procédures, les autres tuées pour prélever des structures de leur cerveau.
Objectifs
Le stress prénatal, subi lors du développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles psychiatriques tout au long de la vie. En particulier, il a été montré dans un modèle de rongeur que le stress prénatal induit chez les individus adultes des déficits de mémoire semblables à ceux observés dans le trouble de stress post-traumatique, mais uniquement chez certains individus. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de démêler les mécanismes responsables des différences interindividuelles dans les réponses à l’exposition au stress prénatal, en se concentrant sur le développement du trouble de stress post-traumatique chez la souris. Notre objectif sera ici d'étudier les différences d'activité d'une région spécifique du cerveau, l'hippocampe, entre les animaux résilients, qui ne développent pas de troubles comportementaux, et les animaux vulnérables qui développent un profil comportemental anormal.
Bénéfices attendus
Le trouble de stress post-traumatique est une pathologie liée au stress, aux conséquences dévastatrices, qui se développe à la suite d'un événement traumatique vécu comme une menace d'agression physique ou de mort. La victime manifeste une réaction de peur intense et un profond sentiment d'impuissance. La prévalence à vie du trouble de stress post-traumatique est d'environ 6 à 8 % dans la population générale, mais 20 à 30 % des individus ayant vécu des événements traumatisants graves (par exemple, des combats militaires, des attaques terroristes, des viols) développent cette pathologie, qui peut persister plusieurs années après le traumatisme. On estime que 7,7 millions de citoyens européens sont sévèrement touchés par ce trouble, avec un coût annuel de 9 milliards d'euros. Les traitements actuels, principalement symptomatiques, sont efficaces pour moins de la moitié des patients et sont souvent associés à des effets secondaires ainsi qu’à des symptômes résiduels. Cette pathologie constitue donc un défi médical majeur. L'une des pistes pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques consiste à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la vulnérabilité accrue des 30 % d'individus exposés à un traumatisme qui développent des symptômes de stress post-traumatique, ainsi que la résilience des 70 % restants qui ne manifestent pas ces symptômes. Notre projet contribuera non seulement à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour élaborer de nouveaux traitements, mais aussi à envisager des biomarqueurs prédictifs de la maladie. Il contribuera à l'enrichissement des neurosciences translationnelles, ainsi qu'à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à favoriser une gestion efficace du stress.
Procédures
Hébergement en cage individuelle pour une durée de 2 à 4 semaines. Injections (1/jour pendant 5 jour au maximum; chaque intervention (préhension de l’animal, injection et retour de l’animal dans sa cage) dure en moyenne 40 sec )). Tests comportementaux permettant de mesurer la réactivité au stress des animaux (6 test de 30min max par jour). Sessions de stress de contention de 45 min 3x/jour pendant 7 jours. Une session de stress de contention de 30min.
Impact sur les animaux
1-hébergement individuel (nuisance légère). 2-Tests comportements de courte durée pouvant induire un stress modéré . 3- Douleur légère de courte durée pour les injections d’un produit mimant un état physiologique de stress (nuisance modérée). 4- Pour une partie des animaux , développement des symptômes associés au trouble de stress post-traumatique (troubles de mémoire, anxiété, hypervigilance, qui feront l’objet d’une analyse approfondie. (nuisance modérée).
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de structures cerebrales en vue de réaliser les analayses du projet.
Remplacement
Nous souhaitons identifier les mécanismes associés à la résilience ou à la vulnérabilité à développer un trouble de stress post-traumatique après exposition à un stress prénatal. Par essence, l’expression de cette vulnérabilité ou résilience ne peut s’observer qu’au travers de comportements, nécessitant donc une l’étude d’individus intègres. Il n'est pas possible à l'heure actuelle d'envisager le remplacement de ce modèle par des approches in vitro ou in silico.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, une expérience pilote utilisant un petit nombre d'animaux sera réalisée en vue de déterminer la souche la plus adéquate pour le reste des expériences. De plus, pour le projet, les frères et sœurs d’une même portée seront répartis entre différents lots, permettant ainsi de mener plusieurs expériences en parallèle.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et copaux larges permettant l'élaboration d'un nid additionné de tunnels si nécessaire). Hors périodes de stress les souris seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire sera réalisée. Durant les sessions de stress prénatal, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour. Dès qu’un animal présentera un signe de mal-être, il sera soigné par un responsable du bien-être animal et/ou la vétérinaire. S’il ne présente aucun signe d’amélioration dans les 3 jours suivant, il sera mis à mort.
