Rongeurs

Une partie des souris utilisées est de lignée Nude, immunodéficiente, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de dommageable. 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans la graisse du cou, une perfusion de glucose radiomarqué de trois à six heures par pompe implantée sous la peau, trois prélèvements sanguins, puis deux séances d'IRM séparées par trente minutes de trajet en voiture, les tumeurs greffées pouvant comprimer la colonne vertébrale jusqu'à la paraplégie. Toutes sont tuées pour récupérer la tumeur, le porteur indiquant qu'il ne serait pas possible de les maintenir en vie dans de bonnes conditions une fois celle-ci retirée.

Objectifs

Les cancers de la glande surrénale sont des cancers rares qui ont la particularité d’être fréquemment héréditaires. Les patients sont porteurs d’anomalies génétiques qui leur procurent un risque très important de développer une ou plusieurs de ces tumeurs au cours de leur vie. Dans certains cas, ces anomalies génétiques sont par ailleurs la cause de forme plus agressives de la maladie avec le développement de métastases dans les os ou le foie notamment. A l’heure actuelle, les traitements sont peu efficaces pour traiter ces patients et le diagnostic précoce de la présence d’une tumeur, permettant de la retirer par chirurgie reste le traitement le plus efficace. Dans le cas des formes héréditaires, l’identification d’une anomalie génétique permet de proposer un test génétique au membre de la famille pour identifier les individus porteurs de l’anomalie et leur proposer un suivi préventif. Des travaux antérieurs ont montré que l’une des conséquences de ces anomalies génétiques étaient une modification de la façon dont les cellules cancéreuses transforment les sucres, en particulier le glucose. Ces modifications du métabolisme peuvent être utilisées à la fois comme outils diagnostiques (les modifications étant différentes en fonctions du type d’anomalie génétique) et thérapeutique (le ciblage de ces modifications pourrait empêcher les cellules cancéreuses de se nourrir et donc de proliférer). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles souris chez qui nous grefferons sous la peau des cellules tumorales ayant différentes anomalies génétiques retrouvées chez les patients. Dans ces modèles, nous étudierons comment les cellules cancéreuses utilisent le glucose pour proliférer. Nous développerons également des techniques d’imagerie par IRM qui permettront d’identifier les anomalies du métabolisme du glucose, en lien avec chaque type d’anomalie génétique. Ces travaux devraient permettre à fois d’identifier des voies qui pourraient être la cible de thérapie anti-cancéreuses spécifiques des anomalies génétiques (et donc potentiellement responsables de moins d’effets secondaires des traitements), et de développer des outils facilement utilisables en radiologie pour détecter les patients porteurs de ces anomalies génétiques. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs ou "EU. La mise en place des modèles de souris est réalisée dans l'EU1 et l'imagerie sera effectuée sur deux appareils d’IRM différents situés sur 2 sites distincts (EU2 et EU3).

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des différents mécanismes de malignité des tumeurs en fonction de leurs mutations ainsi qu’à la compréhension de leur métabolisme complexe dans un contexte in vivo, le laboratoire pourra proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant des métabolites uniquement dans les cellules tumorales de la surrénale. Cette étude pourrait également permettre de développer une méthode innovante de diagnostic précoce ou de réponse thérapeutique pour les tumeurs pouvant, in fine, être transférée chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour avoir une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans le coussin graisseux sous anesthésie et analgésie (moins de 10 minutes). Une partie des animaux subira une perfusion intraveineuse de glucose radiomarqué durant 3h, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une autre partie des animaux subira une perfusion de glucose radiomarqué durant 6h par pompe osmotique, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une troisième partie des animaux subira sous anesthésie gazeuse une première séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 2, puis après transport en voiture de 30 minutes, une seconde séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 3.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention, de l’anesthésie et lors du transport vers les différents sites d'expérimentation. L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation. L'implantation d’une pompe osmotique sous cutanée ainsi que le développement d’une tumeur dans le coussinet graisseux peuvent causer une légère douleur et potentiellement une réduction temporaire de la mobilité de la souris. Les tumeurs greffées sous le coussinet graisseux des souris peuvent potentiellement se développer en profondeur et adopter un comportement métastatique en fusionnant avec les muscles dorsaux résultant en une compression de la colonne vertébrale. Les animaux peuvent rarement montrer rapidement des signes de difficultés motrices dans les postérieurs, se développant en paraplégie.