Choix des espèces
L'activité de l'hippocampe, qui est notre région candidate pour expliquer les facteurs de résilience/vulnérabilité au stress prénatal, a été étudiée principalement chez le rongeur. De plus, le modèle utilisé dans ce projet est la souris car 1) ce projet fait suite à des premières études réalisées chez la souris; 2) il s'insère dans un projet plus général faisant appel à des lignées transgéniques développées chez la souris. Les animaux seront utilisés : -A l'âge de 7 semaines pour les femelles en reproduction car il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. -A l’âge adulte (11-12 semaines) pour les animaux expérimentaux puisque notre modèle a pour objectif d'étudier les conséquences du stress prénatal sur la vulnérabilité ou la résilience à développer un trouble de stress post-traumatique.
Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la reproduction chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Un tatouage sur les phalanges, un bout de queue coupé pour en extraire l'ADN, et pour certaines femelles deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle. 6 188 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs ovules et leurs spermatozoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet porte sur des lignées génétiquement modifiées rendues infertiles d'un sexe ou de l'autre, pour comprendre la fécondation, améliorer la procréation médicalement assistée et chercher des pistes contraceptives. Le porteur écrit que le nombre d'animaux "sera réduit au minimum" sans donner le moindre calcul d'effectif, alors que 6 188 souris naîtront et seront tuées pour des gestes qui tiennent en trois lignes.
Objectifs
Les troubles de la fertilité sont en constante augmentation dans le monde et plus particulièrement dans les pays industrialisés. Environ un couple sur cinq consulte pour des difficultés à procréer. Les causes de l'infertilité sont souvent inconnues. Le recours à l’assistance médicale à la procréation représente un parcours éprouvant pour les couples et un coût financier important pour la société. La prise en charge de ces problèmes d’infertilité exige une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires nécessaires à la fertilité et représente un défi à la fois scientifique et sociétal. Le projet étudie plusieurs aspects de la reproduction et de l'infertilité pour comprendre comment un spermatozoïde fonctionnel est produit, comment les informations qu'il porte et qu'il transmet à la descendance, sont mises en place, comment il reconnaît l'ovule, comment leur rencontre in vitro peut être améliorée pour une assistance médicale ou comment la fécondation pourrait être bloquée pour un effet contraceptif. Le projet étudie des lignées de souris génétiquement modifiées pour des gènes indispensables à la reproduction des mâles ou des femelles, chez la souris et l'homme, et analyse en particulier leur fertilité par des accouplements in vivo et des approches de fécondation in vitro. Les expériences de fécondation in vitro permettent également de tester l’efficacité de nouveaux contraceptifs non hormonaux ciblant les ovules et les spermatozoïdes.
Bénéfices attendus
Les résultats devraient permettre d’identifier les gènes impliqués dans la fertilité humaine et d’améliorer la prise en charge des couples ayant besoin de l’assistance médicale à la procréation. Ils devraient permettre de proposer de nouvelles stratégies contraceptives qui n'utiliseraient plus d'hormones et d'identifier des marqueurs de qualité des ovules et spermatozoïdes.
Procédures
Les animaux seront soumis à un tatouage d'un numéro d'identification sur les phalanges ainsi qu'un prélèvement d'un petit bout de queue qui dure une minute maximum et une fois dans leur vie, afin d'obtenir de l'ADN. Certaines femelles seront soumises à deux injections d'hormones à 48 h d'écart. Chaque injection dure 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
La brève contention des animaux lors des injections d'hormones, les prélèvements et le tatouage causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les animaux des lignées utilisées ne présentent pas de symptômes dommageables, hormis une infertilité d’un des sexes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’est pas possible de contourner le recours au modèle animal pour la production de spermatozoïdes et d’ovules nécessaires à la réalisation de ce projet. A chaque fois que cela est possible, des cellules en culture manipulées pour exprimer les molécules d'intérêt seront utilisées pour des analyses préliminaires afin de réduire au strict minimum le nombre de souris utilisées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum. La stimulation hormonale assure la maturation de 3 à 4 fois plus d'ovules par rapport à des cycle spontanés et permet de réduire d'un facteur équivalent le nombre de souris femelles donneuses d'ovules. Les nombres d'expériences demandées tiennent compte des variables de production connues en ce qui concerne la stimulation hormonale, les taux de fécondation. Il est donc possible que le nombre d'expériences sur lesquels les calculs du nombre de souris se basent soit plus faible qu'initialement prévu dans le projet. Afin de limiter le nombre de souris produites pour nos analyses, les mêmes souris seront utilisées dans un premier temps pour les accouplements, ceci permettant d'évaluer la fertilité générale, puis après mise à mort, leurs ovules et spermatozoïdes feront l'objet d'analyses in vitro.
Raffinement
Au sein de l'animalerie, zootechniciens et personnels de recherche formés veilleront quotidiennement au bien-être des animaux et controleront leur état de santé. Une grille de suivi et/ou des points limites ont été définis pour chaque procédure. Les animaux disposeront de cotons et d'abris adaptés, pour enrichir leur environnement.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, il n’a pas été possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par celle de méthodes alternatives. En effet, il n’est pas possible de reproduire la formation de spermatozoïdes ou d'ovules et la fécondation sans avoir recours à des animaux. Ce projet sera réalisé chez la souris, modèle animal dans lequel la majorité des gènes, notamment ceux impliqués dans la fertilité, sont similaires à ceux de l'homme. Pour ce projet, des souris des 2 sexes, âgées de 4 à 25 semaines, jeunes adultes et adultes ayant atteint la maturité sexuelle, seront nécessaires pour cette étude sur la reproduction.
Caractérisation d’un modèle cardiaque déficient en Frataxine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Porteurs d'une mutation qui prive leurs cellules cardiaques de frataxine, 68 rats Long Evans développent une atteinte du cœur censée reproduire l'ataxie de Friedreich. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour que leurs cœurs soient analysés au microscope. Chaque animal passe une échocardiographie sous anesthésie gazeuse de 45 minutes une fois par mois pendant un an, une électromyographie sous anesthésie injectable et des prises de sang, la cadence passant à une mesure par semaine dès qu'une anomalie cardiaque apparaît. Le porteur justifie le passage de la souris au rat par une similitude physiologique plus grande avec les humains, système cardiovasculaire, système nerveux et enzymes du foie, tout en rappelant que le même modèle murin se dégrade vite dès l'âge de neuf semaines.
Objectifs
L'ataxie de Friedreich est une maladie évolutive, due à l’atteinte de certaines cellules du système nerveux (maladie neuro-dégénérative). Elle se traduit avant tout par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie). Une atteinte cardiaque, des troubles ostéo-articulaires (scoliose, pieds creux) et un diabète sont parfois associés. Dans cette étude nous allons utiliser un modèle de rat déficient pour une petite protéine, induisant le developpement d'une ataxie de Friedreich. Ce modèle est bien défini chez la souris, notamment dans le décours de la pathologie, qui dès l’âge de 9 semaines présente une réduction rapide de l'état, du fait d'une pathologie cardiaque de ces souris. Si les mêmes symptômes se présentent chez le rat, ils seront euthanasiés dès l'apparition des premiers symptômes ou seront surveillés de manière rapprochée et à l'aide des points limites décrits dans la section appropriée. Pour ce projet, nous effectuerons une caractérisation détaillée de la fonction cardiaque de rats mâle et femelle par échocardiographie, de la fonction musculaire par une électromyographie (EMG), ainsi qu'une analyse histologique du cœur de ces animaux. Globalement, ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure ce modèle de rat correspond au spectre clinique de l'ataxie de Friedreich.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle de rat de l'ataxie de Friedreich, qui recapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Ce modèle nous servira dans un deuxième temps à obtenir des preuves de concept in vivo que de nouvelles approches thérapeutiques sont efficaces sur plusieurs signes cliniques prédictifs de la pathologie humaine, avec pour but, poursuivre par un développement thérapeutique clinique. L'objectif final étant de proposer un traitement efficace pour les patients atteints d'ataxie de Friedreich.