Devenir

Les animaux seront élevés pour être utilisés lors d’expérience où ils développeront des tumeurs, suite à une injection de cellules ou une greffe d’un fragment de tumeur dans le flanc ou dans la graisse du cou. À la fin de ces expériences les animaux seront euthanasiés pour récupérer la tumeur car il ne serait pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse, notamment la caractérisation des évènements menant au processus métastatique, qui intègre le microenvironnement tumoral, la néovascularisation, et les régulations endocrines. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de ce cancer ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle murin afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre restreint d’animaux au maximum de sorte à pallier le problème de variation observable in vivo mais également dû à la différence de taille des tumeurs qui peut considérablement altérer le métabolisme intra tumoral, soit 2240 animaux au total sur 5 ans. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.

Raffinement

Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des maisonnettes et morceaux de bois si nécessaire. Les animaux sont hébergés à un maximum de 5 par cage et s'il y a nécessité d'un hébergement individuel dû à une blessure ou une bagarre, il sera placé en cage double séparé d’un congénère par une cloison transparente trouée. Les animaux Nude présentent un phénotype considéré comme dommageable à cause de leur statut immuno-déficient. Ils seront hébergés en zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous un poste de sécurité microbiologique afin de réduire l'impact de leur phénotype et qu'il ne s’exprime en développant une quelconque maladie. La procédure chirurgicale pour les greffes est pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenu par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux est observé, au minimum, deux fois par semaine afin de monitorer leur bien-être et d’observer l’apparition des tumeurs. Les souris sont pesées toutes les semaines pour détecter toute variation de poids anormal, ou stagnation malgré l’augmentation du volume tumoral. Dès l’apparition de tumeurs, celles-ci seront mesurées avec un pied à coulisse deux fois par semaine. Les animaux ayant reçu une greffe de pompe osmotique seront monitorés toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation. Le transport des animaux entre les sites d'expérimentation se fera en voiture dans des cages de transport adaptée avec litière, cotons compactés et gelée alimentaire adaptée au besoin des animaux. Des points limites adaptés ont été défini au préalable afin de réduire au maximum la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’augmenter les chances de prise tumorale à partir des greffes de cellules, nos lignées cellulaires étant également d’origine murine. Par ailleurs le modèle murin nous permet d’avoir accès à des animaux immunodéficients qui constituent un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou murines. Nos lignées cellulaires sont issues de différentes souris, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse immunodéficiente afin de minimiser le risque de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’Homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

Tuées y compris guéries, parce que le porteur juge qu'elles pourraient récidiver après avoir reçu des cellules cancéreuses, 374 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe de cellules de cancer colorectal, des injections d'immunothérapie deux fois par semaine pendant trois semaines, trois séances d'irradiation par protons de vingt minutes sous anesthésie, et des prélèvements sanguins toutes les deux semaines sur animal éveillé. Le suivi de la croissance tumorale dure six mois et impose des transports en voiture entre les deux établissements. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la protonthérapie, hormis le stress des anesthésies répétées, tout en décrivant des tumeurs qui peuvent développer des zones de tissu mort en surface.

Objectifs

Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de deux approches thérapeutiques pour traiter le cancer du côlon en utilisant la protonthérapie et l'immunothérapie. La protonthérapie est une technique de radiothérapie qui utilise des protons (particules chargées) pour cibler de manière précise les cellules cancéreuses, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains voisins de la tumeur. L'immunothérapie, utilisant des anticorps vise à stimuler le système immunitaire pour qu'il reconnaisse et détruise les cellules cancéreuses. Les deux traitements seront administrés de deux manières : simultanément (protonthérapie et immunothérapie en même temps) ou de manière séquentielle (d'abord la protonthérapie, puis l'immunothérapie). Notre étude s'intéresse à l'impact de cette combinaison sur l'environnement immunitaire autour de la tumeur. L’étude utilisera des souris, qui recevront des greffes de cellules de côlon cancéreuses. Après les traitements, la croissance du cancer sera suivie pendant six mois pour déterminer quelle association de traitements est la plus efficace. Le but est d’optimiser cette association de protonthérapie et d’immunothérapies pour améliorer le traitement du cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Nous voulons identifier la meilleure façon de donner ces traitements : soit en les administrant ensemble, soit en les donnant l'un après l'autre. Le but final est de trouver un traitement antitumoral beaucoup plus efficace. Les résultats de cette recherche pourraient ensuite servir à développer un essai clinique sur la meilleure des deux approches, ce qui pourrait grandement aider à créer de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer.