Procédures
Nous allons réaliser une mesure de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (45 minutes) et une mesure de la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie (une injection d'anesthésique et une autre de son réversant). Il y aura également un e suivi du poids des animaux (1X/semaine) et un prélèvement sanguin (30 secondes). Amendement: La mesure de la fonction cardiaque sera réalisée 1 fois par mois pendant 1 an maximum, dès lors qu'une anomalie sera détectée la mesure sera réalisée 1 fois par semaine pendant 1mois. Amendement 1 : plusieurs mesures de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (45 minutes) seront réalisées afin de suivre le phénotype cardiaque des animaux.
Impact sur les animaux
La mutation induit un phenotype dommageable induisant une dysfonction cardiaque. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse pouvant induire de légères difficultés respiratoires. Les animaux subiront une anesthesie gazeuse et une injection d'anesthesique chimique et de son réversant pour étudier les fonctions cardiaques et musculaires qui peuvent générer une douleur de courte durée au point d'injection et de légères difficultés respiratoires. Une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux pouvant induire de légères difficultés respiratoire et une hypovolémie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques).
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant une mutation dans le gène de la frataxine dans les cardiomyocytes, représentatif de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser de façon détaillée la fonction cardiaque de ces animaux. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptomes de la pathologie de l'ataxie de Friedreich. Des modèles cellulaires ou le gène de la frataxine est inhibé ont été étudiés et ont permis de cibler différentes molécules étant capables de diminuer les effets cellulaires indésirable de l'inhibition de ce gène. Cependant cette étape in vivo, qui nous permettra de comprendre la physiologie cardiaque d'un animal où la frataxine est inhibée, est indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme. Nous avons dans cette étude choisi un modèle de rat. Un avantage majeur des modèles de rats par rapport aux souris est leur grande similitude physiologique avec les humains. Leur système cardiovasculaire et leur système nerveux sont plus proches de ceux des humains que ceux des souris, tout comme le nombre et le type d'enzymes hépatiques. Il semblerait qu’un modèle de rat pour l'ataxie de Friedreich reflété mieux la plupart des aspects de la maladie humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous préconisons habituellement 9 animaux par groupe et par sexe. Cependant dans cette étude nous travaillerons sur des groupes de 12 animaux pour la partie phénotypage car il s’agit de rats Long Evans, issus de croisements non consanguins et présentent donc une plus grande variabilité. Pour la partie analyse moléculaire 3 animaux par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats comparables. De plus, les données de modèles similaires chez la souris montrent des différences dans l'évolution de la maladie cardiaque entre les mâles et les femelles. Pour cette raison, nous devons les garder séparés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâtons à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. A réception, les animaux vont passer une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors du transport. Lors de l'anesthésie de l'EMG, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. Amendement 1 : Nous allons réaliser des echocardiographies pour suivre le phénotype dommageable de ces animaux.
Choix des espèces
Le modèle rat portant une mutation inductible sur le gène de la frataxine dans les cellules musculaires permet de reproduire tout ou une partie des symptômes de l'ataxie de Friedreich observés en clinique humaine (données préliminaires). Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, mâle et femelle. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le planning de phénotypage démarrera à l'âge de 9 semaines.
Toxicologie réglementaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7480
Cochons d'Inde : 2530
Hamsters dorés : 1090
Hamsters de Chine : 1090
Lapins : 3700
22 970 animaux vont être utilisés, 7 480 rats, 7 080 souris, 3 700 lapins, 2 530 cobayes et 2 180 hamsters dorés et de Chine, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des substances à tester en administration unique ou quotidienne, subissent des études de carcinogénèse et de reprotoxicité, des tests d'irritation oculaire, cutanée et mucosale, et pour certains une chirurgie d'une heure trente. Le porteur indique que les tumeurs induites peuvent provoquer douleur, agressivité et automutilation, et que la toxicité aiguë peut tuer les individus testés. L'installation travaille pour des clients de l'industrie pharmaceutique et agro-alimentaire, et annonce des points limites propres à chaque procédure sans en décrire aucun.