Procédures

EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil. EU1 : Un groupe d'animaux subira une injection de 1 min sous anesthésie générale, puis un prélèvement sanguin de 1 min toutes les deux semaines sur animal vigil, puis 1 injection d'une minute 2 fois par semaine sur animal vigil pendant 3 semaines. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune. EU2 : Un groupe d'animaux subira un prélèvement sanguin de 1 min, puis 1 injection d'une minute sur animal vigil, suivie par 3 séances d’irradiation sous anesthésie générale d'une durée de 20 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Lorsque des cellules cancéreuses sont implantées chez la souris, cela peut causer des douleurs, des infections, une perte de poids temporaire et parfois de la déshydratation. Les tumeurs issues de ces cellules peuvent parfois développer des zones de tissu mort en surface, ce qui a été observé dans d'autres études. Les immunothérapies que nous utiliserons ont déjà été testées et n'ont pas causé d'effets secondaires. Cependant, les injections répétées peuvent engendrer un peu de stress pour les animaux et une inflammation ou une infection au point d’injection. Le transport des souris entre les deux établissements peut induire du stress, mais il est indispensable pour les amener sur le site où elles seront irradiées avec des protons. Quant à la protonthérapie, aucun effet secondaire n'est attendu, hormis le stress des anesthésies répétées.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort si les points limites sont atteints ou à la fin du projet, car aucune d’entre elles ne peut être maintenue en vie. En effet, ayant toutes reçu des injections de cellules cancéreuses, elles présentent un risque et pourraient récidiver, même si elles sont guéries.

Remplacement

Pour étudier l'efficacité des traitements combinés avec la protonthérapie, il est important d'utiliser des animaux car ils ont des fonctions physiologiques complètes, comme dans un corps humain. De plus, pour tester l'association avec des immunothérapies, il est nécessaire d'utiliser des animaux dont le système immunitaire fonctionne bien. La recherche montre que l'effet de la protonthérapie dépend du niveau d'oxygène dans les tissus, qui peut varier, ainsi que de l'environnement autour de la tumeur. Nos premières études sur ce modèle nous ont aidés à choisir les bonnes immunothérapies à associer à la protonthérapie. À ce stade, seule une étude sur des animaux peut évaluer l'impact de la combinaison de ces traitements sur la réponse du système immunitaire. Les études sur des cultures cellulaires, qui utilisent des cellules en dehors d'un organisme, ne peuvent pas reproduire la complexité d’un corps entier, surtout lorsqu’il s’agit d’étudier comment fonctionne le système immunitaire.

Réduction

Les études préliminaires ont contribué à sélectionner les immunothérapies les plus adaptées, ce qui a permis de réduire le nombre de groupes. Le nombre d'animaux requis a été défini de manière à garantir un échantillon suffisant pour effectuer une analyse statistique fiable.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage, avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs qualifiés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Pendant les phases où les souris seront anesthésiées, elles seront maintenues au chaud et leurs yeux seront protégés. Au réveil, si nécessaire, une réhydratation sera administrée. Les souris seront pesées régulièrement, leur état de santé général sera soigneusement suivi et la taille des tumeurs sera mesurée trois fois par semaine. Si des signes de détérioration sont détectés, une surveillance renforcée pourra être mise en place (jusqu’à deux fois par jour). Si nécessaire, le responsable du projet ou un vétérinaire interviendra pour ajuster les soins ou, en dernier recours, décider de mettre fin à la souffrance de l’animal. Les injections seront effectuées par du personnel qualifié en utilisant des aiguilles adaptées. Les prélèvements sanguins seront réalisés avec soin pour minimiser les risques d’hématome permettant ainsi une bonne cicatrisation. Lors des transports en voiture, les souris seront placées dans des boîtes de transport équipées de filtres pour éviter toute contamination. Ces boîtes contiendront de la litière, de la nourriture, de l’eau en gel et des éléments pour leur confort afin de réduire leur stress. Si la température extérieure est trop froide, des chaufferettes seront placées sous les boîtes pour maintenir une température agréable.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées en laboratoire en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leur faible coût d’élevage comparé à d'autres animaux. Ce choix repose principalement sur leur similitude avec l’homme au niveau de l'anatomie, de la physiologie et de la génétique. L’utilisation de souris adultes est justifiée par le fait qu’à ce stade de leur développement, leurs systèmes biologiques, notamment leur système immunitaire, sont pleinement développés et fonctionnels, permettant ainsi d’étudier de manière réaliste la progression du cancer et la réponse immunitaire aux traitements. Contrairement aux cultures cellulaires, qui offrent une vision restreinte des interactions biologiques, les souris adultes permettent d’observer les mécanismes immunitaires et tumoraux dans un organisme vivant et complexe. Cette approche est essentielle pour mieux comprendre comment le système immunitaire combat les tumeurs et pour tester l'efficacité de thérapies innovantes, telles que les traitements immunitaires, dans un contexte proche de la réalité humaine. De plus, le système immunitaire de la souris est bien documenté et les outils d’analyse disponibles sont parfaitement adaptés à ce modèle animal.

Nées dans l'établissement et modifiées génétiquement pour porter la version humaine du récepteur plaquettaire visé, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis maintenues en vie pour être réutilisées dans des projets ultérieurs. Sous anesthésie, chaque souris reçoit une injection d'anticorps antiplaquettaire, puis l'extrémité de sa queue est coupée sur 3 mm et le temps de saignement est mesuré jusqu'à trente minutes. Le porteur indique que l'anesthésie peut perturber le rythme respiratoire et que la molécule injectée peut provoquer des saignements. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucun modèle d'hémostase in vitro et que les modèles disponibles ne sont pas assez sophistiqués.

Objectifs

Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans les thromboses qui apparaissent lorsqu’une artère présente une plaque d’athérosclérose. La plaque peut se rompre, induisant le recrutement de plaquettes et la formation d’un caillot, appelé thrombus, qui peut induire un accident vasculaire cérébral (AVC). Un récepteur des plaquettes est connu pour assurer l’interaction entre les plaquettes et une protéine, permettant l’adhérence des plaquettes lors d’une lésion vasculaire, conduisant à l’arrêt du saignement. Ce récepteur est une cible anti-thrombotique connue de par son rôle important dans l’adhérence des plaquettes et dans la croissance du thrombus. Nous avons généré une molécule qui cible le récepteur et bloque l’interaction entre le récepteur et la protéine. Il a montré une inhibition de la formation de caillot dans un modèle in vitro de perfusion de sang humain et de souris. Dans ce projet nous souhaitons étudier l’impact de ce traitement antiplaquettaire sur le temps de saignement à la queue chez la souris. Nous comparerons cet impact en ayant recours à 2 voies d’injection du traitement : intraveineuse et sous-cutanée. Les procédures seront réalisées chez des souris modifiées génétiquement présentant le récepteur humain puisque notre molécule cible le récepteur dans sa version humaine. Nous avons préalablement vérifié que cette modification du récepteur n’impactait pas les fonctions plaquettaires des souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’un faible impact de la molécule sur l’arrêt du saignement. Nous espérons une augmentation minime du temps de saignement chez les souris ayant reçu notre agent. Cette observation permettrait d’envisager l’utilisation de notre molécule dans des contextes médicaux où le besoin est un agent présentant une activité antithrombotique forte sans risque de saignement tels que l’accident vasculaire cérébral par exemple. A ce jour il n’existe pas d’agent possédant ces caractéristiques. .

Procédures

Les animaux anesthésiés sont soumis à une injection du traitement antiplaquettaire et à un temps de saignement à la queue. Cette procédure consiste en la coupure de l’extrémité de la queue sur 3 mm et observation du temps nécessaire à l’arrêt du saignement. Cette observation est réalisée une seule fois par animal et sur une durée maximum de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire. On pourra également observer une douleur localisée après l’injection du traitement que d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire de la molécule injectée.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux sont maintenus en vie car ils pourront être réutilisés dans des projets ultérieurs comprenant des procédures légères ou sans réveil ne nécessitant pas de prélèvement à la queue. Ces réutilisations auront lieu au minimum 10 jours après la fin de l’utilisation de l’animal dans ce projet afin que l’anti plaquettaire injecté soit éliminé.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de l’agent anti-plaquettaire sur l’arrêt du saignement. Ce processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs, cellules des vaisseaux) ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’hémostase in vitro.