Objectifs
L’objectif de ce pojet est d’évaluer la toxicité de substances, de dispositifs médicaux ou agro-alimentaires pour l’industrie pharmaceutique chez les rongeurs, de type rat, souris, hamster et cobaye et chez les lagomorphes de type lapin.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’évaluer la toxicité de substances et dispositifs pharmaceutiques ou agro-alimentaires sur des modèles animaux. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances ou dispositifs sur l’Homme afin de proposer des traitements ou des produits agro-alimentaires. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour l’évaluation de la tumorigénicité, l’injection de la substance à tester est réalisée sur animal anesthésié. Il s’agit d’une administration unique ou d'une chirurgie. Un protocole d’analgésie sera appliqué pour la chirurgie. La chirurgie ne peut exéceder 1h30 et l’administration dure 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de la toxicité aigue, il s'agit d'une administration unique de la substance test. L'administration dure 10 minutes maximum. Pour l'évaluation de la toxicité chronique et sub-chronique, de la toxicocinétique, de la carcinogénèse, de la reprotoxicité et de la génotoxicité, l’administration de la substance test peut être réalisée quotidiennement (le schéma de traitement dépend de ce qui est réalisé chez l'Homme). Ces administrations durent 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de la présence de contaminants viraux, la substance test est administrée deux fois. Les administrations durent 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de l’irritabilité cutanée, l’irritabilité occulaire, l’irritabilité mucosale et la sensibilisation de la peau, il s'agit d'une administration unique de la substance test. L'administration dure 10 minutes maximum. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés pour toutes les procédures décrites. Le nombre de prélèvement sanguin dépend de la durée de l'étude, il peut y avoir entre 2 prélèvements sanguins jusqu'à 20 prélèvements sanguins par étude pour les études les plus longues. La durée d'un prélèvement sanguin est de 10 minutes maximum. Pour certaines procédures les animaux sont mis à jeun en cage métabolique, les durées de mise à jeun étant comprises entre 16 heures et 24 heures maximum pour le rat, le hamster, le cobaye et le lapin. Pour la souris, la mise à jeun est de 6h minimum et n'excèdera pas 10h.
Impact sur les animaux
Les études de tumorigénicité et de carcinogénèse peuvent provoquer l’apparition de tumeurs chez les animaux, ce qui peut engendrer une douleur. Les effets liés à l’apparition d’une masse tumorale peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, atteinte de l’état général (poils hérissés, le dos voûté…)). L’étude de toxicité aigüe peut engendrer une irritation au niveau du site d’injection dû à l’administration de la substance test. Une douleur peut accompagner cette irritation de même qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). In fine, la toxicité de la substance testée peut provoquer la mort des individus. Les études de toxicité sub-chronique et chronique, de toxicocinétique, de génotoxicité et de reprotoxicité peuvent engendrer une irritation au niveau du site d’injection dû à l’administration ou aux administrations répétées de la substance test. Une douleur peut accompagner cette irritation de même qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)) selon le schéma et le mode d’administration. Les études d’irritation oculaire, cutanée, mucosale et de sensibilisation de la peau peuvent engendrer des irritations, des plaies, des nécroses au niveau du site d’application de la substance test. Ceci peut être accompagné d’une douleur d’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). Les études d’évaluation de la présence éventuelle de contaminants viraux peuvent engendrer une douleur. Les effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l’absence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques, de dispositifs médicaux ou agro-alimentaires nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Dans le cas de la tumorogénicité et de la carcinogénèse, il peut s’agir de l’apparition d’une tumeur associée à une possible douleur. Dans le cas des études de toxicité sub-chronique et chronique, de toxicocinétique, de génotoxicité et de reprotoxicité, il peut s’agir de l’irritation au niveau du site d’injection et des organes reproducteurs. Dans le cas des études de toxicité aigüe, il peut s’agir de signes cliniques de toxicité et in fine la mort des individus si la dose testée est toxique. Dans le cas d’irritation oculaire, cutanée, mucosale et de sensibilisation de la peau, il peut s’agir d’irritation, de plaies et de nécrose au niveau du site d’application. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum) et peut aller jusqu'à 50 animaux par groupe pour les procédures de carcinogénèse et de reprotoxicité. Les analyses statistiques seront effectuées comme décrit dans les procédures internes. Afin de réduire le nombre d’animaux, différents prélèvements d'organes et/ou de sang seront réalisés.