Réduction

Le projet se fera par étapes, un timing à la fois. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des temps de saignement.

Raffinement

Une période d’acclimatation n’est pas nécessaire puisque toutes les souris naissent chez nous. Une habituation à la manipulation est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. • Par une anesthésie avant et pendant les injections • Du gel ophtalmique est appliqué afin de protéger les yeux • Par l’application d’un anesthésique local après les injections RO • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles d’arrêt du saignement. Les techniques de mutation génétique ont permis de générer des souris exprimant le récepteur dans sa version humaine, permettant d’étudier l’effet d’une molécule dirigée contre ce récepteur sur l’arrêt du saignement. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

Pour établir le rôle de la testostérone dans la réponse à la malnutrition infantile, 44 souris juvéniles sont castrées ou opérées à blanc dès le sevrage, puis nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélèvement d'organes. Après six heures de jeûne, chacune est gavée de glucose, la queue incisée, puis saignée dix fois de suite. Le porteur affirme que la castration de souriceaux n'induit pas de conséquences délétères au-delà des suites opératoires attendues, et annonce des points limites "suffisamment prédictifs" qui restent à établir.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle entraîne un retard de croissance, ainsi qu’un métabolisme altéré chez les enfants. Des études récentes ont suggéré que la réponse à la malnutrition infantile pourrait être différente en fonction du sexe, les garçons étant plus susceptibles que les filles. En accord avec cela, de précédentes études ont permis de montrer qu’un régime alimentaire mimant la malnutrition impactait différemment les souris juvéniles mâles et femelles. En effet, les mâles malnutris souffrent d’un retard de croissance et d’altérations du métabolisme plus importantes que les femelles. Au contraire, l’apparition de la puberté est retardée chez les femelles malnutries mais pas chez les mâles. Notre hypothèse est que les hormones sexuelles (testostérone et oestrogène) régulent cette réponse différente en fonction du sexe. En combinant une approche de castration avec un modèle de régime faible en protéines induisant la malnutrition, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de la testostérone dans la réponse des mâles à la malnutrition juvénile. La castration est préférée pour avoir une réponse physiologique intégrée de la présence des hormones sexuelles, en plus de l’impossibilité d’implanter de pompes osmotiques contenant des inhibiteurs de la testostérone à cause de la taille trop petite des animaux.

Bénéfices attendus

Les altérations physiologiques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les mécanismes moléculaires sous-tendant ces altérations. Ce projet permettra d’élucider le rôle de la testostérone dans les adaptations physiologiques à la malnutrition juvénile. Nous pourrons ainsi mieux appréhender la physiologie des animaux juvéniles en contexte de malnutrition, ce qui permettra d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition juvénile

Procédures

Les souris seront nourries soit avec un régime contrôle, soit avec un régime nutritionnel pauvre en protéines, mimant la malnutrition infantile, pendant 5 semaines. Les animaux seront mesurés chaque semaine sous anesthésie générale pendant 3 minutes puis pesés (< 1 min) pendant 5 semaines. Une première moitié subira une castration chirurgicale impliquant une anesthésie générale pendant 20 minutes ainsi qu’une procédure chirurgicale de 15 minutes. L’autre moitié subira une chirurgie contrôle impliquant une anesthésie générale pendant 20 minutes ainsi qu’une procédure chirurgicale de 15 minutes. Dans le cadre d’un test métabolique, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6 heures puis gavées avec du glucose, suite à une contention (environ 10 secondes). Elles auront ensuite une incision à la queue (environ 1 seconde) puis subiront 7 prélèvements de sang à la queue (environ 5 secondes par prélèvement) et trois prélèvements additionnels à la queue pour mesurer le taux d’insuline (environ 1 minute). A la fin de la procédure, toutes les souris auront un prélèvement sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie générale (3 minutes d’anesthésie, 30 secondes de prélèvement).

Impact sur les animaux

Les mesures et les pesées engendreront un stress modéré sans douleur associé à la contention de l’animal et à l’anesthésie, pendant une courte durée. L’orchidectomie ou la chirurgie contrôle entraîneront un stress ainsi qu’une douleur modérée de moyenne durée lors du réveil après la chirurgie, limitée grâce à la prise en charge. Le jeûne induit un stress léger sur la souris, sans douleur. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, ainsi qu'une douleur légère de courte durée liée à l'incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et une douleur légère liée au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue. Le gavage des animaux induit une possibilité de fausse route ou irritation à cause de la sonde.

Devenir

L‘ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et à la suppression de la production d’une hormone, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition ni ne permet l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur la croissance et le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique appropriée, tout en palliant le problème de la variabilité inter-individuelle. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les mâles juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe que nous comparerons avec nos données précédentes. Pour la procédure complète, le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité (80%), grâce à nos études précédentes. Le test statistiqueprendra en compte le régime alimentaire et la castration chirurgicale. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie et pourront être réutilisées.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale afin d'y remédier le plus efficacement possible. En cas d'intervention induisant un biais expérimental trop important, les animaux seront mis à mort. Le protocole du régime expérimental, et le test de tolérance au glucose oral ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. L’orchidectomie sur des juvéniles a déjà été décrite dans la littérature et n’induit pas de conséquences délétères sur les animaux au-delà des effets post-chirurgicaux attendus. L’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant la chirurgie en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera contrôlée pendant et après chirurgie pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie, et la prise en charge de la douleur avec une grille d’évaluation permettra d’ajuster le traitement pour chaque animal. Les expérimentateurs réalisant la chirurgie seront formés auprès de collaborateurs expérimentés pratiquant cette opération sur des souris juvéniles en amont de la procédure.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de sa physiologie, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier l’effet d’une hormone dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 35 jours après le sevrage (procédure commencée à jour 21 ; P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’au jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une suppression de la production de testostérone sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance et le développement du métabolisme énergétique.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie d'une heure trente, une exposition à la nicotine huit heures par jour pendant vingt jours, une mesure du seuil de retrait de la patte, et deux mois de test quotidien de recherche de récompense alimentaire, cinq jours par semaine. Le projet cherche à relier la vulnérabilité à la nicotine et la sensibilité à la douleur en passant par l'impulsivité, avec l'espoir de nouvelles pistes contre le tabagisme. Le porteur écrit que l'imprégnation en nicotine "n'a pas d'effets nuisibles" et que les tests, hors chirurgie, sont "sans douleur" pour l'animal.

Objectifs

Le trouble lié à l'utilisation du tabac, impliquant les produits dérivés du tabac tels que les cigarettes, les e-cigarettes ou le snus (forme de tabac conditionné en sachets, contenant une poudre de tabac à sucer ou à chiquer), est l’une des addictions les plus répandues. En France, la consommation de tabac entraîne 73 000 décès chaque année, posant l'un des défis de santé publique les plus importants de notre époque. Malgré son importance, la comorbidité liée à l'utilisation du tabac avec une hypersensibilité à la douleur passe souvent inaperçue. Il est donc impératif de prendre en compte ces troubles conjointement, et de les traiter simultanément pour améliorer les approches thérapeutiques contre le tabagisme.

Bénéfices attendus

D'un point de vue de santé publique, notre objectif est d'adopter une approche transdiagnostique pour explorer l'interaction entre l'utilisation de la nicotine/du tabac et la douleur. Cette approche permettra d’identifier des mécanismes partagés et offrira de nouvelles pistes pour tester si des médicaments spécifiques peuvent être des candidats prometteurs pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à traiter la sensibilisation à la douleur chez les sujets impulsifs, réduisant les troubles liés à l'utilisation du tabac chez ces individus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales (durée 1h30). Tous les animaux suivront des tests comportementaux : mesure du seuil de retrait de la patte (10min, 1 fois), comportement dirigé vers une récompense alimentaire (1h/ jour pendant 2 mois, 5 jours/sem), exposition à la nicotine (8h/jour pendant 20 jours), enregistrements in vivo (1h/jour de 1 à 15 jours). Selon les procédures, certains animaux seront injectés (quelques secondes, de 1 à 3 semaines, 5jours/semaines)