Raffinement
De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Il s’agit de modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Leur génotype est donc connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. De même, les lapins présent un organisme et des mécanismes de fonctionnemnt internes similaires à l’homme. Leur génotype est également connu et leur utilisation est largement décrite dans la bibliographie. Ces espèces (rat, souris, cobaye, hamster, lapin) sont choisies en fonction du produit à tester, de la dose, du volume et de la procédure expérimentale suivie. Cobayes, rats, hamsters, lapins : adultes ou jeunes adultes car ils nécessitent d’avoir le système immunitaire et autres organes vitaux fonctionnels et totalement développés, dont l’appareil reproducteur. Souris : adultes ou jeunes adultes sauf pour les études de contaminants viraux pour lesquelles des nouveaux-nés sont requis dans le cadre d’études réglementaires obéissant aux lignes diretrices de la Pharmacopée Européenne ou de la FDA.
Evaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution dans l’organisme de composés pharmaceutiques chez les rongeurs et lapins
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 840
Lapins : 800
Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).
Bénéfices attendus
L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).
Devenir
En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.
Raffinement
En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.
Choix des espèces
Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.
Rôle du canal ionique mécanosensible Piezo1 dans la fonction du tissu adipeux brun et des adipocytes beiges
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, ou entre 10 et 20 % avec des signes de souffrance, sont mises à mort. 1 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et sang. Elles subissent seize semaines de régime riche en graisses, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept prélèvements en deux heures, des injections quotidiennes pendant sept jours, et un séjour de six heures ou dix jours à 5 °C, seules en cage pour les empêcher de se réchauffer les unes contre les autres. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun système cellulaire ne reproduit cette complexité, qu'il lui est donc "nécessaire" d'étudier la protéine au sein d'un "organisme entier" et qu'"aucune méthode alternative n'existe".
Objectifs
Il existe dans notre organisme deux grands types de cellules graisseuses appelées adipocytes : les adipocytes blancs qui stockent les graisses que nous mangeons et les adipocytes bruns et beiges qui brulent ces graisses. L'&ctivation de ces adipocytes bruleurs de graisse contribue au maintien de la température corporelle lors d'une exposition au froid et permet de dissiper l'excédent calorique après un repas. Ainsi favoriser la fonction de ces adipocytes bruleurs de graisse diminuerait la prise de poids. Nous avons récemment découvert que ces adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse expriment en grande quantité une protéine donc l’activation est contrôlée par des forces mécaniques. Cette protéine, appelée Piezo1, est dite mécano-sensible. L'objectif de ce projet est de déterminer si cette protéine mécano-sensible contrôle la capacité des adipocytes bruns et beiges à bruler des graisses lors de l'exposition au froid et après la prise d'un repas et si elle joue un rôle dans ces adipocytes pour moduler le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisse.
Bénéfices attendus
L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine mécano-sensible dans les mécanismes d'activation des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer cette protéine comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 1 min/souris. Les souris vigiles seront soumises à des prélèvements d’une goutte sang lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT) (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Cette goutte de sang est appliquée sur une bandelette qui est insérée dans un glucomètre pour mesurer la glycémie. Le GTT sera réalisé aprés 8 et 13 semaines de régimes. Le GTT et l’ITT seront espacés de 2 semaines. Pour les experiences à thermoneutralité, les souris seront hébergées à 30 °C pendant 4 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température corporelle, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h ou 10 jours et seront pour ces durées seules dans la cage afin d’éviter le comportement de thermorégulation sociale qui consiste au regroupement d’animaux les uns contre les autres afin de se réchauffer, comportement qui pourrait fausser les résultats de la mesure de la variation de température corporelle.