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquelles des traitements antalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place. Les animaux sont également exposés à une solution de nicotine qui permet une imprégnation en nicotine, objet de l'étude pour l'addiction, mais cela n'a pas d'effets nuisibles. Le comportement sensoriel des animaux consistera à définir un seuil de réaction à une stimulation mécanique sur animal en libre mouvement. Ce test n'engendre pas de douleur. Les injections intrapéritonéales sont réalisées par un personnel compétent et n'engendrent pas de douleur autre que celle de la piqure. La contention des animaux lors de la connection/déconnection des fibres peut être source de stress, même si les animaux sont au préalable habitués au geste. Les autres tests expérimentaux sont sans douleur sur l'animal et n'engendre pas de nuisances ou d'effets néfastes.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Nous utilisons le modèle animal pour modéliser la pathologie humaine de l'addiction à la nicotine. Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. De plus, notre projet d'étude des comorbidités entre addiction à la nicotine et sensibilité à la douleur repose sur une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal et impliquant le fonctionnement du système nerveux dans son intégrité. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser le nombre minimal de souris nécessaires pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'expérience, plusieurs tests sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives (10/cage maximum) dans un milieu enrichi (litière de cellulose, carrés de cellulose et papier ouaté). La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement par le zootechnicien. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable du projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites fixés. Des fiches de suivi post-opératoires sont mises en place, ainsi qu’une grille d’évaluation sur laquelle des critères d’arrêt et des mesures conservatoires sont décrites. Avant toute procédure, les animaux connaissent une période d’acclimatation de minimum 7 jours, durant laquelle ils sont délicatement manipulés (handling) de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention.

Choix des espèces

Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. Nos travaux considèrent la souris in vivo, et mettent à profit différents protocoles comportementaux irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain, ce qui permet de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre des comportements spécifiques liés à la toxicomanie. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 56 jours, soit l’âge adulte. Nous choississons ce stade dévelopemental qui correspond à une maturation complète du cerveau.

Tous les 144 rats sont tués à la fin de l'expérience, le porteur indiquant qu'ils ne peuvent plus être utilisés pour d'autres projets, tandis que les dispositifs implantés dans leur corps sont retirés, décontaminés et remis en service. Ces implants de télémétrie sont posés sous la peau entre les omoplates ou dans l'abdomen, sous anesthésie, la plaie étant refermée par agrafes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie des rats reçoit ensuite une injection déclenchant un choc inflammatoire, avec fièvre et prostration attendues. Le projet évalue la faisabilité de cette technologie dans le laboratoire, le porteur mettant en avant le confort qu'elle apporte aux animaux en évitant les contentions et les sondes rectales répétées.

Objectifs

L’activité motrice des animaux est entre autres le reflet de leur bien-être et de leur état de santé général, la diminution ou l’augmentation de l’activité peut être transitoire ou épisodique, ce qui rend la détection et l’évaluation de leur amplitude fastidieuse. On associe également la baisse ou l’augmentation de la température corporelle à des modifications des paramètres physiologiques ou à une pathologie. Les mesures de l’activité et de la température corporelle peuvent être réalisées de manière continue et individuelle à l’aide de micro-dispositifs implantés chez les animaux, les informations sont acheminées et centralisées par des émetteurs-récepteurs et permettent une analyse à postériori à l’issue de la période de mesure. Ce projet consiste à la mise en place de cette technologie dans notre laboratoire de manière à en évaluer sa faisabilité et sa pertinence.

Bénéfices attendus

Les avantages de cette technologie d’utilisation de ces dispositifs de télémétrie sont multiples, il s’agit surtout de la possibilité de réaliser des meures continues de plusieurs paramètres sans intervention de manipulation ni contention des animaux, ce qui est un confort supplémentaire pour l’animal. Les implants de nouvelle génération présentent un avantage supplémentaire, car ils permettent de maintenir les hébergements sociaux de animaux, les mesures issues de plusieurs émetteurs avec des fréquences différentes peuvent avoir la même cage d’origine. Dans le contexte des programmes d’évaluation d’efficacité de nouveaux médicaments dans nos modèles de pathologie métaboliques, le recours à cette technologie pourrait apporter des informations complémentaires dont nous ne disposons pas à ce jour en raison des contraintes imposées par les mesures traditionnelles (activités par caméra IR ou mesure de température par sonde rectales) Le succès de cette phase d’évaluation des dispositifs simples pourrait être poursuivie par l’utilisation d’implants plus complexe qui donnent accès à des mesures de paramètres physiologiques complexes (électrocardiogramme, encéphalogramme, myogramme, ou encore pression artérielle)

Procédures

Il faut distinguer les temps chirurgicaux et post opératoires, des périodes expérimentales de mesure au cours des desquelles seront selon les cas ajoutés des interventions techniques. L’application des conditions d’asepsie sont primordiales. Pour la pose de l’implant sous-cutané : intervention chirurgicale dans le creux intrascapulaire. Une seule intervention par animal d’une durée de 5 minutes (anesthésie-tonte-asepsie-analgésie-incision plan cutané-pose implant- fermeture plaie avec agrafes) Pour la pose de l’implant intra-péritonéal : intervention chirurgicale dans la partie abdominale. Une seule intervention par animal d’une durée de 10 minutes (anesthésie-tonte abdomen-asepsie-analgésie locale-incision plan cutané puis plan musculaire-insertion implant- suture plan musculaire-fermeture plaie avec agrafes-analgésie). Les animaux implantés qui subiront un stimulus inflammatoire, recevront une injection intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les procédures seront réalisées sur des animaux sains. La nuisance sera limitée aux inconforts liés au temps chirurgical au moment de la pose de l’implant, et à la période post-opératoire de cicatrisation de la plaie. Dans le cas de l’utilisation des implants de télémétrie pour des animaux qui subissent un choc inflammatoire stérile, nous pourrons observer un stress et un inconfort produit par le stimulus (prostration et fièvre).

Devenir

Les animaux seront engagés dans des procédures courtes d'évaluation. Le nombre le plus restreint possible sera utilisé ( pas de répétition des essais concluants) Les aniamux seront mis à mort à la fin de l'expérience car il ne peuvent être utilisés pour d'autres projets. par aulleurs, les dispositifs implantés sont réutilisables ( durée de fonctionnement limitée et coût unitaire élevé) , ils seront donc retirés puis recyclé après avoir suivi une procédure de reconditionnement adaptées. (décontamination et stérilisation)

Remplacement

La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permette d’évaluer les paramètres physiologiques constitue une étape clé dans le développement de solutions thérapeutiques qui altèrent ces paramètres physiologiques lorsque les organismes sont atteints par une maladie. Son remplacement à ce stade d’un projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique simple qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.

Réduction

La stratégie de réduction consiste à ne réaliser finalement tous les essais dans les conditions optimales et d’être en mesure de sécuriser les résultats obtenus. Cela passe par la robustesse des résultats qui sont produits (effectifs suffisant et strictement nécessaire pour les analyses statistiques) mais également en apportant un maximum d’informations pertinentes sur le nombre le plus réduit d’animaux engagés. Le recours à des méthodes non invasives et non stressantes pour les animaux permet d’accroître le niveau d’information sur un nombre identique d’animaux, cela revient à réduire le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Les rats sont hébergés en groupes sociaux, ils ne sont pas realotés puisque la technologie qui sera employée permet de travailler avec 5 individus hébergés dans une même cage. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de stress inflammatoire aigu nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que la chirurgie même de durée relativement brève occasionne de la douleur, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.

Choix des espèces

Notre domaine de recherche concerne les troubles métaboliques et plus précisément les maladies du foie. La littérature scientifique, est riche dans ce domaine car les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.) Les méthodes chirurgicales de pose des types d’implants évoqués dans ce projet sont relativement aisées chez les souris et rats, mais les modèles d’études que nous avons au laboratoire sont essentiellement pratiqués chez les rats, c’est la raison pour laquelle les évaluations des méthodes de mesures télémétriques seront réalisées chez le rat au cours de ce projet. Les animaux seront employés à l'âge adulte généralement vers 8 semaines d'âge. Les modèles que nous avons établis sont appliqués sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Ce sont donc chez des animaux d’âge moyen de 8 semaines que seront pratiqués les essais de mesure à l’aide d’implants télémétriques.