Impact sur les animaux
Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place pour détecter rapidement tous signes de souffrance et prendre les mesures appropriées. Les critères d’appréciation de la douleur sont ceux publiés par l’Office Vétérinaire Fédéral Suisse : « Classification rétrospective des expériences sur animaux selon leur degré de gravité (catégories de contrainte) » (800.116- 1.05), mis à jour en 2004. Les souris seront mises à mort si blessure grave, signes de souffrance et de stress (repli en boule, pelage négligé, maigreur), perte de poids > 20 % par rapport à la pesée précédente ou perte entre 10 et 20 % avec signe de souffrance. Lors des injections en intra-péritonéale répétées, les souris seront plus particulièrement surveillées pour repérer des irritations ou des zones d'infection aux zones d'injection. Pour les injections IP quotidiennes pendant 7 jours, nous alternerons les sites d'injection droite/gauche afin d'éviter de créer une zone inflammatoire au point d'injection. Lors de l'exposition au froid, les souris comme tous les homeothermes sont capables de mettre en jeux différents processus pour maintenir leur température corporelle. Nous surveillerons cependant ces souris plus particulièrment pour détecter tous signes d'hypothermie sévère comme une perte du réflexe de redressement, une prostration ou une léthargie. La température rectale sera mesurée et si inférieure à 32°C la souris sera mise à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes et du sang.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études in vitro sur des cellules d'adipocytaires brunes et nous avons ainsi montré que Piezo1 est fortement exprimé dans ces adipocytes et nos expériences in vitro suggèrent que Piezo1 contrôle le développement/fonction des adipocytes thermogéniques, adipocytes qui participent au contrôle de la prise de poids. Les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques sont complexes faisant intervenir un dialogue inter-organe, le système immunitaire, et le microbiote intestinal. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de cette proteine mécano-sensible Piezo1 dans les adipocytes brusn et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet. Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et permettant des études statistiques pertinentes. Ce nombre a été obtenu en utilisant un logiciel dédié qui tient compte de la variabilité de l'effet étudié. En pratique le nombre d'animaux est de 8-12 par groupe pour la plupart des expériences. Différents test statistiques seront utilisés pour déterminer si les différences observées entre les groupes experimentaux sont significatives. Nous choisissons de faire des groupes de 8-12 souris et les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition. Ceci nous permettra de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Nous avons généré des souris avec une invalidation de la protéine étudiée restreinte au adipocytes bruns et beiges pour limiter le risque d'apparition d'un phenotype dommageable. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un maximum de 4-5 souris/cage sur des portoirs ventilés. L’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique et pour l'exposition au froid. Les personnes réalisant les procédures sont autorisées à l'expérimentation animale et respecteront les règles d'éthique. L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, batonnets de bois). Le suivi sanitaire est quotidien et réalisé les jours ouvrables et fériés par les zootechniciens et par des personnes formées pour cela le WE. Cela permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes dans les élevages et de prendre les mesures correctives nécessaires (isolement de l'animale pour soins si blessure pas trop grave, mise à mort si blessure importante et/ou signes de souffrance). Si des signes de souffrance apparaissent au cours d'une expérimentations, l'experimentation sera immédiatement arrétée. Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place pour détecter rapidement tout signes de souffrance et prendre les mesures appropriées. Les animaux seront anesthésiés par un mélange Kétamine (100mg/kg) / Xylasine (10mg/kg) pour éviter toute souffrance lors de prélévement important de sang par ponction cardiaque entrainant la mort de l'animale.
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a beaucoup d'adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse qui contribuent à la dépense énergétique et à la capacité d'adaptation au froid. Les souris sont donc un modèle de choix pour identifier de nouvelles protéines régulant la fonction de ces adipocytes et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en lipide, elles deviennent obèse en 16-20 semaines. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Pour l'ensemble des procédures, nous utiliserons des souris males adultes dont l'age sera de 15-24 semaines selons les procedures.